CN111527197A - 细胞聚集促进剂 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供适当控制细胞聚集体的大小而不依赖于机械性/物理性方式的方法，具体而言，本发明涉及包含SRF抑制剂的用于细胞的悬浮培养的细胞聚集促进剂。另外，本发明涉及包括在包含SRF抑制剂的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序的细胞聚集体的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及细胞聚集促进剂。另外，本发明涉及细胞聚集体的制备方法、以及利用该方法制备的细胞聚集体。另外，本发明涉及细胞培养组合物。
背景技术
随着近年来对人ES细胞、人iPS细胞等人多能干细胞的研究，再生医学实用化的可能性不断增高。这些细胞具有能够无限增殖的能力、和分化成各种细胞的能力，因此，使用了多能干细胞的再生医学有望从根本上改变对难治性疾病、生活方式病等的治疗方法。已经可以在试验管内由多能干细胞分化诱导以神经细胞为代表的心肌细胞、血液细胞、以及视网膜细胞等各个种类的细胞。
与使用多能干细胞对各种器官进行再生的再生医学相关的实用化所面临的课题之一是如何高效率地生产器官再生所需要的大量细胞。例如，肝脏的再生需要约2×1011个细胞。为了通过平坦的基板上的贴壁培养对上述个数的细胞进行培养，需要约106cm2以上的基板，这相当于约20000个通常的10cm培养皿。由于通过基板表面上的贴壁培养而得到的细胞数依赖于培养面积，因此难以扩大规模，难以供给再生医学所需要的足够量的细胞。
因此，由于在培养基中一边使细胞悬浮一边进行培养的悬浮培养容易扩大规模，因此期待适合细胞的大量生产。
例如，非专利文献1中公开了使用旋转瓶作为悬浮培养的细胞培养容器，通过强搅拌力搅拌液体培养基，同时进行人多能干细胞的悬浮培养，制造均匀大小的球状体的方法。
非专利文献2中公开了使用形成了微小微孔的基板在各微孔中制备均匀大小的球状体的方法。
非专利文献3中公开了使用粘性、比重经过调整的培养基作为培养基，在保持多能干细胞的悬浮状态的同时抑制细胞彼此的碰撞并进行培养的方法。
专利文献1中公开了在液体培养基中对细胞进行回转培养来制备细胞的聚集体的技术。
专利文献2中公开了将多能干细胞悬浮培养至细胞团块的平均直径为约200μm以上且300μm以下的方法。
专利文献3中公开了通过在包含溶血磷脂酸(LPA)、鞘氨醇-1-磷酸(S1P)等溶血磷脂的培养基中对细胞进行悬浮培养来抑制细胞的聚集的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2003-304866号公报
专利文献2：国际公开WO2013/077423号小册子
专利文献3：国际公开WO2016/121737号小册子
非专利文献
非专利文献1：Olmer R.et al.,Tissue Engineering:Part C,Volume 18(10):772-784(2012)
非专利文献2：Ungrin MD et al.,PLoS ONE,2008,3(2),e1565
非专利文献3：Otsuji GT et al.,Stem Cell Reports,Volume 2:734-745(2014)
发明内容
发明要解决的课题
本发明人等发现，细胞之间膜蛋白、细胞膜的非特异性吸附、细胞表面的钙粘蛋白介导的细胞之间的粘附在对多能干细胞等贴壁细胞进行悬浮培养方面是重要的机制。即，对于悬浮培养的技术的要求而言，存在必须制备适度大小的细胞聚集体而不妨害细胞的膜蛋白、细胞表面的钙粘蛋白等的结合的课题。然而，非专利文献1～3、专利文献1或2中公开的悬浮培养技术存在以下问题。
非专利文献1的方法存在因剪切应力而容易发生细胞死亡的问题。
非专利文献2的方法存在难以大规模化、难以更换培养基等的问题。
非专利文献3的方法存在因培养时培养基的移动少而难以将氧、营养成分供给至细胞聚集体的问题。
专利文献1中未公开用于将细胞团块的大小控制为适度大小的方式。
专利文献2中记载了在培养基中添加水溶性高分子来提高粘性作为用于防止细胞团块彼此粘附的方式。因此，与非专利文献3同样地存在难以将氧、营养成分供给至细胞聚集体的问题。
因此，本发明人等为了解决上述课题，开发了一种悬浮培养的技术，其能够通过在专利文献3中包含溶血磷脂的培养基中对细胞进行悬浮培养，从而抑制细胞的聚集，生产适度大小的聚集体而不对细胞造成损害。
但是，专利文献3中仅公开了溶血磷脂作为抑制细胞聚集的成分。本发明人等想到，如果除溶血磷脂以外，还可提供通过在悬浮培养中存在于培养基中而抑制或促进细胞聚集的成分，则能够更适当地控制细胞聚集体的大小而不依赖于机械性/物理性的方式。
解决课题的方法
本发明人等进行了深入研究，结果发现，SRF抑制剂通过在悬浮培养中存在于培养基中而起到促进细胞聚集的作用，从而完成了以下的各发明。
(1)一种细胞聚集促进剂，其包含SRF抑制剂，所述细胞聚集促进剂用于细胞的悬浮培养。
(2)根据(1)所述的细胞聚集促进剂，其中，所述SRF抑制剂的浓度为9.0μg/mL以上且10.0mg/mL以下。
(3)根据(1)或(2)所述的细胞聚集促进剂，其进一步包含ROCK抑制剂。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的细胞聚集促进剂，其中，所述SRF抑制剂为CCG-1423。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的细胞聚集促进剂，其中，所述细胞为干细胞。
(6)一种细胞聚集体的制备方法，该方法包括：在包含SRF抑制剂的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序。
(7)根据(6)所述的制造方法，其中，所述培养基中的所述SRF抑制剂的浓度为4.5ng/mL以上且4.6mg/mL以下。
(8)根据(6)或(7)所述的制造方法，其中，所述培养基中进一步包含ROCK抑制剂。
(9)根据(6)～(8)中任一项所述的制造方法，其中，所述SRF抑制剂为CCG-1423。
(10)根据(6)～(9)中任一项所述的制造方法，其中，所述细胞为干细胞。
(11)一种细胞聚集体，其是通过(6)～(10)中任一项所述的制造方法得到的。
(12)一种细胞培养组合物，其包含细胞、培养基、以及SRF抑制剂。
(13)根据(12)所述的细胞培养组合物，其中，所述SRF抑制剂的浓度为4.5ng/mL以上且4.6mg/mL以下。
(14)根据(12)或(13)所述的细胞培养组合物，其进一步包含ROCK抑制剂。
(15)根据(12)～(14)中任一项所述的细胞培养组合物，其中，所述SRF抑制剂为CCG-1423。
(16)根据(12)～(15)中任一项所述的细胞培养组合物，其中，所述细胞为干细胞。
(17)根据(12)～(16)中任一项所述的细胞培养组合物，其中，所述细胞的形态为细胞聚集体。
(18)一种促进细胞聚集的方法，该方法包括：在包含SRF抑制剂的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序。
(19)根据(18)所述的方法，其中，所述培养基中的所述SRF抑制剂的浓度为4.5ng/mL以上且4.6mg/mL以下。
(20)根据(18)或(19)所述的方法，其中，进一步包含ROCK抑制剂。
(21)根据(18)～(20)中任一项所述的方法，其中，所述SRF抑制剂为CCG-1423。
(22)根据(18)～(21)中任一项所述的方法，其中，所述细胞为干细胞。
(23)一种细胞培养培养基，其包含培养基和SRF抑制剂。
(24)根据(23)所述的细胞培养培养基，其中，所述SRF抑制剂的浓度为4.5ng/mL以上且4.6mg/mL以下。
(25)根据(23)或(24)所述的细胞培养培养基，其进一步包含ROCK抑制剂。
(26)根据(23)～(25)中任一项所述的细胞培养培养基，其进一步包含生长因子。
(27)根据(23)～(26)中任一项所述的细胞培养培养基，其用于干细胞的培养。
(28)根据(23)～(27)中任一项所述的细胞培养培养基，其用于制备细胞聚集体。
(29)根据(6)～(10)中任一项所述的制造方法、(11)所述的细胞聚集体、(17)所述的细胞培养组合物、或(28)所述的细胞培养培养基，其中，在细胞聚集体的70％以上(重量基准)中，宽度最宽的部分的尺寸为500μm以下，优选为300μm以下。
(30)根据(6)～(10)及(29)中任一项所述的制造方法、(11)或(29)所述的细胞聚集体、(17)或(29)所述的细胞培养组合物、或者(28)或(29)所述的细胞培养培养基，其中，在细胞聚集体的70％以上(重量基准)中，宽度最宽的部分的尺寸为40μm以上，优选为100μm以上。
本说明书包含作为本申请优先权基础的日本专利申请号2017-254688号的公开内容。
发明的效果
可以为了促进悬浮培养时细胞的聚集而将本发明的细胞聚集促进剂的一个实施方式配合在培养基中。
根据本发明的细胞聚集体的制备方法的一个实施方式，可以以高产量制备细胞聚集体。
本发明的细胞聚集体的一个实施方式具有适度的尺寸，活细胞率高。
本发明的细胞培养组合物的一个实施方式可以用于以高产量制备细胞聚集体。
附图说明
图1示出了在添加或未添加CCG-1423的培养基中，对人iPS细胞进行悬浮培养时，培养第1天的相差显微镜的观察图像。
图2示出了在添加或未添加CCG-1423的培养基中，对人iPS细胞进行悬浮培养时，培养第1天的死细胞数的测定结果。
图3示出了在添加或未添加CCG-1423的培养基中，对人iPS细胞进行悬浮培养而制备细胞聚集体并继续进行悬浮培养时，从培养第1天至第5天的相差显微镜的观察图像。
图4示出了在添加或未添加CCG-1423的培养基中，对人iPS细胞进行悬浮培养而制备细胞聚集体并继续进行悬浮培养时，从培养第1天至第5天的葡萄糖消耗量的测定结果。
图5示出了在添加或未添加CCG-1423的培养基中，对人iPS细胞进行悬浮培养而制备细胞聚集体并继续进行悬浮培养时，培养第5天的细胞产量的测定结果。
图6示出了添加CCG-1423进行悬浮培养而制备了细胞聚集体后，继续进行悬浮培养时，培养第5天的人iPS细胞的未分化标志物(SOX2、OCT4及Nanog)阳性率的测定结果。
图7是示出在包含CCG-1423的培养基中，对人iPS细胞进行悬浮培养(培养第1天)而制备细胞聚集体时，培养第1天的细胞聚集体的直径分布的图表。
具体实施方式
以下，使用优选的实施方式对本发明详细地进行说明。
＜1.细胞＞
本发明中，形成细胞聚集体的细胞可以是具有粘附性的细胞(贴壁细胞)。贴壁细胞可以是动物来源细胞等，优选可以为哺乳类动物来源细胞等，更优选可以为生物组织来源细胞及来自于生物组织来源细胞的细胞等，特别优选可以为上皮组织来源细胞及来自于上皮组织细胞的细胞等、或者结缔组织来源细胞及来自于结缔组织来源细胞的细胞等、或者肌肉组织来源细胞及来自于肌肉组织来源细胞的细胞等、或者神经组织来源细胞及来自于神经组织来源细胞的细胞等，进一步优选可以为动物来源干细胞及由动物来源干细胞分化而成的细胞等，更加优选可以为动物来源多能干细胞及由动物来源多能干细胞分化而成的细胞等，更进一步优选可以为哺乳类动物来源多能干细胞及由哺乳类动物来源多能干细胞分化而成的细胞等，更加优选可以为人来源多能干细胞及由人来源多能干细胞分化而成的细胞等。
在本发明中，“干细胞”是指能够分化为其它细胞且具有自我复制能力的细胞。在“干细胞”中，特别将具有多能性(pluripotency)、且在适当条件下的体外(in vitro)培养中能够在保持多能性的状态下无限增殖的细胞称为“多能干细胞”，所述多能性是指可以分化为构成生物体的全部种类的细胞。作为多能干细胞的具体例子，可以列举例如：胚胎干细胞(ES细胞)、作为于胎儿原始生殖细胞来源的多能干细胞的EG细胞(Shamblott M.J.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1998)95,p.13726-13731)、作为睾丸来源的多能干细胞的GS细胞(Conrad S.,Nature(2008)456,p.344-349)、作为体细胞来源的人工多能干细胞的iPS细胞(induced pluripotent stem cells)等，但并不限定于此。本发明中使用的多能干细胞特别优选为ES细胞或iPS细胞。ES细胞是来自被称为胚泡的早期胚胎的多能干细胞。iPS细胞是通过向体细胞导入重编程因子使体细胞重编程为未分化状态，赋予了多能性的培养细胞。作为重编程因子，可以使用例如OCT3/4及KLF4及SOX2及c-Myc(Takahashi K,etal.Cell.2007；131:861-72.)，可以使用例如OCT3/4及SOX2及LIN28及Nanog(Yu J,etal.Science.2007；318:1917-20.)。这些因子导入细胞的形态没有特别限定，可以列举例如：使用了质粒的基因导入、合成RNA的导入、以蛋白质形式直接导入等。另外，也可以利用通过使用了microRNA、RNA、低分子化合物等的方法制备的iPS细胞。以ES细胞、iPS细胞为代表的多能干细胞可以使用市售品或受让的细胞，也可以使用新制备的细胞。作为iPS细胞，可以使用例如253G1株、201B6株、201B7株、409B2株、454E2株、HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、TkDN4-M株、TkDA3-1株、TkDA3-2株、TkDA3-4株、TkDA3-5株、TkDA3-9株、TkDA3-20株、hiPSC 38-2株、MSC-iPSC1株、BJ-iPSC1株等。作为ES细胞，可以使用例如KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SEES-1株、SEES-2株、SEES-3株、SEES-4株、SEES-5株、SEES-6株、SEES-7株、HUES8株、CyT49株、H1株、H9株、HS-181株、RPChiPS771-2株等。还可以使用新制备的临床级的iPS细胞或ES细胞。制备iPS细胞时的细胞的来源没有特别限定，例如可以使用成纤维细胞或淋巴细胞等。
另外，作为本发明的细胞种类，只要是能够通过细胞外基质、钙粘蛋白等粘附于塑料、细胞等的细胞即可，没有特别限定，可以示例出例如：上述的多能干细胞(诱导性多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)、作为睾丸来源的多能干细胞的GS细胞、胎儿原始生殖细胞来源的EG细胞、来自于骨髓等的Muse细胞等)、成体干细胞(somatic stem cell)(来自于骨髓、脂肪组织、牙髓、胎盘、卵膜、脐带血、羊膜、绒毛膜等的间充质干细胞、神经干细胞等)、神经细胞、心肌细胞、心肌祖细胞、肝细胞、肝脏祖细胞、α细胞、β细胞、成纤维细胞、软骨细胞、角膜细胞、血管内皮细胞、血管内皮祖细胞、外周细胞等，上述细胞可以是基因导入的形态、基因组上的对象基因等被敲低的形态。
本发明中使用的细胞可以来自于任意的动物，例如，可以来自于小鼠、大鼠、仓鼠等啮齿类、人、大猩猩、黑猩猩等灵长类、以及来自于犬、猫、兔、牛、马、绵羊、山羊等家畜或宠物等哺乳动物，特别优选为来自人的细胞。
在本发明中，可以使用在使其粘附或悬浮并进行了培养后被单独分离的细胞。这里，“单独分离的细胞”是指，将多个细胞以基团的形式粘附在一起的细胞剥离、分散后的状态的所述细胞。单独分离是指，将粘附于培养容器、培养载体等的状态的细胞或细胞彼此粘附在一起的状态的细胞群剥离、分散而成为单一细胞的工序。单独分离的细胞群可以是在液体培养基中悬浮的状态。单独分离的方法没有特别限定，可以优选使用剥离剂(胰蛋白酶或胶原酶等细胞剥离酶)或EDTA(乙二胺四乙酸)等螯合剂或剥离剂与螯合剂的混合物等。剥离剂没有特别限定，可以列举：胰蛋白酶、Accutase(注册商标)、TrypLETM ExpressEnzyme(Life Technologies Japan公司)、TrypLETM Select Enzyme(Life TechnologiesJapan公司)、Dispase(注册商标)、胶原酶等。本发明也可以优选使用单独分离后进行了冷冻保存的上述细胞。
＜2.细胞聚集体＞
细胞聚集体是多个细胞三维聚集而形成的块状的细胞群，也被称为球状体。细胞聚集体代表性地具有基本球状的形状。
在本说明书中，“细胞聚集”是指多个细胞三维集合而形成集合块。有不同细胞的聚集和相同细胞的聚集，本说明书中包括任意的聚集。相同细胞的聚集也包括由1个细胞增殖而形成集合块的情况。作为细胞聚集的机制，可以列举细胞之间膜蛋白、细胞膜的非特异性吸附、由细胞表面的钙粘蛋白介导的细胞之间的粘附等，但并不限定于此。
在本发明中，构成细胞聚集体的细胞只要是1种以上的上述细胞即可，没有特别限定。例如，由人多能干细胞或人胚胎干细胞等多能干细胞构成的细胞聚集体包括表达了多能干细胞标志物的细胞和/或多能干细胞标志物呈阳性的细胞。作为多能干细胞标志物，例如，可以示例出：Alkaline Phosphatase、NANOG、OCT4、SOX2、TRA-1-60、c-Myc、KLF4、LIN28、SSEA-4、SSEA-1等。
多能干细胞标志物可以通过该技术领域中的任意检测方法进行检测。作为检测表达标志物的方法，可以举出例如流式细胞术，但并不限定于此。在使用荧光标记抗体的流式细胞术中，在检测到比阴性对照(同型对照)发出更强的荧光的细胞时，判定该细胞对该标志物呈“阳性”。对于通过流式细胞术分析的荧光标记抗体呈阳性的细胞的比率有时记为阳性率。另外，荧光标记抗体可以使用该技术领域中公知的任意抗体，可以列举利用例如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)等标记的抗体，但并不限定于此。
在构成细胞聚集体的细胞为多能干细胞的情况下，表达多能干细胞标志物的细胞和/或多能干细胞标志物呈阳性的细胞的比例(比率)例如可以为80％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、100％以下。表达多能干细胞标志物的细胞和/或多能干细胞标志物呈阳性的细胞的比例为上述范围内的细胞聚集体是未分化性高、更均匀的细胞群。需要说明的是，多能干细胞标志物与未分化标志物含义相同，两者可以替换使用。
通过本发明的一个以上的实施方式制备的细胞聚集体的尺寸(size)没有特别限定，在用显微镜观察时，观察图像中宽度最宽的部分的尺寸的上限例如为1000μm以下、900μm以下、800μm以下、700μm以下、600μm以下、500μm以下、400μm以下、300μm以下、200μm以下。下限例如为40μm以上、50μm以上、60μm以上、70μm以上、80μm以上、90μm以上、100μm以上。另外，1个人iPS细胞为约10μm的尺寸。这样尺寸范围的细胞聚集体容易向内部的细胞供给氧、营养成分，作为细胞的增殖环境是优选的。
对于通过本发明的一个以上的实施方式制备的细胞聚集体的基团而言，在构成该基团的细胞聚集体中，以重量基准计，例如10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上优选具有上述范围的尺寸。对于包含20％以上的上述范围的尺寸的细胞聚集体的细胞聚集体的集团而言，在各细胞聚集体中，易于向内部的细胞供给氧、营养成分，作为细胞的增殖环境是优选的。
对于通过本发明的一个以上的实施方式制备的细胞聚集体的集团而言，在构成该集团的细胞中，活细胞的比例(生存率)优选为例如50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上。上述范围的生存率的细胞聚集体易于保持聚集状态，是适于细胞增殖的状态。
＜3.培养基＞
本发明中使用的培养基可以通过将任意的动物细胞培养用培养基作为基础培养基，适当添加SRF抑制剂或SRF抑制剂和ROCK抑制剂、或者包含SRF抑制剂或SRF抑制剂和ROCK抑制剂的细胞聚集促进剂、并且根据需要适当添加其它成分来制备。本发明中使用的培养基优选为适于细胞的悬浮培养的培养基，代表性地为液体培养基。
作为基础培养基，可以使用BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、GlasgowMEM培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基(Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium)、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、Ham’s F10培养基、Ham’s F12培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、以及它们的混合培养基(例如，DMEM/F12培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12Ham))等培养基，没有特别限定。作为DMEM/F12培养基，特别是使用优选以60/40以上且40/60以下的重量比、更优选以55/45以上且45/55以下的重量比、最优选以等量(50/50的重量比)将DMEM培养基和Ham’s F12培养基混合而成的培养基。
本发明中使用的培养基优选为不含血清的培养基、即无血清培养基，或包含血清代替品(Serum Replacement)的培养基。作为血清代替品的例子，可以举出KnockOutTMSerum Replacement(KSR)(Gibco)。
本发明中使用的培养基更优选包含选自L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒及碳酸氢钠中的至少1种，更优选包含它们全部。L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒、以及碳酸氢钠可以以溶液、衍生物、盐或混合试剂等的形式添加于培养基。例如，L-抗坏血酸可以以抗坏血酸-2-磷酸酯镁等衍生物的形式添加于培养基。硒可以以亚硒酸盐(亚硒酸钠等)的形式添加于培养基。胰岛素及转铁蛋白可以是从动物(优选为人、小鼠、大鼠、牛、马、山羊等)的组织或血清等分离出的天然来源的胰岛素及转铁蛋白，也可以是通过基因工程制备的重组蛋白质。胰岛素、转铁蛋白及硒可以以试剂ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)的形式添加于培养基。ITS是包含胰岛素、转铁蛋白、以及亚硒酸钠的用于促进细胞增殖的添加剂。
可以使用包含选自L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒及碳酸氢钠中的至少1种的市售的培养基。作为添加了胰岛素及转铁蛋白的市售的培养基，可以使用CHO-S-SFM II(Life Technologies Japan公司)、Hybridoma-SFM(Life Technologies Japan公司)、eRDFDry Powdered Media(Life Technologies Japan公司)、UltraCULTURETM(BioWhittaker公司)、UltraDOMATM(BioWhittaker公司)、UltraCHOTM(BioWhittaker公司)、UltraMDCKTM(BioWhittaker公司)等。可以优选使用STEMPRO(注册商标)hESC SFM(Life TechnologiesJapan公司)、mTeSR1(Veritas公司)、TeSR2(Veritas公司)等。此外，也优选使用人iPS细胞、人ES细胞的培养中使用的培养基。
本发明中使用的培养基优选包含至少1种生长因子。作为生长因子，没有限定，优选包含选自FGF2(Basic fibroblast growth factor-2)、TGF-β1(Transforming growthfactor-β1)、Activin A、IGF-1、MCP-1、IL-6、PAI、PEDF、IGFBP-2、LIF、以及IGFBP-7中的1种以上。特别优选的生长因子为FGF2和/或TGF-β1。
作为本发明中使用的最优选的培养基，是包含L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒及碳酸氢钠、以及至少1种生长因子作为后述的除SRF抑制剂和ROCK抑制剂以外的成分的无血清培养基，特别优选为包含L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒及碳酸氢钠、以及至少1种生长因子(优选为FGF2及TGF-β1)、且不含血清的DMEM/F12培养基。作为这样的培养基，可以优选使用添加了SRF抑制剂或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的Essential 8TM培养基(LifeTechnologies Japan公司)。Essential 8TM培养基可以将由Life Technologies Japan公司市售的DMEM/F12培养基DMEM/F-12(HAM)1∶1与Essential 8TM补充剂(包含L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒、碳酸氢钠、FGF2及TGF-β1)混合来制备。
本发明中使用的培养基可以含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如，非必需氨基酸)、维生素、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、抗生素等其它成分。
作为抗生素，可以使用青霉素、链霉素、两性霉素B等。
＜4.SRF抑制剂＞
SRF抑制剂定义为抑制血清反应因子(SRF,serum response factor)的活性的物质，所述血清反应因子是属于MADS(MCM1,Agamous,Deficiens,and SRF)box超家族的转录因子，可以列举例如：CCG-1423(N-[2-[4(4-氯苯基)氨基]-1-甲基-2-氧代乙氧基]-3,5-双(三氟甲基)-苯甲酰胺)、作为CCG-1423类似物的CCG-100602(1-[3,5-双(三氟甲基)苯甲酰基]-N-(4-氯苯基)-3-哌啶甲酰胺)、CCG-203971(6-氨基-1,4-二氢-1,3-二甲基-4-[4-(三氟甲基)苯基]-吡喃并[2,3-c]吡唑-5-甲腈)、CCG-222740(参考文献：Yu-Wai-Man C etal.Local delivery of novel MRTF/SRF inhibitors prevents scar tissue formationin a preclinical model of fibrosis.Sci Rep.2017Mar 31；7(1):518)及它们的衍生物、以及对于SRF的反义核酸、诱导RNA干扰的核酸(例如，siRNA)、显性负性突变体、以及它们的表达载体。
作为SRF抑制剂，可以使用1种或2种以上的SRF抑制剂。
上述的N-[2-[4(4-氯苯基)氨基]-1-甲基-2-氧代乙氧基]-3,5-双(三氟甲基)-苯甲酰胺的结构式如下所述。
[化学式1]
SRF抑制剂特别优选为选自CCG-1423、CCG-100602、CCG-203971及CCG-222740中的1种以上，最优选为CCG-1423。
＜5.ROCK抑制剂＞
ROCK抑制剂定义为抑制Rho-激酶(ROCK,Rho-associated protein kinase)的激酶活性的物质，可以列举例如：Y-27632(4-[(1R)-1-氨乙基]-N-吡啶-4-基环己烷-1-甲酰胺或其盐(例如二盐酸盐))(例如，参照Ishizaki et al.,Mol.Pharmacol.57,976-983(2000)；Narumiya et al.,Methods Enzymol.325,273-284(2000))、H-1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1,4-二氮杂
或其盐(例如二盐酸盐))(例如，参照Sasaki et al.,Pharmacol.Ther.93：225-232(2002))、Fasudil/HA1077(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪或其盐(例如二盐酸盐))(例如，参照Uenata et al.,Nature 389:990-994(1997))、Wf-536((+)-(R)-4-(1-氨乙基)-N-(4-吡啶基)苯甲酰胺单盐酸盐)(例如，参照Nakajima et al.,CancerChemother.Pharmacol.52(4):319-324(2003))、Y39983(4-[(1R)-1-氨乙基]-N-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基苯甲酰胺二盐酸盐)、SLx-2119(2-[3-[4-(1H-吲唑-5-基氨基)-2-喹唑啉基]苯氧基]-N-(1-甲基乙基)-乙酰胺)、氮杂苯并咪唑-氨基呋咱、DE-104、XD-4000、HMN-1152、4-(1-氨基烷基)-N-(4-吡啶基)环己烷-甲酰胺、Rhostatin、BA-210、BA-207,BA-215,BA-285,BA-1037、Ki-23095、VAS-012(例如，JamesK.Liao et al.,J Cardiovasc Pharmacol.2007Jul；50(1):17-24.)及它们的衍生物、以及对于ROCK的反义核酸、诱导RNA干扰的核酸(例如，siRNA)、显性负性突变体、以及它们的表达载体。另外，作为ROCK抑制剂，已知其它低分子化合物，在本发明中，这样的化合物或它们的衍生物也可以作为ROCK抑制剂使用(例如，参照美国专利申请公开第20050209261号、美国专利申请公开第20050192304号、美国专利申请公开第20040014755号、美国专利申请公开第20040002508号、美国专利申请公开第20040002507号、美国专利申请公开第20030125344号、美国专利申请公开第20030087919号、以及国际公开第2003/062227号、国际公开第2003/059913号、国际公开第2003/062225号、国际公开第2002/076976号、国际公开第2004/039796号)。作为ROCK抑制剂，可以使用1种或2种以上的ROCK抑制剂。
上述的4-[(1R)-1-氨乙基]-N-吡啶-4-基环己烷-1-甲酰胺的结构式如下所述。
[化学式2]
另外，上述的(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1,4-二氮杂
的结构式如下所述。
[化学式3]
ROCK抑制剂特别优选为选自Y-27632及H-1152中的1种以上，最优选为Y-27632。Y-27632及H-1152分别可以以水合物的形式使用。
＜6.促进细胞聚集的方法＞
本发明的一个方式是一种促进细胞聚集的方法，该方法包括：在包含SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序(悬浮培养工序)。
在本说明书中，“促进细胞(的)聚集”是指，促进细胞聚集作用，并由此促进细胞聚集体的形成或增大。在本说明书中，“细胞聚集促进剂”是指具有促进细胞聚集的效果的药剂。
本方式的方法包括悬浮培养工序作为必需工序，包括维持培养工序及回收工序作为可选工序。以下，对各工序进行说明。
(悬浮培养工序)
对于在包含SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序(悬浮培养工序)的具体实施方式进行说明。
SRF抑制剂、ROCK抑制剂、培养基及细胞的具体实施方式如上所述。
悬浮培养工序中的培养基中的SRF抑制剂的浓度可以根据细胞的种类、细胞数、培养基的种类等各条件进行适当调整，从而能够促进细胞的聚集。对于悬浮培养工序中的培养基中的SRF抑制剂的浓度而言，例如在SRF抑制剂为CCG-1423(Cayman Chemical、CASNo.285986-881、C18H14ClF6N2O3、分子量＝454.8)的情况下，作为上述抑制剂的浓度的下限，只要起到促进细胞聚集的效果即可，没有特别限定，优选为4.5ng/mL以上，更优选为45ng/mL以上，特别优选为450ng/mL以上，最优选为1.1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、10μg/mL以上、11μg/mL以上、12μg/mL以上、13μg/mL以上、14μg/mL以上、15μg/mL以上、16μg/mL以上、17μg/mL以上、18μg/mL以上。另一方面，作为上限，只要是细胞不死亡的浓度即可，没有特别限定，优选为4.6mg/mL以下，更优选为460μg/mL以下，特别优选为46μg/mL以下，最优选为19μg/mL以下。另外，上述抑制剂的浓度优选为4.5ng/mL以上且4.6mg/mL以下。另外，悬浮培养工序中的培养基中的SRF抑制剂的浓度特别优选为10nM以上、且10mM以下的范围。作为上述浓度的下限，优选为10nM以上，更优选为100nM以上，特别优选为1μM以上，最优选为2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上、6μM以上、7μM以上、8μM以上、9μM以上、10μM以上、11μM以上、12μM以上、13μM以上、14μM以上、15μM以上、16μM以上、17μM以上、18μM以上、19μM以上、20μM以上、21μM以上、22μM以上、23μM以上、24μM以上、25μM以上、26μM以上、27μM以上、28μM以上、29μM以上、30μM以上、31μM以上、32μM以上、33μM以上、34μM以上、35μM以上、36μM以上、37μM以上、38μM以上、39μM以上。另一方面，作为上限，优选为10mM以下，更优选为1mM以下，特别优选为100μM以下，最优选为40μM以下。
另外，悬浮培养工序中的培养基中的ROCK抑制剂的浓度可以根据细胞的种类、细胞数、培养基的种类等各条件进行适当调整，从而能够促进细胞的聚集。对于悬浮培养工序中的培养基中的ROCK抑制剂的浓度而言，例如在ROCK抑制剂为Y-27632(和光纯药工业株式会社、CAS No.331752-47-7、C14H21N3O·2HCl·H2O、分子量＝338.27)的情况下，特别优选为3.3ng/mL以上且3.4mg/mL以下的范围。作为上述浓度的下限，只要起到促进细胞聚集的效果即可，没有特别限定，优选为3.3ng/mL以上，更优选为33ng/mL以上，特别优选为330ng/mL以上，最优选为800ng/mL以上、1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、10μg/mL以上、11μg/mL以上、12μg/mL以上、13μg/mL以上、14μg/mL以上。另一方面，作为上限，只要是细胞不死亡的浓度即可，没有特别限定，优选为3.4mg/mL以下，更优选为340μg/mL以下，特别优选为34μg/mL以下，最优选为14μg/mL以下。另外，悬浮培养工序中的培养基中的ROCK抑制剂的浓度特别优选为10nM以上、且10mM以下的范围。上述浓度的下限优选为10nM以上，更优选为100nM以上，特别优选为1μM以上，最优选为2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上、6μM以上、7μM以上、8μM以上、9μM以上、10μM以上、11μM以上、12μM以上、13μM以上、14μM以上、15μM以上、16μM以上、17μM以上、18μM以上、19μM以上、20μM以上、21μM以上、22μM以上、23μM以上、24μM以上、25μM以上、26μM以上、27μM以上、28μM以上、29μM以上、30μM以上、31μM以上、32μM以上、33μM以上、34μM以上、35μM以上、36μM以上、37μM以上、38μM以上、39μM以上。作为上限，优选为10mM以下，更优选为1mM以下，特别优选为100μM以下，最优选为40μM以下。
悬浮培养工序优选为在假设在培养基中不存在本发明的SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的情况下，在细胞形成细胞聚集体的条件下进行悬浮培养的工序。
悬浮培养工序中使用的培养容器优选为细胞对容器内面的粘附性低的容器。作为这样的细胞对容器内面的粘附性低的容器，可以举出例如用具有生物相容性的物质进行了亲水性表面处理的板。例如，可以使用NunclonTMSphera(Thermo Fisher Scientific公司)作为培养容器，但没有特别限定。
培养容器的形状没有特别限定，可以列举例如：盘状、烧瓶状、孔状、袋状、旋转瓶状等形状的培养容器。
悬浮培养可以是静置培养，也可以是在培养基流动的条件下的培养(流动培养)，优选为流动培养。作为流动培养，优选为以促进细胞聚集的方式使培养基流动的条件下的培养。作为以促进细胞聚集的方式使培养基流动的条件下的培养，可以举出例如，以利用回转流、摇摆流等流动引起的应力(离心力、向心力)将细胞聚集于一点的方式使培养基流动的条件下的培养、通过直线往复运动使培养基流动的条件下的培养，特别优选为回转培养法或摇动培养法。
“回转培养法”(包含振荡培养法)是指，以利用回转流引起的应力(离心力、向心力)将细胞聚集于一点的方式使培养基流动的条件下的培养的方法。具体而言，通过将容纳有包含细胞的培养基的培养容器基本沿水平面以画出圆、椭圆、扁平的圆、扁平的椭圆等闭合轨道的方式回转而进行，或者通过将在使培养容器静置的状态下使用搅拌棒、搅拌叶片这样的搅拌子使容器内的培养基回转来进行。后者例如可以通过使用带有搅拌叶片的旋转瓶状的培养容器来实现。这样的培养容器已有市售品，也可以利用。在该情况下，培养基、培养液的量等可以使用培养容器制造商推荐的量。
回转培养法的回转速度没有特别限定，上限可以优选为200rpm以下，更优选为150rpm以下，进一步优选为120rpm以下，更优选为115rpm以下，更优选为110rpm以下，更优选为105rpm以下，更优选为100rpm以下，更优选为95rpm以下，特别优选为90rpm以下。下限可以优选为1rpm以上，更优选为10rpm以上，进一步优选为50rpm以上，更优选为60rpm以上，更优选为70rpm以上，进一步优选为80rpm以上，更优选为90rpm以上。回转培养时的回转宽度没有特别限定，下限例如可以为1mm以上，优选为10mm以上，更优选为20mm以上，最优选为25mm以上。回转宽度的上限例如可以为200mm以下，优选为100mm以下，优选为50mm以下，更优选为30mm以下，最优选为25mm以下。另外，回转培养时的旋转半径也没有特别限定，优选以回转宽度为上述范围的方式进行设定。旋转半径的下限例如为5mm以上，优选为10mm以上，上限例如可以为100mm以下，优选为50mm以下。通过使回转培养的条件为该范围，易于制备适当尺寸的细胞聚集体，因此是优选的。
“摇动培养法”是指在通过摇动(摇摆)搅拌这样的直线往复运动对培养基施加摇摆流的条件下进行培养的方法。具体而言，通过使容纳有包含细胞的培养基的培养容器在基本上与水平面垂直的平面内摇动来进行。摇动速度没有特别限定，例如在将1次往返作为1次的情况下，下限可以为以1分钟2次以上、4次以上、6次以上、8次以上、或10次以上进行摇动，另一方面，上限可以为以1分钟15次以下、20次以下、25次以下、或50次以下进行摇动。摇动时，优选相对于垂直面对培养容器赋予一定角度、即摇动角度。摇动角度没有特别限定，例如，下限可以为0°以上、1°以上、2°以上、4°以上、6°以上、或8°以上，另一方面，上限可以为10°以下、12°以下、15°以下、18°以下或20°以下。通过将摇动培养的条件设为该范围，可以制备适当尺寸的细胞聚集体，因此是优选的。
另外，也可以通过上述这样的回转与摇动组合而成的运动，一边搅拌，一边进行培养。
使用了旋转瓶状的培养容器的培养是在培养容器中使用搅拌叶片在搅拌液体培养基的同时进行的培养。转速、培养基量没有特别限定。在市售的旋转瓶状的培养容器的情况下，作为细胞培养组合物的量，可以优选使用制造商推荐的量。转速例如可以设为10rpm以上且100rpm以下，但没有特别限定。
悬浮培养中细胞在培养基中的接种密度(悬浮培养开始时的细胞密度)可以适当调整，作为下限，例如为0.01×105个细胞/mL以上，更优选为0.1×105个细胞/mL以上，更优选为1×105个细胞/mL以上。作为接种密度的上限，例如为20×105个细胞/mL以下，更优选为10×105个细胞/mL以下。接种密度为该范围时，容易形成适当大小的细胞聚集体。例如可以为0.1×105个细胞/mL、0.2×105个细胞/mL、0.3×105个细胞/mL、0.4×105个细胞/mL、0.5×105个细胞/mL、0.6×105个细胞/mL、0.7×105个细胞/mL、0.8×105个细胞/mL、0.9×105个细胞/mL、1×105个细胞/mL、1.5×105个细胞/mL、2×105个细胞/mL、3×105个细胞/mL、4×105个细胞/mL、5×105个细胞/mL、6×105个细胞/mL、7×105个细胞/mL、8×105个细胞/mL、9×105个细胞/mL、10×105个细胞/mL。
悬浮培养时的细胞培养组合物的量可以根据使用的培养容器而适当调整，例如在使用12孔板(俯视时每1个孔的孔底面的面积为3.5cm2)时，可以为0.5mL/孔以上、且1.5mL/孔以下，更优选可以为1.3mL/孔。例如在使用6孔板(俯视时每1个孔的孔底面的面积为9.6cm2)时，可以为1.5mL/孔以上、优选为2mL/孔以上、更优选为3mL/孔以上，可以为6.0mL/孔以下、优选为5mL/孔以下、更优选为4mL/孔以下。例如在使用125mL锥形烧瓶(容量为125mL的锥形烧瓶)时，可以为10mL/容器以上、优选为15mL/容器以上、更优选为20mL/容器以上、更优选为25mL/容器以上、更优选为20mL/容器以上、更优选为25mL/容器以上、更优选为30mL/容器以上，可以为50mL/容器以下、更优选为45mL/容器以下、更优选为40mL/容器以下。例如在使用500mL锥形烧瓶(容量为500mL的锥形烧瓶)时，可以为100mL/容器以上、优选为105mL/容器以上、更优选为110mL/容器以上、更优选为115mL/容器以上、更优选为120mL/容器以上，可以为150mL/容器以下、更优选为145mL/容器以下、更优选为140mL/容器以下、更优选为135mL/容器以下、更优选为130mL/容器以下、更优选为125mL/容器以下。例如在使用1000mL锥形烧瓶(容量为1000mL的锥形烧瓶)时，可以为250mL/容器以上、优选为260mL/容器以上、更优选为270mL/容器以上、更优选为280mL/容器以上、更优选为290mL/容器以上，可以为350mL/容器以下、更优选为340mL/容器以下、更优选为330mL/容器以下、更优选为320mL/容器以下、更优选为310mL/容器以下。例如在使用2000mL锥形烧瓶(容量为2000mL的锥形烧瓶)时，可以为500mL/容器以上、更优选为550mL/容器以上、更优选为600mL/容器以上，可以为1000mL/容器以下、更优选为900mL/容器以下、更优选为800mL/容器以下、更优选为700mL/容器以下。例如在使用3000mL锥形烧瓶(容量为3000mL的锥形烧瓶)时，可以为1000mL/容器以上、优选为1100mL/容器以上、更优选为1200mL/容器以上、更优选为1300mL/容器以上、更优选为1400mL/容器以上、更优选为1500mL/容器以上，可以为2000mL/容器以下、更优选为1900mL/容器以下、更优选为1800mL/容器以下、更优选为1700mL/容器以下、更优选为1600mL/容器以下。例如在使用2L培养袋(容量为2L的一次性培养袋)时，可以为100mL/袋以上、更优选为200mL/袋以上、更优选为300mL/袋以上、更优选为400mL/袋以上、更优选为500mL/袋以上、更优选为600mL/袋以上、更优选为700mL/袋以上、更优选为800mL/袋以上、更优选为900mL/袋以上、更优选为1000mL/袋以上，可以为2000mL/袋以下、更优选为1900mL/袋以下、更优选为1800mL/袋以下、更优选为1700mL/袋以下、更优选为1600mL/袋以下、更优选为1500mL/袋以下、更优选为1400mL/袋以下、更优选为1300mL/袋以下、更优选为1200mL/袋以下、更优选为1100mL/袋以下。例如在使用10L培养袋(容量为10L的一次性培养袋)时，可以为500mL/袋以上、更优选为1L/袋以上、更优选为2L/袋以上、更优选为3L/袋以上、更优选为4L/袋以上、更优选为5L/袋以上，可以为10L/袋以下、更优选为9L/袋以下、更优选为8L/袋以下、更优选为7L/袋以下、更优选为6L/袋以下。例如在使用20L培养袋(容量为20L的一次性培养袋)时，可以为1L/袋以上、更优选为2L/袋以上、更优选为3L/袋以上、更优选为4L/袋以上、更优选为5L/袋以上、更优选为6L/袋以上、更优选为7L/袋以上、更优选为8L/袋以上、更优选为9L/袋以上、更优选为10L/袋以上，可以为20L/袋以下、更优选为19L/袋以下、更优选为18L/袋以下、更优选为17L/袋以下、更优选为16L/袋以下、更优选为15L/袋以下、更优选为14L/袋以下、更优选为13L/袋以下、更优选为12L/袋以下、更优选为11L/袋以下。例如在使用50L培养袋(容量在50L的一次性培养袋)时，可以为1L/袋以上、更优选为2L/袋以上、更优选为5L/袋以上、更优选为10L/袋以上、更优选为15L/袋以上、更优选为20L/袋以上、更优选为25L/袋以上，可以为50L/袋以下、更优选为45L/袋以下、更优选为40L/袋以下、更优选为35L/袋以下、更优选为30L/袋以下。细胞培养组合物的量为该范围时，容易形成适当大小的细胞聚集体。
使用的培养容器的容量可以适当选择，没有特别限定，以俯视容纳液体培养基的部分的底面时的面积计，下限例如可以使用0.32cm2以上、优选为0.65cm2以上、更优选为0.65cm2以上、进一步优选为1.9cm2以上、更优选为3.0cm2以上、3.5cm2以上、9.0cm2以上、或9.6cm2以上的培养容器，作为上限，例如可以使用1000cm2以下、优选为500cm2以下、更优选为300cm2以下、更优选为150cm2以下、更优选为75cm2以下、更优选为55cm2以下、进一步优选为25cm2以下、进一步更优选为21cm2以下、例如可以使用9.6cm2以下、或3.5cm2以下的培养容器。
上述SRF抑制剂或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的存在下的细胞悬浮培养的温度、时间、CO2浓度等条件没有特别限定。培养温度优选为20℃以上，更优选为35℃以上，优选为45℃以下，更优选为40℃以下，最优选为37℃。培养时间优选为0.5小时以上，更优选为12小时以上，优选为7天以下，更优选为72小时以下，更优选为48小时以下，最优选为24小时以下。作为培养时的CO2浓度，优选为4％以上，更优选为4.5％以上，优选为10％以下，更优选为5.5％以下，最优选为5％。另外，在本发明的促进细胞聚集的方法中，可以在悬浮培养工序中伴有传代操作。培养条件为该范围时，易于形成适当大小的细胞聚集体。另外，可以以适当的频率进行培养基更换。培养基更换的频率根据培养的细胞种而不同，例如，可以以5天1次以上、4天1次以上、3天1次以上、2天1次以上、1天1次以上来进行。对于培养基更换而言，可以在用与后述的回收工序相同的方法将细胞回收后，添加新鲜的培养基，平稳地使细胞聚集体分散后，进行再次培养。
对于在悬浮培养工序中将细胞的数量增加至何种程度、另外将细胞的状态调整至何种程度，可以根据培养的细胞的种类、细胞聚集的目的、培养基的种类、培养条件而适当确定。
悬浮培养工序中使用的细胞优选为预先通过维持培养工序进行培养，通过回收工序进行回收，并根据需要进行了单细胞化的细胞。对于维持培养工序、回收工序、单细胞化，如后所述。
悬浮培养工序之后，通过通常方法废弃培养液，将细胞回收。此时，优选细胞通过剥离或分散处理而以单一的细胞的形式进行回收。对于具体的方法，在后述的回收工序中详细说明。回收的细胞可以直接供于下一工序，或者在根据需要用缓冲液(包括PBS缓冲液)、生理盐水或培养基(优选为下一工序中使用的培养基或基础培养基)清洗之后供于下一工序。
(维持培养工序)
“维持培养工序”是为了在保持了未分化性的状态下使细胞增殖而对悬浮培养工序前的细胞群、或者悬浮培养工序后或随后的回收工序后得到的细胞聚集体进行培养的工序。维持培养可以是使细胞粘附于容器、载体等培养基材并进行培养的贴壁培养，也可以是在培养基中使细胞悬浮并进行培养的悬浮培养。
在维持培养工序中，只要通过该领域中已知的动物细胞培养方法对作为对象的细胞进行培养即可。可以是贴壁培养或悬浮培养。
维持培养工序中使用的培养基、细胞的具体实施方式如上所述。
维持培养工序中使用的培养容器、细胞的接种密度、培养条件如以上关于悬浮培养工序所述的内容。
维持培养工序中的培养基的流动状态不受限制。可以是静置培养，也可以是流动培养。
“静置培养”是指在培养容器内将培养基静置的状态下进行培养。在贴壁培养中，通常采用该静置培养。
“流动培养”是指在使培养基流动的条件下进行培养。流动培养的具体实施方式如以上关于悬浮培养工序所述的内容。
对于在维持培养工序中将细胞的数量增加至何种程度、另外将细胞的状态调整至何种程度，可以根据培养的细胞的种类、细胞聚集的目的、培养基的种类、培养条件而适当确定。
维持培养工序的优选的一个方式是将细胞聚集体进一步进行培养的维持培养工序，所述细胞聚集体是通过在SRF抑制剂或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的存在下的悬浮培养工序而形成的。该方式的维持培养工序中的培养方法没有特别限定，可以举出例如在不含SRF抑制剂及ROCK抑制剂的培养基中对细胞聚集体进行悬浮培养的工序。作为该维持培养中使用的培养基，除不含SRF抑制剂及ROCK抑制剂以外，可以使用与上述相同的培养基，作为培养的条件，可以使用与悬浮培养工序相同的条件。在该方式的维持培养工序中，优选以适当的频率进行培养基更换。培养基更换的频率根据细胞种而不同，可以包括优选以5天1次以上、更优选以4天1次以上、进一步优选以3天1次以上、更优选以2天1次以上、最优选以1天1次以上的频率进行培养基更换操作。在对干细胞的细胞聚集体进行培养时，该频率的培养基更换是特别合适的。培养基更换的方法没有特别限定，优选为将包含细胞聚集体的细胞培养组合物全部回收至离心管，离心分离或以静置状态放置5分钟左右，留下沉淀的细胞聚集体，去除上清，然后添加新鲜的培养基，在平稳地使细胞聚集体分散后，再次将细胞聚集体分散培养基返回至板等培养容器，由此可以继续培养细胞聚集体。该方式的维持培养工序的培养时间没有特别限定，优选为3天以上且7天以下。通过在不包含SRF抑制剂及ROCK抑制剂的培养基中于上述条件下进一步对细胞聚集体进行悬浮培养，可以得到适当尺寸的细胞聚集体。
在维持培养工序之后，通过通常方法废弃培养液，回收细胞。此时，优选细胞通过剥离或分散处理以单一细胞的形式回收。对于具体的方法，在后述的回收工序中详细说明。回收的细胞可以直接供于下一工序，或者在根据需要用缓冲液(包括PBS缓冲液)、生理盐水或培养基(优选为下一工序中使用的培养基或基础培养基)清洗之后供于下一工序。
(回收工序)
“回收工序”是从维持培养工序或悬浮培养工序后的培养液中回收培养的细胞的工序，是本发明的方法中的可选工序。
在本说明书中，“(细胞的)回收”是指将培养液与细胞分离，获得细胞。细胞的回收方法只要是按照该领域的细胞培养方法使用的通常方法即可，没有特别限定。细胞培养方法通常可大致分为悬浮培养方法和贴壁培养方法。以下，对于各培养方法后的细胞的回收方法进行说明。
(悬浮培养方法后的回收方法)
在通过悬浮培养法对细胞进行培养的情况下，细胞以悬浮在培养液中的状态存在。因此，细胞的回收可以通过利用静置状态或离心分离去除上清的液体成分来实现。另外，作为细胞的回收方法，也可以选择使用过滤器、中空纤维分离膜等。
在以静置状态去除液体成分时，只要将放入培养液的容器以静置状态放置5分钟左右，留下沉淀的细胞、细胞聚集体，去除上清即可。另外，离心分离只要以细胞不会因离心力而受到损伤的旋转速度和处理时间来进行即可。例如，旋转速度的下限只要能够将细胞沉淀即可，没有特别限定，例如可以为500rpm以上、800rpm以上、或1000rpm以上。另一方面，上限只要是细胞不会受到或不容易受到离心力造成的损伤的速度即可，例如可以为1400rpm以下、1500rpm以下、或1600rpm以下。另外，处理时间的下限只要是能够通过上述旋转速度将细胞沉淀的时间即可，没有特别限定，例如可以为30秒钟以上、1分钟以上、3分钟以上、或5分钟以上。另外，上限只要是细胞不会或不容易因上述旋转而受到伤害的时间即可，例如可以为30秒钟以下、6分钟以下、8分钟以下、或10分钟以下。回收的细胞可以根据需要进行清洗。清洗方法没有限定。例如，可以与上述的维持培养工序中的工序后的清洗方法同样地进行。清洗液可以使用缓冲液(包含PBS缓冲液)、生理盐水、或培养基(优选为基础培养基)。
(贴壁培养后的回收方法)
在通过贴壁培养法对细胞进行培养的情况下，在培养后，大量细胞以粘附于培养容器、培养载体等外部基质的状态存在。因此，为了从培养容器中去除培养液，只要将培养后的容器平稳地倾斜，使液体成分流出即可。粘附于外部基质的细胞残留在培养容器内，因此可以容易地将培养液与细胞分离。
然后，也可以根据需要对粘附于外部基质的细胞表面进行清洗。清洗液可以使用缓冲液(包含PBS缓冲液)、生理盐水、或培养基(优选为基础培养基)。但并不限定于此。清洗后的清洗液可以通过与培养液相同的操作去除。该清洗工序可以反复进行数次。
接着，将粘附于外部基质的细胞群从外部基质上剥离。剥离方法只要按照该领域中公知的方法进行即可。通常使用刮削、将蛋白水解酶作为有效成分的剥离剂、EDTA等螯合剂、或剥离剂与螯合剂的混合物等。
刮削是使用刮刀等通过机械性方式剥取附着于外部基质的细胞的方法。但是，细胞容易因机械性操作而受到损伤，因此，在回收后的细胞供于进一步培养的情况下，优选是将粘固于外部基质的细胞的支架(scaffold)部分化学性破坏或分解而消除对外部基质的粘附的剥离方法。
在剥离方法中使用剥离剂和/或螯合剂。剥离剂没有限定，例如，除了胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶、透明质酸酶以外，还可以利用市售的Accutase(注册商标)、TrypLETMExpress Enzyme(Life Technologies Japan公司)、TrypLETM Select Enzyme(Life Technologies Japan公司)、Dispase(注册商标)等。各剥离剂的浓度及处理时间只要在细胞的剥离或分散所用的通常方法的范围内使用即可。例如，在胰蛋白酶的情况下，溶液中的浓度的下限只要是能够剥离细胞的浓度即可，没有特别限定，例如可以为0.01％以上、0.02％以上、0.03％以上、0.04％以上、0.05％以上、0.08％以上、或0.10％以上。另一方面，溶液中的浓度的上限只要是细胞本身不会受到因胰蛋白酶的作用而溶解等的影响的浓度即可，没有特别限定，例如可以为0.15％以下、0.20％以下、0.25％以下、或0.30％以下。另外，处理时间尽管取决于胰蛋白酶的浓度，但其下限只要是可利用胰蛋白酶的作用将细胞从外部基质上充分剥离的时间即可，没有特别限定，例如可以为1分钟以上、2分钟以上、3分钟以上、4分钟或5分钟以上。另一方面，处理时间的上限只要是细胞本身不会受到因胰蛋白酶的作用而溶解等的影响的时间即可，没有特别限定，例如可以为8分钟以下、10分钟以下、12分钟以下、15分钟以下、18分钟以下、或20分钟以下。在其它剥离剂或螯合剂的情况下，可以基本相同地进行。需要说明的是，在使用市售的剥离剂时，可以按照附带的实验方案中记载的浓度及处理时间来进行。
从外部基质上剥离的细胞通过离心分离去除包含剥离剂的上清。离心条件可以与上述“悬浮培养方法后的回收方法”相同。回收后的细胞可以根据需要进行清洗。清洗方法也可以与上述“悬浮培养方法后的回收方法”同样地进行。
本工序后得到的细胞可以部分包含单层细胞片、细胞聚集体等细胞集合体。另一方面，回收的细胞也可以根据需要进行单一细胞化。
(单一细胞化)
在本说明书中，“单一细胞化”是指，使单层细胞片、细胞聚集体等那样的多个细胞相互粘附或聚集而成的细胞集合体分散，形成单一的游离的细胞状态。
单一细胞化可以提高上述的剥离方法所使用的剥离剂和/或螯合剂的浓度、和/或延长剥离剂和/或螯合剂的处理时间。例如，在胰蛋白酶的情况下，溶液中的浓度的下限只要是能够将细胞集合体分散的浓度即可，没有特别限定，例如可以为0.15％以上、0.18％以上、0.20％以上、或0.24％以上。另一方面，溶液中的浓度的上限只要是细胞本身不会受到溶解等的影响的浓度即可，没有特别限定，可以为0.25％以下、0.28％以下、或0.30％以下。另外，尽管处理时间取决于胰蛋白酶的浓度，但其下限只要是通过胰蛋白酶的作用将细胞集合体充分分散的时间即可，没有特别限定，例如可以为5分钟以上、8分钟以上、10分钟以上、12分钟以上、或15分钟以上。另一方面，处理时间的上限只要是细胞本身不会受到因胰蛋白酶的作用而溶解等的影响的时间即可，没有特别限定，例如可以为18分钟以下、20分钟以下、22分钟以下、25分钟以下、28分钟以下、或30分钟以下。需要说明的是，在使用市售的剥离剂时，可以按照附带的实验方案中记载的能够使细胞分散为单一状态的浓度来使用。通过在基于上述剥离剂和/或螯合剂的处理后温和地进行物理性处理，可以促进单一细胞化。该物理性处理没有限定，可以举出例如，将细胞与溶液一起多次进行移液的方法。另外，可以根据需要使细胞通过过滤器、筛网。
单一细胞化后的细胞可以通过静置或离心分离将包含剥离剂的上清去除而回收。回收的细胞可以根据需要进行清洗。对于离心分离的条件、清洗方法，可以与上述“悬浮培养方法后的回收方法”同样地进行。
＜7.细胞聚集促进剂＞
本发明的另一方式是一种细胞聚集促进剂，其包含SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂，所述细胞聚集促进剂用于细胞的悬浮培养。
本发明的细胞聚集促进剂可以用于在悬浮培养中适度促进细胞的聚集，形成基本均匀大小的细胞聚集体。在使用了本发明的细胞聚集促进剂的干细胞的悬浮培养中，可以保持干细胞的未分化性。
本发明的细胞聚集促进剂的形态没有特别限定，可以是SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂本身，也可以是SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂与其它成分组合而成的组合物。上述组合物的形态没有特别限定。上述组合物例如可以是悬浮培养中使用的培养基的形态，也可以是制备培养基时配合的添加用组合物的形态。
本发明的细胞聚集促进剂的优选实施方式是含有SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的培养基或磷酸缓冲液等缓冲液。作为培养基中的SRF抑制剂及ROCK抑制剂的浓度，可以示例出＜6.促进细胞聚集的方法＞一栏中关于悬浮培养所记载的培养基中的SRF抑制剂及ROCK抑制剂的浓度。
本发明的细胞聚集促进剂的另一个优选实施方式是在液体状或固体状介质中含有SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的液体状或固体状组合物。上述液体状或固体状组合物是制备悬浮培养用的培养基时添加的添加物。该实施方式的细胞聚集促进剂优选以制备的培养基中的SRF抑制剂及ROCK抑制剂的最终浓度为＜6.促进细胞聚集的方法＞一栏中关于悬浮培养所记载的培养基中的SRF抑制剂及ROCK抑制剂的浓度的方式进行制备。该实施方式的细胞聚集促进剂中的SRF抑制剂的浓度没有特别限定，优选为SRF抑制剂的作为悬浮培养时培养基中的优选浓度而列举的上述浓度的1倍以上、更优选为2倍以上、更优选为10倍以上、更优选为100倍以上、更优选为1000倍以上、更优选为10000倍以上，具体而言，例如在SRF抑制剂为CCG-1423(Cayman Chemical、CAS No.285986-881、C18H14ClF6N2O3、分子量＝454.8)的情况下，特别优选为9.0μg/mL以上且10.0mg/mL以下的范围。作为上述浓度的下限，只要起到促进细胞聚集的效果即可，没有特别限定，优选为9.0μg/mL以上、10.0μg/mL以上、20.0μg/mL以上、30.0μg/mL以上、40.0μg/mL以上、50.0μg/mL以上、60.0μg/mL以上、70.0μg/mL以上、80.0μg/mL以上、90.0μg/mL以上、100.0μg/mL以上。另一方面，作为上限，只要是细胞不死亡的浓度即可，没有特别限定，优选为10.0mg/mL以下、9.0mg/mL以下、8.0mg/mL以下、7.0mg/mL以下、6.0mg/mL以下、5.0mg/mL以下、4.0mg/mL以下、3.0mg/mL以下、2.0mg/mL以下、1.0mg/mL以下、900.0μg/mL以下、800.0μg/mL以下、700.0μg/mL以下、600.0μg/mL以下、500.0μg/mL以下。另外，SRF抑制剂的浓度特别优选为20μM以上且20mM以下的范围。作为上述SRF抑制剂的浓度的下限，例如为20μM以上、200μM以上、0.05mM以上、0.1mM以上、0.2mM以上、0.3mM以上、0.4mM以上、0.5mM以上、0.6mM以上、0.7mM以上、0.8mM以上、0.9mM以上、1mM以上、2mM以上、3mM以上、4mM以上、5mM以上、6mM以上、7mM以上、8mM以上、9mM以上、10mM以上、11mM以上、12mM以上、13mM以上、14mM以上、15mM以上。另一方面，作为上限，例如为20mM以下。另外，该实施方式的细胞聚集促进剂中的ROCK抑制剂的浓度没有特别限定，优选为ROCK抑制剂的作为悬浮培养时培养基中的优选浓度而列举的上述浓度的1倍以上、更优选为2倍以上、更优选为10倍以上、更优选为100倍以上、更优选为1000倍以上、更优选为10000倍以上，具体而言，例如在ROCK抑制剂为Y-27632(和光纯药工业株式会社、CASNo.331752-47-7、C14H21N3O·2HCl·H2O、分子量＝338.27)的情况下，特别优选为6.7μg/mL以上且14.0mg/mL以下的范围。例如，可以为6.7mg/mL。作为上述浓度的下限，只要起到促进细胞聚集的效果即可，没有特别限定，优选为6.7μg/mL以上、7.0μg/mL以上、8.0μg/mL以上、9.0μg/mL以上、10.0μg/mL以上、20.0μg/mL以上、30.0μg/mL以上、40.0μg/mL以上、50.0μg/mL以上、60.0μg/mL以上、70.0μg/mL以上、80.0μg/mL以上、90.0μg/mL以上、100.0μg/mL以上。另一方面，作为上限，只要是细胞不死亡的浓度即可，没有特别限定，优选为14.0mg/mL以下、13.0mg/mL以下、12.0mg/mL以下、11.0mg/mL以下、10.0mg/mL以下、9.0mg/mL以下、8.0mg/mL以下、7.0mg/mL以下、6.0mg/mL以下、5.0mg/mL以下、4.0mg/mL以下、3.0mg/mL以下、2.0mg/mL以下、1.0mg/mL以下、900.0μg/mL以下、800.0μg/mL以下、700.0μg/mL以下、600.0μg/mL以下、500.0μg/mL以下。另外，ROCK抑制剂的浓度特别优选为20μM以上且40mM以下的范围。作为上述ROCK抑制剂的浓度的下限，例如为20μM以上、200μM以上、0.5mM以上、0.6mM以上、0.7mM以上、0.8mM以上、0.9mM以上、1mM以上、2mM以上、3mM以上、4mM以上、5mM以上、6mM以上、7mM以上、8mM以上、9mM以上、10mM以上、11mM以上、12mM以上、13mM以上、14mM以上、15mM以上、16mM以上、17mM以上、18mM以上、19mM以上、20mM以上。另一方面，作为上限，例如为40mM以下、30mM以下。
细胞聚集促进剂除了SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂以外，还可以含有溶剂和/或赋形剂等。作为溶剂，可以列举：水、缓冲液(包含PBS)、生理盐水、有机溶剂(DMSO、DMF、二甲苯、低级醇)等。作为赋形剂，可以列举：抗生素、缓冲剂、增稠剂、着色剂、稳定剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂、保藏剂、抗氧化剂等。抗生素没有特别限定，可以使用例如青霉素、链霉素、两性霉素B等。作为缓冲剂，可以列举：磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液等。作为增稠剂，可以列举：明胶、多糖类等。作为着色剂，可以举出酚红等。作为稳定剂，可以列举：白蛋白、葡聚糖、甲基纤维素、明胶等。作为表面活性剂，可以列举：胆固醇、烷基糖苷、烷基多糖苷、烷基单甘油酯醚、葡糖苷、麦芽糖苷、新戊二醇类、聚氧乙二醇类、硫代葡糖苷、硫代麦芽糖苷、肽、皂苷、磷脂、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、脂肪酸二乙醇酰胺等。作为乳化剂，可以列举：甘油脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等。作为防腐剂，可以列举：氨基乙磺酸、苯甲酸、苯甲酸钠、乙醇、乙二胺四乙酸钠、琼脂、dl-樟脑、柠檬酸、柠檬酸钠、水杨酸、水杨酸钠、水杨酸苯酯、二丁基羟基甲苯、山梨酸、山梨酸钾、氮、脱氢乙酸、脱氢乙酸钠、2-萘酚、白糖、蜂蜜、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、l-薄荷醇、桉树油等。作为保藏剂，可以列举：苯甲酸、苯甲酸钠、乙醇、乙二胺四乙酸钠、干燥亚硫酸钠、柠檬酸、甘油、水杨酸、水杨酸钠、二丁基羟基甲苯、D-山梨糖醇、山梨酸、山梨酸钾、脱氢乙酸钠、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、丙二醇、磷酸等。作为抗氧化剂，可以列举：柠檬酸、柠檬酸衍生物、维生素C及其衍生物、番茄红素、维生素A、类胡萝卜素类、维生素B及其衍生物、类黄酮类、多酚类、谷胱甘肽、硒、硫代硫酸钠、维生素E及其衍生物、α硫辛酸及其衍生物、碧萝芷、Flavangenol、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽还原酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶、以及它们的混合物等。
细胞聚集促进剂可以含有生长因子，优选含有FGF2及TGF-β1中1种以上的生长因子。
＜8.细胞聚集体的制备方法、以及通过该方法制备的细胞聚集体＞
本发明的另一方式是一种细胞聚集体的制备方法，该方法包括：在包含SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序。
根据该方法，可以以高产量制备适度尺寸的细胞聚集体。特别是在细胞为干细胞的情况下，可以以高产量制备保持了干细胞的未分化性、且具有适度尺寸的细胞聚集体。
SRF抑制剂、ROCK抑制剂、培养基及细胞的具体实施方式如上所述。
对于上述工序中的培养基中的SRF抑制剂的浓度而言，例如在SRF抑制剂为CCG-1423(Cayman Chemical、CAS No.285986-881、C18H14ClF6N2O3、分子量＝454.8)的情况下，作为上述抑制剂的浓度的下限，只要起到促进细胞聚集的效果即可，没有特别限定，优选为4.5ng/mL以上、更优选为45ng/mL以上、特别优选为450ng/mL以上、最优选为1.1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、10μg/mL以上、11μg/mL以上、12μg/mL以上、13μg/mL以上、14μg/mL以上、15μg/mL以上、16μg/mL以上、17μg/mL以上、18μg/mL以上、19μg/mL以上。另一方面，作为上限，只要是细胞不死亡的浓度即可，没有特别限定，优选为4.6mg/mL以下、更优选为460μg/mL以下、特别优选为46μg/mL以下、40μg/mL以下、30μg/mL以下、20μg/mL以下。另外，上述抑制剂的浓度优选为4.5ng/mL以上且4.6mg/mL以下。另外，上述工序中的培养基中的SRF抑制剂的浓度特别优选为10nM以上、且10mM以下的范围。作为上述浓度的下限，优选为10nM以上、更优选为100nM以上、特别优选为1μM以上、最优选为2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上、6μM以上、7μM以上、8μM以上、9μM以上、10μM以上、11μM以上、12μM以上、13μM以上、14μM以上、15μM以上、16μM以上、17μM以上、18μM以上、19μM以上、20μM以上、21μM以上、22μM以上、23μM以上、24μM以上、25μM以上、26μM以上、27μM以上、28μM以上、29μM以上、30μM以上、31μM以上、32μM以上、33μM以上、34μM以上、35μM以上、36μM以上、37μM以上、38μM以上、39μM以上。另一方面，作为上限，优选为10mM以下、更优选为1mM以下、特别优选为100μM以下、最优选为40μM以下。
另外，对于上述工序中的培养基中的ROCK抑制剂的浓度而言，例如在ROCK抑制剂为Y-27632(和光纯药工业株式会社、CAS No.331752-47-7、C14H21N3O·2HCl·H2O、分子量＝338.27)的情况下，特别优选为3.3ng/mL以上且3.4mg/mL以下的范围。作为上述浓度的下限，只要起到促进细胞聚集的效果即可，没有特别限定，优选为3.3ng/mL以上、更优选为33ng/mL以上、特别优选为330ng/mL以上、最优选为800ng/mL以上、1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、10μg/mL以上、11μg/mL以上、12μg/mL以上、13μg/mL以上、14μg/mL以上。另一方面，作为上限，只要是细胞不死亡的浓度即可，没有特别限定，优选为3.4mg/mL以下，更优选为340μg/mL以下，特别优选为34μg/mL以下，最优选为14μg/mL以下。另外，上述工序中的培养基中的ROCK抑制剂的浓度特别优选为10nM以上、10mM以下的范围。上述浓度的下限优选为10nM以上、更优选为100nM以上、特别优选为1μM以上、最优选为2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上、6μM以上、7μM以上、8μM以上、9μM以上、10μM以上、11μM以上、12μM以上、13μM以上、14μM以上、15μM以上、16μM以上、17μM以上、18μM以上、19μM以上、20μM以上、21μM以上、22μM以上、23μM以上、24μM以上、25μM以上，26μM以上、27μM以上、28μM以上、29μM以上、30μM以上、31μM以上、32μM以上、33μM以上、34μM以上、35μM以上、36μM以上、37μM以上、38μM以上、39μM以上。作为上限，优选为10mM以下、更优选为1mM以下、特别优选为100μM以下、最优选为40μM以下。
上述工序的具体实施方式与＜6.促进细胞聚集的方法＞一栏中说明的、促进细胞聚集的方法中的“在包含SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序”的具体实施方式相同。
本发明的另一方式是一种细胞聚集体，其是通过上述的细胞聚集体的制备方法得到的。
本发明的该方式的细胞聚集体具有适度的尺寸，活细胞率高。另外，在细胞为干细胞的情况下，构成细胞聚集体的细胞保持了未分化性。
本发明的该方式的细胞聚集体优选具备＜2.细胞聚集体＞一栏中记载的特征。
另外，本发明的制备细胞聚集体的方法除了在包含SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的培养基中对细胞进行悬浮培养的悬浮培养工序以外，还可以包括任意适当的工序。作为上述任意的工序，例如为维持培养工序、细胞聚集体的回收工序。此外，上述悬浮培养可以包括传代操作。维持培养工序及回收工序的优选实施方式与＜6.促进细胞聚集的方法＞一栏中说明的维持培养工序及回收工序相同。
＜9.细胞培养组合物＞
本发明的另一方式是一种细胞培养组合物，其包含细胞、培养基、以及SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂。
本发明的该方式的细胞培养组合物可以用于以高产量制备细胞聚集体。特别是在细胞为干细胞的情况下，可以用于以高产量制备保持了干细胞的未分化性、且具有适度尺寸的细胞聚集体。
另外，本发明的该方式的细胞培养组合物可以以细胞聚集体的形态包含细胞。
SRF抑制剂、ROCK抑制剂、培养基、细胞及细胞聚集体的具体实施方式如上所述。
对于本发明的该方式的细胞培养组合物中的SRF抑制剂的浓度而言，例如在SRF抑制剂为CCG-1423(Cayman Chemical、CAS No.285986-881、C18H14ClF6N2O3、分子量＝454.8)的情况下，作为上述抑制剂的浓度的下限，只要起到促进细胞聚集的效果即可，没有特别限定，优选为4.5ng/mL以上、更优选为45ng/mL以上、特别优选为450ng/mL以上、最优选为1.1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、10μg/mL以上、11μg/mL以上、12μg/mL以上、13μg/mL以上、14μg/mL以上、15μg/mL以上、16μg/mL以上、17μg/mL以上、18μg/mL以上。另一方面，作为上限，只要是细胞不死亡的浓度即可，没有特别限定，优选为4.6mg/mL以下、更优选为460μg/mL以下、特别优选为46μg/mL以下、最优选为19μg/mL以下。另外，上述抑制剂的浓度优选为4.5ng/mL以上且4.6mg/mL以下。另外，本发明的该方式的细胞培养组合物中的SRF抑制剂的浓度特别优选为10nM以上、且10mM以下的范围。作为上述浓度的下限，优选为10nM以上、更优选为100nM以上、特别优选为1μM以上、最优选为2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上、6μM以上、7μM以上、8μM以上、9μM以上、10μM以上、11μM以上、12μM以上、13μM以上、14μM以上、15μM以上、16μM以上、17μM以上、18μM以上、19μM以上、20μM以上、21μM以上、22μM以上、23μM以上、24μM以上、25μM以上，26μM以上、27μM以上、28μM以上、29μM以上、30μM以上、31μM以上、32μM以上、33μM以上、34μM以上、35μM以上、36μM以上、37μM以上、38μM以上、39μM以上。另一方面，作为上限，优选为10mM以下、更优选为1mM以下、特别优选为100μM以下、最优选为40μM以下。
另外，对于本发明的该方式的细胞培养组合物中的ROCK抑制剂的浓度而言，例如在ROCK抑制剂为Y-27632(和光纯药工业株式会社、CAS No.331752-47-7、C14H21N3O·2HCl·H2O、分子量＝338.27)的情况下，特别优选为3.3ng/mL以上且3.4mg/mL以下的范围。作为上述浓度的下限，只要起到促进细胞聚集的效果即可，没有特别限定，优选为3.3ng/mL以上、更优选为33ng/mL以上、特别优选为330ng/mL以上、最优选为800ng/mL以上、1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、10μg/mL以上、11μg/mL以上、12μg/mL以上、13μg/mL以上、14μg/mL以上。另一方面，作为上限，只要是细胞不死亡的浓度即可，没有特别限定，优选为3.4mg/mL以下、更优选为340μg/mL以下、特别优选为34μg/mL以下、最优选为14μg/mL以下。另外，本发明的该方式的细胞培养组合物中的ROCK抑制剂的浓度特别优选为10nM以上、且10mM以下的范围。上述浓度的下限优选为10nM以上、更优选为100nM以上、特别优选为1μM以上、最优选为2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上、6μM以上、7μM以上、8μM以上、9μM以上、10μM以上、11μM以上、12μM以上、13μM以上、14μM以上、15μM以上、16μM以上、17μM以上、18μM以上、19μM以上、20μM以上、21μM以上、22μM以上、23μM以上、24μM以上、25μM以上，26μM以上、27μM以上、28μM以上、29μM以上、30μM以上、31μM以上、32μM以上、33μM以上、34μM以上、35μM以上、36μM以上、37μM以上、38μM以上、39μM以上。作为上限，优选为10mM以下、更优选为1mM以下、特别优选为100μM以下、最优选为40μM以下。
作为由上述细胞培养组合物制备细胞聚集体的工序，可以举出在上述细胞培养组合物中对细胞进行悬浮培养的工序。该工序的具体实施方式与＜6.促进细胞聚集的方法＞一栏中说明的、促进细胞聚集的方法中的“在包含SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序”的具体实施方式相同。
上述细胞培养组合物可以通过在将SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂添加于培养基之后添加细胞来制备，也可以通过在将细胞混合于培养基之后添加SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂来制备，优选通过在将SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂添加于培养基之后添加细胞来制备。在将SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂添加于培养基时，也可以添加稳定剂。上述稳定剂只要是有助于SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂在液体培养基中的稳定化、保持活性、防止对培养容器等的吸附等的物质即可，没有特别限定，可以使用白蛋白等蛋白质、乳化剂、表面活性剂、两亲性物质、或肝素等多糖类等。
上述细胞培养组合物可以通过将包含SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的培养基(任选进一步包含上述稳定剂)冷冻保存，然后解冻，添加细胞来制备。
＜10.细胞培养培养基＞
本发明的另一方式是一种细胞培养培养基，其包含培养基、以及SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂。
本发明的该方式的细胞培养培养基可以作为用于通过悬浮培养从细胞以高产量制备细胞聚集体的培养基来使用。特别是在细胞为干细胞的情况下，可以用于以高产量制备保持了干细胞的未分化性、且具有适度尺寸的细胞聚集体。
SRF抑制剂、ROCK抑制剂、培养基及细胞的具体实施方式如上所述。
对于本发明的该方式的细胞培养培养基中的SRF抑制剂的浓度而言，例如在SRF抑制剂为CCG-1423(Cayman Chemical、CAS No.285986-881、C18H14ClF6N2O3、分子量＝454.8)的情况下，作为上述抑制剂的浓度的下限，只要起到促进细胞聚集的效果即可，没有特别限定，优选为4.5ng/mL以上、更优选为45ng/mL以上、特别优选为450ng/mL以上、最优选为1.1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、10μg/mL以上、11μg/mL以上、12μg/mL以上、13μg/mL以上、14μg/mL以上、15μg/mL以上、16μg/mL以上、17μg/mL以上、18μg/mL以上。另一方面，作为上限，只要是细胞不死亡的浓度即可，没有特别限定，优选为4.6mg/mL以下、更优选为460μg/mL以下、特别优选为46μg/mL以下、最优选为19μg/mL以下。另外，上述抑制剂的浓度优选为4.5ng/mL以上且4.6mg/mL以下。另外，本发明的该方式的细胞培养培养基中的SRF抑制剂的浓度特别优选为10nM以上、且10mM以下的范围。作为上述浓度的下限，优选为10nM以上、更优选为100nM以上、特别优选为1μM以上、最优选为2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上、6μM以上、7μM以上、8μM以上、9μM以上、10μM以上、11μM以上、12μM以上、13μM以上、14μM以上、15μM以上、16μM以上、17μM以上、18μM以上、19μM以上、20μM以上、21μM以上、22μM以上、23μM以上、24μM以上、25μM以上，26μM以上、27μM以上、28μM以上、29μM以上、30μM以上、31μM以上、32μM以上、33μM以上、34μM以上、35μM以上、36μM以上、37μM以上、38μM以上、39μM以上。另一方面，作为上限，优选为10mM以下、更优选为1mM以下、特别优选为100μM以下、最优选为40μM以下。
另外，对于本发明的该方式的细胞培养培养基中的ROCK抑制剂的浓度而言，例如在ROCK抑制剂为Y-27632(和光纯药工业株式会社、CAS No.331752-47-7、C14H21N3O·2HCl·H2O、分子量＝338.27)的情况下，特别优选为3.3ng/mL以上且3.4mg/mL以下的范围。作为上述浓度的下限，只要起到促进细胞聚集的效果即可，没有特别限定，优选为3.3ng/mL以上、更优选为33ng/mL以上、特别优选为330ng/mL以上、最优选为800ng/mL以上、1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、10μg/mL以上、11μg/mL以上、12μg/mL以上、13μg/mL以上、14μg/mL以上。另一方面，作为上限，只要是细胞不死亡的浓度即可，没有特别限定，优选为3.4mg/mL以下、更优选为340μg/mL以下、特别优选为34μg/mL以下、最优选为14μg/mL以下。另外，本发明的该方式的细胞培养培养基中的ROCK抑制剂的浓度特别优选为10nM以上、且10mM以下的范围。上述浓度的下限优选为10nM以上、更优选为100nM以上、特别优选为1μM以上、最优选为2.5μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上、6μM以上、7μM以上、8μM以上、9μM以上、10μM以上、11μM以上、12μM以上、13μM以上、14μM以上、15μM以上、16μM以上、17μM以上、18μM以上、19μM以上、20μM以上、21μM以上、22μM以上、23μM以上、24μM以上、25μM以上，26μM以上、27μM以上、28μM以上、29μM以上、30μM以上、31μM以上、32μM以上、33μM以上、34μM以上、35μM以上、36μM以上、37μM以上、38μM以上、39μM以上。作为上限，优选为10mM以下、更优选为1mM以下、特别优选为100μM以下、最优选为40μM以下。
细胞聚集细胞培养培养基制备细胞聚集体的工序，可以举出在上述细胞培养培养基中对细胞进行悬浮培养的工序。该工序的具体实施方式与＜6.促进细胞聚集的方法＞一栏中说明的、促进细胞聚集的方法中的“在包含SRF抑制剂、或SRF抑制剂及ROCK抑制剂的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序”的具体实施方式相同。
上述细胞培养培养基可以冷冻保存至使用前，并在使用时解冻来使用。
实施例
＜实施例1.人iPS细胞的维持培养＞
作为人iPS细胞，使用了TkDN4-M株(东京大学医科学研究所)。在涂布有Vitronectin(Thermo Fisher Scientific公司)的细胞培养用培养皿上接种人iPS细胞，培养基使用Essential 8TM(Thermo Fisher Scientific公司)进行了维持培养。作为传代时的细胞剥离剂，使用了Accutase(Thermo Fisher Scientific公司)。另外，仅在细胞接种时在培养基中添加了Y-27632(和光纯药工业株式会社)，使其为10μM的浓度。每天进行培养基更换。实验中使用了传代数至50次为止的人iPS细胞。
＜实施例2.通过细胞聚集试验确认聚集促进效果＞
对于添加SRF抑制剂带来的促进细胞聚集的效果进行了研究。
(方法)
将按照实施例1的步骤培养的人iPS细胞用Accutase处理3分钟～5分钟，进行剥离，分散至单细胞。将该细胞悬浮于包含最终浓度5mg/mL的BSA(和光纯药工业株式会社)及最终浓度2.5μM的Y-27632(和光纯药工业株式会社)的Essential 8TM培养基，对其一部分进行台盼蓝染色，调查了细胞数。制备为每1mL包含2×105个细胞。另行调整细胞聚集促进剂，使得CCG-1423(Cayman、10010350)的最终浓度为4.55mg/mL(10mM)，将上述调整后的细胞聚集促进剂添加于上述细胞悬浮液，使得CCG-1423的最终浓度为10μM，然后，以1.3mL/孔的比例接种于悬浮培养用12孔板(Sumitomo Bakelite公司)。以接种了细胞的板在旋转振荡器(OPTIMA公司)上以90rpm的速度沿水平面画出回转宽度(直径)为25mm的圆的方式进行回转培养，在5％CO2、37℃的环境中进行了悬浮培养。作为对照试验，在使用了除了未添加CCG-1423以外与上述同样地制备的细胞悬浮液的条件下进行了试验。
开始培养起第二天(培养第1天)通过相差显微镜获得了图像。
另外，使用Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST(株式会社同仁化学研究所)计算出死细胞数。
(结果)
将上述悬浮培养后(培养第1天)的显微镜观察图像示于图1。观察的结果是，与对照试验(0μM CCG-1423)相比，添加了CCG-1423的条件下形成了比较大的聚集体，促进了聚集。对死细胞数进行调查的结果是，与对照试验(0μM CCG-1423)相比，添加了CCG-1423的条件下死细胞数减少(图2)。
＜实施例3.CCG-1423存在条件对聚集体形成后的细胞增殖能力、未分化能力的影响＞
进行人iPS细胞的悬浮培养，测定葡萄糖消耗量、细胞产量、未分化标志物的阳性率，分析了CCG-1423对细胞造成的影响。
(方法)
与实施例2同样地制备细胞悬浮液，另行调整细胞聚集促进剂，使得CCG-1423(同上)的最终浓度为4.55mg/mL(10mM)，将上述调整后的细胞聚集促进剂添加上述细胞悬浮液，使得CCG-1423的最终浓度为10μM，然后以4mL/孔的比例接种于悬浮培养用6孔板(Sumitomo Bakelite公司)。以接种了细胞的板在旋转振荡器(OPTIMA公司)上以90rpm的速度沿水平面画出回转宽度(直径)为25mm的圆的方式进行回转培养，在5％CO2、37℃的环境中进行了悬浮培养。培养第二天(培养第1天)以后，每天更换为新鲜的培养基(包含最终浓度5mg/mL的BSA(和光纯药工业株式会社)的Essential 8TM培养基)，持续培养至培养5天后。作为对照试验，在不含CCG-1423及Y-27632的培养基中同样地进行了培养。培养中，每天通过相差显微镜获得图像。对培养第1天获得的图像中的208个细胞聚集体进行观察，与显微镜照片的比例尺进行比较，求出各细胞聚集体的最宽部分的宽度(表示为“φ”)，调查其分布，计算出平均值±标准偏差。用生物传感器BF-5iD(王子计测机器株式会社)测定培养基更换时回收的培养上清中包含的葡萄糖的浓度，计算出葡萄糖消耗量。
另外，在培养第5天回收细胞聚集体，利用Accutase分散后，悬浮于包含5mg/mL的BSA的Essential 8TM培养基。对该细胞悬浮液的一部分进行台盼蓝染色，调查了细胞数。以300g对上述细胞悬浮液进行3分钟离心分离后，去除上清，用PBS(磷酸缓冲生理盐水)清洗细胞。然后，利用4％多聚甲醛(和光纯药工业株式会社)在室温下固定20分钟后，用PBS清洗3次，利用300μL的PBS将细胞再悬浮，然后用旋涡混匀器一边进行搅拌，一边添加冷甲醇3mL，在-20℃下进行过夜及更长时间的透性化处理。在用3％FBS(胎牛血清)/PBS清洗3次后，利用3％FBS(胎牛血清)/PBS将细胞再悬浮，在室温下封闭30分钟～1小时。然后，利用荧光标记抗SOX2抗体(Cat.No.656110、Biolegend公司)及荧光标记抗OCT4抗体(Cat.No.653703、Biolegend公司)及荧光标记抗Nanog抗体(Cat.No.674010、Biolegend公司)在4℃下进行30分钟～1小时的染色。用3％FBS(胎牛血清)/PBS清洗1次后，利用FACSVerse对通过细胞过滤器的细胞进行了分析。作为对照试验，与分别对应于上述3种抗体的3种已荧光标记的同型对照抗体(Cat.No.400129、Cat.No.400314、Cat.No.400136；Biolegend公司)反应来代替上述3种抗体(已荧光标记的抗SOX2抗体、荧光标记抗OCT4抗体、荧光标记抗Nanog抗体)，除此以外，使用了同样地进行了处理的细胞。
另外，在培养第5天测定了细胞产量。细胞产量的测定按照以下步骤进行。即，用Accutase将形成的细胞聚集体处理5～10分钟，通过用吸管尖进行吸移，使细胞单独分散，进行了台盼蓝染色后，使用血球计数板对细胞数进行计数，测定了细胞产量。
(结果)
图3是培养第1天至第5天观察到的显微镜照片。在添加了CCG-1423的条件下，从接种后至培养第1天形成了细胞聚集体，通过继续进行培养，细胞逐渐增殖，细胞聚集体增大。
图7是添加了CCG-1423的条件下培养第1天的细胞聚集体尺寸(直径)的分布图。另外，以下的表1示出了添加CCG-1423的条件下按培养第1天的尺寸分类的细胞聚集体的个数及其比例。
对添加了CCG-1423的条件下培养第1天的细胞聚集体尺寸(直径)的平均值±标准偏差进行计算的结果是171.3±22.8μm。
另外，在添加了CCG-1423的条件下的培养第1天，相对于细胞聚集体总个数，细胞聚集体尺寸(直径)为40μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为100％。其中，上述细胞聚集体尺寸(直径)为60μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为99.5％，上述细胞聚集体尺寸(直径)为80μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为98.5％，上述细胞聚集体尺寸(直径)为100μm以上且300μm以下的细胞聚集体的比例为98.5％。
[表1]
表1.按尺寸分类的细胞聚集体的个数及其比例
将葡萄糖消耗量示于图4，将培养第5天的细胞产量示于图5。在添加了CCG-1423的条件下，葡萄糖消耗量每天增加，表明细胞正在增殖，已知在培养第5天增殖至接种细胞数(8×105个/孔)的约8.5倍。
将未分化标志物的阳性率的测定结果示于图6。对于在包含CCG-1423的培养基中制备细胞聚集体、然后也通过悬浮培养进行了增殖的细胞而言，作为标志物的SOX2阳性细胞为99％以上，OCT4阳性细胞为97％以上，Nanog阳性细胞为99％以上，确认了通过添加CCG-1423而形成的人iPS细胞的聚集体保持了未分化性。
本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请通过整体引用而引入本说明书。
Claims (17)
1.一种细胞聚集促进剂，其包含SRF抑制剂，所述细胞聚集促进剂用于细胞的悬浮培养。
2.根据权利要求1所述的细胞聚集促进剂，其中，所述SRF抑制剂的浓度为9.0μg/mL以上且10.0mg/mL以下。
3.根据权利要求1或2所述的细胞聚集促进剂，其进一步包含ROCK抑制剂。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞聚集促进剂，其中，所述SRF抑制剂为CCG-1423。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞聚集促进剂，其中，所述细胞为干细胞。
6.一种细胞聚集体的制备方法，该方法包括：在包含SRF抑制剂的培养基中对细胞进行悬浮培养的工序。
7.根据权利要求6所述的制造方法，其中，所述培养基中的所述SRF抑制剂的浓度为4.5ng/mL以上且4.6mg/mL以下。
8.根据权利要求6或7所述的制造方法，其中，所述培养基中进一步包含ROCK抑制剂。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的制造方法，其中，所述SRF抑制剂为CCG-1423。
10.根据权利要求6～9中任一项所述的制造方法，其中，所述细胞为干细胞。
11.一种细胞聚集体，其是通过权利要求6～10中任一项所述的制造方法得到的。
12.一种细胞培养组合物，其包含细胞、培养基、以及SRF抑制剂。
13.根据权利要求12所述的细胞培养组合物，其中，所述SRF抑制剂的浓度为4.5ng/mL以上且4.6mg/mL以下。
14.根据权利要求12或13所述的细胞培养组合物，其进一步包含ROCK抑制剂。
15.根据权利要求12～14中任一项所述的细胞培养组合物，其中，所述SRF抑制剂为CCG-1423。
16.根据权利要求12～15中任一项所述的细胞培养组合物，其中，所述细胞为干细胞。
17.根据权利要求12～16中任一项所述的细胞培养组合物，其中，所述细胞的形态为细胞聚集体。
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