CN111534505A - 一种固定化漆酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固定化漆酶及其制备方法和应用。采用的技术方案是：将金属有机骨架材料MIL‑125与pH为3.0～8.0的漆酶溶液混合，在转速150～200r/min，温度20～80℃下，吸附0.5～3h，离心，洗涤，干燥，得固定化漆酶。本发明所制备的固定化酶具有催化效率高，可循环使用，稳定性高等优点。
Description
技术领域
本发明属于酶工程领域，特别涉及一种固定化漆酶及其制备方法和应用。
背景技术
氯酚类物质是一类难降解化合物，长期以来，被广泛应用于木材防腐、杀虫剂以及除草剂的生产中，其中2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)是一种有毒、难降解的污染物，广泛存在于农药、燃料和增塑剂等的生产废水中。美国、中国等国家已把其列入水中有害物质或优先污染物“黑名单”。因此，如何消除环境中氯酚类化合物的污染成为受到广泛重视的课题。
随着大众绿色环保意识的增强与社会中生物技术的发展，酶作为绿色、环保、高效的生物制剂越来越多的应用到生物工业、制药业、造纸业等行业中。然而，如何解决游离酶稳定性差，重复利用度差，局部反应率低等问题已经成了目前人们研究的热点。漆酶是一种能绿色催化酚类的多酚氧化酶，在污水处理，木质素降解等方面表现出潜在的应用价值。
酶的固定化就是在保持酶活力和特性的情况下，将酶固定在载体基质上，使酶及其衍生物可以循环使用的一项技术。目前固定化漆酶，主要制备方法有四种：吸附、交联、包埋和共价结合。由于传统方法所制备的固定化酶的回收率相对较低，固定化酶在使用一定时间后，酶活力下降明显，大大降低了酶的应用性能，因此有必要寻求一种合适的载体，使固定化酶具有稳定性高、操作性强及工艺简便等特性，以期应用于工业化生产。
在过去的几十年中，与控制合成介孔材料取得的成果相比，介孔材料的发展一直非常缓慢。严格来说，目前在介孔材料的应用方面还没有突破性的进展。介孔材料具有连续可调的孔径，比表面积大，孔隙化学组成容易调节，生物相容性和稳定性好等优点。与传统无机纳米材料相比，金属有机骨架材料(MOFs)的分子结构中含有大量有机配体(官能团)，可以与生物蛋白分子形成特定的分子间氢键，共价键或疏水分子间相互作用，有望在酶固定领域具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种以金属有机骨架材料MIL-125为载体固定漆酶的方法，并将其应用于酚类、芳胺类化合物的氧化反应，得到具有高酶活性和稳定性且可循环使用的固定化漆酶。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种固定化漆酶，是以金属有机骨架材料MIL-125为载体，吸附漆酶制得的固定化漆酶。
固定化漆酶的制备方法，包括如下步骤：将金属有机骨架材料MIL-125与pH为3.0～8.0的漆酶溶液混合，在转速150～200r/min，温度20～80℃下，吸附0.5～3h，离心，洗涤，干燥，得固定化漆酶。
进一步的，上述的制备方法，所述金属有机骨架材料MIL-125的制备方法，包括如下步骤：采用热熔法，将对苯二甲酸和钛酸四丁酯加入到N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和甲醇的混合溶液中，室温搅拌后，将混合溶液转移到反应釜中，140～160℃下反应16-20h后，冷却至室温，离心，所得沉淀用DMF和甲醇洗涤，干燥，得金属有机骨架材料MIL-125。
进一步的，上述的制备方法，所述pH为3.0～8.0的漆酶溶液的制备方法，包括如下步骤：将漆酶溶解于pH为3.0～8.0的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液中制得。
进一步的，上述的制备方法，按质量比，漆酶:MIL-125＝(2～18):1。
更进一步的，上述的制备方法，按质量比，漆酶:MIL-125＝14:1。
进一步的，上述的制备方法，将金属有机骨架材料MIL-125与pH为6.0的漆酶溶液混合，在转速170r/min，50℃下，吸附1～3h，离心，洗涤，干燥，得固定化漆酶。
固定化漆酶在催化酚类或芳胺类化合物氧化反应中的应用。方法如下：将固定化漆酶与酚类或芳胺类化合物溶液混合，在pH为3.0～8.0，转速150～200r/min，温度20～70℃下，进行酶催化反应。
进一步的，所述酚类化合物是氯酚类化合物。
更进一步的，所述氯酚类化合物是2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)。
进一步的，按质量比，2,4-DCP:固定化漆酶＝(50～500):1。
更进一步的，按质量比，2,4-DCP:固定化漆酶＝200:1。
本发明的有益效果如下：
1、目前，金属有机骨架材料中应用的金属离子主要是包括3d过渡金属、3p金属或镧系的二价或三价离子。其中，钛因其具有低毒性、良好的氧化还原活性和光催化性能，广泛应用于金属有机骨架材料中。MIL-125是一种晶状二羧酸钛，由角或边共享的八面体钛单元构成，通过1,4-苯二甲酸酯(BDC)连接体与12个其他环状八聚体连接形成多孔三维结构。与其他金属有机骨架材料相比，MIL-125具有较大的表面积和良好的孔隙度，且热稳定性强。本发明以MIL-125为载体，对漆酶进行吸附，制备固定化漆酶，具有低毒、稳定等特性，可应用于食品、医药等行业。
2、本发明提供的固定化漆酶制备过程简单，节约资源，且适合工业化大生产。在多个领域，例如制药业，食品业和农业等有广泛的应用，因此具有广阔的商业前景。漆酶的特殊的催化性质使漆酶不但在木素降解、纸浆废水处理，造纸业工业废水脱毒等方面有着广泛应用，同时在生物传感器和生物燃料电池的领域中也有广泛的应用。
3、本发明所制备的固定化漆酶可循环使用并且提高了漆酶对温度、pH等条件的耐受性。
附图说明
图1是本发明制备的MIL-125的XRD谱。
图2是本发明制备的MIL-125的SEM扫描电镜图。
图3是pH对MIL-125吸附漆酶的影响。
图4是温度对MIL-125吸附漆酶的影响。
图5是本发明制备的固定化漆酶在不同pH下对2,4-DCP催化性能的影响。
图6是本发明制备的固定化漆酶在不同温度下对2,4-DCP催化性能的影响。
图7是本发明制备的固定化漆酶重复操作5次后的相对酶活性。
具体实施方式
下面结合实施例及附图，对本发明进行进一步详细的描述。以下描述的具体实施例不用于限定本发明，仅仅用以解释本发明。
以下实施例中漆酶粗粉购自丹麦诺维信试剂公司；对于实施例中所用的各种试剂及操作，除另有说明外，均为本领域常规的试剂和操作。
1、漆酶吸附率的计算方法参照公式(1)；
其中：A(％)为漆酶吸附率；
C0(mg/L)为酶蛋白的初始浓度；
Ce(mg/L)为吸附后离心所得上清液中酶蛋白的浓度
2、2,4-DCP去除率的计算方法参照公式(2)
其中：D(％)为2,4-DCP去除率；
C1(mg/L)为2,4-DCP的初始浓度；
C2(mg/L)为酶解后2,4-DCP的最终浓度
3、固定化漆酶酶活性的计算方法参照公式(3)
其中：Q(U/mL·min)为酶活性；
t(min)为酶解反应时间
实施例1
固定化漆酶的制备方法，包括如下步骤：
1、金属有机骨架材料MIL-125的制备
将对苯二甲酸和钛酸四丁酯加入到N,N-二甲基甲酰胺和甲醇的混合溶液中，室温搅拌后，将混合溶液转移到反应釜中，140～160℃下反应16-20h后，冷却至室温，离心，所得沉淀用N,N-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤，干燥，得金属有机骨架材料MIL-125。
2、pH为3.0～8.0的漆酶溶液制备
将漆酶溶解于pH为3.0～8.0的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液中制得。
3、固定化漆酶的制备
将金属有机骨架材料MIL-125与pH为3.0～8.0的漆酶溶液混合，在转速150～200r/min，温度20～80℃下，吸附0.5～3h，离心，洗涤，干燥，得固定化漆酶。
(一)pH对MIL-125吸附漆酶的影响
1、金属有机骨架材料MIL-125的制备
将2.20g的对苯二甲酸和2.4mL的钛酸四丁酯加入到40mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和甲醇(9:1，v/v)的混合溶液中，室温搅拌20min后，将混合溶液转移到反应釜中，150℃下反应16h后，冷却至室温，离心，所得沉淀依次用DMF和甲醇分别洗涤两次，置于70℃的真空干燥箱中干燥12h，即得金属有机骨架材料MIL-125。
图1是制备的MIL-125的XRD谱。由图1可见，峰位置位于2θ＝6.7°，9.7°，11.6°等，为MIL-125的特征峰。
图2是制备的MIL-125的SEM扫描电镜图。由图2可见，所制备的MIL-125呈圆盘状，粒径在2μm左右。
2、漆酶溶液的制备
分别称取3.00g漆酶溶解在500mL pH＝3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液中，离心取上清液，得不同pH的浓度为6mg/mL的漆酶溶液，分别测定其酶蛋白含量(C0)，并在4℃下保存备用。
3、固定化漆酶的制备
分别取pH＝3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，浓度为6mg/mL的漆酶溶液9mL，加入6mgMIL-125，混合均匀，置于转速为170r/min的恒温振荡器中，于50℃下，吸附40min后，分别将混合液离心，所得沉淀用去离子水洗涤后，冷冻干燥，分别得到不同pH下制备的固定化漆酶。分别对离心所得上清液，测定其酶蛋白含量(Ce)。
参照公式(1)计算不同pH下制备的固定化漆酶中漆酶吸附率。结果如图3所示，从图3中可以看出，随着pH的升高MIL-125对漆酶的吸附率显著升高，直到pH为6.0时达到平缓，因此可选泽pH＝6.0作为MIL-125吸附漆酶的最佳pH。
(二)温度对MIL-125吸附漆酶的影响
1、金属有机骨架材料MIL-125的制备
将2.20g的对苯二甲酸和2.4mL的钛酸四丁酯加入到40mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和甲醇(9:1，v/v)的混合溶液中，室温搅拌20min后，将混合溶液转移到反应釜中，150℃下反应16h后，冷却至室温，离心，所得沉淀依次用DMF和甲醇分别洗涤两次，置于70℃的真空干燥箱中干燥12h，即得金属有机骨架材料MIL-125。
2、漆酶溶液的制备
称取3.00g漆酶溶解在500mL pH＝6.0的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液中，离心取上清液，得pH＝6.0浓度为6mg/mL的漆酶溶液，测定其酶蛋白含量(C0)，并在4℃下保存备用。
3、固定化漆酶的制备
分别取pH＝6.0浓度为6mg/mL的漆酶溶液9mL，加入6mg MIL-125，混合均匀，置于转速为170r/min的恒温振荡器中，分别于20、30、40、50、60、70、80℃下，吸附40min后，分别将混合液离心，所得沉淀用去离子水洗涤后，冷冻干燥，分别得到不同温度下制备的固定化漆酶。分别对离心所得上清液，测定其酶蛋白含量(Ce)。
参照公式(1)计算漆酶吸附率，结果如图4，随着温度的升高，漆酶的吸附率逐渐升高，为防止在固定过程中漆酶的失活，因此选择50℃作为MIL-125固定化漆酶的最佳温度。
实施例2
1、金属有机骨架材料MIL-125的制备
将2.20g的对苯二甲酸和2.4mL的钛酸四丁酯加入到40mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和甲醇(9:1，v/v)的混合溶液中，室温搅拌20min后，将混合溶液转移到反应釜中，150℃下反应16h后，冷却至室温，离心，所得沉淀依次用DMF和甲醇分别洗涤两次，置于70℃的真空干燥箱中干燥12h，即得金属有机骨架材料MIL-125。
2、漆酶溶液的制备
称取3.00g漆酶溶解在500mL pH＝6.0的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液中，离心取上清液，得pH＝6.0浓度为6mg/mL的漆酶溶液，测定其酶蛋白含量(C0)，并在4℃下保存备用。
3、固定化漆酶的制备
取pH＝6.0浓度为6mg/mL的漆酶溶液9mL，加入6mg MIL-125，混合均匀，置于转速为170r/min的恒温振荡器中，于50℃下，吸附2h后，将混合液离心，所得沉淀用去离子水洗涤后，冷冻干燥，得固定化漆酶。对离心所得上清液，测定其酶蛋白含量(Ce)。参照公式(1)，计算漆酶吸附率为72.6％。
实施例3固定化漆酶催化2,4-DCP氧化反应
采用实施例2制备的固定化漆酶进行如下实验。
方法如下：将固定化漆酶与酚类或芳胺类化合物溶液混合，在pH为3.0～8.0，转速150～200r/min，温度20～70℃下，进行酶催化反应。
(一)固定化漆酶在不同pH下对2,4-DCP催化性能的影响
方法：取20mg固定化漆酶，加入到10mL浓度为2.5mmol/L的2,4-DCP溶液中，混合均匀，分别调节混合溶液的pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，分别在转速170r/min，30℃下，酶解10min。
离心取上清液，使用紫外分光光度器测量波长595nm处的吸光度，计算上清液中2,4-DCP的浓度，参照公式(2)计算2,4-DCP的去除率，结果如图5所示。由图5可见，随着pH的升高，2,4-DCP的去除率逐渐升高，在pH为6.0时达到最高，随后去除率随着溶液pH的升高降低，因此固定化漆酶的最佳酶解pH为6.0。
(二)固定化漆酶在不同温度下对2,4-DCP催化性能的影响
方法：取20mg固定化漆酶，加入到10mL浓度为2.5mmol/L的2,4-DCP溶液中，混合均匀，调节混合溶液的pH为6.0，分别在转速170r/min，温度为20、30、40、50、60、70℃下，酶解10min。
离心取上清液，使用紫外分光光度器测量波长595nm处的吸光度，计算上清液中2,4-DCP的浓度，参照公式(2)计算2,4-DCP的去除率，结果如图6所示。由图6可见，随着温度的升高2,4-DCP的去除率逐渐升高，在30℃时达到最高，随后去除率随着温度的升高降低，因此固定化漆酶酶解反应的最佳温度为30℃。
(三)重复性实验
方法：取20mg固定化漆酶，加入到10mL浓度为2.5mmol/L的2,4-DCP溶液中，混合均匀，调节混合溶液的pH为6.0，分别在转速170r/min，温度为30℃下，酶解10min。离心，上清液使用紫外分光光度器测量波长595nm处的吸光度，计算上清液中2,4-DCP的浓度。沉淀物为固定化漆酶，洗涤干燥后，重复进行实验。
参照公式(3)计算酶活性，结果如图7所示。由图7可见，重复5次后，固定化漆酶仍保持60％以上的酶活性，这说明MIL-125为固定化漆酶的良好载体。
Claims (10)
1.一种固定化漆酶，其特征在于，是以金属有机骨架材料MIL-125为载体，吸附漆酶制得的固定化漆酶。
2.权利要求1所述的固定化漆酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将金属有机骨架材料MIL-125与pH为3.0～8.0的漆酶溶液混合，在转速150～200r/min，温度20～80℃下，吸附0.5～3h，离心，洗涤，干燥，得固定化漆酶。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述金属有机骨架材料MIL-125的制备方法，包括如下步骤：将对苯二甲酸和钛酸四丁酯加入到N,N-二甲基甲酰胺和甲醇的混合溶液中，室温搅拌后，将混合溶液转移到反应釜中，140～160℃下反应16-20h后，冷却至室温，离心，所得沉淀用N,N-二甲基甲酰胺和甲醇洗涤，干燥，得金属有机骨架材料MIL-125。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述pH为3.0～8.0的漆酶溶液的制备方法，包括如下步骤：将漆酶溶解于pH为3.0～8.0的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液中制得。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，按质量比，漆酶:MIL-125＝(2～18):1。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，按质量比，漆酶:MIL-125＝14:1。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将金属有机骨架材料MIL-125与pH为6.0的漆酶溶液混合，在转速170r/min，50℃下，吸附1～3h，离心，洗涤，干燥，得固定化漆酶。
8.权利要求1所述的固定化漆酶在催化酚类或芳胺类化合物氧化反应中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，方法如下：将权利要求1所述的固定化漆酶与酚类或芳胺类化合物溶液混合，在pH为3.0～8.0，转速150～200r/min，温度20～70℃下，进行酶催化反应。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述酚类化合物是氯酚类化合物。
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