CN111549380A - 一种构建双链rna测序文库的试剂盒及其应用 - Google Patents
一种构建双链rna测序文库的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111549380A CN111549380A CN202010442309.1A CN202010442309A CN111549380A CN 111549380 A CN111549380 A CN 111549380A CN 202010442309 A CN202010442309 A CN 202010442309A CN 111549380 A CN111549380 A CN 111549380A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stranded rna
- reagent
- double
- kit
- rna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 title claims abstract description 141
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 title claims abstract description 114
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 61
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 30
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 12
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 12
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 12
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 claims description 10
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 9
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 claims description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 claims description 6
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 claims description 3
- -1 T4 DNA ligase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 241001516406 Avian orthoreovirus Species 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 6
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 101150076840 PolI gene Proteins 0.000 description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 4
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 2
- 208000008104 Reoviridae Infections Diseases 0.000 description 2
- 101150027674 S1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 206010003274 Arthritis viral Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 208000004575 Infectious Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010025476 Malabsorption Diseases 0.000 description 1
- 208000004155 Malabsorption Syndromes Diseases 0.000 description 1
- 241000702244 Orthoreovirus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 229920000604 Polyethylene Glycol 200 Polymers 0.000 description 1
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002582 Polyethylene Glycol 600 Polymers 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 229920002593 Polyethylene Glycol 800 Polymers 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002663 nebulization Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N pentaethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCO JLFNLZLINWHATN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种构建双链RNA测序文库的试剂盒及其应用；该试剂盒包含双链RNA片段化试剂、RNA接头连接试剂和扩增试剂；其中，所述接头连接试剂包含RNA连接酶和/或DNA连接酶。本发明的试剂盒可更简便快捷的完成双链RNA测序文库的构建，并能保证文库的质量达到测序要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种构建双链RNA测序文库的试剂盒及其应用。
背景技术
RNA病毒是病毒的一种，如：丙型肝炎病毒，乙型脑炎病毒，全部流感病毒等。通常RNA病毒的遗传物质(核糖核酸)是单链的(ssRNA,single-stranded RNA)，也有遗传物质是双链的(dsRNA,double-stranded RNA)。双链RNA病毒因其核酸为互补的双链RNA而得名。dsRNA病毒有两个特点：一是病毒基因组多为10-12个节段的双链RNA分子；二是病毒具有双层衣壳，没有包膜。病毒的双链RNA在病毒自身依赖RNA多聚酶作用下转录出mRNA，然后再翻译出早期蛋白或晚期蛋白。双链RNA在复制时，必须先以其原负链为模板复制出正链RNA，再由正链RNA复制出新的负链，构成子代RNA。双链RNA(dsRNA)病毒大部分属于呼肠病毒科。例如禽呼肠孤病毒(avian reovirus，ARV)，ARV属呼肠病毒科、正呼肠病毒属，基因组为线性双链RNA。
目前国内外很多品牌的试剂盒都可以实现单链RNA建库从而进行高通量测序，但是针对一些含有双链RNA的样本，市面上暂无实现方便快捷的双链RNA建库从而进行高通量测序的方案。Qi Zheng等(Genome-Wide Double-Stranded RNA Sequencing Reveals theFunctional Significance of Base-Paired RNAs in Arabidopsis，2010)公开了一种双链RNA测序文库的构建方法，该方法将双链RNA片段化后使RNA单链化，后在单链RNA的两端先后连接测序接头，之后通过逆转录反应得到DNA测序文库，该方法需要对RNA单链化处理后先后在3’端和5’分别加接头，步骤相对较多，建库耗时较长。因此，需要开发一种高效的建库方法及其对应的试剂盒，以提高双链RNA的建库效率。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种用于构建双链RNA测序文库的试剂盒及其在双链RNA建库中的应用。
在一个方面，本发明提供一种用于构建双链RNA测序文库的试剂盒，所述试剂盒包含双链RNA片段化试剂、接头连接试剂和扩增试剂；
任选地，所述试剂盒还包含双链RNA提取试剂、双链RNA末端修复试剂、接头和核酸纯化试剂中的一种或多种；
其中，所述接头连接试剂包含RNA连接酶和/或DNA连接酶。
在一些实施方案中，所述接头连接试剂包含RNA连接酶。
在另一些实施方案中，所述接头连接试剂还包含DNA聚合酶。
在又一些实施方案中，所述DNA聚合酶具有使DNA链5’至3’方向延长的功能，优选的DNA聚合酶为DNA聚合酶I。
在一些实施方案中，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶；所述RNA连接酶为T4 RNA连接酶。
在另一些实施方案中，所述双链RNA片段化试剂包含选自Tris-HCl、镁离子和二甲基亚砜、聚乙二醇、BSA和钾离子的至少一种。
在另一个方面，本发明提供一种一种用于构建双链RNA测序文库的试剂盒，所述试剂盒包含双链RNA片段化试剂、双链RNA末端修复试剂、接头连接试剂、核酸纯化试剂和扩增试剂；
其中，所述接头连接试剂包含RNA连接酶和DNA连接酶。
在又一方面，本发明提供一种用于构建双链RNA测序文库的试剂盒，所述试剂盒包含双链RNA片段化试剂、双链RNA末端修复试剂、接头连接试剂、核酸纯化试剂和扩增试剂；其中，所述接头连接试剂包含T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶I和酶反应缓冲液；所述双链RNA片段化试剂包含选自Tris-HCl、镁离子、二甲基亚砜、聚乙二醇、BSA和钾离子。
在一些实施方案中，所述扩增试剂包含DNA聚合酶，优选的所述DNA聚合酶包含逆转录酶和Taq酶。
本发明还提供上述试剂盒在双链RNA测序文库构建中的应用。
发明详述
本文的“任选”、“任选的”或“任选地”是指随后所述的事件或情况可以发生，或可以不发生，而且该这种叙述包括所述事件或情况发生的情形和不发生的情形。
本文中的“双链RNA测序文库”指的是用于对双链RNA基因序列进行高通量测序所需要的文库，在本发明的一个实施例中，该文库为DNA文库。
本文中的“试剂盒”包含不同的组分，各组分之间可以形成混合物在一个容器或多个容器中，或者是各组分之间单独包装，包装容器不限。
本文中“双链RNA片段化试剂”指能够打断双链RNA或待测双链RNA的试剂组合物，其能够使长的双链RNA片段化为相对短链的双链RNA；其中，本文中“片段化的双链RNA”、“双链RNA片段”或“打断的双链RNA片段”包含突出的末端，即双链RNA片段的末端存在部分单链RNA，可以采用本领域公知的任何方法是将双链RNA突出的末端平端化，但不排除有些打断的双链RNA片段是平末端的。
本文的“接头连接试剂”指使片段化的双链RNA与接头连接的试剂，本文的接头连接试剂可使一种接头与片段化的双链RNA两条链的5’端连接，同时对应的另一接头与片段化的双链RNA两条链的3’端连接，并且上述两个连接可在一个体系中一次完成。
本文中“随机打断”指在双链RNA的任意位置打断使其片段化，片段化的RNA仍然为双链结构，末端为单链结构；随机打断的方式可以是本领域任意已知的方式，例如酶法打断、机械打断和化学打断中任意一种或一种以上，优选采用机械打断或化学打断的方法，其中机械打断可以使用用于DNA或RNA片段化的现有的装置，适宜应用用于DNA或RNA片段化的条件进行，基于机械打断例子如：超声波打断、毛细管或孔的流体力学的剪切处理、喷雾化的处理等。
本文的“待测双链RNA”表示经过提取处理的双链RNA，本领域技术人员可以理解的是，本文的双链RNA的获得可采取任何本领域已知的提取及纯化手段获得。
本文中的“末端修复”指对打断后获得的双链RNA片段的突出的单链末端进行修复的操作，以使打断后的双链RNA片段平端化或无5’端突出。
本发明的一些实施例中，片段化的RNA连接的接头根据不同的测序平台而不同，根据连接接头的类型不同，可选的对片段化的RNA进行平端化或部分平端化，平端化指两条RNA单链完全互补，部分平端化指存在5’端的突出。
本文的“连接接头”或“接头连接”指在经过末端修复或未修复的双链RNA片段的两端分别连接接头；本文中一些实施例中，在双链RNA片段的两条链的5’端分别连接第一接头，在双链RNA的两条链3’端分别连接第二接头，其中第一接头和第二接头序列不同；在一些优选的实施例中，双链RNA片段的两条链的5’端和3’端在一步反应中同时与接头连接。
本文的“接头”指在DNA片段两端加上一段核苷酸，该核苷酸包含一段序列其能够与测序仪器匹配进行测序(例如与芯片引物互补配对)，例如适用于illumina平台，IonTorrent平台或MGI平台。
示例性的接头如图1所示，两个接头序列不同，图示只是为了区分不同的接头，对接头的序列长度差异没有特别限制，可接受的两个接头序列的长度差异在0-10个碱基范围内。
在一些实施例中，所述的接头是单链或双链RNA，或部分双链RNA。
在一些实施例中，所述的接头是单链或双链DNA，或部分双链DNA。
在一些实施例中，所述的第一接头包含标签序列，用于区分不同的样本。
在一些实施例中，所述的第一接头还包含与测序平台的第一芯片探针结合的序列；例如本发明的一个实施例中第一接头包含P7序列，P7序列与illumina测序平台的芯片探针结合。
本文中的“芯片引物”和“芯片探针”表示相同的含义。
在一些实施例中，所述的第一接头还包含测序引物结合序列，其与illumina测序平台测序过程中添加的测序引物互补结合或部分互补结合。
在一些实施例中，所述的第二接头包含与测序平台的第二芯片探针结合的序列；例如本发明的一个实施例中第一接头包含P5序列，P5序列与illumina测序平台的芯片探针结合。
在一些实施例中，所述的第二接头还包含测序引物结合序列，其与illumina测序平台测序过程中添加的测序引物互补结合或部分互补结合。
可选的，所述第二接头包含另一标签序列，以提高样本区分准确度。
在一些实施例中，所述第一接头序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
在一些实施例中，所述第二接头序列为5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACnnnnnnnnATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
nnnnnnnn表示8bp index序列，
本文中“芯片探针”指固定在测序仪器芯片上的一段核苷酸序列，其能够捕获文库中的DNA序列实现高通量测序。本文中的“第一芯片探针”与“第二芯片探针”序列不同，优选illumina测序平台的芯片探针。
在一些实施例中，通过RNA连接酶将第一接头分别与片段化的双链RNA两条链的5’端连接，第二接头分别与片段化的双链RNA两条链的3’端连接。
在另一些实施例中，通过DNA连接酶将第一接头分别与片段化的双链RNA两条链的5’端连接，第二接头分别与片段化的双链RNA两条链的3’端连接。
在有一些实施例中，通过RNA连接酶和DNA连接酶将第一接头分别与片段化的双链RNA两条链的5’端连接，第二接头分别与片段化的双链RNA两条链的3’端连接。
在一些实施例中，还需要进一步包含DNA聚合酶，优选DNA聚合酶I实现第一接头和/或第二接头与片段化双链RNA的连接。例如，P7和P5接头与双链RNA连接时，需要DNA聚合酶补平缺口。
在一些实施例中，所述的DNA连接酶为T4 DNA连接酶；所述RNA连接酶为T4 RNA连接酶。
在一个实施例中，所述双链RNA片段化试剂包含选自Tris-HCl、镁离子和二甲基亚砜、聚乙二醇、BSA和钾离子。
本文中“扩增”或“扩增的”或“富集”指制备特定核酸的拷贝的体外方法，所述特定核酸诸如靶核酸或加标签的核酸。扩增核酸的很多方法是本领域已知的，并且扩增反应包括但不限于聚合酶链式反应、连接酶链式反应、链置换扩增反应、滚环扩增反应。扩增的核酸可以是DNA或RNA。不管起始核酸是DNA、RNA或两者，从一个核酸分子或更多个核酸分子(“扩增产物”)的扩增得到的产物都可以是DNA或RNA、或DNA和RNA核苷或核苷酸两者的混合物，或者它们可包括修饰的DNA或RNA核苷或核苷酸。
在一些实施例中，所述的扩增试剂包含逆转录酶和taq酶，在对应的酶反应缓冲体系中以双链RNA为模板经过逆转录反应获得单链DNA，以单链DNA或前述逆转录得到的各条单链DNA之间互补配对得到的双链DNA为模板进行PCR反应，完成DNA的复制。其中，taq酶可替换成能够完成DNA复制的任何酶。
本文中“连接酶”指催化核酸链的5'-磷酸末端和3'-羟基末端之间的磷酸二酯键的分子内和分子间形成的核酸修饰酶。
在一些实施例中，通过DNA连接酶和RNA连接酶实现在双链RNA片段的末端添加接头序列，通过DNA聚合酶I实现缺口的补平。
在一些实施例中，采用T4 DNA连接酶，T4 RNA连接酶和DNA聚合酶I完成接头与双链RNA片段的连接，该反应体系中配套有适合于上述三种酶完成上述连接反应的缓冲液。
在一些实施例中，接头连接试剂中还包含甜菜碱。
在一些实施例中，接头连接试剂中进一步包含PEG，即聚乙二醇，可以是细胞工程中常用的使细胞发生融合形成杂种细胞的常用聚合度，例如PEG 200、PEG 400、PEG 600、PEG 800、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000等。
本文中，以两端包含接头的双链RNA片段为模板得到双链DNA产物，其通过逆转录PCR获得cDNA之后，经过PCR获得富集的双链DNA，进一步，双链DNA经过纯化后获得测序文库。
在一些实施例中，所述接头连接试剂包含T4 DNA ligase(T4 DNA连接酶),T4 RNAligase(T4 RNA连接酶),DNA polI(DNA聚合酶I)，PEG，甜菜碱，T4 RNA Ligase ReactionBuffer(T4 RNA连接酶反应缓冲液)。
在一些实施例中，所述接头连接试剂包含T4 DNA ligase(T4 DNA连接酶)7-15U/μl,T4 RNA ligase(T4 RNA连接酶)7-15U/μl,DNA polI(DNA聚合酶I)0.2-0.4U/μl，PEG5％-9％，甜菜碱500mM-650mM，T4 RNA Ligase Reaction Buffer(T4 RNA连接酶反应缓冲液)，其余为DEPC水。
优选的，35μl接头连接体系中包括：末端修复的产物18μl，接头0.4μM,T4 DNAligase400U,T4 RNA ligase 400U,DNA pol I 10U，PEG 2.5μl，甜菜碱0.6M，T4 RNALigase Reaction Buffer(T4 RNA连接酶反应缓冲液)2μl，其余为DEPC水。本领域技术人员能够领会，可根据上述反应体系的比例进行任意的放大或缩小体系，以实现反应。
本发明的一个实施例中，双链RNA打断缓冲液包含如下成分：
| 组分 | 体积 |
| 1M Tris-HCl(PH7.5) | 1ml |
| 1M MgCl<sub>2</sub> | 50μl |
| 1M KCl | 500μl |
| 100％DMSO | 300μl |
| 50％PEG | 200μl |
| 10mg/ml BSA | 10μl |
| DEPC水 | 加至10ml |
其中，上述缓冲液与双链RNA的体积比为1：1。
本发明的一个实施例中，打断后的双链RNA经过末端修复，修复反应于42℃反应30min，修复体系如下所示：
| 组分 | 体积 |
| 打断的双链RNA片段 | 15μl |
| dNTP 10mM | 1.5μl |
| 逆转录酶200U/μl | 1.5μl |
| 总体积 | 18μl |
本发明的一个实施例中，经过末端修复的双链RNA片段，于37℃反应4h，进行接头连接。接头连接体系如下所示：
| 组分 | 体积 |
| 末端修复的双链RNA片段 | 18μl |
| 接头(15μM) | 1μl |
| T4 DNA ligase(400U/μl) | 2μl |
| T4 RNA ligase(200U/μl) | 1μl |
| DNA polI(N105，5U/μl) | 2μl |
| 50％PEG | 2.5μl |
| 5M甜菜碱 | 4μl |
| T4 RNA ligase缓冲液 | 2μl |
| 总体积 | 35μl |
在一个实施例中，所述的接头如下所示：
常规接头序列：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
带标签的接头序列：
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACnnnnnnnnATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
nnnnnnnn表示8bp标签序列。
本发明的有益效果：
本发明的用于构建双链RNA测序文库的试剂盒，可在打断的双链RNA片段两端通过一步反应直接连接接头，后续通过逆转录PCR及PCR得到包含接头的DNA，可作为待测双链RNA的测序文库，与现有技术相比无需对双链RNA进行单链化处理，也无需在3’和5’端先后连接接头，反应步骤少，节省时间成本和原料成本。
附图说明
图1示例性的片段化双链RNA两端连接接头序列；
图2是禽呼肠孤病毒S1基因检测的电泳图；
图3是用Agilent 2100 Bioanalyzer评价文库质量图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1：构建双链RNA文库
1、双链RNA提取与检测
本实验提取的是禽呼肠孤病毒中的双链RNA，禽呼肠孤病毒感染(Avian reovirusinfection)是鸡的一种传染性疾病，可引起鸡多种疾病，包括病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病和所谓吸收不良综合征。参考《微生物样本采集手册》取致病鸡的上呼吸道样本(鼻咽拭子)，利用以下方法提取双链RNA(试剂取自Vazyme#RM101)：
(1)在1.5ml Nuclease-free低吸附EP管中加入200μl待提取样本(不足200μl样品可使用生理盐水补齐)，然后加入20μl蛋白酶K，轻微涡旋或上下颠倒混匀后加入20μl磁珠和600μl裂解液，涡旋震荡混匀15sec，室温裂解5min，期间上下颠倒混匀两次。
(2)瞬时离心，将EP管置于磁力架上，静置1min，用移液器移除上清。
(3)洗涤：将上述样品取下磁力架，加入700μl洗涤液，涡旋15sec混匀，瞬时离心，将EP管放上磁力架，静置1min，除尽上清。
(4)漂洗：将上述样品取下磁力架，加入700μl漂洗液，涡旋15sec混匀，瞬时离心，将EP管放上磁力架，静置1min，除尽上清。
(5)瞬时离心后重新放上磁力架，移尽残留上清。开盖室温晾置3～5min，直至磁珠表面无反光。
(6)加入50μl洗脱液，温和混匀15sec，室温静置3min，期间震荡混匀2次。
(7)瞬时离心至EP管底后将样品重新置于磁力架上，静置1min后，吸取上清至新的Nuclease-free离心管中，用于后续检测或置于-30～-15℃以下短期保存或置于-70℃以下长期保存。
本实施例所用的双链RNA的提取方法，也可以为本领域的其他常规方法。
在禽呼肠孤病毒S1基因部分片段298bp上设计一对引物，利用可以直接检测RNA的试剂盒进行检测确认该双链RNA取自禽呼肠孤病毒(比如Vazyme的货号为P611或P612的检测试剂盒)，引物序列如下：
上游引物：5’ATGCTGCGTATGCCTCCCGGT 3’
下游引物：5’TCAAACGTCGTTATGGCGGA 3’
用上述引物和常规PCR扩增试剂(Vazyme#P112)进行扩增，1％琼脂糖跑电泳，得到如图2结果，其中泳道M是5000bp的Marker，泳道1是PCR产物，可见：PCR产物的条带大小是298bp，我们所提取的确实是禽呼肠孤病毒的RNA。
2、双链RNA(dsRNA)打断
本实施例所用的打断缓冲液(Buffer2)，配方如表1所示：
【表1】
| 组分 | 体积 |
| 1M Tris-HCl(PH7.5) | 1ml |
| 1M MgCl<sub>2</sub> | 50μl |
| 1M KCl | 500μl |
| 100％DMSO | 300μl |
| 50％PEG | 200μl |
| 10mg/ml BSA | 10μl |
| DEPC水 | 加至10ml |
按照表2进行混样，于95℃反应15min，4℃保存备用。
【表2】
| 组分 | 体积 |
| Buffer2 | 7.5μl |
| dsRNA | 7.5μl |
3、末端修复
按照表3配制反应体系，于42℃反应30min，进行末端修复。
【表3】
4、接头连接
接头来源Vazyme#N801，DNA polI来源Vazyme#N105。
按照表4配制反应体系，于37℃反应4h，进行接头连接。
【表4】
| 组分 | 体积 |
| 上一步产物 | 18μl |
| 接头(N801，15μM) | 1μl |
| T4 DNA ligase(400U/μl，NEB,M0202S) | 2μl |
| T4 RNA ligase(200U/μl，NEB,M0242S) | 1μl |
| DNA polI(N105，5U/μl) | 2μl |
| 50％PEG | 2.5μl |
| 5M甜菜碱 | 4μl |
| T4 RNA ligase缓冲液 | 2μl |
| 总体积 | 35μl |
接头序列：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
带标签的接头序列：
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACnnnnnnnnATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
nnnnnnnn表示8bp标签序列，
5、产物纯化
1)颠倒或旋涡振荡使VAHTS RNA Clean Beads(Vazyme#N412)充分混匀，吸35μl(1×)加入到连接产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。
2)室温孵育10min，使RNA结合到磁珠上。
3)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移除上清。
4)保持样品处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠(注意不要吹散磁珠)，室温孵育30sec，小心移除上清。
5)重复步骤4)一次。
6)保持样品处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5-10min。
7)将样品从磁力架上取出，加入21.5μl Nuclease-free H2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后，小心吸取19μl上清至一个新的Nuclease-free PCR管中，立刻进行PCR。
6、文库扩增
按照表5配制反应体系，按照表6的程序进行反应。
【表5】
【表6】
7、PCR产物纯化
1)颠倒或旋涡振荡使VAHTS DNA Clean Beads充分混匀，吸取45μl(0.9×)加入到PCR产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀。
2)室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上。
3)将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移除上清。
4)保持样品处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清。
5)重复步骤4)一次。
6)保持样品处于磁力架上，在室温下开盖干燥磁珠约5-10min。
7)将样品从磁力架上取出，加入25μl Nuclease-free H2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吸打充分混匀，室温静置2min后置于磁力架上，待溶液澄清后，小心吸取22.5μl上清至一个新的Nuclease-free PCR管中。
8、用Agilent 2100Bioanalyzer评价文库质量
取1μl纯化后的PCR产物，用Agilent DNA 1000kit(Agilent,Cat.No.5067-1504)分析，得到下图3所示结果，从图中可知，我们得到的文库质量和文库大小在300-500bp区间。
9、Illumina平台上机测序，并进行数据分析，得到表7数据，L1_15_10和L1_15_15是两个重复。禽呼肠孤病毒物种的双链RNA序列GC含量在50％附近，从表7可见，本方案得到的文库测序数据中Clean_GC为50.33％和50.24％，与禽呼肠孤病毒物种的双链RNA序列GC含量相符。表7中Total mapped ratio表示本方案测序结果与禽呼肠孤病毒核酸序列比对后有97.31％和96.76％的序列是吻合的，说明本发明的文库构建方案可行。
【表7】
注：Samples：样品名称；Clean_reads：过滤后的下机数据；Clean-GC:过滤后数据中碱基的GC含量；Clean_Q20：表示质量值≧20的碱基所占百分比；Clean_Q30表示质量值≧30的碱基所占百分比；Dup rate：重复率；Adapter：接头残留率；Total mapped ratio：比对率。
Claims (10)
1.一种用于构建双链RNA测序文库的试剂盒，所述试剂盒包含双链RNA片段化试剂、接头连接试剂和扩增试剂；
任选地，所述试剂盒还包含双链RNA提取试剂、双链RNA末端修复试剂、接头和核酸纯化试剂中的一种或多种；
其中，所述接头连接试剂包含RNA连接酶和/或DNA连接酶。
2.权利要求1所述的试剂盒，所述接头连接试剂包含RNA连接酶。
3.权利要求1所述的试剂盒，所述接头连接试剂还包含DNA聚合酶。
4.权利要求3所述的试剂盒，所述DNA聚合酶具有使DNA链5’至3’方向延长的功能，优选的DNA聚合酶为DNA聚合酶I。
5.权利要求1所述的试剂盒，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶；所述RNA连接酶为T4 RNA连接酶。
6.权利要求1所述的试剂盒，所述双链RNA片段化试剂包含选自Tris-HCl、镁离子和二甲基亚砜、聚乙二醇、BSA和钾离子的至少一种。
7.一种用于构建双链RNA测序文库的试剂盒，所述试剂盒包含双链RNA片段化试剂、双链RNA末端修复试剂、接头连接试剂、核酸纯化试剂和扩增试剂；
其中，所述接头连接试剂包含RNA连接酶和DNA连接酶。
8.一种用于构建双链RNA测序文库的试剂盒，所述试剂盒包含双链RNA片段化试剂、双链RNA末端修复试剂、接头连接试剂、核酸纯化试剂和扩增试剂；
其中，
所述接头连接试剂包含T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶I和酶反应缓冲液；所述双链RNA片段化试剂包含选自Tris-HCl、镁离子、二甲基亚砜、聚乙二醇、BSA和钾离子。
9.权利要求1-8任一项所述的试剂盒，所述扩增试剂包含DNA聚合酶，优选的所述DNA聚合酶包含逆转录酶和Taq酶。
10.权利要求1-9任一项试剂盒在双链RNA测序文库构建中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010442309.1A CN111549380B (zh) | 2020-05-22 | 2020-05-22 | 一种构建双链rna测序文库的试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010442309.1A CN111549380B (zh) | 2020-05-22 | 2020-05-22 | 一种构建双链rna测序文库的试剂盒及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111549380A true CN111549380A (zh) | 2020-08-18 |
| CN111549380B CN111549380B (zh) | 2022-03-15 |
Family
ID=72006627
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010442309.1A Active CN111549380B (zh) | 2020-05-22 | 2020-05-22 | 一种构建双链rna测序文库的试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111549380B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112111563A (zh) * | 2020-10-29 | 2020-12-22 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 一种冷藏保存预混试剂盒及使用方法 |
| CN114134206A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-03-04 | 武汉臻和医学检验实验室有限公司 | 一种ffpe样本rna文库及其构建方法 |
| CN114672540A (zh) * | 2020-12-24 | 2022-06-28 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 一种二代测序文库构建的试剂盒及其构建方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1662652A (zh) * | 2002-06-21 | 2005-08-31 | 北京诺塞基因组研究中心有限公司 | 随机化的dna文库和双链rna文库,其用途及生产方法 |
| WO2006007569A2 (en) * | 2004-07-01 | 2006-01-19 | Somagenics, Inc. | Methods of preparation of gene-specific oligonucleotide libraries and uses thereof |
| CN108060191A (zh) * | 2017-11-07 | 2018-05-22 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种双链核酸片段加接头的方法、文库构建方法和试剂盒 |
| CN111139532A (zh) * | 2020-02-24 | 2020-05-12 | 南京诺唯赞生物科技有限公司 | 一种dna和rna同时构建测序文库的方法及试剂盒 |
-
2020
- 2020-05-22 CN CN202010442309.1A patent/CN111549380B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1662652A (zh) * | 2002-06-21 | 2005-08-31 | 北京诺塞基因组研究中心有限公司 | 随机化的dna文库和双链rna文库,其用途及生产方法 |
| WO2006007569A2 (en) * | 2004-07-01 | 2006-01-19 | Somagenics, Inc. | Methods of preparation of gene-specific oligonucleotide libraries and uses thereof |
| CN108060191A (zh) * | 2017-11-07 | 2018-05-22 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种双链核酸片段加接头的方法、文库构建方法和试剂盒 |
| CN111139532A (zh) * | 2020-02-24 | 2020-05-12 | 南京诺唯赞生物科技有限公司 | 一种dna和rna同时构建测序文库的方法及试剂盒 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112111563A (zh) * | 2020-10-29 | 2020-12-22 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 一种冷藏保存预混试剂盒及使用方法 |
| CN114672540A (zh) * | 2020-12-24 | 2022-06-28 | 上海思路迪生物医学科技有限公司 | 一种二代测序文库构建的试剂盒及其构建方法 |
| CN114134206A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-03-04 | 武汉臻和医学检验实验室有限公司 | 一种ffpe样本rna文库及其构建方法 |
| CN114134206B (zh) * | 2021-12-06 | 2023-11-24 | 武汉臻和医学检验实验室有限公司 | 一种ffpe样本rna文库及其构建方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111549380B (zh) | 2022-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6324962B2 (ja) | 標的ｒｎａ枯渇化組成物を調製するための方法およびキット | |
| US10400279B2 (en) | Method for constructing a sequencing library based on a single-stranded DNA molecule and application thereof | |
| CN111808854B (zh) | 带有分子条码的平衡接头及快速构建转录组文库的方法 | |
| WO2016037416A1 (zh) | 泡状接头及其在核酸文库构建及测序中的应用 | |
| CN111549380B (zh) | 一种构建双链rna测序文库的试剂盒及其应用 | |
| TW201321518A (zh) | 微量核酸樣本的庫製備方法及其應用 | |
| CN116515977B (zh) | 基于单端接头转座酶的单细胞基因组测序试剂盒和方法 | |
| CN112359093B (zh) | 血液中游离miRNA文库制备和表达定量的方法及试剂盒 | |
| WO2012037881A1 (zh) | 核酸标签及其应用 | |
| CN113638055B (zh) | 一种制备双链rna测序文库的方法 | |
| CN112877403A (zh) | 构建靶序列的测序文库的方法 | |
| TW201321520A (zh) | 用於病毒檢測的方法和系統 | |
| CN116790821B (zh) | 一种针对于PEDV的RAA-PfAgo检测引物及其应用 | |
| US20200123591A1 (en) | Epigenetic profiling using targeted chromatin ligation | |
| CN115873922B (zh) | 一种单细胞全长转录本建库测序方法 | |
| CN110777154A (zh) | 用于结核分枝杆菌耐药检测的突变基因、及其检测方法和试剂盒 | |
| CN118957165B (zh) | 用于检测甲型流感病毒的探针组合、试剂盒及检测方法 | |
| CN118345196A (zh) | 一种非洲猪瘟lamp-crispr检测试剂及其检测方法和应用 | |
| CN118272509A (zh) | 基于组合索引的单细胞dna-蛋白互作测序试剂盒和方法 | |
| CN119120774A (zh) | 基于RAA/PCR-CRISPR-Cas13a检测戊型肝炎病毒RNA的试剂盒 | |
| WO2014086037A1 (zh) | 构建核酸测序文库的方法及其应用 | |
| CN116497105B (zh) | 基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒及测序方法 | |
| Moller et al. | Nucleic Acid Extraction and Next‐Generation Sequencing Library Prep | |
| CN121046375A (zh) | 一种检测寡核苷酸池合成质量的单链寡核苷酸分子及方法 | |
| CN118727162A (zh) | 单细胞4c文库构建方法和检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |