CN111518813A

CN111518813A - 视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用

Info

Publication number: CN111518813A
Application number: CN201910108800.8A
Authority: CN
Inventors: 李斌
Original assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Niufusi Biological Technology Co ltd
Priority date: 2019-02-03
Filing date: 2019-02-03
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2039-02-03
Also published as: CN111518813B

Abstract

本发明提供了视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用。具体地，本发明对RHO基因编码序列进行了针对性特殊优化设计，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞(如感光细胞、视神经细胞)中高效表达RHO蛋白的核苷酸序列，并构建了一种表达正常人源RHO蛋白的重组AAV病毒。相对于未优化的编码序列，经过特殊优化后的RHO编码序列(SEQ ID NO.:1)的表达量显著提高，非常适合在哺乳动物(尤其是人)细胞内表达，能有效治疗视网膜色素变性。

Description

视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用。

背景技术

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是视网膜感光细胞和色素上皮细胞变性导致进行性视野缺损的一组最常见的遗传性致盲性眼底疾病。患者多表现为夜盲、进行性视野缩小和视力下降，最终因视网膜感光细胞凋亡而导致视功能下降，甚至完全丧失。RP具有高度的遗传异质性和临床异质性,有散发、常染色体显性、常染色体隐性、X连锁遗传和双基因遗传等多种遗传方式。目前此病的发病率为1/3500,全世界至少100万人患有此病，其中中国人约占1/4左右,且发病人数程逐年上升趋势。40％-50％的患者为散发或单发,无家族发病史,称为散发性视网膜色素变性(sporadic retinitis pigmentosa,SRP)。X连锁遗传约占所有RP患者的6-20％。常染色体隐性遗传占5％-15％。常染色体显性遗传视网膜色素变性(autosomal dominant retinitis pigmentosa，ADRP)占15％～25％。视紫红质(rhodopsin，RHO)基因突变在欧洲及北美占常染色体显性遗传视网膜色素变性(ADRP)的16％-25％,在中国和日本大约7％左右。RHO基因碱基的突变可造成RHO蛋白的氨基酸替换、终止、或缺失而引起RHO蛋白功能异常，从而引起视功能的紊乱。

因此，本领域亟需开发一种能够有效治疗视网膜色素变性的基因治疗方法和治疗药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够有效治疗视网膜色素变性的基因治疗方法和治疗药物。

本发明的另一目的是提供一种编码视紫红质的编码序列、载体及制备方法。

本发明的第一方面，提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码视紫红质，且所述核苷酸序列选自下组：

(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；

(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％；和

(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括DNA序列、cDNA序列、或mRNA序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括单链序列和双链序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括与SEQ ID NO.:1完全互补的核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种融合核酸，所述融合核酸包含如本发明第一方面所述的编码视紫红质的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述融合核酸还包含UTR序列。

在另一优选例中，所述UTR序列包括3’UTR和/或5’UTR。

在另一优选例中，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：

Z0-Z1-Z2 (I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z0为无、或5’UTR序列；

Z1为如本发明第一方面所述的核苷酸序列；和

Z2为无、或3’UTR序列。

在另一优选例中，所述融合核酸从5’-3’端的结构为5’UTR-RHO-3’UTR。

在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为1-30nt，较佳地1-15nt，更佳地3-6nt。

在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列来源于限制性内切酶酶切形成的核苷酸接头序列。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为病毒颗粒的形式。

在另一优选例中，所述载体为腺相关病毒AAV载体。

在另一优选例中，所述AAV载体的血清型选自：AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、或其组合。较佳地，所述AAV载体的血清型为AAV8或AAV9。

在另一优选例中，所述载体为AAV8载体或AAV9载体。

在另一优选例中，所述载体为壳体转移的AAV载体。

在另一优选例中，所述载体包含AAV2基因组和AAV8壳体蛋白(AAV2/8)、或AAV2基因组和AAV9壳体蛋白(AAV2/9)。

在另一优选例中，所述载体为重组腺相关病毒载体rAAV2/8或rAAV2/9。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒载体、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述载体为含有或插入有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸的AAV载体；较佳地为rAAV2/8或rAAV2/9载体。

在另一优选例中，所述载体的骨架为腺相关病毒载体质粒pSNaV。

在另一优选例中，所述载体用于表达视紫红质。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其染色体中整合有外源的如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：HEK293细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。较佳地，所述宿主细胞为(视网膜)神经节细胞或感光细胞。

本发明的第五方面，提供了如本发明第三方面所述的载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力、和/或治疗或预防眼部疾病。

在另一优选例中，所述眼部疾病为视网膜色素变性(RP)。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗或预防视网膜色素变性，如常染色体显性遗传视网膜色素变性(ADRP)。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于减少患有或有风险形成视网膜色素变性的受试者中的感光细胞或视神经细胞死亡。

本发明的第六方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体；更佳地为AAV2/8或AAV2/9载体。

在另一优选例中，所述药物制剂中载体的含量为1×10⁹-1×10¹⁶个病毒/毫升，较佳地1×10¹²-1×10¹³个病毒/毫升。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗或预防眼部疾病，较佳地治疗或预防视网膜色素变性(RP)。

本发明的第七方面，提供了一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括将本发明第三方面所述的载体施用于需要的对象。

在另一优选例中，所述方法为治疗或预防眼部疾病的方法。

在另一优选例中，所述眼部疾病为视网膜色素变性(RP)。

在另一优选例中，所述方法为在患有或有风险形成色素性视网膜炎的患者中减少感光细胞或视神经细胞死亡的方法。

在另一优选例中，将所述载体引入到需要的对象的眼睛内。

在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述方法包括通过视网膜下，直接视网膜注射或玻璃体内注射来将本发明第三方面所述的载体施用至需要的对象的眼。

在另一优选例中，所述方法可使由于视网膜色素变性引起的感光细胞或视神经细胞死亡在需要的对象的一生中基本上得以阻止。

在另一优选例中，所述方法在处理的眼中视觉功能基本得以恢复或维持。

本发明的第八方面，提供了一种重组视紫红质的制备方法，包括步骤：培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而得到重组视紫红质。

本发明的第九方面，提供了一种病毒载体生产系统，其包含一组编码所述病毒载体生产所需要的组分的多核苷酸，其中所述病毒载体基因组包含本发明第一方面所述的核苷酸序列。

本发明的第十方面，提供了用于本发明第九方面所述的病毒载体生产系统的DNA构建体，其包含本发明第一方面所述的核苷酸序列。

本发明的第十一方面，提供了病毒载体生产细胞，其包含本发明第一方面所述的核苷酸序列、或本发明第九方面所述的病毒载体生产系统、或本发明第十方面所述的DNA构建体。

本发明的第十二方面，提供了生产病毒载体的方法，其包括将本发明第一方面所述的核苷酸序列引入细胞并在适合于所述病毒载体生产的条件下培养所述细胞。

在另一优选例中，所述细胞是HEK293或HEK293T细胞。

本发明的第十三方面，提供了一种载体，所述载体含有编码RHO蛋白的核酸分子。

在另一优选例中，所述RHO蛋白具有如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述编码RHO蛋白的核酸分子具有如SEQ ID NO.:1、2、6或7所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述载体为腺相关病毒载体，较佳地为腺相关病毒载体AAV2/8或AAV2/9。

本发明的第十四方面，提供了本发明第十三方面所述载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力、和/或治疗或预防眼部疾病。

在另一优选例中，所述眼部疾病包括视网膜色素变性。

本发明的第十五方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)本发明第十三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了经优化的RHO核苷酸序列与原人视紫红质基因序列对比结果。优化RHO核苷酸序列与原人视紫红质基因开放阅读框序列比较同源性为88.31％(922/1044)。其中上行序列为经优化的开放阅读框核苷酸序列，下行序列为原人视紫红质基因序列(野生序列)。

图2显示了PCR核酸电泳验证野生RHO基因(泳道1)和优化RHO基因(泳道2)的克隆结果。

图3显示了重组质粒pSNaV/rAAV-优化hRHO结构图。

图4显示了rAAV-RHO病毒的蛋白电泳图。其中，泳道1:蛋白marker；泳道2：rAAV-优化hRHO。

图5显示了不同组别兔眼的眼底拍照结果。

图6显示了不同组别兔眼的RHO免疫荧光检测结果柱状图。

图7显示了不同组别兔眼的OCT检测结果。图7A为A组的OCT检测结果，图7B为B组的OCT检测结果，图7C为M组的OCT检测结果，图7D为O组的OCT检测结果。

图8显示了不同组别兔眼的RHO基因的mRNA检测结果。

图9显示了不同组别兔眼的RHO蛋白检测结果。

图10显示了不同组别小鼠体重变化。

图11显示了不同组别小鼠肌肉RHO基因的mRNA相对表达水平。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，对视紫红质(RHO)基因编码序列进行了针对性优化设计，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞中进行高效转录和高效表达人源RHO蛋白的核苷酸序列，并构建了视紫红质的重组表达载体。实验结果表明，相对于未优化的编码序列，经过特殊优化后的RHO编码序列(SEQ ID NO.:1)的表达量显著提高。此外，本申请人还意外地发现对于本申请特殊优化后的RHO编码序列，相比其他血清型的AAV载体，AAV2/8和AAV2/9作为载体能够更好地表达RHO蛋白、更有效地治疗RP。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。

如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。

腺相关病毒

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。

重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

在本发明一个优选的实施例中，载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV含有大约4700碱基并在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。

AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请No.PCT/US2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239；美国专利No.4,797,368、6,596,535和5,139,941，以及欧洲专利No.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于AAV的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒，和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。

在一些实施方案中，重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16的AAV病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的，并在美国专利No.6,596,535中有所描述。不同血清型AAV的衣壳蛋白识别细胞表面的受体不同，因而对不同组织细胞的侵染效率差异很大，表现出一定的器官靶向特异性。不同血清型的AAV对不同的目的蛋白编码序列，表达效率也可能存在不同结果。

视网膜色素变性(RP)

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是视网膜感光细胞和色素上皮细胞变性导致进行性视野缺损的一组最常见的遗传性致盲性眼底疾病。患者多表现为夜盲、进行性视野缩小和视力下降，最终因视网膜感光细胞凋亡而导致视功能下降，甚至完全丧失。RP具有高度的遗传异质性和临床异质性,有散发、常染色体显性、常染色体隐性、X连锁遗传和双基因遗传等多种遗传方式。目前此病的发病率为1/3500,全世界至少100万人患有此病，其中中国人约占1/4左右,且发病人数程逐年上升趋势。40％-50％的患者为散发或单发,无家族发病史,称为散发性视网膜色素变性(sporadic retinitis pigmentosa,SRP)。X连锁遗传约占所有RP患者的6-20％。常染色体隐性遗传占5％-15％。常染色体显性遗传视网膜色素变性(autosomal dominant retinitis pigmentosa，ADRP)占15％～25％。视紫红质(rhodopsin，RHO)基因突变在欧洲及北美占常染色体显性遗传视网膜色素变性(ADRP)的16％-25％,在中国和日本大约7％左右。随着分子遗传学的发展,人们对该病的分子发病机理的探讨已取得突破性的进展。视紫红质(RHO)基因，其编码的蛋白仅在视杆光感受器细胞中专一表达，并且与RP发病早期即存在的视杆变性一致，从而成为RP分子缺陷研究的第一个候选基因。

RHO

如本文所用，术语“视紫红质”、“RHO蛋白”、“多肽”、“人RHO蛋白”和“hRHO蛋白”具有相同的意义，在本文中可互换使用。

自1990年Dryja等首次发现存在RHO基因突变以来，至今已报道了有100多种致病突变，大多数是无意或错意突变。90％以上是单个碱基的点突变，少数为微小缺失、无义突变和插入突变。RHO基因位于染色体3q21-q24，含有4个内含子和5个外显子，编码含有348个氨基酸的RHO蛋白，这是在人眼中把光讯号转化为视讯号过程中一个起重要作用的光敏蛋白，RHO蛋白主要分布于视杆细胞外节的膜盘上，是视杆细胞产生暗视觉的主要物质，也是膜盘的主要组成部分。具有光敏性的RHO蛋白是G蛋白偶联受体家族的一员，由视蛋白以及11-顺式视黄醛两个部分组成，视蛋白的二级结构含有7个跨膜的α螺旋，是由348个氨基酸组成，RHO的11-顺式视黄醛位于视蛋白的第七个α螺旋的赖氨酸上，其N端在膜盘外，C端在膜盘内，接受光照后，11-顺式视黄醛异构成全反式视黄醛，是蛋白结构迅速变化使视红质处于激发状态，从而引起感光换能级联反应。随着全反式视黄醛从视蛋白上分离，RHO成为没有光敏性的拖辅机视蛋白，当再次与11-顺式视黄醛结合后，才能恢复它的光敏性。RHO基因碱基的突变可造成RHO蛋白的氨基酸替换、终止、或缺失而引起RHO蛋白功能异常，从而引起视功能的紊乱。

RHO基因一个等位基因的突变就会导致其蛋白结构异常，也就是会导致糖基化改变的异常视蛋白的产生；该蛋白滞留在视杆细胞的内质网中，不能运输到视杆细胞外节盘膜中，或者该变异视蛋白由于结构异常不能折叠，而不能整合入盘膜或引起盘膜结构不稳定而引发视杆细胞变性，导致RP。目前还没有FDA或欧洲药品管理局批准的治疗方法来治疗这种常染色体显性遗传的视网膜色素变性。近年来，基因治疗RP取得了较大的进展。目前已建立了多种RP的动物模型，包括视网膜变性(retinal degeneration，rd)小鼠、慢性视网膜变性(retinal degeneration slow，rds)小鼠等，为RP发病机制及治疗研究提供了帮助。与RP相关的基因所编码的蛋白质主要与光级酶联反应或视紫质光代谢、光感受器结构蛋白、光感受器细胞转录因子有关，目前研究表明RP病理变化均以细胞凋亡为共同途径。基因治疗是将治疗基因装配到一定的载体中，导人体细胞所缺陷的基因，以阻止疾病的发展。基因载体包括病毒载体和非病毒载体，病毒载体主要有腺相关病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、重组腺相关病毒载体等。本发明选择AAV载体作为病毒载体，AAV本身并不会被整合入人体基因组，而是作为循环载体，降低了引起其他基因病的风险，且只引起较小的免疫反应，并能在多种视网膜细胞中长期转基因表达。

核酸编码序列

本发明的要解决的技术问题是克服现有技术中RHO表达效率不高、治疗效果不佳的技术缺陷。本发明提供一种优化的RHO基因序列。本发明优化后的RHO编码序列如SEQ IDNO：1所示，其大小为1044bp。经研究发现，本发明优化的RHO基因序列(SEQ ID NO.:1)，使RHO蛋白表达效率更高，有更多的RHO蛋白在患者视神经细胞或感光细胞发挥生理作用。

本发明所述的编码视紫红质的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。在另一优选例中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％。在本发明中，所述经优化的编码视紫红质的核酸又称作RHO优化编码序列、RHO优化基因、或RHO优化核酸或优化hRHO。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。

RHO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

MNGTEGPNFYVPFSNATGVVRSPFEYPQYYLAEPWQFSMLAAYMFLLIVLGFPINFLTLYVTVQHKKLRTPLNYILLNLAVADLFMVLGGFTSTLYTSLHGYFVFGPTGCNLEGFFATLGGEIALWSLVVLAIERYVVVCKPMSNFRFGENHAIMGVAFTWVMALACAAPPLAGWSRYIPEGLQCSCGIDYYTLKPEVNNESFVIYMFVVHFTIPMIIIFFCYGQLVFTVKEAAAQQQESATTQKAEKEVTRMVIIMVIAFLICWVPYASVAFYIFTHQGSNFGPIFMTIPAFFAKSAAIYNPVIYIMMNKQFRNCMLTTICCGKNPLGDDEASATVSKTETSQVAPA(SEQ ID NO.:3)

核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。核酸序列可以是基因组的、重组的或合成的。核酸序列可以是分离的或纯化的。核酸序列可以是单链或双链的。优选地，核酸序列将编码如本文描述的RHO蛋白。核酸序列可以通过克隆衍生，例如使用包括限制性酶切、连接、凝胶电泳的标准的分子克隆技术，例如在Sambrook等Molecular Cloning:A laboratorymanual,Cold Spring Harbour Laboratory Press)中描述的。核酸序列可是分离的，例如使用PCR技术分离的。分离意指从任何杂质和从被自然地发现与其来源中的核酸序列缔合的其他核酸序列和/或蛋白中分离核酸序列。优选地，其还将不含细胞材料、培养基或来自纯化/生产过程的其他化学物质。核酸序列可以是合成的，例如通过直接的化学合成产生。核酸序列可以作为裸露的核酸被提供，或可与蛋白或脂质复合提供。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

在本发明较佳的实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术利用所述宿主细胞表达RHO蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明RHO蛋白的宿主细胞(如哺乳动物细胞)。一般来说包括步骤：将本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体转导入宿主细胞内。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。

宿主细胞可以是原核细胞，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有：CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择HEK细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、神经细胞为宿主细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

序列优化

在本发明中，提供了特殊优化的、表达效率(包括转录效率和/或翻译效率)显著提高的视紫红质的编码序列，所述编码序列如SEQ ID NO.:1所示。

如本文所用，所述“优化的RHO编码序列”、“优化RHO编码基因”、“hRHO优化基因”、“优化hRHO基因”、“优化RHO核酸”可互换使用，均指本发明经过特殊优化后的编码视紫红质的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。本发明优化的RHO编码序列别适合在哺乳动物细胞中表达。

在本发明中，所述RHO的野生DNA编码序列(未优化的DNA编码序列)如SEQ ID NO.:2所示，所述未优化的野生DNA编码序列的表达量很低。RHO野生编码序列的具体核酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

ATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCC(SEQ ID NO.:2)

本发明优化了影响基因表达的序列片段，这些序列片段包括但不限于，密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。最终获得了多个经优化的RHO编码序列，包括如SEQ ID NO.:1、6、7所示的核苷酸序列等。

其中，野生RHO序列与如SEQ ID NO.:6所示的RHO优化序列相似度为77.97％(814/1044)。

ATGAATGGTACTGAAGGCCCTAACTTTTATGTTCCCTTCTCTAATGCTACCGGAGTCGTACGTTCCCCATTTGAGTACCCGCAATATTACTTAGCCGAACCTTGGCAGTTCTCAATGTTGGCAGCGTATATGTTTCTTCTCATTGTGCTAGGGTTCCCCATCAACTTTCTGACATTATACGTTACGGTCCAACATAAAAAGTTGCGCACTCCACTTAATTATATACTCCTAAACCTGGCTGTAGCCGATTTATTCATGGTGTTGGGTGGCTTTACCTCGACACTTTACACGAGTCTCCACGGATATTTCGTTTTTGGGCCGACTGGTTGTAATCTAGAGGGCTTCTTTGCAACCCTGGGAGGGGAAATTGCGTTATGGAGCTTGGTCGTACTTGCTATCGAGCGATACGTGGTTGTCTGCAAACCTATGTCTAACTTCCGGTTTGGTGAAAATCATGCCATAATGGGCGTAGCATTCACATGGGTGATGGCGCTCGCTTGTGCCGCACCCCCACTAGCGGGATGGTCCAGATATATTCCGGAGGGGCTGCAGTGCTCATGTGGTATCGACTACTATACGTTAAAGCCTGAAGTTAACAATGAGTCGTTTGTCATATACATGTTCGTAGTGCACTTTACTATTCCCATGATCATAATTTTCTTTTGCTATGGCCAATTGGTTTTCACCGTCAAAGAAGCTGCCGCACAGCAACAGGAGAGTGCGACAACGCAAAAGGCTGAAAAAGAGGTAACTAGGATGGTGATCATAATGGTTATTGCCTTTCTTATCTGTTGGGTCCCATACGCAAGCGTAGCGTTCTATATATTTACCCATCAGGGATCTAACTTCGGGCCGATTTTTATGACAATCCCTGCTTTCTTTGCCAAGTCCGCAGCGATATACAATCCCGTGATTTATATCATGATGAACAAACAATTCCGTAATTGCATGCTCACGACTATATGTTGCGGTAAGAACCCACTAGGCGATGACGAAGCTTCAGCCACCGTTTCGAAAACAGAGACGAGTCAGGTCGCACCGGCG(SEQ ID NO.:6)

其中，野生RHO序列与如SEQ ID NO.:7所示的RHO优化序列相似度为81.42％(850/1044)。

ATGAACGGCACCGAGGGCCCCAACTTCTACGTGCCCTTCAGCAACGCCACCGGCGTGGTGCGCAGCCCCTTCGAGTACCCCCAGTACTACCTGGCCGAGCCCTGGCAGTTCAGCATGCTGGCCGCCTACATGTTCCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTGACCCTGTACGTGACCGTGCAGCACAAGAAGCTGCGCACCCCCCTGAACTACATCCTGCTGAACCTGGCCGTGGCCGACCTGTTCATGGTGCTGGGCGGCTTCACCAGCACCCTGTACACCAGCCTGCACGGCTACTTCGTTTTTGGGCCGACTGGTTGTAATCTAGAGGGCTTCTTTGCAACCCTGGGAGGGGAAATTGCGTTATGGAGCTTGGTCGTACTTGCTATCGAGCGATACGTGGTTGTCTGCAAACCTATGTCTAACTTCCGGTTTGGTGAAAATCATGCCATAATGGGCGTAGCATTCACATGGGTGATGGCGCTCGCTTGTGCCGCACCCCCACTAGCGGGATGGTCCAGATATATTCCGGAGGGGCTGCAGTGCTCATGTGGTATCGACTACTATACGTTAAAGCCTGAAGTTAACAATGAGTCGTTTGTCATATACATGTTCGTAGTGCACTTTACTATTCCCATGATCATAATTTTCTTTTGCTATGGCCAATTGGTTTTCACCGTCAAAGAAGCTGCCGCACAGCAACAGGAGAGTGCGACAACGCAAAAGGCTGAAAAAGAGGTAACTAGGATGGTGATCATAATGGTTATTGCCTTTCTTATCTGTTGGGTCCCATACGCAAGCGTAGCGTTCTATATATTTACCCATCAGGGATCTAACTTCGGGCCGATTTTTATGACAATCCCTGCTTTCTTTGCCAAGTCCGCAGCGATATACAATCCCGTGATTTATATCATGATGAACAAACAATTCCGTAATTGCATGCTCACGACTATATGTTGCGGTAAGAACCCACTAGGCGATGACGAAGCTTCAGCCACCGTTTCGAAAACAGAGACGAGTCAGGTCGCACCGGCG(SEQ ID NO.:7)

通过大量的分析和试验筛选，最终得到如SEQ ID NO.:1所示的特别优化的DNA编码序列，其大小为1044bp，起始于密码子ATG，由5个外显子组成，编码348个氨基酸，是一种G-蛋白偶联受体，在视觉光电转化过程中起作用的。此序列是经过特殊优化，转录水平和翻译水平提高，RHO表达量显著提高。特别优化后的SEQ ID NO.:1所示的编码序列与SEQ IDNO.:2所示的野生编码序列相似度为88.31％(922/1044)。

ATGAACGGCACCGAGGGCCCCAACTTCTACGTGCCCTTCAGCAACGCCACCGGCGTGGTGCGCAGCCCCTTCGAGTACCCCCAGTACTACCTGGCCGAGCCCTGGCAGTTCAGCATGCTGGCCGCCTACATGTTCCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTGACCCTGTACGTGACCGTGCAGCACAAGAAGCTGCGCACCCCCCTGAACTACATCCTGCTGAACCTGGCCGTGGCCGACCTGTTCATGGTGCTGGGCGGCTTCACCAGCACCCTGTACACCAGCCTGCACGGCTACTTCGTGTTCGGCCCCACCGGCTGCAACCTGGAGGGCTTCTTCGCCACCCTGGGCGGCGAGATCGCCCTGTGGAGCCTGGTGGTGCTGGCCATCGAGCGCTACGTGGTGGTGTGCAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGCGAGAACCACGCCATCATGGGCGTGGCCTTCACCTGGGTGATGGCCCTGGCCTGCGCCGCCCCCCCCCTGGCCGGCTGGAGCCGCTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCAGCTGCGGCATCGACTACTACACCCTGAAGCCCGAGGTGAACAACGAGAGCTTCGTGATCTACATGTTCGTGGTGCACTTCACCATCCCCATGATCATCATCTTCTTCTGCTACGGCCAGCTGGTGTTCACCGTGAAGGAGGCCGCCGCCCAGCAGCAGGAGAGCGCCACCACCCAGAAGGCCGAGAAGGAGGTGACCCGCATGGTGATCATCATGGTGATCGCCTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCCTTCTACATCTTCACCCACCAGGGCAGCAACTTCGGCCCCATCTTCATGACCATCCCCGCCTTCTTCGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCCGTGATCTACATCATGATGAACAAGCAGTTCCGCAACTGCATGCTGACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCCCTGGGCGACGACGAGGCCAGCGCCACCGTGAGCAAGACCGAGACCAGCCAGGTGGCCCCCGCC(SEQ ID NO.:1)

表达载体和宿主细胞

本发明还提供了一种用于RHO蛋白的表达载体，它含有本发明的优化RHO编码序列。

通过提供的序列信息，熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的核酸序列或载体。

优选地，编码RHO蛋白的核酸序列作为载体，优选地表达载体被提供。优选地，其可作为优选地适用于在视网膜靶细胞中转导和表达的基因治疗载体被提供。载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体:腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。优选地，病毒载体是复制缺陷的(replicationdefective)，尽管设想其可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶视网膜细胞的基因组。用于向视网膜靶细胞引入编码RHO蛋白的核酸序列的优选的病毒载体是AAV载体，例如自身互补的腺相关病毒(scAAV)。使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8载体)可以实现选择性靶向。

病毒载体可被修饰以缺失任何非必需的序列。例如，AAV中，病毒可被修饰以缺失全部或部分的IX基因、Ela和/或Elb基因。对于野生型AAV，没有辅助病毒诸如腺病毒的存在，复制是非常低效率的。对于重组的腺相关病毒，优选地，复制基因和衣壳基因以反式被提供(在pRep/Cap质粒中)，并且仅AAV基因组的2ITR被保留并且包装进入病毒体，同时需要的腺病毒基因被被腺病毒或另一个质粒提供。也可对慢病毒载体做出类似的修饰。

病毒载体具有进入细胞的能力。然而，非病毒载体诸如质粒可与剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类剂包括聚阳离子剂。可选地，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用，并且优选地适于在人类中使用。

载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在视网膜靶细胞中的表达。

“可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。

启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导在内视网膜细胞中遍在的表达，或神经元特异的表达。在后一种情况中，启动子可以指导细胞类型特异的表达，例如对给视神经节细胞。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如，合适的启动子可以选自由以下组成的组:L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。使用细胞特异的启动子可以实现靶向，例如Grm6-SV40用于选择性靶向给视神经细胞。Grm6启动子是Grm6基因的200碱基对增强子序列和SV40真核启动予的融合体，Grm6基因编码给视神经细胞特异的代谢型谷氨酸受体mGluR6。Grm6基因的优选的来源是小鼠和人类。使用泛-神经元的启动子可以实现遍在的表达，其实例在本领域是己知的并且可得的。一个此类实例是CAG。CAG启动于是CMV早期增强子和鸡肌动蛋白启动子的融合体。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

许多表达载体可应用RHO蛋白在哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)表达。本发明优选用腺相关病毒作为表达载体，优选用AAV2/8或AAV2/9载体作为表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，用于表达RHO蛋白。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)，提高RHO蛋白的表达量。

制剂和组合物

本发明提供一种制剂或组合物，所述制剂或组合物含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗视网膜色素变性。

本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的载体(vector)，例如病毒载体(包括腺相关病毒载体)。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗眼部疾病。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。

在本发明中，所述载体可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，优选地，载体作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如

)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明提供的编码RHO的核酸，可以体外或体内生产RHO蛋白，可应用于制备治疗视网膜色素变性的药物。

经优化的编码视紫红质的核酸表达量更高，从而翻译出更多的RHO蛋白。优化RHO核酸比现有技术编码表达更多的RHO蛋白，其转染效率更高，能较好地治疗视网膜色素变性。感染视神经细胞，在神经细胞内表达RHO蛋白进发挥作用。

治疗方法

本发明提供了向细胞提供感光细胞或视神经细胞功能的方法，所述方法包括将包含编码RHO的优化序列的载体引入到眼睛内。所述方法可包括向眼睛的内视网膜细胞视网膜下或玻璃体内施用核酸载体。

本发明提供了用于通过向细胞提供感光细胞或视神经细胞功能在治疗视网膜退化的方法中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码RHO的优化序列。本发明组合物可以单独给药，或者与其他治疗药物联合给药(如配制在同一药物组合物中)。

本发明还提供了扩大视网膜中的感光细胞或视神经细胞功能的方法，特别是在视杆和/或视锥细胞退化之后扩大视网膜中的感光细胞或视神经细胞功能的方法，所述方法包括将核酸载体引入到眼睛的玻璃体腔内，所述核酸载体包含编码RHO的优化序列。所述方法可包括向眼睛的内视网膜细胞，视网膜下或玻璃体内施用核酸载体。本发明提供了用于通过扩大视网膜中的感光细胞或视神经细胞功能在治疗视网膜退化中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码RHO的优化序列。

本发明还提供了对受试者恢复视力的方法，所述方法包括将包含编码RHO的优化序列的载体引入到眼睛内。方法可包括视网膜下或玻璃体内施用核酸载体到眼睛的内视网膜细胞。本发明提供了用于在对受试者恢复视力中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码RHO的优化序列。

本发明还提供了治疗受试者中的视网膜疾病的方法，所述方法包括将包含编码RHO的优化序列的载体引入到眼睛内。方法可包括视网膜下或玻璃体内施用核酸载体到眼睛的内视网膜细胞。疾病可以是视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；其他形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、视网膜色素变性、Leber先天性黑蒙症、葡萄膜炎和由感光细胞或视神经细胞能力的丧失导致的任何其他疾病。

如本文所用，向细胞提供感光细胞或视神经细胞功能意指，之前不具有感光细胞或视神经细胞能力或其感光细胞或视神经细胞能力已经完全地或部分地退化的细胞，在其中表达编码RHO的外来核酸序列后，变成感光的。此类细胞在本文中可被称作转化的细胞，因为其在其中包含非天然的核酸。优选地，转化的视网膜细胞展现天然的感光细胞的一些或全部的感光细胞能力。优选地，转化的视网膜细胞展现天然的视神经节细胞的一些或全部的视神经节细胞能力。优选地，转化的细胞展现天然的视网膜感光细胞的至少相同或大体上相同的感光能力。优选地，转化的细胞展现比患病的或正在退化的天然的视网膜感光细胞高的感光能力。因此，转化的细胞相比于来自同一来源、保持在同一条件下、未经处理的退化的或患病的细胞，将优选地具有增加的感光细胞或视神经细胞。转化的细胞通过其中的外源核酸的存在可与天然的细胞区分。

如本文所用，扩大感光细胞或视神经细胞功能意指通过增加感光细胞或视神经细胞诸如视杆或视锥细胞中的功能和/或通过向细胞提供感光细胞或视神经细胞功能，增加视网膜的感光细胞或视神经细胞功能。因此，视网膜相比于未用如本文描述的方法处理的视网膜，将具有增加的接收光信号并且传送此类信号的能力，增加可以是任何量。

如本文所用，恢复受试者中的视力意指，受试者相比于治疗之前，例如使用如本文描述的视力测试，显示改进的视力。恢复包括任何程度的改进，包括视力的完全恢复到完美的或接近完美的视力。

如本文所用，治疗疾病意指施用如本文描述的核酸或载体以改善或减轻疾病的一种或多种症状，所述疾病选自由以下组成的组:视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、视网膜色素变性、缺血性状况、Leber先天性黑蒙症、葡萄膜炎和由感光细胞或视神经细胞能力的丧失导致的任何其他疾病。改善或减轻可导致外周或中央视力、和/或白天或夜间视力的改善。

本发明的方法包括将编码RHO蛋白的核酸序列引入到眼睛的玻璃体腔内。优选地，方法包括使细胞与包含编码RHO蛋白的核酸序列的载体(较佳地为病毒，更佳地为腺相关病毒)接触。优选地，细胞是视网膜细胞，优选地视锥细胞、视杆细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞。

当核酸序列和一种或多种酶以多个(两个或多个)剂量被提供时，这些剂量可分隔合适的时间间隔，例如30秒到若干小时或1天或多天。

每个剂量可包含有效量的核酸序列或病毒载体。核酸序列或病毒载体的有效剂量可以在每治疗方案1×10⁹-1×10¹⁶病毒的范围。

本发明是基于靶向编码RHO的优化的核酸序列到视网膜细胞，以补偿视网膜中感光细胞或视神经细胞的退化。核酸序列被靶向至的细胞是视网膜的细胞，其是活的并且能够表达外来核酸序列。视网膜细胞是视网膜的细胞，其是神经或神经元细胞并且能够变兴奋并传送电信号。优选地，靶视网膜细胞将能够产生电信号并且起始信号级联，导致信号向视神经的传送。优选地，靶视网膜细胞是内视网膜的细胞。靶细胞可以是视杆或视锥细胞，和/或可以是非感光细胞(即呈其天然形式的对光不响应的视网膜细胞)。靶视网膜细胞可以包括一种或多种细胞类型，所述细胞类型选自由以下组成的组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、米勒细胞和/或无长突细胞。

因此，当靶视网膜细胞是靶向视网膜的给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞时，编码RHO的核酸的表达可以被称作异位表达。因此，本发明在其范围内包括在非感光细胞中异位表达编码RHO的核酸序列的方法。此类异位表达通过其中的异源RHO蛋白的表达，具有向细胞提供感光细胞或视神经细胞功能的作用。这用于增加观察到退化的视网膜的感光能力。

水平细胞是内视网膜细胞，参与信号加工和反馈到感光细胞；双极细胞是内视网膜细胞并且在视杆/视锥细胞和无长突和/或神经节细胞间通信；无长突细胞发现于内视网膜并且允许在感光细胞途径和神经节细胞间的通信；神经节细胞是最内部的视网膜细胞，其将信号从感光细胞传递到视神经。

本文对细胞的提及包括细胞的后代。优选地，根据本发明的对细胞的修饰还发生在转化的宿主细胞以后的代中。后代细胞可以不与最初的靶向细胞一致，但优选地将也展现非天然的RHO的表达。

与现有技术相比，本发明主要具有以下优点：

1.本发明人视紫红质(hRHO)编码基因序列进行了针对性的特殊优化，基因序列不同于现有技术。与RHO的未优化的DNA编码序列相比，表达效率显著提高。优化后的序列RHO蛋白表达量显著提高、生物活性高。

2.本发明rAAV2/8和rAAV2/9携带优化hRHO基因表达效果最好，穿透能力强，感染效率高，且能够在多种组织层次表达。

3.本发明优化的RHO编码基因(SEQ ID NO.:1)或重组表达载体能够非常有效地治疗眼部疾病(如视网膜色素变性)，并且安全性好，不会发生明显的炎症反应或其他并发症。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1序列优化

在本实施例中，基于RHO蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.:3)和天然的编码序列(SEQ ID NO.:2)，本发明人对编码序列进行了优化。具体地，本发明优化了影响基因表达的序列片段，这些序列片段包括但不限于：密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。

在本实施例中，设计了数十个优化的RHO编码序列，并对优化的RHO编码序列进行分析和试验筛选。结果发现，相比天然的RHO编码序列(SEQ ID NO.:2)，序列如SEQ ID NO.:1所示的特别优化的DNA编码序列，其RHO蛋白表达效率显著提高。而序列如SEQ ID NO.:6和7所示的核苷酸序列的RHO蛋白表达效率没有显著提高，提高幅度不到10％。

实施例2重组人视紫红质基因的重组腺相关病毒载体构建及其病毒包装纯化

1、含有人视紫红质基因重组腺相关病毒载体的构建

1)载体构建

将天然的编码序列(SEQ ID NO.:2)和实施例1中优化的人视紫红质基因(SEQ IDNO：1)加Kpn I和Sal I两个酶切位点或者将以该新基因设计引物用PCR扩增的产物与pSNaV质粒载体，分别进行Kpn I和Sal I双酶切，回收酶切产物，T4DNA Ligase连接过夜，连接产物转化感受态细胞得到重组pSNaV/-野生hRHO和pSNaV/-优化hRHO。

2)重组子的筛选和鉴定

取37℃培养后的LB平板，出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有Amp 100mg/L的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养8h。培养好后取菌液，提取质粒，质粒提取步骤参照Biomiga说明书。取1uL质粒作为模板，所述特异性引物为：

1F:5’-ACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATG-3’(SEQ ID NO.:4)；

1R:5’-GTCTTGGACACGGTAGCAGAGGC-3’(SEQ ID NO.:5)；

PCR扩增程序

对PCR产物电泳检测(图2)，得到一个大小约1000bp左右的目的条带。

3)菌液保存及PCR扩增及其片段测序

吸取1mL经过鉴定的菌液与灭菌后的的甘油1:3比例混匀,于-80℃保存，进行菌液测序，将测序得到的序列与优化的人视紫红质基因比对分析，成功得到序列正确的重组腺相关病毒质粒骨架pSNaV/rAAV-优化hRHO(图3)。

2、rAAV-hRHO重组腺相关病毒包被

1)转染前一天，将293T细胞接种于225cm2细胞培养瓶中，接种密度3.0×107个/mL细胞,培养基为DMEM+10％牛血清，置37℃含5％CO2的培养箱中培养过夜。

2)转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染。具体步骤为：

(a)每个转染瓶取pAdHelper、pAAV-r2c5、pSNaV-hRHO质粒按要求比例与DMEM+PlasmidTrans II(VGTC)(转染试剂)在1.5mL无菌Ep管中混匀，编号为A试剂，室温静止10～15min；

(b)将A试剂同30mL DMEM+10％牛血清混合均匀，编号B试剂；

(c)将B试剂均匀加入细胞培养瓶中，37℃含5％CO2的培养箱中继续培养；

(d)转染16h后，换完全培养基(DMEM+10％牛血清)。

3)转染48h后，收取细胞。

4)将收取细胞用PBS重悬，并反复冻融3次。

3、rAAV-hRHO病毒的纯化与浓缩

采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三步来分离、浓缩和纯化rAAV-hRHO病毒。总回收率＝终产物的病毒颗粒数/起始物的病毒颗粒数。

4、病毒纯度和滴度验证

灌制SDS-PAGE分离胶和积层胶,分离胶浓度为10％。分别按每个加样孔加样15μg。电泳完毕后用考马斯亮蓝染色，用相应的脱色液脱色直到显出低背景的、清晰的条带(图4)。

结果显示，VP1/VP2/VP3＝1:1:10，条带清晰，比例正常，无可见杂带，纯度在99％以上。

rAAV-hRHO的滴度测定采用荧光定量PCR方法检测rAAV-RHO的物理滴度。

SYBRⅡ(takara)；目的片段引物(20uM)；包装病毒用目的质粒(已知浓度)；待测病毒；PCR八联管(Bio-red)。实验方法：模板1ul，SYBRⅡ7ul引物1 0.25ul，引物2 0.25ul，加nuclease-free水到14ul。PCR反应条件：预变性：95℃10min；循环：95℃15sec，60℃1min。确定其基因组滴度为1×10¹²vg/mL。

实施例3rAAV-hRHO重组腺相关病毒对视网膜色素变性的效果实验

1.兔眼玻璃体腔注射

取51只兔子分为3组，分为实验A组-P组和对照组，分别吸取50ul 1×10¹²vg/mL的腺相关病毒在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射。

其中，携带有优化的RHO编码序列的重组腺相关病毒载体rAAV/优化-hRHO；携带野生(未优化)的RHO编码序列的重组腺相关病毒载体rAAV/野生-hRHO。

2、裂隙灯、眼压、眼底照相检查

9组兔子分别于术后1、3、7、30天进行裂隙灯，眼压的检查。所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害(图5)。表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症。

3、视网膜的荧光照相

玻璃体腔注射30天后，预计EGFP组视网膜的荧光照相显示，EGFP成功在视网膜上表达，表明以rAAV为载体，携带EGFP转染兔眼玻璃体内，能够正常在视网膜上表达。

4、hRHO的免疫荧光检测

玻璃体腔注射30天后，剥离实验组和对照组眼球，制成石蜡切片。石蜡切片置于65℃烘箱中烘片2h，脱蜡至水，用PBS冲洗三次，每次5min。切片置于EDTA缓冲液中微波修复，中火至沸后断电，间隔10min低火至沸。自然冷却后PBS洗3次，每次5min。切片放入3％过氧化氢溶液，室温下孵育10min。PBS洗3次，每次5min，甩干后5％BSA封闭20min。去除BSA液，每张切片加入50μl稀释的一抗覆盖组织，4℃过夜。PBS洗三次，每次5min。去除PBS液，每张切片加50μl-100μl相应种属的荧光二抗，避光室温下孵育50min-1h。避光PBS洗3次，每次5min。去除PBS液。每张切片加50-100μl DAPI避光染核5min。PBS洗3次，每次5min。切片稍干后用抗荧光淬灭封片剂封片，4℃避光保存待拍照。

视网膜抗hRHO的免疫荧光结果如图6所示。可以看出，各rAAV2-优化hRHO组的免疫荧光相对强度明显比对应的rAAV2-野生hRHO组(未优化组)免疫荧光相对强度提高。A组(rAAV2/2-优化hRHO)的免疫荧光相对强度为0.81，B组(rAAV2/2-野生hRHO)的免疫荧光相对强度为0.58，提高了约40％。M组(rAAV2/8-优化hRHO)的免疫荧光相对强度为1.38，N组(rAAV2/8-野生hRHO)的免疫荧光相对强度为0.37，提高了约2.73倍。O组(rAAV2/9-优化hRHO)的免疫荧光相对强度为1.89，P组(rAAV2/9-野生hRHO)的免疫荧光相对强度为0.56，提高了约2.38倍。这表明，相比未优化的编码序列SEQ ID NO.:2，本发明的经特殊优化的hRHO的编码核苷酸序列(SEQ ID NO.:1)的蛋白表达更高。

从图6中还可以看出，O组和M组视网膜上的hRHO表达明显比其他组提高，证明AAV8和AAV9携带的hRHO基因表达效果更好。

5、OCT检测

各组的OCT结果如图7所示，显示视网膜神经纤维无明显差别。

6、Real-Time PCR检测hRHO的表达

首先用NCBI的保守结构域分析软件分析hRHO的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物：

兔-actin-F：CCTTCTACAACGAGCTGCGC(SEQ ID NO.:8)

兔-actin-R：TACAGGGACAGCACGGCC(SEQ ID NO.:9)

原hRHO-F：CTTCACCCACCAGGGCTCCAACT(SEQ ID NO.:10)

原hRHO-R：AGTGGGTTCTTGCCGCAGCAGAT(SEQ ID NO.:11)

优化hRHO-F：CTTCACCCACCAGGGCAGCAACT(SEQ ID NO.:12)

优化hRHO-R：ACCTGGCTGGTCTCGGTCTTGCT(SEQ ID NO.:13)

1)提取RNA、反转录

利用TRIZOL试剂盒提取不同实验组兔子视网膜的总RNA并反转录合成cDNA模板。

2)荧光定量PCR的反应体系和反应程序

在Real-time PCR Detection System仪器上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Green mix12.5μL、ddH2O 8μL，一对引物各1μL，cDNA样品2.5μL，总体系25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因兔-actin，各个基因的扩增都做三个重复。实际加样时，为减小误差，各PCR反应管中共有的试剂可加在一起然后分装。加样完毕，进行荧光定量PCR。

按照95℃预变性1s，94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，共40个循环的反应程序进行扩增，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃～55℃的融解曲线分析。

采用2-△△CT相对定量方法(Livak et al.2001)研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以看家基因兔-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值。

结果如图8所示，对于AAV2/2、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/6，rAAV2-优化hRHO组的mRNA相对表达量高于对应的rAAV2-野生hRHO组。尤其是AAV2/4、AAV2/5、AAV2/6，rAAV2-优化hRHO组的mRNA相对表达量显著提高。该结果出乎意料地表明，本发明的经优化的hRHO的编码核苷酸序列(SEQ ID NO.:1)，居然意外地提高了转录效率，从而使得rAAV2-优化hRHO组基因水平上表达明显比rAAV2-野生hRHO组提高。该结果表明，在转录效率方面，rAAV2-优化hRHO组的转录效率显著更高。

此外，还可以看出，AAV2/2、AAV2/8、AAV2/9(A组、O组和M组)的mRNA表达水平明显高于其他血清型的AAV。A组、O组和M组视网膜上的hRHO表达明显比其他组提高，证明AAV2/2、AAV8和AAV9携带的hRHO基因表达效果更好。

7、Western blot检测hRHO蛋白的表达

分离不同实验组的家兔眼球的视网膜，按100μL/50mg组织加入对应体积的RIPA裂解液，匀浆器匀浆后离心收取上清。紫外分光光度法280nm测定蛋白浓度后，按总蛋白50μg计算实验组和对照组上样体积，进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot。抗体孵育后进行ECL显影。

结果如图9所示。可以看出，各rAAV2-优化hRHO组的蛋白水平上表达明显比对应的rAAV2-野生hRHO组(未优化组)提高。最优的rAAV2/9-优化hRHO组提高了3.3倍，rAAV2/8-优化hRHO组提高了1.8倍，rAAV2/2-优化hRHO组提高了1倍。这表明，在翻译效率方面，本发明的经优化的hRHO的编码核苷酸序列(SEQ ID NO.:1)的翻译效率更高。

此外，O组和M组视网膜上的hRHO表达明显比其他组提高，证明AAV8和AAV9携带的hRHO基因蛋白表达效果最好，优化序列比原始序列hRHO基因蛋白表达效果更好。

随着基因治疗在眼部疾病治疗上的快速发展，治愈视网膜色素变性也将不是什么难题。因为人眼与兔眼的解剖和体积相似，本发明以兔子眼睛为模型进行rAAV-hRHO的玻璃体腔注射。本实验研究注射剂量，安全水平，术后并发症，为未来的临床试验提供重要的参考。所有兔子的裂隙灯，眼压的检查，均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害。表明本实验是安全的。

免疫荧光、实时定量PCR和Western blot的结果可以证明hRHO能稳定地表达于兔子的视网膜上。因为病变会引起视盘周围的的视网膜神经节细胞凋亡，rAAV-EGFP组的视网膜切片能够检测到视盘周围的视网膜有稳定的荧光表达。hRHO的荧光染色结果可以说明其能够到达视网膜神经节细胞中，表明rAAV2-hRHO能到达病人眼中病变的区域。眼底照相、OCT的结果显示单次玻璃体腔注射携带RHO基因的腺相关病毒是安全的，并且没有视网膜毒性，能被应用在未来的临床试验。

实施例4

取20只小鼠分为5组，按上表分为对照组(玻璃体注射1×10¹²vg rAAV-EGFP[广州派真生物技术有限公司])、实验组A、B、C、D分别玻璃体注射上述4种重组人RHO基因重组腺相关病毒(rAAV2/2-优化hRHO、rAAV2/2-hRHO和rAAV2/9-优化hRHO和rAAV2/9-hRHO，50μl，1×10¹²vg/mL)，在小鼠大腿内侧穿刺注射。观察小鼠一个月内的体重变化并提取小鼠大腿组织mRNA。QPCR检测hRHO基因，比较A、B组与对照组hRHO基因相对表达水平。

从图10可以看出，A、B、C、D组小鼠体重随时间增加，注射AAV2/2和AAV2/9是安全的。

从图11可以看出，A、B组rAAV2/2-优化hRHO、rAAV2/2-野生hRHO相对表达量提高约40倍，C、D组的rAAV2/9-优化hRHO和rAAV2/9-野生hRHO相对表达量提高约100倍。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用

<130> P2019-0018

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1044

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atgaacggca ccgagggccc caacttctac gtgcccttca gcaacgccac cggcgtggtg 60

cgcagcccct tcgagtaccc ccagtactac ctggccgagc cctggcagtt cagcatgctg 120

gccgcctaca tgttcctgct gatcgtgctg ggcttcccca tcaacttcct gaccctgtac 180

gtgaccgtgc agcacaagaa gctgcgcacc cccctgaact acatcctgct gaacctggcc 240

gtggccgacc tgttcatggt gctgggcggc ttcaccagca ccctgtacac cagcctgcac 300

ggctacttcg tgttcggccc caccggctgc aacctggagg gcttcttcgc caccctgggc 360

ggcgagatcg ccctgtggag cctggtggtg ctggccatcg agcgctacgt ggtggtgtgc 420

aagcccatga gcaacttccg cttcggcgag aaccacgcca tcatgggcgt ggccttcacc 480

tgggtgatgg ccctggcctg cgccgccccc cccctggccg gctggagccg ctacatcccc 540

gagggcctgc agtgcagctg cggcatcgac tactacaccc tgaagcccga ggtgaacaac 600

gagagcttcg tgatctacat gttcgtggtg cacttcacca tccccatgat catcatcttc 660

ttctgctacg gccagctggt gttcaccgtg aaggaggccg ccgcccagca gcaggagagc 720

gccaccaccc agaaggccga gaaggaggtg acccgcatgg tgatcatcat ggtgatcgcc 780

ttcctgatct gctgggtgcc ctacgccagc gtggccttct acatcttcac ccaccagggc 840

agcaacttcg gccccatctt catgaccatc cccgccttct tcgccaagag cgccgccatc 900

tacaaccccg tgatctacat catgatgaac aagcagttcc gcaactgcat gctgaccacc 960

atctgctgcg gcaagaaccc cctgggcgac gacgaggcca gcgccaccgt gagcaagacc 1020

gagaccagcc aggtggcccc cgcc 1044

<210> 2

<211> 1044

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

atgaatggca cagaaggccc taacttctac gtgcccttct ccaatgcgac gggtgtggta 60

cgcagcccct tcgagtaccc acagtactac ctggctgagc catggcagtt ctccatgctg 120

gccgcctaca tgtttctgct gatcgtgctg ggcttcccca tcaacttcct cacgctctac 180

gtcaccgtcc agcacaagaa gctgcgcacg cctctcaact acatcctgct caacctagcc 240

gtggctgacc tcttcatggt cctaggtggc ttcaccagca ccctctacac ctctctgcat 300

ggatacttcg tcttcgggcc cacaggatgc aatttggagg gcttctttgc caccctgggc 360

ggtgaaattg ccctgtggtc cttggtggtc ctggccatcg agcggtacgt ggtggtgtgt 420

aagcccatga gcaacttccg cttcggggag aaccatgcca tcatgggcgt tgccttcacc 480

tgggtcatgg cgctggcctg cgccgcaccc ccactcgccg gctggtccag gtacatcccc 540

gagggcctgc agtgctcgtg tggaatcgac tactacacgc tcaagccgga ggtcaacaac 600

gagtcttttg tcatctacat gttcgtggtc cacttcacca tccccatgat tatcatcttt 660

ttctgctatg ggcagctcgt cttcaccgtc aaggaggccg ctgcccagca gcaggagtca 720

gccaccacac agaaggcaga gaaggaggtc acccgcatgg tcatcatcat ggtcatcgct 780

ttcctgatct gctgggtgcc ctacgccagc gtggcattct acatcttcac ccaccagggc 840

tccaacttcg gtcccatctt catgaccatc ccagcgttct ttgccaagag cgccgccatc 900

tacaaccctg tcatctatat catgatgaac aagcagttcc ggaactgcat gctcaccacc 960

atctgctgcg gcaagaaccc actgggtgac gatgaggcct ctgctaccgt gtccaagacg 1020

gagacgagcc aggtggcccc ggcc 1044

<210> 3

<211> 348

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Asn Gly Thr Glu Gly Pro Asn Phe Tyr Val Pro Phe Ser Asn Ala

1 5 10 15

Thr Gly Val Val Arg Ser Pro Phe Glu Tyr Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala

20 25 30

Glu Pro Trp Gln Phe Ser Met Leu Ala Ala Tyr Met Phe Leu Leu Ile

35 40 45

Val Leu Gly Phe Pro Ile Asn Phe Leu Thr Leu Tyr Val Thr Val Gln

50 55 60

His Lys Lys Leu Arg Thr Pro Leu Asn Tyr Ile Leu Leu Asn Leu Ala

65 70 75 80

Val Ala Asp Leu Phe Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Thr Leu Tyr

85 90 95

Thr Ser Leu His Gly Tyr Phe Val Phe Gly Pro Thr Gly Cys Asn Leu

100 105 110

Glu Gly Phe Phe Ala Thr Leu Gly Gly Glu Ile Ala Leu Trp Ser Leu

115 120 125

Val Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Val Val Val Cys Lys Pro Met Ser

130 135 140

Asn Phe Arg Phe Gly Glu Asn His Ala Ile Met Gly Val Ala Phe Thr

145 150 155 160

Trp Val Met Ala Leu Ala Cys Ala Ala Pro Pro Leu Ala Gly Trp Ser

165 170 175

Arg Tyr Ile Pro Glu Gly Leu Gln Cys Ser Cys Gly Ile Asp Tyr Tyr

180 185 190

Thr Leu Lys Pro Glu Val Asn Asn Glu Ser Phe Val Ile Tyr Met Phe

195 200 205

Val Val His Phe Thr Ile Pro Met Ile Ile Ile Phe Phe Cys Tyr Gly

210 215 220

Gln Leu Val Phe Thr Val Lys Glu Ala Ala Ala Gln Gln Gln Glu Ser

225 230 235 240

Ala Thr Thr Gln Lys Ala Glu Lys Glu Val Thr Arg Met Val Ile Ile

245 250 255

Met Val Ile Ala Phe Leu Ile Cys Trp Val Pro Tyr Ala Ser Val Ala

260 265 270

Phe Tyr Ile Phe Thr His Gln Gly Ser Asn Phe Gly Pro Ile Phe Met

275 280 285

Thr Ile Pro Ala Phe Phe Ala Lys Ser Ala Ala Ile Tyr Asn Pro Val

290 295 300

Ile Tyr Ile Met Met Asn Lys Gln Phe Arg Asn Cys Met Leu Thr Thr

305 310 315 320

Ile Cys Cys Gly Lys Asn Pro Leu Gly Asp Asp Glu Ala Ser Ala Thr

325 330 335

Val Ser Lys Thr Glu Thr Ser Gln Val Ala Pro Ala

340 345

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

acttctacgt gcccttctcc aatg 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

gtcttggaca cggtagcaga ggc 23

<210> 6

<211> 1044

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

atgaatggta ctgaaggccc taacttttat gttcccttct ctaatgctac cggagtcgta 60

cgttccccat ttgagtaccc gcaatattac ttagccgaac cttggcagtt ctcaatgttg 120

gcagcgtata tgtttcttct cattgtgcta gggttcccca tcaactttct gacattatac 180

gttacggtcc aacataaaaa gttgcgcact ccacttaatt atatactcct aaacctggct 240

gtagccgatt tattcatggt gttgggtggc tttacctcga cactttacac gagtctccac 300

ggatatttcg tttttgggcc gactggttgt aatctagagg gcttctttgc aaccctggga 360

ggggaaattg cgttatggag cttggtcgta cttgctatcg agcgatacgt ggttgtctgc 420

aaacctatgt ctaacttccg gtttggtgaa aatcatgcca taatgggcgt agcattcaca 480

tgggtgatgg cgctcgcttg tgccgcaccc ccactagcgg gatggtccag atatattccg 540

gaggggctgc agtgctcatg tggtatcgac tactatacgt taaagcctga agttaacaat 600

gagtcgtttg tcatatacat gttcgtagtg cactttacta ttcccatgat cataattttc 660

ttttgctatg gccaattggt tttcaccgtc aaagaagctg ccgcacagca acaggagagt 720

gcgacaacgc aaaaggctga aaaagaggta actaggatgg tgatcataat ggttattgcc 780

tttcttatct gttgggtccc atacgcaagc gtagcgttct atatatttac ccatcaggga 840

tctaacttcg ggccgatttt tatgacaatc cctgctttct ttgccaagtc cgcagcgata 900

tacaatcccg tgatttatat catgatgaac aaacaattcc gtaattgcat gctcacgact 960

atatgttgcg gtaagaaccc actaggcgat gacgaagctt cagccaccgt ttcgaaaaca 1020

gagacgagtc aggtcgcacc ggcg 1044

<210> 7

<211> 1044

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

atgaacggca ccgagggccc caacttctac gtgcccttca gcaacgccac cggcgtggtg 60

cgcagcccct tcgagtaccc ccagtactac ctggccgagc cctggcagtt cagcatgctg 120

gccgcctaca tgttcctgct gatcgtgctg ggcttcccca tcaacttcct gaccctgtac 180

gtgaccgtgc agcacaagaa gctgcgcacc cccctgaact acatcctgct gaacctggcc 240

gtggccgacc tgttcatggt gctgggcggc ttcaccagca ccctgtacac cagcctgcac 300

ggctacttcg tttttgggcc gactggttgt aatctagagg gcttctttgc aaccctggga 360

ggggaaattg cgttatggag cttggtcgta cttgctatcg agcgatacgt ggttgtctgc 420

aaacctatgt ctaacttccg gtttggtgaa aatcatgcca taatgggcgt agcattcaca 480

tgggtgatgg cgctcgcttg tgccgcaccc ccactagcgg gatggtccag atatattccg 540

gaggggctgc agtgctcatg tggtatcgac tactatacgt taaagcctga agttaacaat 600

gagtcgtttg tcatatacat gttcgtagtg cactttacta ttcccatgat cataattttc 660

ttttgctatg gccaattggt tttcaccgtc aaagaagctg ccgcacagca acaggagagt 720

gcgacaacgc aaaaggctga aaaagaggta actaggatgg tgatcataat ggttattgcc 780

tttcttatct gttgggtccc atacgcaagc gtagcgttct atatatttac ccatcaggga 840

tctaacttcg ggccgatttt tatgacaatc cctgctttct ttgccaagtc cgcagcgata 900

tacaatcccg tgatttatat catgatgaac aaacaattcc gtaattgcat gctcacgact 960

atatgttgcg gtaagaaccc actaggcgat gacgaagctt cagccaccgt ttcgaaaaca 1020

gagacgagtc aggtcgcacc ggcg 1044

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

ccttctacaa cgagctgcgc 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

tacagggaca gcacggcc 18

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

cttcacccac cagggctcca act 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

agtgggttct tgccgcagca gat 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

cttcacccac cagggcagca act 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

acctggctgg tctcggtctt gct 23

Claims

1.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码视紫红质，且所述核苷酸序列选自下组：

(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；

(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.一种融合核酸，其特征在于，所述融合核酸包含如权利要求1所述的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的融合核酸，其特征在于，所述融合核酸还包含UTR序列，较佳地5’UTR序列和/或3’UTR序列。

4.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的融合核酸。

5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为腺相关病毒载体。

6.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体为腺相关病毒载体AAV2/8或AAV2/9。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体，或其染色体中整合有外源的如权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的融合核酸。

8.如权利要求4所述的载体的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力、和/或治疗或预防眼部疾病。

9.一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有(a)权利要求4所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

10.一种载体，其特征在于，所述载体含有编码RHO蛋白的核酸分子。