CN111566484A - 细胞外囊泡蛋白及其在癌症诊断、预测对疗法的反应和治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

公开了用于治疗癌症患者并鉴定可能对于用抗PD‑1/PD‑L1和其他抗癌和免疫调节疗法的治疗有反应的恶性肿瘤患者的组合物和方法。

Description

细胞外囊泡蛋白及其在癌症诊断、预测对疗法的反应和治疗 中的用途

本申请要求2017年11月9日提交的美国临时申请号62/583,901的优先权，其全部内容通过引用并入本文，如同全文阐述一样。

本发明是在政府的支持下利用美国国立卫生研究院的基金完成的，基金号：GM085146和CA174523。美国政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及肿瘤学、免疫治疗和医学领域。更具体地，本发明提供了有助于临床医生监测对治疗的反应、鉴定最有可能从治疗中受益的那些患者的生物标记物及其使用方法，以及抑制癌症转移的新的治疗方法。本文公开的标记物也可用于鉴定对癌症治疗有用的治疗剂的试验。

背景技术

在整个说明书中引用了一些出版物和专利文件，以便描述本发明所属领域的现状。这些引用中的每一篇都通过引用并入本文，如同全文阐述一样。

免疫检查点配体蛋白(例如PD-L1、PD-L2、B7H3和B7H4)是在多种细胞类型(包括肿瘤细胞)中表达的跨膜蛋白。因为这些蛋白质与活化的T细胞上的受体(例如PD-1)结合以引发免疫检查点反应，因此它们在免疫抑制中起关键作用(Dong等，2002)。免疫检查点信号传导通路的鉴定源于治疗多种类型癌症的基于免疫检查点阻断的疗法的发展。例如，靶向PD-L1/PD-1轴的阻断抗体在治疗包括转移性黑素瘤在内的多种实体瘤中已显示出惊人的前景(Chen and Han，2015；Topalian等，2016)。但是，只有少数患者对该疗法有反应，并且反应往往是部分的或短暂的(Ribas等，2016；Zaretsky等，2016)。

PD-L1介导的免疫抑制的当前模型集中在肿瘤细胞表面上的PD-L1与T细胞上的PD-1之间的直接相互作用。这种相互作用递送有效的抑制信号，其诱导了T细胞的功能性“衰竭”或凋亡(Chen和Han，2015；Topalian等，2016)。癌细胞表面上的PD-L1可以使免疫细胞局部失活，作为对免疫压力的适应性反应(Juneja等，2017；Lau等，2017)。然而，数个临床观察结果也表明，癌细胞表面PD-L1不是PD-L1的唯一生物活性形式。PD-L1不仅存在于癌细胞表面，而且还存在于细胞质中(Chowdhury等，2016；Mahoney等，2015；Obeid等，2016；Sznol和Chen，2013)。此外，已经在患有黑素瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤的患者的血液样品中鉴定出可溶性PD-L1蛋白；血液PD-L1蛋白的水平似乎与肿瘤进展和患者的总存活率相关(Finkelmeier等，2016；Frigola等，2011；Rossille等，2014；Wang等，2015；Zhou等，2017)。

尽管免疫检查点阻断疗法最近取得了成功，但患者反应通常是部分的或短暂的。需要更好的对肿瘤细胞和免疫系统之间相互作用的分子理解，以改善当前的疗法并鉴定最可能对治疗产生反应的患者。

发明内容

根据本发明，提供了用于鉴定对抗癌疗法有反应的受试者的方法。示例性方法包括：在治疗之前获得从受试者收集的第一生物样品，对所述受试者施用一种或多种抗癌剂和从所述治疗的受试者收集第二生物样品，检测在所述第一和第二生物样品中的循环的细胞外囊泡PD-L1和/或干扰素γ(IFNγ)的水平，以及当相对于所述第一生物样品，在所述第二生物样品中细胞外囊泡PD-L1和/或IFNγ的水平升高时，鉴定受试者为对治疗有反应，和/或鉴定所述受试者为对所述治疗有反应的，其中相对于所述第一生物样品，所述第二生物样品中的细胞外囊泡PD-L1和IFNγ的水平升高。

一方面，癌症是黑素瘤，并且抗癌疗法涉及PD-1/PD-L1，并且包括但不限于派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、用于癌症治疗的免疫学上特异性靶向PD1/PDL1的抗体和用于癌症治疗的特异性靶向PD1/PDL1的小分子。用本文描述的方法评估或治疗的其他癌症，包括例如，肺癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、鼻咽癌、淋巴瘤、梅克尔细胞癌、具有错配修复缺陷的癌症或可用抗PD1/PDL1疗法治疗的任何其他癌症。

如上所述，在治疗之前和之后采集第一和第二样品。方法还可以包括在获得第二样品之后采集后续的额外样品以监测受试者的疾病状态。根据用于治疗癌症的治疗方案以及所治疗癌症的具体类型，可以在治疗后的几天、几周或几个月内采集第二样品。在采集第一样品后1、2、3、4、6、8、9、10、12或16周左右可以获得第二样品。在某些情况中，样品可以相隔几天获得，例如在治疗后的2、3、4、5、6、7或10天获得。

在某些实施方式中，方法进一步包括确定所述治疗之前和之后的血液细胞外囊泡PD-L1蛋白水平之间的比率。方法还可以包括确定治疗之前和之后的IFNγ水平的比率。在其他实施方式中，在治疗之前和之后确定PD-L1和IFNγ水平的比率。前述方法可以进一步包括分离包含外泌体的细胞外囊泡，所述外泌体包括与恶性转化或进展相关的一种或多种蛋白质，例如Akt、Wnt5A、MAPK1、HSP70、TRAP1、HSP90、SerpinH1、VEGFC、R-RAS、HLA-G5、BRAF、NRAS、KIT、TP53、PTEN、EGFR、HER2、ALK、AKT1、KRAS、MET、RET、RHOA、ARID1A、CDH1或其突变体，其中所述的包括外泌体的细胞外囊泡任选地在抗癌治疗之前和之后分离。

还提供了在从癌症患者中获得的生物样品中检测含癌细胞来源的PD-L1的囊泡的方法，该囊泡选自PD-L1外泌体、细胞外囊泡、核外颗粒体、凋亡小体和癌小体(oncosome)。一种这样的方法包括使所述样品与特异性结合PD-L1的一种或多种试剂接触；并且检测结合复合物的形成，该结合复合物包括与所述含癌症来源的PD-L1的囊泡结合的所述一种或多种试剂。方法可以进一步包括从所述结合复合物中分离所述含PD-L1的囊泡。

在本发明的另一方面，提供了从生物流体样品中分离含癌蛋白的外泌体或含癌蛋白的细胞外囊泡的方法。示例性方法包括从患者获得样品，将该样品与特异性结合所述癌蛋白的试剂一起温育，并分离试剂，从而从所述样品中分离含癌蛋白的外泌体或细胞外囊泡，其中所述癌蛋白选自BRAF、NRAS、KIT、TP53、PTEN、EGFR、HER2、ALK、AKT1、MET、RET、RHOA、ARID1A和CDH1、Wnt5A、MAPK1、HSP70、TRAP1、HSP90、SerpinH1、VEGFC、R-RAS、HLA-G5及其突变蛋白，在所述外泌体或所述细胞外囊泡中存在所述癌蛋白指示癌症。在某些实施方式中，此类蛋白质的存在与转移癌有关。该方法可以进一步包括将样品与特异性结合CD63或CD274的试剂一起温育。

本发明还提供了用于治疗与循环的细胞外囊泡和/或外泌体PD-L1水平异常相关的转移癌的方法。示例性方法包括从患者获得生物样品；使所述样品与和血液PD-L1形成特异性结合对的试剂接触，从而形成结合复合物，所述PD-1/PD-L1存在于外泌体或细胞外囊泡中；从所述样品中去除所述结合复合物，从而消耗PD-1/PDL1的血液水平。在优选实施方式中，样品是血液，并且所述接触和去除发生在血浆置换期间。在这种方法中，将过滤后的血液重新注入受试者。使用上述方法待治疗的癌症包括但不限于黑素瘤、肺癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胃癌、淋巴瘤、梅克尔细胞癌、具有错配修复缺陷的癌症或可以用抗PD1/PDL1疗法治疗的其他癌症。

在本发明的另一方面，公开了在从癌症患者获得的生物样品中检测含免疫细胞来源的蛋白质的囊泡的方法。在某些实施方式中，囊泡选自含免疫细胞来源的蛋白质的外泌体、细胞外脱落囊泡、核外颗粒体、凋亡小体和癌小体。通过如下进行分离：使样品与特异性结合所述免疫细胞来源的蛋白质的一种或多种试剂接触；和检测结合复合物的形成，该结合复合物包括与所述含免疫细胞来源的蛋白质的囊泡结合的所述一种或多种试剂，其中所述免疫细胞来源的蛋白质选自CD109、CD151、CD276、CD44、CD46、CD47、CD55、CD58、CD59、CD70、CD9、CD95、CD97、CD99和B7H4中的一种或多种。方法可以进一步包括分离包括CD63和CD81的外泌体。

还提供了在从癌症患者获得的生物样品中检测含免疫细胞来源的蛋白质的细胞外囊泡的方法。这样的囊泡包括但不限于含免疫细胞来源的蛋白质的外泌体、细胞外脱落囊泡、核外颗粒体、凋亡小体和癌小体。示例性方法包括使所述样品与特异性结合免疫细胞来源的蛋白质的一种或多种试剂接触；以及检测结合复合物的形成，所述结合复合物包含与所述含免疫细胞来源的蛋白质的囊泡结合的所述一种或多种试剂，其中所述免疫细胞来源的蛋白质选自IFNγ，所述外泌体或所述细胞外囊泡的所述免疫细胞蛋白质的存在指示所述免疫细胞的类型或功能状态。上述方法可以进一步需要将样品与特异性结合CD9、CD63和CD81的试剂一起温育。待检测的其他含免疫细胞来源的蛋白质的囊泡包括，例如CD3、CD4、CD8、CD11、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD25、CD27、CD38、CD45、CD68、CD80、CD86、CD138、CD152、CD160、CD223、CD244、CD274、CD276和CD366的一种或多种。

在仍另一实施方式中，提供了用于实践上述任何方法的试剂盒。

附图说明

图1A-1N。黑素瘤细胞来源的外泌体在其表面上携带PD-L1蛋白。(图1A)从人黑素瘤细胞的培养上清液纯化的外泌体的代表性TEM图像。(图1B)使用NanoSight纳米颗粒跟踪系统表征纯化的外泌体。(图1C)反相蛋白质阵列(RPPA)数据的热图，其显示了原发性或转移性黑素瘤细胞系分泌的全细胞裂解物(“WCL”)和外泌体(“EXO”)中PD-L1的水平(左侧图)。Log2转换的RPPA数据显示在右侧图中。参见图2A用于统计分析。(图1D)来自不同转移性黑素瘤细胞系的全细胞裂解物(“W”)和纯化的外泌体(“E”)中PD-L1的免疫印迹。加样相同量的全细胞裂解物和外泌体蛋白质。CD63、Hrs、Alix和TSG101被用作外泌体标记物。GAPDH被用作加样对照。(图1E)密度梯度离心证实转移性黑素瘤细胞分泌的PD-L1与外泌体标记物CD63、Hrs、Alix和TSG101共分级。(图1F)用针对PD-L1胞外结构域的单克隆抗体免疫金标记的黑素瘤细胞来源的外泌体的代表性TEM图像。箭头指示5纳米金颗粒。(图1G)通过CD63包被的珠对外泌体PD-L1的流式细胞术分析图(左侧图)。如通过流式细胞术测定的，人黑素瘤细胞在外泌体表面上PD-L1蛋白的分泌(右侧图)。指出了代表性实验中具有PD-L1⁺外泌体的珠子的百分比。(图1H)使用针对PD-L1的胞外结构域的单克隆抗体的外泌体PD-L1的ELISA图(左侧图)。如通过ELISA测定的，人黑素瘤细胞分泌的外泌体表面上的PD-L1(右侧图)。(图1I)如通过ELISA测量的，在有或没有IFN-γ处理的情况下，黑素瘤细胞分泌的外泌体上的PD-L1水平。(图1J)在有或没有IFN-γ处理的情况下，使用黑素瘤细胞分泌的外泌体的PD-1结合测定。(图1K)蛋白质印迹分析显示与对照细胞(“C”)相比，经IFN-γ处理的细胞(“IFN”)分泌的外泌体中PD-L1水平升高。加样相同量的IFN-γ处理和对照细胞的外泌体蛋白质。(图1L)细胞内PD-L1和外泌体标记物CD63的免疫荧光染色。(图1M)蛋白质印迹显示在具有HRS敲低的黑素瘤细胞中CD63和PD-L1(在WCL中)的细胞内积累，以及CD63和PD-L1(在EXO中)的外泌体分泌减少。(图1N)PD-L1和Hrs的共免疫沉淀。数据表示三个(图1C、1I)或两个(图1G、1H、1J)独立的生物重复的平均值±s.d.。通过未配对t-检验，***P＜0.001(图1I)。

图2A-2E。黑素瘤细胞分泌携带PD-L1的外泌体。(图2A)Log2转换的RPPA数据显示，与原发性黑素瘤细胞系相比，转移性黑素瘤细胞系分泌的外泌体PD-L1水平更高。数据表示四个原发性(WM1552C、WM35、WM793、WM902B)或转移性(UACC-903、1205Lu、WM9、WM164)黑素瘤细胞系的平均值±s.d.。(图2B)来自小鼠黑素瘤B16-F10细胞的全细胞裂解物(“WCL”)中或纯化的外泌体(“EXO”)中PD-L1的免疫印迹。加样相同量的全细胞裂解物和外泌体蛋白质。Hrs、Alix和TSG101用作外泌体标记物。(图2C)细胞内PD-L1和Hrs的免疫荧光染色。(图2D)流式细胞术分析表明HRS的敲低导致人黑素瘤WM9细胞中PD-L1的积累。数据表示三个独立的生物重复的平均值±s.d.。(图2E)从IFN-γ处理的WM9细胞的培养基中免疫沉淀的PD-L1蛋白的免疫印迹。使用分别靶向PD-L1的胞内结构域(克隆E1L3N)和胞外结构域(克隆E1J2J)的两种不同的单克隆抗体进行蛋白质印迹。在图2E中，三角形表示糖基化的全长PD-L1；圆圈表示仅含有胞外结构域的PD-L1。通过未配对t-检验，*P<0.05，**P<0.01(图2A、2D)。

图3A-3I。患有转移性黑素瘤的患者中大多数循环的PD-L1蛋白再外泌体上携带。(图3A)使用特异性识别人PD-L1蛋白的胞外结构域的单克隆抗体，在源自携带人黑素瘤异种移植小鼠或对照小鼠的血浆样品中人黑素瘤细胞来源的外泌体PD-L1的ELISA图。(图3B)如通过ELISA测量的，从对照裸鼠(n＝10)或携带人黑素瘤异种移植的裸鼠(n＝10)的血浆样品分离的外泌体上PD-L1的水平。(图3C)在携带异种移植的裸鼠中外泌体PD-L1的血浆水平与肿瘤负荷之间的皮尔逊相关性。(图3D)从患有IV期黑素瘤的患者的血浆样品中纯化的循环的外泌体的代表性TEM图像。(图3E)从12名患有IV期黑素瘤的患者(表示为“P1”至“P12”)的血浆样品中纯化的外泌体中PD-L1的免疫印迹。还测试了包括Hrs、Alix和TSG101的外泌体标记物，以及包括TYRP-1、TYRP-2和MART-1的黑素瘤特异性标记物。(图3F)如通过将外泌体PD-L1的水平除以患者血浆中检测到的总循环PD-L1的水平计算的，外泌体部分中循环的PD-L1的百分比。(图3G)ELISA显示了健康供体(表示为“HD”，n＝11)和黑素瘤患者(表示为“MP”，n＝30)中循环的外泌体PD-L1的水平。(图3H)与健康供体(n＝11)相比，患有转移性黑素瘤的患者(n＝30)中循环的外泌体PD-L1水平的ROC曲线分析。(图3I)ELISA显示了在具有(n＝30)或没有(n＝11)可测量的肿瘤负荷的黑素瘤患者中循环的外泌体PD-L1的水平。数据表示平均值±s.d.。通过未配对t-检验，**P<0.01，***P<0.001(图3B、3G、3I)。

图4A-4D。黑素瘤细胞分泌外泌体PD-L1进入循环系统。(图4A)如通过ELISA分析的，针对人PD-L1蛋白的胞外结构域的单克隆抗体特异性地识别了重组人PD-L1蛋白，而不是重组小鼠PD-L1蛋白。(图4B)针对人PD-L1的胞外结构域的单克隆抗体特异性检测人外泌体PD-L1，但不是小鼠外泌体PD-L1。(图4C)如通过布拉德福德蛋白质测定法测量的，从对照裸鼠(n＝10)和携带人黑素瘤异种移植的裸鼠(n＝10)的血浆样品中分离的总外泌体蛋白质水平。(图4D)每μg总循环的外泌体蛋白质中对照裸鼠(n＝10)和携带人黑素瘤异种移植的裸鼠(n＝10)的血浆中循环的外泌体PD-L1水平(ng)。(图4E)标准密度梯度离心分析显示循环的PD-L1蛋白与外泌体标记物Hrs和TSG101(通常在1.13至1.19g/ml之间)和黑素瘤特异性标记物TYRP-2共分级。数据表示平均值±s.d.(图4B-4D)。通过未配对t-检验，*P<0.05，***P<0.001(图4C-4D)。

图5A-5D。具有或不具有PD-L1表达的情况下，MEL624细胞分泌的外泌体PD-L1的表征和定量。(图5A)RPPA数据的热图，显示了由对照(MEL624)或表达PD-L1(PD-L1/MEL624)的人黑素瘤MEL624细胞分泌的外泌体中PD-L1的水平。Log2转换后的数据显示在顶部。(图5B)来自MEL624或PD-L1/MEL624细胞的全细胞裂解物(“W”)中或纯化的外泌体(“E”)中PD-L1的免疫印迹。加样每种细胞系的相同量的全细胞裂解物和外泌体蛋白质。CD63、Hrs、Alix和TSG101被用作外泌体标记物。GAPDH被用作加样对照。(图5C)如通过ELISA确定的，由MEL624或PD-L1/MEL624细胞分泌的外泌体表面上的PD-L1。(图5D)如通过ELISA测量的，由MEL624或PD-L1/MEL624细胞分泌的外泌体上的PD-L1水平。数据表示三个(图5A、5D)或两个(图5C)独立生物重复的平均值±s.d.。通过未配对t-检验，***P＜0.001(图5D)。

图6A-6L。外泌体PD-L1抑制CD8 T细胞，并促进体外和体内黑素瘤的进展。(图6A)在具有或不具有IgG同种型或PD-L1抗体阻断的情况下用MEL624细胞来源的外泌体或PD-L1/MEL624细胞来源的外泌体处理后，检查了人外周CD8 T细胞的Ki-67和GzmB表达的代表性轮廓图(左侧)。在右侧图显示了以抗CD3/CD28抗体刺激的Ki-67⁺GzmB⁺CD8 T细胞的百分比。(图6B-6C)在具有或不具有IgG同种型或PD-L1抗体阻断的情况下，用黑素瘤WM9细胞来源的外泌体处理后，检查人外周PD-1⁺或PD-1^-CD8 T细胞(用抗CD3/CD28抗体刺激)的Ki-67和GzmB表达的代表性轮廓图(图6B)，以及为Ki-67⁺GzmB⁺的PD-1⁺或PD-1^-CD8 T细胞的百分比(图6C)。(图6D)在具有或不具有IgG同种型或PD-L1抗体阻断的情况下，用WM9细胞来源的外泌体处理后，用膜联蛋白V染色的人外周PD-1⁺CD8 T细胞(用抗CD3/CD28抗体刺激)的代表性直方图(左侧)。膜联蛋白V⁺细胞的比例显示在右侧图中。(图6E-6F)在MEL624细胞中执行了CD8 T细胞介导的肿瘤细胞杀伤测定。在具有或不具有IgG同种型或PD-L1抗体阻断的情况下，用PBS(对照)、MEL624细胞来源的外泌体或PD-L1/MEL624细胞来源的外泌体处理后，抗CD3/CD28刺激的CD8 T细胞与MEL624细胞共培养96小时。通过结晶紫染色可视化存活的肿瘤细胞(图6E)，并计算肿瘤细胞(与刺激的CD8 T细胞共培养)的相对存活率(图6F)。(图6G)在细胞接种后每隔2-3天评估在具有或不具有IgG同种型或PD-L1抗体阻断的情况，用B16-F10细胞来源的外泌体处理的小鼠中B16-F10PD-L1敲低肿瘤的体积(每组n＝6)。(图6H-6I)在具有或不具有IgG同种型或PD-L1抗体阻断的情况下，用B16-F10细胞来源的外泌体处理后的荷瘤小鼠的存活率(每组n＝6)。显示了总的对数秩P值(图6H)，并且将威尔科克森检验用于双向比较(图6I)。(图6J)肿瘤组织中CD8 TIL的代表性免疫荧光染色图像。(图6K)如通过免疫荧光染色确定的，B16-F10 PD-L1敲低肿瘤中CD8 TIL的数目。显示的是从10个高倍视野(HPF)量化的细胞数(平均值±s.d.)。(图6L)在具有或不具有IgG同种型或PD-L1抗体阻断的情况下，用B16-F10细胞来源的外泌体处理后，检查CD8 TIL或脾CD8 T细胞的Ki-67表达的代表性轮廓图(顶部)。在底部显示为Ki-67⁺的PD-1⁺CD8 TIL或脾CD8 T细胞的比例和总和(每组n＝4-6)。数据表示两个(图6A、6C)或三个(图6D、6F)独立生物重复的平均值±s.d.。通过未配对t-检验(图6A、6C、6D、6F、6K、6L)或双向方差分析(图6L)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。“NS”，不显著。

图7A-7C。外泌体PD-L1对CD8 T细胞的功能抑制。(图7A)在用人黑素瘤WM9细胞来源的外泌体处理后，检查人外周CD8 T细胞的Ki-67和GzmB表达的代表性轮廓图(左侧)。在右侧图显示了Ki-67⁺GzmB⁺CD8 T细胞(用抗CD3/CD28抗体刺激)的百分比。(图7B)在存在或不存在抗PD-1阻断抗体的情况下，用WM9细胞来源的外泌体处理后，检查人外周PD-1⁺或PD-1^-CD8 T细胞(用抗CD3/CD28抗体刺激)的Ki-67和GzmB表达的代表性轮廓图(左侧)。右侧显示为Ki-67⁺GzmB⁺的PD-1⁺或PD-1^-CD8 T细胞的百分比。(图7C)在MEL624细胞中测定了CD8 T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。在具有或不具有IgG同种型或PD-L1抗体阻断的情况下，用PBS(对照)或WM9细胞来源的外泌体处理后的抗CD3/CD28刺激的CD8 T细胞与MEL624细胞共培养96小时。通过结晶紫染色将存活的肿瘤细胞可视化。在左下图显示了肿瘤细胞(与刺激的CD8 T细胞共培养)的相对存活率。数据表示两个(图7A)或三个(图7B、7C)独立生物重复的平均值±s.d.。通过未配对t-检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001(图7A-7C)。

图8A-8C。小鼠黑素瘤B16-F10细胞分泌的外泌体PD-L1导致小鼠脾CD8 T细胞的抑制和凋亡。(图8A)在具有或不具有IgG同种型或PD-L1抗体阻断的情况下，用B16-F10细胞来源的外泌体处理后，检查小鼠脾脏总、PD-1⁺或PD-1^-CD8 T细胞(用抗CD3/CD28抗体刺激)的Ki-67和GzmB表达的代表性轮廓图(顶部)。在底部显示为Ki-67⁺GzmB⁺的总、PD-1⁺或PD-1-CD8 T细胞的百分比。(图8B)由B16-F10细胞来源的外泌体诱导的小鼠脾总、PD-1⁺或PD-1^-CD8 T细胞的凋亡。(图8C)在具有或不具有IgG同种型或PD-L1抗体阻断的情况下，用B16-F10细胞来源的外泌体处理后，用膜联蛋白V染色的小鼠脾PD-1⁺CD8 T细胞的代表性直方图(顶部)。在底部显示了膜联蛋白V⁺细胞的百分比。数据表示两个(图8A)或三个(图8B、8C)独立生物重复的平均值±s.d.。通过未配对t-检验，*P<0.05，**P<0.01(图8A-8C)。

图9A-9E。外泌体PD-L1减少T淋巴细胞浸润并促进体内黑素瘤生长。(图9A)在具有或不具有PD-L1敲低的情况下，检查B16-F10细胞的PD-L1表达的代表性流式细胞术直方图。使用针对PD-L1的慢病毒shRNA(“shPD-L1”)或加扰对照shRNA(“shCTL”)，稳定地耗尽了B16-F10细胞的PD-L1。(图9B)来自对照(“shCTL”)或PD-L1敲低(“shPD-L1”)B16-F10细胞的全细胞裂解物(“WCL”)中或纯化的外泌体(“EXO”)中PD-L1的免疫印迹。(图9C)细胞接种后第23天的PD-L1敲低(“shPD-L1”)或对照(“shCTL”)B16-F10肿瘤的体积(每组n＝6)。数据表示平均值±s.d.。通过未配对t-检验，**P<0.01。(图9D)携带PD-L1敲低(“shPD-L1”)或对照(“shCTL”)B16-F10肿瘤的小鼠的存活率(每组n＝6)。显示的是总体对数秩P值。(图9E)代表性图像显示了在具有或不具有IgG同种型或PD-L1抗体阻断的情况下，用B16-F10细胞来源的外泌体处理后，C57BL/6小鼠中PD-L1敲低的B16-F10肿瘤的生长。

图10A-10K。循环的外泌体PD-L1的水平将对派姆单抗的临床反应者与无反应者分层。(图10A)在具有和不具有对派姆单抗的临床反应的黑素瘤患者之间，比较循环的外泌体PD-L1的治疗前水平。“R”：反应者，n＝11；“NR”：无反应者，n＝19。(图10B)与无反应者相比，临床反应者中循环的外泌体PD-L1的治疗前水平的ROC曲线分析。(图10C)具有高和低循环的外泌体PD-L1的治疗前水平的患者的客观缓解率(“ORR”)。(图10D)在黑素瘤患者的血浆中，IFN-γ水平与外泌体PD-L1水平的皮尔逊相关性(n＝30)。(图10E)在治疗前和治疗时的连续时间点的循环的外泌体PD-L1的水平(n＝23)。(图10F)在治疗前和治疗时的连续时间点，临床反应者(n＝10)和无反应者(n＝13)中循环的外泌体PD-L1的水平。(图10G)在治疗前和治疗时的连续时间点，临床反应者中PD-1⁺Ki-67⁺CD8 T细胞的频率和循环的外泌体PD-L1的水平。(图10H)在临床反应者和无反应者中，第6周循环的外泌体PD-L1水平与第3周PD-1⁺Ki-67⁺CD8 T细胞的频率的皮尔逊相关性。(图10I)在临床反应者和无反应者中，第6周循环的外泌体PD-L1水平的倍数变化与PD-1⁺Ki-67⁺CD8 T细胞的倍数变化的皮尔逊相关性。(图10J)比较临床反应者和无反应者之间在第6周时循环的外泌体PD-L1的倍数变化。(图10K)相对于无反应者，临床反应者中在第6周时循环的外泌体PD-L1的倍数变化的ROC曲线分析。(图10L)在第6周时循环的外泌体PD-L1的高和低倍数变化的患者的客观缓解率。数据表示平均值±s.d.。通过未配对t-检验(图10A、10J)、配对t-检验(图10E、10F)或Fisher精确检验(图10C、10L)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。“NS”，不显著。

图11。外泌体PD-L1介导的免疫抑制的模型。除了直接的肿瘤细胞-T细胞相互作用之外，黑素瘤细胞还分泌大量在其表面上携带PD-L1蛋白的外泌体，其与肿瘤微环境中和循环中的T细胞相互作用，以全身性地抑制免疫系统。IFN-γ进一步上调了外泌体PD-L1，充当肿瘤细胞适应免疫系统的更有效机制。外泌体PD-L1-T细胞相互作用可被抗PD-1或抗PD-L1抗体阻断，这表明外泌体PD-L1与T细胞PD-1之间相互作用的破坏参与当前基于PD-L1/PD-1阻断的疗法。

图12A-12C。循环的外泌体PD-L1是抗PD-1疗法的临床结果的基于原理和临床上可使用的预测因子。(图12A)跟踪抗PD-1治疗之前和期间循环外泌体PD-L1的水平可用于最早在治疗的6周时将对抗PD-1疗法的反应者(绿色)与无反应者(红色)分层。(图12B)应用循环的外泌体PD-L1预测患者对抗PD-1疗法的反应的图。在对PD-1疗法产生临床反应的转移性黑素瘤患者中，循环的外泌体PD-L1的治疗前水平较低。在抗PD-1治疗6周后，临床反应者中循环的外泌体PD-L1的水平显著增加，但无反应者中没有。(图12C)跟踪循环的外泌体PD-L1的治疗前和治疗时的水平二者为确定疗法的成功(绿色)或失败(红色)提供指导。

图13A-13D。T细胞来源的脱落囊泡和外泌体的纯化和表征。(图13A)如通过NanoSight纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术所确定的，由活化的和未活化的T细胞分泌的脱落囊泡和外泌体的大小分布。“SV”：脱落囊泡；“EXO”：外泌体。(图13B)使用NanoSight纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术定量活化和未活化的T细胞分泌的脱落囊泡和外泌体。(图13C)使用Bio-Rad布拉德福德蛋白质测定法测量活化和未活化的T细胞分泌的脱落囊泡和外泌体的总蛋白质水平。(图13D)通过免疫印迹分析了来自活化和未活化的T细胞的纯化的脱落囊泡和外泌体中外泌体标记物、T细胞标记物和免疫调节蛋白的存在。

具体实施方式

肿瘤细胞上的PD-L1与淋巴细胞上的PD-1相互作用以引发免疫检查点反应。在这里，我们报道转移性黑素瘤细胞还分泌高水平的其表面上携带PD-L1的外泌体(以下称为“PD-L1外泌体”)。

我们报道，外泌体PD-L1蛋白的分泌是由转运必需内体分选复合体(ESCRT)机械的组分调节的，并且更具体是由内体蛋白Alix调节的。此外，干扰素-γ(IFN-γ)上调了外泌体上PD-L1的水平。PD-L1外泌体有效地抑制CD8 T细胞的功能，并促进体外和体内肿瘤生长。

在患有转移性黑素瘤患者中，循环的外泌体PD-L1水平与IFN-γ水平正相关。此外，循环的外泌体PD-L1的治疗前和治疗中水平均与对抗PD-1疗法的临床反应强烈相关。因此，循环的外泌体PD-L1的变化模式将临床反应者和无反应者分层，从而提供了对抗癌治疗反应的可靠预测因子。

外泌体PD-L1蛋白的鉴定和表征提供了新型的分子机制，黑素瘤细胞通过该机制与免疫系统全身性地相互作用并与免疫系统抗争。对外泌体PD-L1的免疫抑制作用的这种鉴定促进了PD-L1/PD-1阻断疗法的发展，并为跟踪这种致命癌症的进展提供了新的生物标记物。

提供以下定义以促进对本发明的理解。

I.定义

为了本发明的目的，“一个”或“一种”实体是指一个或多个(一种或多种)该实体。例如，“一个抗体”是指一个或多个cDNA或至少一个cDNA。因此，术语“一个”或“一种”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。还应注意，术语“包括”、“包含”和“具有”可以互换使用。此外，化合物“选自”是指以下列举中的一种或多种化合物，包括两种或更多种化合物的混合物(即组合)。根据本发明，分离的或生物学上纯的分子是已经从其天然环境中移出的化合物。因此，“分离的”和“生物学上纯的”不一定反映化合物已纯化的程度。本发明的分离的化合物可以从其天然来源中获得，可以使用实验室合成技术来生产，或者可以通过任何这样的化学合成途径来生产。

当涉及具体核苷酸或氨基酸时，短语“基本上由……组成”是指具有给定SEQ IDNO：的性质的序列。例如，当参考氨基酸序列使用时，该短语包括该序列本身以及不会影响该序列的功能和新颖特性的分子修饰。

术语“外泌体”和“细胞外囊泡”在本文可互换使用，以描述从多种不同细胞类型释放的内体和质膜来源的膜囊泡。这些细胞外囊泡(EV)通过充当在膜细胞与胞质蛋白、脂质和RNA之间转移的载体，代表了细胞间通信的重要模式。在中间内吞区室、多囊体(MVB)与质膜融合后，细胞外囊泡或外泌体从细胞释放。这将腔内囊泡(ILV)释放到细胞外环境和囊泡中，从而释放外泌体。还有其他类型的微囊泡，包括凋亡小体和核外颗粒体，它们分别源自经历凋亡和质膜脱落的细胞。尽管凋亡小体、核外颗粒体和外泌体都大致上有相同的大小(通常为40-100nm)，并且都含有细胞溶质的“吞咽”，但它们是不同种类的囊泡。

“生物标记物”或“敏感性标记物”是与对治疗(例如包括抗PD-1和/或抗PD-L1疗法的治疗)的不同敏感性或反应相关联的标志物。这样的标记物可以包括但不限于核酸、由其编码的蛋白质或其他小分子。这些标记物可以用来有利于鉴定出那些可能对疗法有反应的患者与那些不太可能反应的患者。它们也可以目标是调节对疗法的反应，或用于筛选测定，以鉴定对黑素瘤或其他癌症的治疗和管理具有效果或协同作用的药物。

生物标记物的检测可以通过标准的组织学和/或免疫检测方法进行。在具体实施方式中，可以通过多肽检测或多肽表达水平检测的任何方法检测标记物。例如，可以使用任何抗体检测方法(例如，免疫荧光(IF)方法、流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS))来检测多肽，可以使用抗原回收和/或微阵列检测方法。可以使用与标记物多肽特异性结合的试剂，例如抗体和抗体衍生物以及抗体片段。可以使用的其他检测技术包括，例如，捕获测定(例如，ELISA)、质谱法(例如，LCMS/MS)和/或聚合酶链反应(例如，RT-PCR)。也可以通过全身性施用标记形式的抗体至生物标记物，然后通过成像来检测生物标记物。

在仍另一方法中，检测外泌体PD-L1蛋白的方法包括荧光或量子点标记的抗体，例如用于标记外泌体表面上的蛋白质的标记的抗PDL1。在标记外泌体蛋白质后，采用NanoSight NS300分析仪的基于光散射的纳米颗粒跟踪分析(NTA)可用于监测小至10nM的个体囊泡。蛋白质标记和大小测量的这种组合提供了独特的能力，以可视化悬浮液中的外泌体蛋白质并直接观察其布朗运动，通过利用可视化数据分析确认的数量分布、以及计数和浓度测量产生快速、准确、高分辨率的分级(sizing)数据。

在另一实施方式中，通过如本文所述的核酸检测技术评估了来自受试者的核酸样品。

在其他实施方式中，通过测量mRNA表达来测量或检测生物标记物。本领域技术人员可以使用它们的常识来使用多种技术例如qRT-PCR、Fluidigm、RNAseq(例如IIlumina)、Affymetrix基因图谱、NanoString nCounter平台或Nanopore测序(Oxford NanoporeTechnologies)以测量RNA水平。

如本文所用，术语“固体基质”是指任何形式，例如珠子、微粒、微阵列、微量滴定孔或试管的表面、量油尺或过滤器。基质的材料可以是聚苯乙烯、纤维素、乳胶、硝化纤维、尼龙、聚丙烯酰胺、葡聚糖或琼脂糖。

如本文所用，“靶核酸”是指存在于复杂核酸混合物中的核酸的先前限定的区域，其中限定的野生型区域包含至少一种已知的核苷酸变异，该核苷酸变异可能与或可能不与疾病相关联。可以通过cDNA克隆或减性杂交从天然来源分离核酸分子或人工合成核酸分子。可以通过三酯合成方法或通过使用自动DNA合成仪来人工合成核酸分子。

关于本发明中使用的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。当应用于DNA时，该术语是指如此DNA分子，该DNA分子与在其来源的天然存在的生物基因组中紧密相邻(在5'和3'方向上)的序列分开。例如，“分离的核酸”可以包括插入到载体(例如质粒或病毒载体)或整合到原核生物或真核生物的基因组DNA中的DNA分子。“分离的核酸分子”也可以包括cDNA分子。插入载体中的分离的核酸分子在本文中有时也称为重组核酸分子。

关于RNA分子，术语“分离的核酸”主要是指由如上限定的分离的DNA分子编码的RNA分子。可选地，该术语可以指如此RNA分子，该RNA分子已经与在其天然状态下(即在细胞或组织中)其相关联的RNA分子充分分开，以致其以“基本上纯的”形式存在。相对于核酸，使用术语“富集的”是指与在正常细胞中或获取序列的细胞中相比，特定的DNA或RNA序列构成了在目标细胞或溶液中存在的总DNA和RNA的显著更高的分数(2-5倍)。这可能是由于人通过优先减少存在的其他DNA或RNA的量、或通过优先增加特定DNA或RNA序列的量或两者的组合而引起的。但是，应该注意的是，“富集的”并不意味着不存在其他DNA或RNA序列，而只是目标序列的相对数量显著地增加。

出于一些目的，核苷酸序列为纯化形式也是有利的。关于核酸的术语“纯化的”不需要绝对的纯度(例如均质的制品)；相反，它指示该序列比在天然环境中相对更纯(与天然水平相比，该水平至少应高2-5倍，例如以mg/ml计)。从cDNA文库中分离的个体克隆可以纯化至电泳均质。从这些克隆获得的要求保护的DNA分子可以直接从总DNA或总RNA中获得。cDNA克隆不是天然存在的，而是优选通过操纵部分纯化的天然存在的物质(信使RNA)获得的。从mRNA构建cDNA文库涉及合成物质(cDNA)的产生，并且可以通过克隆选择携带cDNA文库的细胞从合成文库中分离出纯的个体cDNA克隆。因此，包括从mRNA构建cDNA文库和分离不同的cDNA克隆的方法产生了天然信息的大约10-6倍的纯化。因此，明确地预期纯化至少一个数量级、优选两个或三个数量级，和更优选四个或五个数量级。因此，术语“基本上纯的”是指包括以重量计至少50-60％的目标化合物(例如，核酸，寡核苷酸等)的制品。更优选地，该制品包括以重量计至少75％，和最优选以重量计90-99％的目标化合物。纯度通过适用于目标化合物的方法测量。

本文有时使用术语“分离的蛋白质”或“分离和纯化的蛋白质”。该术语主要是指通过表达本发明的分离的核酸分子产生的蛋白质。可选地，该术语可以指已经和与其天然相关联的其他蛋白质充分分开的蛋白质，以致以“基本上纯的”形式存在。“分离的”并不意味着排除与其他化合物或材料的人工或合成混合物，或存在不干扰基本活性的杂质，例如由于纯化不完全、添加稳定剂、或混入例如免疫原性制品或药学上可接受的制品中，杂质可能存在。

“PD-L1”可以指人PD-L1或其他生物体中的同系物，这取决于其使用的上下文。人PD-L1也称为CD274、B7-H、B7H1、B7-H1、B7同系物1、MGC142294、MGC142296、PDCD1L1、PDCD1LG1、PDCD1配体1、PDL1、程序性细胞死亡1配体1和程序性死亡配体1，并且具有Uniprot号Q9NZQ7和NCBI基因ID号29126。人PD-L1是由人9号染色体上的CD274基因编码的290个氨基酸的I型跨膜蛋白。小鼠PD-L1的NCBI GenBank ID号为ADK70950.1。

“癌蛋白”是与恶性转化和进展相关联的蛋白质。这样的蛋白质可以包含或可以不包含突变。示例性“癌蛋白”包括但不限于BRAF、NRAS、KIT、TP53、PTEN、EGFR、HER2、ALK、AKT1、KRAS、MET、RET、RHOA、ARID1A、CDH1、Akt、Wnt5A、MAPK1、HSP70、TRAP1、HSP90、SerpinH1、VEGFC、R-RAS和HLA-G5。

免疫调节蛋白是在调节恶性转化和进展的免疫过程中起作用的蛋白质。这样的蛋白质包括例如CD109、CD151、CD276、CD44、CD46、CD47、CD55、CD58、CD59、CD70、CD9、CD95、CD97、CD99和B7H4。

术语“互补的”描述了可以彼此形成多种有利相互作用的两个核苷酸。例如，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，因为它们可以形成两个氢键。同样，鸟嘌呤和胞嘧啶是互补的，因为它们可以形成三个氢键。因此，如果核酸序列包含以下碱基，胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶的序列，则该核酸分子的“补体”将是包含腺嘌呤替代胸腺嘧啶、胸腺嘧啶替代腺嘌呤、胞嘧啶代替鸟嘌呤、和鸟嘌呤代替胞嘧啶的分子。因为补体可以包含与亲本核酸分子形成最佳相互作用的核酸序列，所以这种补体可以以高亲和力与其亲本分子结合。

关于单链核酸，具体是寡核苷酸，术语“特异性杂交”是指具有足够互补序列的两个单链核苷酸分子之间的缔合，以允许在本领域通常使用的预定条件下进行这种杂交(有时称为“基本互补”)。具体地，该术语是指寡核苷酸与包含在本发明的单链DNA或RNA分子中的基本互补序列的杂交，以实质上排除了寡核苷酸与非互补序列的单链核酸的杂交。

例如，下面阐述了一种用于计算实现指定序列同源性的核酸分子之间的杂交所需的严格条件的通用式(Sambrook等，分子克隆，Cold Spring Harbor Laboratory(1989))：Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-600/#bp以双链体。

为了说明上式，使用[Na+]＝[0.368]和50％的甲酰胺，42％的GC含量为，200个碱基的平均探针大小，Tm为57℃。同源性每降低1％，DNA双链体的Tm就会降低1-1.5℃。因此，使用42℃的杂交温度将观察到具有大于约75％序列同一性的靶标。

杂交和洗涤的严格性主要取决于溶液的盐浓度和温度。一般地，为了使探针与其靶标的退火速率最大化，杂交通常在盐和温度条件下进行，该温度条件比杂交体(hybrid)的计算Tm低20-25℃。洗涤条件应尽可能严格，以确保探针与靶标的同一性的程度。一般地，选择洗涤条件为低于杂交体的Tm约12-20℃。关于本发明的核酸，中等严格杂交限定为在42℃下在6X SSC、5X Denhardt溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑鱼精DNA中的杂交，并在55℃下在2X SSC和0.5％SDS中洗涤15分钟。高度严格的杂交限定为在42℃下在6X SSC、5XDenhardt溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑鱼精DNA中杂交，并在65℃下在1X SSC和0.5％SDS中洗涤15分钟。非常高度严格的杂交限定为在42℃下在6X SSC、5X Denhardt溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑鱼精DNA中杂交，并在65℃下在0.1X SSC和0.5％SDS中洗涤15分钟。

如本文所用，术语“寡核苷酸”限定为由两个或更多个核糖或脱氧核糖核苷酸——优选为多于三个——组成的核酸分子。寡核苷酸的精确大小将取决于多种因素以及寡核苷酸的具体应用和用途。包括探针和引物在内的寡核苷酸可以是从3个核苷酸至全长核酸分子的任何长度，并且明确地包括从3到全长多核苷酸的每种可能数目的连续核酸。优选地，寡核苷酸的长度为至少约10个核苷酸，更优选长度为至少15个核苷酸，更优选长度为至少约20个核苷酸。

聚合酶链反应(PCR)已经在美国专利4,683,195、4,800,195和4,965,188中描述，其全部公开内容通过引用并入本文。

本文使用的术语“探针”是指寡核苷酸、多核苷酸或核酸(RNA或DNA)——无论是天然存在于纯化的限制性酶消化物中还是合成产生的，其能够与具有与探针互补序列的核酸退火或特异性杂交。探针可以是单链的或双链的。探针的精确长度将取决于许多因素，包括温度、探针来源和方法的用途。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，尽管寡核苷酸探针可以包含较少的核苷酸，但其通常包含15至25、30、50、75或更多个核苷酸。选择本文的探针以与具体靶核酸序列的不同链互补。这意味着探针必须足够互补，以便能够在一组预定条件下与其各自的靶链“特异性杂交”或退火。因此，探针序列不必反映靶标的精确互补序列。例如，非互补核苷酸片段可以附接至探针的5'或3'端，而探针序列的其余部分与靶链互补。可选地，可以将非互补碱基或更长的序列散布在探针中，条件是该探针序列与靶核酸的序列具有足够的互补性以随之特异性退火。许多探针也用非天然存在的标记进行标记，以易于检测靶标。

如本文所用，术语“引物”是指如此寡核苷酸，其是RNA或DNA，单链或双链的，源自生物系统通过限制性内切酶消化而生成的或者是合成产生的，当其置于适合的环境中时能够在功能上充当模板依赖性核酸合成的引发剂。当提供适合的核酸模板、适合的核酸三磷酸核苷前体、聚合酶、适合的辅因子和条件(如合适的温度和pH)时，引物可通过聚合酶的作用或类似活性通过添加核苷酸在其3'末端延伸，以产生引物延伸产物。引物的长度可根据具体条件和应用要求而变化。例如，在诊断应用中，寡核苷酸引物的长度通常为15至25、30、50、75或更多个核苷酸。引物必须与所需模板具有足够的互补性，以引发所需延伸产物的合成，即，能够与所需模板链退火，其方式足以以适当的并置提供引物的3'羟基部分用于通过聚合酶或类似酶引发合成。不需要引物序列代表所需模板的精确补体。例如，可以将非互补核苷酸序列附接至其他互补引物的5'端。可选地，可将非互补碱基散布在寡核苷酸引物序列内，条件是该引物序列与所需模板链的序列具有足够的互补性，以在功能上提供用于延伸产物合成的模板引物复合物。

例如关于核酸或蛋白质的“标记”或“可检测部分”是指这样的组合物，当与核酸或蛋白质连接时，该组合物使核酸或蛋白质可检测，通过例如光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段。示例性标记包括但不限于放射性同位素、磁珠、金属珠、胶粒、荧光染料、酶、生物素、地高辛配基、半抗原等。“标记的核酸或寡核苷酸探针”一般是如此探针，其通过连接体或化学键共价结合，或通过离子键、范德华力、静电引力、疏水相互作用或氢键非共价结合至标记，从而可以通过检测与核酸或探针结合的标记的存在来检测核酸或探针的存在。

“化学治疗剂”或“抗癌剂”是可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的种类包括但不限于：抑制与异常细胞增殖或肿瘤生长有关的基因表达的烷化剂、抗代谢物、激酶抑制剂、纺锤体毒植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)、抗孕激素、雌激素受体下调剂(ERD)、雌激素受体拮抗剂、亮化激素释放激素激动剂、抗雄激素、芳香酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、RAF抑制剂、反义寡核苷酸。可用于本发明的治疗方法中的化学治疗剂可以包括在癌细胞的正常功能中选择性抑制信号传导通路中的一个或多个重要步骤，从而导致凋亡的试剂。信号转导抑制剂(STI)包括但不限于：(i)bcr/abl激酶抑制剂，例如STI 571(Gleevec)；(ii)表皮生长因子(EGF)受体抑制剂，例如激酶抑制剂(Iressa，SSI-774)和抗体(Imclone：C225[Goldstein等(1995)，Clin Cancer Res.1：1311-1318)]和Abgenix：ABX-EGF)；(iii)her-2/neu受体抑制剂，例如Herceptin^TM(曲妥珠单抗)，以及法尼基转移酶抑制剂(FTI)，例如L-744,832(Kohl等，(1995)，Nat Med.1(8)：792-797)；(iv)Akt家族激酶或Akt通路的抑制剂，例如雷帕霉素(参见，例如Sekulic等(2000)Cancer Res.60：3504-3513)；(v)细胞周期激酶抑制剂，例如夫拉平度(flavopiridol)和UCN-01(参见，例如，Sausville(2003)Curr.Med.Chem.Anti-Canc Agents 3：47-56)；和(vi)磷脂酰肌醇激酶抑制剂，例如LY294002(参见，例如，Vlahos等，(1994)J.Biol.Chem.269：5241-5248)。在具体实施方式中，STI选自STI 571、SSI-774、C225、ABX-EGF、曲妥珠单抗、L-744,832、雷帕霉素、LY294002、夫拉平度(flavopiridal)和UNC-01。在仍另一实施方式中，STI为L-744,832。

用作烷化剂的化学治疗剂包括但不限于氮芥，例如苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺(isofamide)、二氯甲基二乙胺、美法仑和乌拉莫司汀；氮丙啶，例如塞替派；甲基磺酸酯，如白消安；亚硝基脲，例如卡莫司汀、洛莫司汀和链脲霉素；铂复合物，例如顺铂和卡铂；生物还原性烷化剂，例如丝裂霉素、甲基苄肼、达卡巴嗪和六甲蜜胺)；DNA链断裂剂(例如博来霉素)；拓扑异构酶II抑制剂(例如，安吖啶、更生霉素、柔红霉素、伊达比星、米托蒽醌、多柔比星、依托泊苷和替尼泊苷)；DNA小沟结合剂(例如普卡霉素(plicamydin))；抗代谢物(例如叶酸拮抗剂、例如甲氨蝶呤和三甲曲沙；嘧啶拮抗剂，例如氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、CB3717、阿扎胞苷、阿糖胞苷和氟尿苷；嘌呤拮抗剂，例如巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁；门冬酰胺酶(asparginase)；和核糖核苷酸还原酶抑制剂，例如羟基脲)；微管蛋白相互作用剂(例如长春新碱、长春碱和紫杉醇(Taxol))；激素剂(例如雌激素；共轭雌激素；炔雌醇；二乙基己烯雌酚；氯烯雌醚(chlortrianisen)；己二烯雌酚(idenestrol)；孕激素如己酸羟孕酮、甲羟孕酮和甲地孕酮；和雄激素如睾酮、丙酸睾酮、氟甲睾酮和甲基睾酮)；肾上腺皮质类固醇(例如强的松、地塞米松、甲基泼尼松龙和泼尼松龙)；亮化激素释放剂或促性腺激素释放激素拮抗剂(例如醋酸亮丙瑞林和醋酸戈舍瑞林)；和抗激素抗原(例如他莫昔芬、抗雄激素剂(例如氟他胺)；和抗肾上腺剂(例如米托坦和氨鲁米特)。优选地，化学治疗剂选自：紫杉醇(

)、顺铂、多烯紫杉醇、卡铂、长春新碱、长春碱、甲氨蝶呤、环磷酰胺、CPT-11、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、雌莫司汀、卡莫司汀、阿霉素(多柔比星)、依托泊苷、三氧化二砷、伊立替康和埃博霉素衍生物。PD-1/PD-L1定向疗法包括但不限于派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗和其他正在研发的抗PD1/PDL1抗体。

化合物或药物组合物的“治疗有效量”是指有效预防、抑制或治疗具体病症或疾病的症状的量。例如，“治疗有效量”可以指如此量，其足以调节动物，特别是人中的肿瘤生长或转移——包括但不限于减少肿瘤的生长或大小，或在施用前(即预防性施用)缺乏任何肿瘤形成的动物中防止肿瘤生长的形成。

“药学上可接受的”表示经联邦或州政府的监管机构批准，或列在用于动物，更具体是人的美国药典或其他公认药典中。

“并发地(concurrently)”是指(1)在时间上同时地，或(2)在共同治疗安排过程期间的不同时间。

“顺序地”是指施用方法的一种组分，然后施用另一种组分。在施用一种组分之后，可以在第一组分之后基本上立即施用下一种组分，或者可以在第一组分之后的有效时间段之后施用下一种组分；有效时间段是从施用第一组分中获得最大益处所花费的时间量。

“特异性结合对”包括特异性结合成员(sbm)和结合伴侣(bp)，它们对彼此具有特定的特异性(或“特异性结合”)，并且在正常条件下优先于其他分子彼此结合。特异性结合对的实例是抗原和抗体、配体和受体以及互补核苷酸序列。技术人员知道许多其他实例。进一步，术语“特异性结合对”或“特异性结合”也适用于特异性结合成员和结合伴侣中的一个或两个构成大分子的一部分的情况。在其中特异性结合对构成核酸序列的实施方式中，它们将具有在测定条件下彼此杂交的长度，优选长于10个核苷酸长度，更优选长于15或20个核苷酸长度。

通常，免疫复合物形成的检测在本领域中是众所周知的，并且可以通过应用多种方法来实现。这些方法通常基于标记或标记物的检测，例如任何那些放射性、荧光、生物和酶标签。关于使用此类标记的美国专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，各自通过引用并入本文。当然，如本领域中已知的，通过使用第二结合配体例如第二抗体和/或生物素/抗生物素蛋白配体结合布置可以发现额外的优点。

“样品”或“患者样品”或“生物样品”一般是指可以针对具体分子，优选敏感性标记物分子进行测试的样品。样品可以包括但不限于细胞、体液，其包括血液、骨髓、血清、血浆、尿液、唾液、泪液、胸膜液等。

“诊断标记物”是体内具有具体分子特征的具体生物化学物质，该具体分子特征使其可用于检测疾病、测量疾病的进展或治疗效果或用于测量目标过程。

术语“受试者”是指动物和人二者。

术语“降低”、“降低的”和“降低了”或“增加”、“增加的”和“增加了”旨在表示参数的测量值与在适合的对照中该参数的测量值相比变化至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高。

如本文所用，术语“抑制”、“抑制了”、“抑制的”、“减少的”、“减少”等指靶基因产物的表达或功能的任何降低，包括表达或功能的任何相对降低，直至包括靶基因产物的表达和功能的完全消除。

“抗体”或“抗体分子”是与具体抗原结合的任何免疫球蛋白，其包括抗体及其片段。该术语包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单结构域抗体(Dab)和双特异性抗体。如本文所用，抗体或抗体分子考虑重组产生的完整免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2、F(v)、scFv、scFv2、scFv-Fc、微体、双体、四体、单个可变结构域(例如可变重结构域、可变轻结构域)、双特异性、

分子(Affibody，Bromma，瑞典)和肽体(peptabody)(Terskikh等(1997)PNAS 94：1663-1668)。

如本文所用，术语“免疫学特异的”是指结合至目标蛋白质或化合物的一个或多个表位的蛋白质/多肽，特别是抗体，而基本上不识别和结合包含抗原性生物分子的混合群体的样品中的其他分子。

“药学上可接受的”表示经联邦或州政府的监管机构批准，或列在用于动物，尤其是人的美国药典或其他公认药典中。

“载体”是指例如稀释剂、佐剂、防腐剂(例如硫柳汞(Thimersol)、苄醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、增溶剂(例如、吐温80、聚山梨酯80)、乳化剂、缓冲液(例如Tris HCl、醋酸盐、磷酸盐)、膨胀剂(例如乳糖、甘露醇)、赋形剂、助剂或与媒介物，其与本发明活性剂一起施用。药学上可接受的载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选将水或盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液用作载体，特别是对于可注射溶液。可以将组合物并入聚合化合物例如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制品中，或并入脂质体或胶束中。这样的组合物可影响本发明的药物组合物的组分的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。本发明的药物组合物可以例如以液体形式制备，或者可以以干粉形式(例如冻干的)。适合的药物载体在下列中有描述：E.W.Martin的“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(MackPublishing Co.，伊斯顿，宾夕法尼亚)；Gennaro，A.R.，The Science and Practice ofPharmacy(Lippincott，Williams和Wilkins)；Liberman等编辑，Pharmaceutical DosageForms，Marcel Decker，纽约，纽约；和Kibbe等编辑，Handbook of PharmaceuticalExcipients，美国药学会，华盛顿。

如本文所用，术语“治疗”是指使患有疾病的患者受益的任何类型的治疗，包括改善患者的状况(例如，减轻一种或多种症状)、延缓疾病的进展和/或治愈疾病。

II.用于治疗癌症的疗法和组合物

本发明提供了药物组合物，其包括至少一种抗癌剂，优选为在药学上可接受的载体中特异性靶向PD-1/PD-L1的试剂。这样的药物组合物可以以治疗有效量施用至需要其的患者，进行癌症治疗。上文中提供了选择性靶向PD-1/PD-L1通路的试剂。

药物组合物可以进一步包含至少一种信号转导抑制剂(STI)(参见，例如，PCT/US04/05155和PCT/US04/05154)。如上所述，适合的STI包括但不限于：(i)bcr/abl激酶抑制剂，例如STI571(Gleevec)；(ii)表皮生长因子(EGF)受体抑制剂，例如激酶抑制剂(Iressa，SSI-774)和抗体(Imclone：C225[Goldstein等(1995)，Clin Cancer Res.1：1311-1318)]和Abgenix：ABX-EGF)；(iii)her-2/neu受体抑制剂，例如Herceptin^TM(曲妥珠单抗)和法尼基转移酶抑制剂(FTI)，例如L-744832(Kohl等(1995)，Nat Med.1(8)：792-797)；(iv)Akt家族激酶或Akt通路的抑制剂，例如雷帕霉素(参见例如Sekulic等(2000)Cancer Res.60：3504-3513)；(v)细胞周期激酶抑制剂，例如夫拉平度和UCN-01(参见，例如，Sausville(2003)Curr.Med.Chem.Anti-Canc Agents3：47-56)；和(vi)磷脂酰肌醇激酶抑制剂，例如LY294002(参见，例如，Vlahos等，(1994)J.Biol.Chem.269：5241-5248)。可选地，至少一种PD-1/PD-L1试剂和至少一种STI可以在单独的药物组合物中。在本发明的具体实施方式中，可以将至少一种PD-1/PD-L1试剂和至少一种STI并发地或顺序地施用至患者。换句话说，可以首先施用至少一种PD-1/PD-L1试剂，可以首先施用至少一种STI，或者可以同时施用至少一种STI和至少一种PD-1/PD-L1试剂。另外，当使用一种以上的PD-1/PD-L1试剂和/或STI时，可以以任何顺序施用化合物。

本发明的药物组合物可以进一步包括至少一种化学治疗剂。上文描述了适合的化学治疗剂。优选的化学治疗剂包括但不限于：紫杉醇(

)、顺铂、多烯紫杉醇、卡铂、长春新碱、长春碱、甲氨蝶呤、环磷酰胺、CPT-11、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、雌莫司汀、卡莫司汀、阿霉素(多柔比星)、依托泊苷、三氧化二砷、伊立替康和埃博霉素衍生物。在具体实施方式中，化学治疗剂是紫杉醇。作为可选方案，至少一种化学治疗剂和至少一种PD-1/PD-L1试剂可以在分开的药物组合物中。

可以使用本方案治疗的癌症包括但不限于：黑素瘤、肺癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胃癌、淋巴瘤、梅克尔细胞癌、具有错配修复缺陷的癌症或可以用抗PD-1/PDL-1疗法治疗的其他癌症。其他癌症包括但不限于胶质母细胞瘤、间皮瘤、肾细胞癌、胃癌、肉瘤、绒毛膜癌、皮肤基底细胞癌和睾丸精原细胞瘤。

III.药物组合物和化合物的施用

本发明的药物组合物可以通过任何适合的途径施用，例如通过注射、口服、肺部、外部或其他施用模式。一般地，本发明的药物组合物包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体等等。这样的组合物可以包括多种缓冲内容物(例如，TrisHCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂，例如清洁剂和增溶剂(例如吐温80、聚山梨酯80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(例如硫柳汞(Thimersol)、苄醇)和膨胀剂(例如乳糖、甘露醇)。可以将组合物并入聚合化合物例如聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制品中，或并入脂质体中。这样的组合物可影响本发明药物组合物的组分的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见，例如，Remington's PharmaceuticalSciences，第18版(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)第1435-1712页，其通过引用并入本文。本发明的药物组合物可以例如以液体形式制备，或者可以以干粉形式(例如冻干的)。

在仍另一实施方式中，本发明的药物组合物可以在控释系统中递送，例如使用静脉内输注、可植入的渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其他施用模式。在具体实施方式中，可以使用泵(参见Langer，同上；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.(1987)14：201；Buchwald等，Surgery(1980)88：507；Saudek等，N.Engl.J.Med.(1989)321：574)。在另一实施方式中，可以使用聚合物材料(参见Medical Applications of Controlled Release,Langer andWise(eds.),CRC Press:Boca Raton,Florida(1974)；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley:New York(1984)；Ranger and Peppas,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.(1983)23:61；也参见Levy et al.,Science(1985)228:190；During et al.,Ann.Neurol.(1989)25:351；Howard et al.,J.Neurosurg.(1989)71:105)。在仍另一实施方式中，可将控释系统放置在动物的靶组织附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson,Medical Applications of Controlled Release，上文，(1984)第2卷，115-138)。具体地，可以在不适当的免疫激活或肿瘤的位点附近将控释装置引入动物中。Langer在综述(Science(1990)249：1527-1533)中讨论了其他控释系统。

IV.试剂盒和制造物品

提供了包括用于实践本文公开的方法的组分和试剂的试剂盒。可以将上述任何产品并入试剂盒，其可包含对本文所列癌症和免疫蛋白免疫学特异性的抗体——包括但不限于PD-1/PD-L1、IFNγ、Akt、Wnt5A、MAPK1、HSP70、TRAP1、HSP90、SerpinH1、VEGFC、R-RAS、HLA-G5、BRAF、NRAS、KIT、TP53、PTEN、EGFR、HER2、ALK、AKT1、KRAS、MET、RET、RHOA、ARID1A、CDH1、CD109、CD151、CD276、CD44、CD46、CD47、CD55、CD58、CD59、CD70、CD9、CD95、CD97、CD99、B7H4、CD63、CD81、CD3、CD4、CD8、CD11、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD25、CD27、CD38、CD45、CD68、CD80、CD86、CD138、CD152、CD160、CD223、CD244、CD274、CD276和CD366；或一种或多种固定在固相支持物上的抗体、寡核苷酸、多肽、肽、抗体、非天然存在的可检测标记、阳性对照标记物或报道分子、药学上可接受的载体、生理学上可接受的载体、使用说明、收集容器、施用器皿、测定底物或其任何组合。

提供以下实施例以说明本发明的某些实施方式。不旨在以任何方式限制本发明。

实施例1

材料和方法

细胞培养物

将人黑素瘤细胞系MEL624、PD-L1/MEL624、WM1552C、WM35、WM902B、WM793、UACC-903、WM9、A375和WM164在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)(Invitrogen)的RPMI 1640培养基(Invitrogen)中培养。小鼠黑素瘤B16-F10细胞在补充有10％(v/v)FBS的DMEM(Sigma)中培养。为了用IFN-γ刺激，将细胞与100ng/ml的重组人IFN-γ(Peprotech)一起温育48小时。

稳定的Hrs或PD-L1敲低黑素瘤细胞的生成

使用利用病毒包装质粒共转染的293T细胞，将针对人HRS(HGS)(NM_004712，GCACGTCTTTCCAGAATTCAA，SEQ ID NO：1)、鼠PD-L1(Cd274)(NM_021893，GCGTTGAAGATACAAGCTCAA；SEQ ID NO：2)或加扰的shRNA对照(Addgene)的短发夹RNA(shRNA)包装到慢病毒颗粒中。转染后48-72小时收获慢病毒上清液。用过滤的慢病毒感染细胞并通过2μg/ml嘌呤霉素进行选择。

患者和标本收集

招募了30例患有III至IV期黑素瘤的患者(表1)，进行在宾夕法尼亚大学(Penn)的Expanded Access Program(http://clinicaltrials.gov标识符NCT02083484)下，以派姆单抗(每3周输注2mg/kg)或市售Keytruda的治疗。患者同意根据机构审查委员会(IRB协议#703001)在宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心的黑素瘤研究计划组织收集协议UPCC08607下进行血液收集。在每3周每次派姆单抗输注之前在肝素钠试管中获得外周血，持续12周。如先前所述(Huang等，2017)，以双盲方式独立进行临床反应的评估。使用一维测量，基于免疫相关的RECIST(irRECIST)将临床反应确定为最佳反应。

表1.患者的人口统计学和基本特征

患者PBMC和体外培养的肿瘤细胞的流式细胞术

使用聚蔗糖(ficoll)梯度分离外周血单核细胞(PBMC)，并使用标准方案进行存储。如前所述(Huang等，2017)，将来自治疗前、第1-4周期(第3-12周)的冷冻保存的PBMC样品融化并通过流式细胞术进行分析。简而言之，使用活/死固定的Aqua死细胞染色试剂盒(Life Technologies)进行活/死细胞鉴别。细胞表面染色在4℃下进行30分钟。使用固定/透化试剂盒(eBioscience)后，在冰上进行细胞内染色60分钟。

为了分析PD-L1在培养的黑素瘤细胞上的表面表达水平，将细胞在PBS中用1％FBS稀释的荧光团标记的抗PD-L1抗体在冰上染色30分钟。为了对表面和细胞内PD-L1二者进行染色，首先将细胞用荧光团标记的抗PD-L1抗体在冰上染色30分钟。之后，洗涤表面染色的细胞，然后固定并透化，然后在冰上用荧光团标记的抗PD-L1抗体染色60分钟。通过从仅表面染色的细胞的MFI中减去完全染色细胞的平均荧光强度(MFI)，计算PD-L1蛋白的细胞内水平。所有数据采集均在BD Biosciences LSR II流式细胞仪上进行，并使用FlowJo软件(TreeStar)进行分析。

外泌体的纯化

为了从细胞培养上清液中纯化外泌体，将细胞在补充有10％外泌体耗尽的FBS的培养基中培养。通过以100,000g过夜离心耗尽牛外泌体。从48-72小时的细胞培养物中收集上清液，并通过标准差速离心方案(8-10)纯化外泌体。简而言之，将培养上清液以2,000g离心20分钟，以去除细胞碎片和死细胞(Beckman Coulter，Allegra X-14R)。然后将上清液以16,500g离心45分钟(Beckman Coulter，J2-HS)以去除较大的囊泡。通过在4℃下以100,000g对上清液进行超速离心(Beckman Coulter，Optima XPN-100)2小时来沉淀外泌体。将沉淀的外泌体悬浮在PBS中，并在4℃下以100,000g超速离心2小时收集。

为了通过差速离心纯化循环的外泌体，将来自黑素瘤患者或健康供体的静脉柠檬酸盐血以1,550g离心30分钟，以获得无细胞血浆(Beckman Coulter，Allegra X-14R)。然后将1ml获得的血浆以16,500g离心45分钟，以去除较大的囊泡(Eppendorf，5418R)。将收集的上清液将在4℃下以100,000g离心2小时(Beckman Coulter，OptimaTM MAX-XP)以沉淀外泌体。将外泌体沉淀悬浮在PBS中，并在4℃下以100,000g超速离心2小时收集。为了使用外泌体分离试剂盒纯化循环的外泌体，首先通过以16,500g离心45分钟(Eppendorf，5418R)将100μl的无细胞血浆预清除大的膜囊泡。然后使用外泌体分离试剂盒(Invitrogen，目录号4484450)从上清液中纯化外泌体。

纯化的外泌体的表征

为了利用流式细胞术进行表征，将纯化的外泌体(25μg)与20μl CD63包被的磁珠(Invitrogen，目录号10606D)在具有0.1％牛血清白蛋白(BSA)的100μl PBS中的溶液中一起温育，在4℃下搅拌过夜。然后洗涤外泌体包被的珠子，并与荧光团标记的抗体一起温育，然后在LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。

为了使用电子显微镜验证纯化的外泌体，将悬浮在PBS中的纯化的外泌体滴到聚乙烯醇缩甲醛(formvar)碳涂覆的镍网格上。用2％乙酸铀酰染色后，将网格风干并使用JEM-1011透射电子显微镜显现。为了免疫金标记，将悬浮在PBS中的纯化的外泌体置于聚乙烯醇缩甲醛碳涂覆的镍网格上、封闭并与识别PD-L1(克隆5H1-A3)胞外结构域的小鼠抗人单克隆抗体一起温育(Dong等，2002)，然后与缀合蛋白A-金颗粒(5nm)的抗小鼠二抗一起温育。每个染色步骤之后进行五次PBS洗涤和十次ddH₂O洗涤，然后用2％乙酸铀酰进行对比染色。

使用装配有快速视频捕获和粒子跟踪软件的NanoSight NS300(MalvernInstruments)确定外泌体的大小。

对于碘克沙醇密度梯度离心，将通过差速离心收集的外泌体加样到不连续的碘克沙醇梯度(通过用在10mM Tris中的0.25M蔗糖稀释60％的OptiPrep^TM碘克沙醇水溶液制成的5％、10％、20％和40％)的顶部和在4℃下以100,000g离心18小时。从梯度的顶部收集了十二个等体积的级分，外泌体分布在1.13至1.19g/ml之间的密度范围，正如先前所证实的(Thery等，2006；Colombo等，2014；Tibes等，2006年)。通过在4℃下以100,000g超速离心2小时进一步沉淀外泌体。

由细胞培养上清液中免疫沉淀PD-L1蛋白

为了分析黑素瘤细胞分泌的PD-L1蛋白，在FBS耗尽的RPMI 1640培养基中，以IFN-γ(100ng/ml)处理WM9细胞48小时。收集培养上清液，并以2,000g离心20分钟，然后以16,500g离心45分钟。为了进一步外泌体分离，将上清液在4℃下以100,000g进行超速离心2小时。为了免疫沉淀PD-L1蛋白，将浓缩的上清液与5μg/ml小鼠抗人5H1-A3单克隆抗体和蛋白A/G琼脂糖在4℃下一起温育过夜。将免疫沉淀的蛋白质加样到12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，并转移到硝酸纤维素膜上。在室温下用5％脱脂牛奶将印迹封闭1个小时，并在4℃下与分别靶向PD-L1的胞内结构域(Cell Signaling Technology，目录号13684)和胞外结构域(Cell Signaling Technology，目录号15165)的两种不同的兔抗人单克隆抗体一起温育过夜，然后与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗兔二抗(Cell Signaling Technology，目录号7074)一起在室温下温育1小时。印迹用ECL检测试剂(Pierce)显影。

ELISA

为了检测外泌体PD-L1，将ELISA板(96孔)(Biolegend)每孔(100μl)包被0.25μg的抗PD-L1单克隆抗体(克隆5H1-A3)，在4℃下过夜。在室温下用200μl封闭缓冲液(Pierce)封闭游离结合位点1小时。然后将100μl从血浆或细胞培养上清液中纯化的外泌体样品添加到每个孔中，并在4℃下温育过夜。添加生物素化的单克隆PD-L1抗体(克隆MIH1，eBioscience)，并在室温下温育1小时。然后添加每孔总共100μl在含0.1％BSA的PBS中稀释的辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素(BD Biosciences)，并在室温下温育1小时。将板用四甲基联苯胺(Pierce)显影，并使用0.5N的H₂SO₄终止。用BioTek酶标仪在450nm下读板。使用重组人PD-L1蛋白(R&D Systems，目录号156-B7)制作标准曲线。重组P-选择素蛋白(R&DSystems，目录号137-PS)和小鼠PD-L1蛋白(R&D Systems，目录号1019-B7)用作阴性对照，以验证检测特异性。标准曲线的结果表明，所建立的ELISA呈现出0.2至12ng/ml的可靠线性检测范围。

PD-1-PD-L1结合测定

为了测试外泌体PD-L1与PD-1的结合，通过在4℃过夜温育，将100μl不同浓度的外泌体样品捕获到PD-L1抗体(克隆5H1-A3)包被的96孔ELISA板上。然后加入100μl的4μg/ml生物素标记的PD-1蛋白(BPS Bioscience，目录号71109)并在室温下温育2小时。然后添加每孔总共100μl在含0.1％BSA的PBS中稀释的辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素(BDBiosciences)，并在室温下温育1小时。将板用四甲基联苯胺(Pierce)显影，并使用0.5NH₂SO₄终止。用BioTek酶标仪在450nm下读板。直接包被在板上的重组人PD-L1蛋白被用作阳性对照。

CD8 T细胞介导的肿瘤细胞杀伤试验

为了确定黑素瘤细胞来源的外泌体对CD8 T细胞杀伤肿瘤细胞的能力的影响，首先用PBS(作为对照)或具有或不具有IgG同种型或PD-L1抗体阻断的情况下的黑素瘤细胞来源的外泌体预处理抗CD3/CD28刺激的CD8 T细胞。然后将用不同预处理的CD8 T细胞与黑素瘤MEL624细胞在12孔板中以10：1的效应子与靶标(E：T)比率共培养96小时。然后将孔用PBS洗涤以除去T细胞，并且将存活的肿瘤细胞固定并通过结晶紫染色显现。将干燥的板成像并使用ImageJ定量强度。

用外泌体治疗CD8 T细胞

为了在外泌体表面上阻断PD-L1，将纯化的外泌体与PD-L1阻断抗体或IgG同种型抗体在100μl的PBS中温育，然后用30ml PBS洗涤并通过超速离心沉淀以去除未结合的游离抗体。用抗CD3(2μg/ml)和抗CD28(2μg/ml)抗体刺激人外周T细胞或小鼠脾T细胞48小时，然后在具有或不具有PD-L1阻断的情况下与人黑素瘤细胞来源的外泌体或小鼠B16-F10细胞来源的外泌体一起温育36-72小时。然后收集细胞，染色，并通过流式细胞术分析。

反相蛋白质阵列(RPPA)

RPPA在MD安德森癌症中心核心研究室进行，每个样品使用50μg蛋白。所有抗体均通过蛋白质印迹法验证(Tibes等，2006)。

免疫荧光染色

在固定的细胞或福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)切片上进行免疫荧光染色。对于固定的细胞，先用0.1％的Triton X-100进行透化，然后用牛血清白蛋白(BSA)缓冲液封闭1小时。对于FFPE切片，在封闭前通过在柠檬酸盐缓冲液(pH＝6.0)中蒸煮进行抗原修复(antigen retrieval)。将固定的细胞或FFPE切片与一抗在4℃下温育过夜，然后与荧光团缀合的二抗温育1小时。细胞核用DAPI染色。使用Leica荧光显微镜以63x放大观察样品。

蛋白质印迹分析

使用12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离全细胞裂解物或外泌体蛋白质，并将其转移到硝酸纤维素膜上。印迹用5％脱脂奶粉在室温下封闭1小时，然后在4℃下与相应的一抗在供应商推荐的稀释度下温育过夜，然后与HRP缀合的二抗(Cell SignalingTechnology)在室温下温育1小时。膜上的印迹用ECL检测试剂(Pierce)显影。

小鼠体内研究

根据宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行所有动物实验。为了在裸小鼠中建立人黑素瘤异种移植模型，将WM9细胞(在100μm培养基中5×10⁶个细胞)注入8周龄雌性无胸腺裸小鼠的侧腹。使用数显卡尺测量肿瘤，并通过式(宽度)²x长度/2计算肿瘤体积。细胞接种后30天或者在30天之前肿瘤的最长尺寸达到2.0cm，对小鼠实施安乐死。在安乐死后，立即通过心脏穿刺收集血液样品，并纯化和使用上述方法通过ELISA检测外泌体。从没有异种移植的性别、年龄和体重匹配的健康裸小鼠中纯化的外泌体用作对照。

为了在C57BL/6小鼠中建立同系小鼠黑素瘤模型，将B16-F10细胞或B16-F10 PD-L1-KD细胞(100μl培养基中5×10⁵个细胞)皮下注射到具有免疫活性的C57BL/6小鼠中。细胞接种后，每3天进行尾静脉注射外泌体(100μg于100μl的PBS中)。每3天对小鼠称重。使用数显卡尺测量肿瘤，并通过公式(宽度)²x长度/2计算肿瘤体积。在肿瘤的最长尺寸达到2.0厘米之前对小鼠实施安乐死。对于流式细胞术，收集脾脏和肿瘤样品，制备单细胞悬液，并使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。

统计分析

RPPA数据分析根据M.D.安德森癌症中心的协议进行。具体而言，通过从载玻片(抗体)的“标准曲线”(超曲线(supercurve))中插值(interpolation)每个稀释曲线来确定每个样品的相对蛋白质水平。超曲线由RPPA核心研究室编写的R脚本构建。这些值定义为超曲线Log2值。对于蛋白质加样，对所有数据点进行标准化，并转化为线性值，称为“归一化线性”。将“归一化线性”值转换为Log2值，然后以中位数居中进行进一步分析。通过减去给定蛋白质中所有样品的中位数来确定中位数居中值(Median-Centered value)。所有上述过程都由RPPA核心研究室执行。RPPA核心研究室提供的归一化数据通过Cluster 3.0(http://bonsai.ims.u-tokyo.ac.jp/～mdehoon/software/cluster/)进行分析，并使用Java TreeView1.0.5(http://jtreeview.sourceforge.net/)进行显现。

使用6.0版的GraphPad Prism进行所有其他统计分析。正态分布由D'Agostino-Pearson综合正态性检验确定，并且组间差异由F-检验评估。对于正态分布的数据，使用双尾配对或未配对的学生t-检验确定均数差异的显著性；对于方差不同的组，进行了采用Welch校正的未配对t-检验。对于非正态分布的数据，分别使用非参数Mann-Whitney U-检验或Wilcoxon匹配对检验进行未配对和配对分析。相关性由Pearson的r系数确定。双向方差分析用于比较不同组之间的小鼠肿瘤体积数据。对数秩和Wilcoxon检验用于分析小鼠存活数据。图形数据中显示的误差线表示平均值±s.d.。P<0.05的双尾数值被认为是统计学上显著的。

结果

外泌体是细胞分泌的50-120nm直径的脂质包裹的囊泡。外泌体携带生物活性分子，其在局部和循环中起作用，以影响细胞外环境和免疫系统(Becker等，2016；Kalluri，2016)。为了理解外泌体在黑素瘤进展中的作用，我们分析了从一组人原发性和转移性黑素瘤细胞系中释放的外泌体。外泌体通过差速离心从细胞培养上清液中纯化，这是纯化外泌体并将其与脱落囊泡和凋亡小体分离的标准方法(Colombo等，2014；Peinado等，2012；Thery等，2006)。通过透射电子显微镜(TEM)和基于光散射的纳米颗粒跟踪分析(图1A-1B)，纯化的外泌体证实为50-120nm直径的膜结合囊泡。纯化的外泌体携带的蛋白质随后通过反相蛋白质阵列(RPPA)进行分析，RPPA是大规模的基于抗体的定量蛋白质组学技术(Tibes等，2006)。RPPA揭示PD-L1大量存在于外泌体中，与原发性黑素瘤细胞相比，其在源自转移性黑素瘤细胞的外泌体中的水平显著更高(图1C、图2A)，这表明PD-L1的外泌体分泌与黑素瘤的进展相关。RPPA结果通过蛋白质印迹验证，其在转移性黑素瘤细胞分泌的外泌体中检测到高水平的PD-L1(图1D)。使用碘克沙醇密度梯度离心，我们进一步确认PD-L1与外泌体共分级(图1E)，该外泌体漂浮在1.13至1.19g/ml范围的密度下，如先前报道(Colombo等，2014；Melo等，2015；Thery等，2006)。除人类细胞外，小鼠转移性黑素瘤B16-F10细胞也分泌外泌体，这些外泌体携带高水平的PD-L1(图2B)。

肿瘤细胞表面PD-L1可以响应活化的T细胞分泌的IFN-γ而被上调，PD-L1通过其胞外结构域与PD-1结合以使T细胞失活(Chen&Han，2015；Garcia-Diaz等，2017；Ribas等，2016)。使用免疫电子显微镜(图1F)、流式细胞术(图1G)和酶联免疫吸附测定(ELISA)(图1H-1I)，我们发现外泌体PD-L1具有与细胞表面PD-L1相同的膜拓扑，其胞外结构域暴露在表面上。这种膜拓扑允许外泌体PD-L1以浓度依赖的方式结合PD-1，类似于肿瘤细胞表面PD-L1，并且这种相互作用可以被PD-L1阻断抗体破坏(图1J)。我们进一步发现，在IFN-γ治疗后，黑素瘤细胞分泌的外泌体PD-L1水平显著增加，并且相应地，这些外泌体显示出对PD-1的结合能力增强(图1G-1K)。与肿瘤细胞表面PD-L1相比，IFN-γ介导的外泌体PD-L1诱导可能充当肿瘤细胞适应免疫压力的更有效手段，这将在后面讨论。

外泌体通过限定的细胞内运输途径生成和释放(Colombo等，2014；Kalluri，2016；Thery等，2006)。因此，我们通过免疫荧光检查了PD-L1在黑素瘤细胞中的定位。PD-L1与外泌体标记物CD63(图1L)和ESCRT亚基Hrs(图2C)共定位，其介导了外泌体货物的识别和分类(Schmidt&Teis，2012)。如通过蛋白质印迹和流式细胞术所测量的(图1M、图2D)，HRS的敲低导致分泌的外泌体中PD-L1水平的降低和全细胞裂解物中PD-L1的伴随增加。由于Hrs介导将泛素化货物分类到外泌体中(Schmidt&Teis，2012)，并且PD-L1的群体显示在细胞中被泛素化(Horita等，2017；Lim等，2016)，因此我们测试了PD-L1是否与Hrs相互作用。实际上，PD-L1与来自细胞裂解物的Hrs共免疫沉淀(图1N)。这些数据表明外泌体分泌PD-L1的ESCRT依赖通路。

为了测试黑素瘤细胞是否分泌其他形式的PD-L1，我们从黑素瘤细胞培养上清液中免疫沉淀PD-L1蛋白。使用分别靶向PD-L1的胞外结构域(ECD)和胞内结构域(ICD)的两种不同的单克隆抗体进行的蛋白质印迹检测到大多数免疫沉淀的PD-L1蛋白为45kD(图2E)，其为全长糖基化膜结合PD-L1的分子量(Li等，2016)。这与先前来自细胞培养上清液中的PD-L1的表征(Chen等，2011；Frigola等，2011)一致。抗ECD的抗体还检测到较小比例的40kD的PD-L1，这可能是从细胞表面裂解的PD-L1蛋白，或者可选地是剪接的缺少ICD和跨膜结构域的PD-L1蛋白(Zhou等，2017)。

接下来，我们在裸小鼠中建立人黑素瘤异种移植物，以测试体内黑素瘤细胞的外泌体PD-L1的分泌。收集来自有或没有人黑素瘤异种移植物的小鼠的血液样品，用于外泌体纯化和随后通过ELISA检测人PD-L1蛋白(图3A)。靶向人PD-L1(图4A-4B)的胞外结构域的单克隆抗体特异性鉴定了在从携带人黑素瘤异种移植物的小鼠而非对照小鼠中分离的循环的外泌体上的人PD-L1(图3B、图4C-4D)。此外，在携带人异种移植物的小鼠中，循环的外泌体PD-L1的水平与肿瘤大小正相关(图3C)。

最近，已经在癌症患者的血液样品中发现了PD-L1(Finkelmeier等，2016；Frigola等，2011；Rossille等，2014；Zhou等，2017)。为了研究血液中的PD-L1是否由外泌体携带，从具有转移性黑素瘤的患者的血浆中纯化循环的外泌体，并通过TEM(图3D)和碘克沙醇密度梯度离心法(图4E)进行验证。PD-L1蛋白与循环的外泌体和黑素瘤特异性外泌体标记物TYRP-2共分级(Peinado等，2012)(图4E)。蛋白质印迹分析证实了在源自所有测试患者的循环外泌体中PD-L1的存在(图3E)。一致地，在纯化的循环外泌体上的PD-L1的ELISA显示外泌体PD-L1占患者血浆中总循环PD-L1的约66％(图3F)。这些结果证实，具有转移性黑素瘤的患者的大部分循环PD-L1携带在外泌体上。

使用ELISA，我们还发现来自具有转移性黑素瘤的患者的循环外泌体上的PD-L1水平比来自健康供体的PD-L1水平约高5倍(P＜0.001)(图6G)。接收者操作特征(ROC)曲线表明，循环的外泌体PD-L1的水平将黑素瘤患者与健康供体区分开，曲线下面积(AUC)为0.95，敏感性为93.33％，特异性为100％(图3H)。具有可测量的肿瘤负荷的黑素瘤患者中循环的外泌体PD-L1的水平显著高于无疾病征兆(NED)的阶段匹配的黑素瘤患者中的水平(图3I)。这些结果暗示循环的外泌体PD-L1水平升高对具有转移性黑素瘤的患者是功能上重要的。

PD-L1介导的免疫抑制的当前模型基于肿瘤细胞表面上的PD-L1与T细胞上的PD-1之间的相互作用。这种相互作用递送抑制信号，其诱导了T细胞的功能性“衰竭”或凋亡(Chen&Han，2015；Dong等，2002；Topalian等，2016)。由于外泌体PD-L1具有与肿瘤细胞表面PD-L1相同的膜拓扑，并且可以与PD-1结合(图1F-1J)，因此我们测试了它是否能够抑制CD8T细胞。首先，我们利用了不表达内源性PD-L1以及其他免疫抑制蛋白(例如FasL和TRAIL)的黑素瘤细胞系MEL624细胞(Dong等，2002)。与从不具有内源性PD-L1的亲本MEL624细胞纯化的外泌体相反(图5A-5D)，富含PD-L1的外泌体来源于表达PD-L1的MEL624细胞(“PD-L1/MEL624”)显著抑制了活化的人CD8 T细胞，正如增殖标记物Ki-67和细胞毒性蛋白颗粒酶B(GzmB)的表达降低所证明的(图6A)。用抗PD-L1抗体预处理外泌体几乎消除了这种作用。除了PD-L1/MEL624细胞外，表达内源性PD-L1(图1C-1K)的人黑素瘤WM9细胞分泌的外泌体也诱导了活化的人CD8 T细胞中Ki-67和GzmB表达的显著降低(图7A)。使用抗PD-L1或抗PD-1抗体阻断外泌体PD-L1与T细胞PD-1之间的相互作用可显著减弱对PD-1⁺CD8 T细胞的抑制作用，但对PD-1^-CD8细胞的作用可忽略不计(图6B-6C、图7B)。使用与源自小鼠黑素瘤B16-F10细胞的外泌体一起温育的小鼠脾CD8 T细胞观察到类似的效果(图8A)。延长外泌体治疗的CD8 T细胞经历凋亡，其在PD-1⁺CD8 T细胞中更为明显；PD-L1阻断抗体显著减弱了该作用(图6D、图8B-8C)。此外，使用肿瘤细胞杀伤试验，我们进一步证明用来源于PD-L1/MEL624和WM9细胞而不是亲本MEL624细胞的外泌体预处理CD8 T细胞显著抑制其杀死MEL624细胞的能力(图6E-6F、图7C)。这些数据表明，黑素瘤来源的外泌体PD-L1通过抑制CD8 T细胞的增殖和细胞毒性并诱导凋亡而在体外抑制CD8 T细胞。

为了检查外泌体PD-L1在体内的作用，在具有免疫活性的C57BL/6小鼠中建立了同系小鼠B16-F10黑素瘤模型。由于B16-F10细胞分泌携带PD-L1的外泌体(图2B)，这可能掩盖了外源施加的外泌体的作用，因此我们用慢病毒shRNA敲低了B16-F10细胞中的内源性PD-L1(“B16-F10 PD-L1-KD”)(图9A-9B)。在C57BL/6小鼠中，PD-L1的敲低显著抑制了B16-F10肿瘤生长(图9C)，并延长了它们的总生存期(图9D)。源自亲本B16-F10细胞的外泌体的注射显著促进了B16-F10 PD-L1-KD肿瘤的生长(图6G、图9E)，并缩短了小鼠的总生存期(图6H-6I)。然而，用抗PD-L1抗体而不是IgG同种型抗体预处理外泌体保护了小鼠免受肿瘤生长并延长了它们的总生存期(图6G-6I、图9E)。为了更好地了解观察到的效应的机制，我们检查了CD8肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的频率和表型。肿瘤的免疫荧光染色显示，注射B16-F10外泌体后，CD8 TIL的数量显著减少；用抗体阻断外泌体PD-L1减弱了该作用(图6J-6K)。流式细胞仪分析显示，外泌体处理导致CD8 TIL的增殖减少，这通过PD-L1阻断得以挽救(图6L)。这些数据表明，外泌体PD-L1抑制CD8 T细胞，并从而促进肿瘤进展。

接下来，我们试图了解外泌体PD-L1是否具有全身性免疫抑制作用。我们对携带B16-F10PD-L1-KD肿瘤的小鼠的脾T细胞进行表型分型。B16-F10外泌体显著降低了增殖性脾PD-1⁺CD8 T细胞的比例，而用PD-L1阻断抗体进行的预处理则减弱了这种作用(图6L)。这些数据表明，外泌体PD-L1全身性抑制抗肿瘤免疫力。

由于外泌体PD-L1介导免疫抑制，并且可以通过ELISA在患者血液中进行评估(图3F-3I)，因此我们着手检查循环的外泌体PD-L1的水平是否与具有转移性黑素瘤的患者中对抗PD-1疗法的临床反应相关。在对于抗PD-1抗体派姆单抗无反应的患者中，循环的外泌体PD-L1的治疗前水平显著更高(图10A)。ROC分析表明，治疗前循环的外泌体PD-L1水平将分开对于派姆单抗的反应者和无反应者，AUC为0.885，敏感性为94.74％，特异性为81.82％(图10B)。大于1.41ng/ml的治疗前循环的外泌体PD-L1水平与客观缓解率(ORR)较差的临床结果相关(图10C)。由于IFN-γ上调外泌体PD-L1(图1G-1K)，并且我们最近的数据显示，对派姆单抗无反应的患者中，IFN-γ的治疗前水平显著更高(Huang等，2017)，我们测试了循环的外泌体PD-L1和IFN-γ之间是否存在相关性。实际上，循环的外泌体PD-L1的水平与循环的IFN-γ的水平正相关(图10D)。这些结果表明，治疗前较高水平的循环的外泌体PD-L1是抗PD-1疗法预后不良的指标。

接下来，在我们的临床试验中，我们检查了接受派姆单抗疗法的患者中的循环的外泌体PD-L1。在派姆单抗治疗期间，循环的外泌体PD-L1的水平显著增加，在第6周达到峰值(图10E)。然而，仅对于临床反应者观察到了这种作用(图10F)。然后，我们在这些临床反应者中检查了外泌体PD-L1和CD8 T细胞恢复活化(re-invigoration)之间的关系。与我们之前的研究类似(Huang等，2017)，CD8 T细胞的增殖和恢复活化在第3周达到峰值，并且是在第6周外泌体PD-L1达到峰值之前(图10G)。此外，对于临床反应者，PD-1⁺CD8 T细胞中Ki-67的绝对值和倍数变化二者与循环的外泌体PD-L1的Ki-67绝对值和倍数变化正相关(图10H-10I)。我们预测循环的外泌体PD-L1的治疗中增加的幅度是肿瘤细胞对T细胞恢复活化的适应性反应的潜在指标，并且似乎与临床结果有关。实际上，临床反应者在治疗6周时循环的外泌体PD-L1水平有更大的增加(图10J)。ROC分析确定了通过对派姆单抗的临床反应，在第6周循环的外泌体PD-L1的增加幅度将患者分层，其具有0.96的AUC，展现92.31％的敏感性和100％的特异性(图10K)。在临床反应者中循环的外泌体PD-L1的治疗中显著增加遵循治疗中的T细胞恢复活化，并与其正相关，这反映了肿瘤对由抗PD-1疗法产生的免疫恢复活化的适应性反应。我们的发现与以前的研究一致，表明肿瘤PD-L1响应于PD-1阻断诱导的免疫恢复活化和IFN-γ产生的适应性表达与阳性预后相关(Herbst等，2014；Shin等，2017；Zaretsky等，2016)。

基于细胞生物学、免疫学和临床研究，我们提出了PD-L1/PD-1检查点介导的肿瘤免疫逃避的改良模型(图11)。除了直接与肿瘤细胞CD8 T细胞相互作用之外，黑素瘤细胞还分泌PD-L1外泌体，这些外泌体起着前线步兵(frontline infantry)的作用，以与肿瘤微环境和循环中的CD8 T细胞相互作用，以便全身性地与抗肿瘤免疫作战。由于单个肿瘤细胞可以释放多个拷贝的外泌体(Peinado等，2012)，因此外泌体与T细胞之间的相互作用为肿瘤细胞抑制免疫系统提供了非常有效的手段。由于抗PD-L1和PD-1抗体二者均可阻断外泌体PD-L1介导的T细胞抑制(图6A-6J、图7-9)，因此新模型还提高了如此可能性：破坏外泌体PD-L1和T细胞PD-1之间相互作用是参与当前的基于PD-L1/PD-1阻断疗法的先前未被认知的机制，并可能为最近的观察结果提供解释，即肿瘤表面上没有PD-L1表达的癌症患者的子集仍然可以从抗PD-1/PD-L1疗法中受益(Larkin等，2015；Patel&Kurzrock，2015)。我们还发现，肿瘤细胞分泌的外泌体上PD-L1的水平被IFN-γ上调。虽然T细胞分泌的IFN-γ已显示出上调肿瘤细胞表面PD-L1的表达作为适应性反应(Chen&Han，2015；Garcia-Diaz等，2017；Topalian等，2016)，但是响应于IFN-γ的外泌体上的PD-L1增加将使免疫检查点功能以较少空间限制的方式进行。考虑到外泌体PD-L1主要靶向PD-1⁺CD8 T细胞，该PD-1⁺CD8 T细胞代表分泌IFN-γ的抗原经历的T细胞，因此外泌体PD-L1的水平可能反映了肿瘤与免疫细胞之间的动态相互作用。除PD-L1之外，其他蛋白质也可能有助于由黑素瘤来源的外泌体诱导的免疫抑制作用。例如，先前报道了肿瘤细胞分泌的外泌体携带FasL，FasL可通过一般的凋亡通路抑制CD8 T细胞(Andreola等，2002；Taylor等，2003)。但是，PD-L1将使外泌体能够主要靶向PD-1⁺CD8 T细胞，从而使肿瘤细胞可以更有效地抵消免疫压力。

我们的临床研究表明，在进行派姆单抗治疗之前和治疗中循环的外泌体PD-L1可能反映了不同的抗肿瘤免疫状态。治疗前的水平可能反映了外泌体PD-L1在免疫功能障碍和调节异常中的重要作用。治疗前外泌体PD-L1低于临界水平的患者可能对抗PD-L1/PD-1疗法产生反应，而外泌体PD-L1在临界水平或其以上的患者将显示无反应。可能的是较高水平的外泌体PD-L1可能会将患者T细胞“衰竭”至不可能通过治疗克服的临界点(breakingpoint)。然而，对于外泌体PD-L1治疗中的水平，其增加将反映通过抗PD-1疗法引起的成功的抗肿瘤免疫力的存在。尽管响应于IFN-γ，外泌体或肿瘤细胞上PD-L1的升高使肿瘤细胞能够适应性地使CD8 T细胞失活，但在治疗期间这是无用的，因为PD-L1/PD-1相互作用被派姆单抗阻断。对于无反应者，不可观察到外泌体PD-L1的增加。先前的研究表明，无反应者中的肿瘤细胞可能已经适应性地下调了其对IFN-γ的反应，以避免抗原呈递的有害增加并逃避IFN-γ诱导的抗增殖作用(Shin等，2017；Zaretsky等，2016)。

我们的研究提供了将循环的外泌体PD-L1用作抗PD-1疗法的临床结果的早期治疗中预测指标的原理(图12A-12B)。它还阐明了一些患者中抗PD-1疗法失败的可能原因(图12C)。肿瘤PD-L1已被建议作为对抗PD-1疗法的临床反应的预测性生物标记物(Patel&Kurzrock，2015；Reck等，2016)。考虑到在肿瘤中PD-L1表达的异质性和动态性质，以及在治疗过程期间难以通过重复的肿瘤活检来跟踪PD-L1的变化，开发外泌体PD-L1作为基于血液的生物标记物提供了用于监测抗PD-1疗法的疗效以及对外泌体介导的癌细胞免疫逃避进行未来机械解剖的具有吸引力的选择。

基于PD-L1/PD-1阻断的免疫疗法已显示出治疗包括转移性黑素瘤在内的多种类型实体瘤的更大希望(Chen和Han，2015；Topalian等，2016)。但是，只有少数患者对该疗法有反应(Ribas等，2016；Zaretsky等，2016)。更好地了解黑素瘤细胞利用PD-L1/PD-1相互作用抑制T细胞并逃避免疫系统的机制将有助于提高基于免疫检查点阻断疗法的疗效。除黑素瘤之外，我们的发现还适用于用抗PD-1/PD-L1疗法治疗的其他类型的癌症。

实施例II

免疫细胞来源的脱落囊泡和外泌体的分离及其使用方法

材料和方法

患者和样本收集

招募了患有III至IV期黑素瘤的患者，进行派姆单抗或市售Keytruda的治疗(每3周输注2mg/kg)。患者同意根据机构审查委员会(IRB协议#703001)在宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心的黑素瘤研究计划组织收集协议UPCC 08607下进行血液收集。在每3周每次派姆单抗输注之前在肝素钠试管中获得外周血，持续12周。如先前所述(Huang等，2017)，以双盲方式独立进行临床反应的评估。使用一维测量，基于免疫相关的RECIST(irRECIST)将临床反应确定为最佳反应。

人外周和T细胞的分离和激活

使用聚蔗糖(ficoll)梯度分离人外周血单核细胞(PBMC)。根据制造商的说明(Thermo FisherScientific)，使用磁珠未接触的人T细胞试剂盒(Dynabeads UntouchedHuman T Cells Kit)从PBMC中进一步纯化T细胞。纯化的T细胞在37℃、5％CO₂下的RPMI1640中培养，所述RPMI1640中补充了10％的外泌体耗尽的胎牛血清(FBS)、100mg/mL的链霉素/青霉素、2mM的L-谷氨酰胺和1mM的丙酮酸钠(Sigma-Aldrich，瑞典)。对于T细胞活化，将纯化的T细胞与抗CD3(2μg/ml)和抗CD28(2μg/ml)抗体温育72小时。

脱落囊泡和外泌体的纯化和表征

为了纯化由T细胞分泌的脱落囊泡和外泌体，从活化和未活化的T细胞中收集培养上清液。将培养上清液以2,000g离心20分钟，以去除细胞碎片和死细胞(Beckman Coulter，Allegra X-14R)。然后将上清液在4℃下以20,500g离心60分钟(Beckman Coulter，J2-HS)以收集脱落囊泡。通过在4℃下以100,000g对上清液进行超速离心(Beckman Coulter，Optima XPN-100)2小时来沉淀外泌体。

为了通过差速离心纯化循环的脱落囊泡和外泌体，将来自黑素瘤患者或健康供体的静脉柠檬酸盐血以1,550g离心30分钟，以获得无细胞血浆(Beckman Coulter，AllegraX-14R)。然后将1ml所获得的血浆在4℃下以20,500g离心60分钟以收集脱落囊泡(Eppendorf，5418R)。收集的上清液将在4℃下以100,000g离心2小时(Beckman Coulter，Optima^TM MAX-XP)以沉淀外泌体。为了使用外泌体分离试剂盒纯化循环的外泌体，首先将100μl无细胞血浆在4℃下以20,500g离心60分钟(Eppendorf，5418R)以收集脱落囊泡。然后使用外泌体分离试剂盒(Invitrogen，目录号4484450)从上清液中纯化外泌体。

为了用流式细胞术进行表征，将纯化的外泌体与CD63-、CD3-、CD4-或CD8-包被的磁珠在含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中于4℃下混合温育过夜。然后洗涤外泌体包被的珠子，并与荧光团标记的抗体一起温育，然后在LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。

为了使用电子显微镜验证纯化的外泌体，将悬浮在PBS中的纯化的外泌体滴到聚乙烯醇缩甲醛碳涂覆的镍网格上。用2％乙酸铀酰染色后，将网格风干并使用JEM-1011透射电子显微镜显现。为了免疫金标记，将悬浮在PBS中的纯化外泌体置于聚乙烯醇缩甲醛碳涂覆的镍网格上、阻断并与一抗一起温育，然后和与蛋白A-金颗粒(5nm)缀合的抗小鼠二抗一起温育。每个染色步骤之后进行五次PBS洗涤和十次ddH₂O洗涤，然后用2％乙酸铀酰进行对比染色。

使用装配有快速视频捕获和粒子跟踪软件的NanoSight NS300(MalvernInstruments)确定外泌体的大小。

对于碘克沙醇密度梯度离心，将通过差速离心收集的外泌体加样到不连续的碘克沙醇梯度(通过用在10mM Tris中的0.25M蔗糖稀释60％的OptiPrep^TM碘克沙醇水溶液制成的5％、10％、20％和40％)的顶部和在4℃下以100,000g离心18小时。从梯度顶部收集了十二个等体积的级分。通过在4℃下以100,000g超速离心2小时进一步沉淀外泌体。

ELISA

为了检测源自T细胞的脱落囊泡和外泌体上的免疫调节蛋白(例如CD276)，以抗CD276的单克隆抗体包被ELISA板，在4℃下过夜。在室温下用200μl封闭缓冲液(Pierce)封闭游离结合位点1小时。然后将100μl从血浆或细胞培养上清液中纯化的外泌体样品添加到每个孔中，并在4℃下温育过夜。加入生物素化的单克隆CD276抗体，并在室温下温育1小时。然后添加每孔总共100μl在含0.1％BSA的PBS中稀释的辣根过氧化物酶缀合的链霉亲和素(BD Biosciences)，并在室温下温育1小时。将板用四甲基联苯胺(Pierce)显影，并使用0.5N的H₂SO₄终止。用BioTek酶标仪在450nm下读板。使用重组人PD-1蛋白制作标准曲线。

蛋白质印迹分析

使用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离全细胞裂解物或脱落囊泡或外泌体的蛋白质，并将其转移到硝酸纤维素膜上。印迹用5％脱脂奶粉在室温下封闭1小时，然后在4℃下与相应的一抗在供应商推荐的稀释度下温育过夜，然后与HRP缀合的二抗(CellSignaling Technology)在室温下温育1小时。膜上的印迹用ECL检测试剂(Pierce)显影。

结果

首先，通过Nanosight纳米粒子跟踪分析(NTA)技术，将经T细胞分泌的纯化的脱落囊泡和外泌体分别确认为100-1000nm和40-100nm的膜囊泡。NTA结果还证明，在由活化和未活化的T细胞分泌的脱落囊泡和外泌体之间的大小分布没有显著差异(图13A)。然而，与未活化的T细胞相比，活化的T细胞分泌显著更多的脱落囊泡和外泌体(图13B)。此外，由活化的T细胞分泌的脱落囊泡和外泌体显示出比源自未活化的T细胞的那些更高得多的蛋白质水平(图13C)。与蛋白质定量结果一致，与未活化的T细胞相比，在从活化的T细胞纯化的脱落囊泡和外泌体中观察到外泌体标记物水平的显著增加(图13D)。这些结果表明，活化的T细胞来源的脱落囊泡和外泌体携带的蛋白质货物比未活化的T细胞来源的那些携带的蛋白质货物更多。

通过免疫印迹进一步分析活化的和未活化的T细胞分泌的脱落囊泡和外泌体的免疫调节蛋白(包括CD152、CD223、CD274、CD276和CD366)的存在(图13D)。尽管显示出不同的水平，但是在由活化和未活化的T细胞二者分泌的脱落囊泡和外泌体中清楚地检测到T细胞表面标记物CD3、CD4和CD8。CD223、CD274、CD276和CD366仅在由来源于活化T细胞的脱落囊泡和外泌体中检测到。然而，与未活化的T细胞相比，活化的T细胞分泌的脱落囊泡中而非外泌体中的CD152的水平更高。这些以上结果表明，T细胞，具体是活化的T细胞，分泌高水平的携带免疫调节蛋白的细胞外囊泡。

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尽管上面已经描述并具体举例说明了本发明的某些优选实施方式，但是这并不意味着本发明限于这些实施方式。对于本领域的技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可以在其中做出多种改变和修改，如所附权利要求书所述。

序列表

<110> X·许

W·郭

G·陈

<120> 细胞外囊泡蛋白及其在癌症诊断、预测对疗法的反应和治疗中的用途

<130> 1070-P06529WO00

<150> 62/583,901

<151> 2017-11-09

<160> 2

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人HRS shRNA

<400> 1

gcacgtcttt ccagaattca a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼠PD-L1 shRNA

<400> 2

gcgttgaaga tacaagctca a 21

Claims (32)

1.一种鉴定对抗癌疗法有反应的受试者的方法，包括：

i)在治疗之前获得由受试者收集的第一生物样品，

ii)向所述受试者施用一种或多种抗癌药剂，并从使用所述一种或多种药剂治疗的所述受试者收集第二生物样品，

iii)在所述第一生物样品和第二生物样品中检测循环的细胞外囊泡PD-L1和/或干扰素γ(IFNγ)的水平，和

iv)相对于所述第一生物样品，在所述第二生物样品中细胞外囊泡PD-L1和/或IFNγ水平升高时，鉴定所述受试者为对治疗有反应的。

2.权利要求1所述的方法，其中所述抗癌疗法涉及PD-1/PD-L1，并且选自派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、用于癌症治疗的免疫学上特异性靶向PD1/PDL1的抗体和特异性靶向PD1/PDL1的小分子。

3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述受试者正在接受用于以下一种或多种癌症的疗法：黑素瘤、肺癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、鼻咽癌、淋巴瘤、梅克尔细胞癌、具有错配修复缺陷的癌症或可用抗PD1/PDL1疗法治疗的其他癌症。

4.权利要求1所述的方法，其中所述抗癌疗法靶向PD-1或所述PD-L1通路，并且在所述疗法后3至9周之间收集所述第二生物样品，所述方法进一步包括确定在所述治疗之前和之后的血液细胞外囊泡PD-L1蛋白之间的比率。

5.权利要求1所述的方法，进一步包括确定治疗之前和之后的IFNγ水平的比率。

6.权利要求4所述的方法，其中确定治疗之前和之后的PD-L1和IFNγ水平的比率。

7.一种在从癌症患者获得的生物样品中检测含癌细胞来源的PD-L1的囊泡的方法，所述囊泡选自PD-L1外泌体、细胞外脱落囊泡、核外颗粒体、凋亡小体和癌小体，所述方法包括i)使所述样品与特异性结合PD-L1的一种或多种试剂接触；和ii)检测结合复合物的形成，所述结合复合物包括与所述含癌症来源的PD-L1的囊泡结合的所述一种或多种试剂。

8.权利要求7所述的方法，进一步包括从所述结合复合物中分离所述含PD-L1的囊泡。

9.权利要求1所述的方法，包括相对于所述第一生物样品，在所述第二生物样品中外泌体PD-L1和/或IFNγ水平的比率升高时，鉴定所述受试者为对治疗有反应的。

10.权利要求1所述的方法，其中所述生物样品选自外周血、血清、血浆、痰、尿液、唾液、腹水或眼泪。

11.权利要求7所述的方法，其中所述PD-L1试剂通过流式细胞术、免疫电子显微镜、酶联免疫吸附测定或基于光散射的纳米颗粒跟踪分析(NTA)来检测。

12.权利要求7所述的方法，其中检测与支持物直接或间接结合的所述一种或多种PD-L1试剂。

13.权利要求7所述的方法，其中所述PD-L1试剂通过抗体与所述支持物间接地结合。

14.权利要求7所述的方法，其中所述试剂是单体、二聚体或四聚体抗体。

15.权利要求7所述的方法，其中所述检测试剂是抗PD-L1抗体。

16.权利要求7所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体用非天然存在的量子点或荧光染料标记。

17.一种用于从生物流体样品中分离含癌蛋白的外泌体或含癌蛋白的细胞外囊泡的方法，其包括：i)从患者获得样品，ii)将所述样品与特异性结合所述癌蛋白的试剂一起温育，和iii)分离试剂，从而从所述样品中分离含癌蛋白的外泌体，其中所述癌蛋白选自PD-L1、BRAF、NRAS、KRAS、KIT、TP53、PTEN、EGFR、HER2、ALK、AKT1、MET、RET、RHOA、ARID1A、PIK3CA、APC、MLL2、MLL3、RB1、NF1、MALAT、KEAP1、IDH1、ATRX、PDGFRA、NAV3、FBXW7、VHL、mTOR、BAP1、PBRM1、SETD2、CDH1、Wnt5A、MAPK1、HSP70、TRAP1、HSP90、SerpinH1、VEGFC、R-RAS、HLA-G5和与癌症相关的其突变蛋白，所述外泌体或所述细胞外囊泡中所述癌蛋白的存在指示癌症。

18.权利要求17所述的方法，进一步包括将所述样品与特异性结合CD63或CD274的试剂一起温育。

19.权利要求17所述的方法，其中所述试剂被固定在磁珠或固体支持物上。

20.权利要求4或权利要求9所述的方法，其中所述比率用于预测患者对所述治疗的反应。

21.一种用于治疗与循环的PD-L1水平异常相关的转移癌的方法，包括：

a)从患者获得生物样品；

b)使所述样品与和血液PD-L1形成特异性结合对的试剂接触，从而形成结合复合物，所述PD-1/PD-L1存在于外泌体或细胞外囊泡中；

c)从所述样品中去除所述结合复合物，从而消耗PD-1/PDL1的血液水平。

22.权利要求21所述的方法，其中所述样品是血液，并且所述接触和去除发生在血浆置换期间。

23.权利要求22所述的方法，其中将经过滤的血液重新注入所述受试者中。

24.根据权利要求21所述的方法，其中所述癌症选自黑素瘤、肺癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、鼻咽癌、淋巴瘤、梅克尔细胞癌、具有错配修复缺陷的癌症或可以用抗PD1/PDL1疗法治疗的其他癌症。

25.一种在从癌症患者获得的生物样品中检测含免疫细胞来源的蛋白质的囊泡的方法，所述囊泡选自含免疫细胞来源的蛋白质的囊泡、细胞外脱落囊泡、核外颗粒体、凋亡小体和癌小体，包括i)使所述样品与特异性结合所述免疫细胞来源的蛋白质的一种或多种试剂接触；和ii)检测结合复合物的形成，所述结合复合物包括与所述含免疫细胞来源的蛋白质的囊泡结合的所述一种或多种试剂，其中所述免疫细胞来源的蛋白质选自CD109、CD151、CD276、CD44、CD46、CD47、CD55、CD58、CD59、CD70、CD9、CD95、CD97、CD99和B7H4。

26.权利要求25所述的方法，进一步包括分离包含CD63和CD81的外泌体。

27.权利要求4所述的方法，进一步包括分离包括Akt、Wnt5A、MAPK1、HSP70、TRAP1、HSP90、SerpinH1、VEGFC、R-RAS和HLA-G5或其突变体中的一种或多种的外泌体，其中在抗癌疗法之前和之后分离所述外泌体。

28.权利要求4所述的方法，进一步包括分离包括BRAF、NRAS、KIT、TP53、PTEN、EGFR、HER2、ALK、AKT1、KRAS、MET、RET、RHOA、ARID1A、CDH1或其突变体的外泌体，其中在抗癌治疗之前和之后分离所述外泌体。

29.一种在从癌症患者获得的生物样品中检测含免疫细胞来源的蛋白质的囊泡的方法，所述囊泡选自含免疫细胞来源的蛋白质的囊泡、细胞外脱落囊泡、核外颗粒体、凋亡小体和癌小体，所述方法包括i)使所述样品与特异性结合所述免疫细胞来源的蛋白质的一种或多种试剂接触；和ii)检测结合复合物的形成，所述结合复合物包括与所述含免疫细胞来源的蛋白质的囊泡结合的所述一种或多种试剂，其中所述免疫细胞来源的蛋白质选自CD3、CD4、CD8、CD11、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD25、CD27、CD38、CD45、CD68、CD80、CD86、CD138、CD152、CD160、CD223、CD244、CD274、CD276和CD366，所述外泌体或所述细胞外囊泡中存在所述免疫细胞蛋白质指示所述免疫细胞的类型或功能状态。

30.权利要求29所述的方法，进一步包括将所述样品与特异性结合CD9、CD63和CD81的试剂一起温育。

31.一种在从癌症患者获得的生物样品中检测含免疫细胞来源的蛋白质的囊泡的方法，所述囊泡选自含免疫细胞来源的蛋白质的囊泡、细胞外脱落囊泡、核外颗粒体、凋亡小体和癌小体，所述方法包括i)使所述样品与特异性结合所述免疫细胞来源的蛋白质的一种或多种试剂接触；和ii)检测结合复合物的形成，所述结合复合物包括与所述含免疫细胞来源的蛋白质的囊泡结合的所述一种或多种试剂，其中所述免疫细胞来源的蛋白质选自CD3、CD4、CD8、CD11、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD25、CD27、CD38、CD45、CD68、CD80、CD86、CD138、CD152、CD160、CD223、CD244、CD274、CD276和CD366。

32.一种用于实践前述权利要求中任一项所述方法的试剂盒。

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