CN111518669A

CN111518669A - 一种核酸检测微流控芯片及其应用

Info

Publication number: CN111518669A
Application number: CN202010377288.XA
Authority: CN
Inventors: 刘国东; 董超; 沈兵; 钱立生; 邱万伟; 黄守程; 李坤; 张静; 于庆才; 张学记
Original assignee: Anhui University of Science and Technology
Current assignee: Anhui University of Science and Technology
Priority date: 2020-05-07
Filing date: 2020-05-07
Publication date: 2020-08-11

Abstract

本发明提供了一种核酸检测微流控芯片及其应用，属于核酸检测技术领域，所述核酸检测微流控芯片，包括连通的RT‑RPA反应区域和试纸检测区域；所述RT‑RPA反应区域包括依次连通的核酸样本加样区、第一缓冲液池、第二缓冲液池、RT‑RPA反应液池、等温扩增池、扩增产物池；所述试纸检测区域包括试纸缓冲液池和试纸储存池。本发明中所述核酸检测微流控芯片可以将多步反应包括核酸等温扩增和试纸检测集成在一个密闭的系统内，一步完成，实现核酸的自动化、可视化检测。

Description

一种核酸检测微流控芯片及其应用

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及一种核酸检测微流控芯片及其应用。

背景技术

微流控芯片可以将多步生物学反应集成整合成一条流水线，将复杂的多步反应在一个密闭的系统内自动化完成。由于核酸检测一般需要扩增放大信号，所以核酸的试纸检测一直存在技术难题，等温扩增技术是近年来新出现的一种简易核酸扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同温度活性的酶和特异性引物来达到快速扩增核酸的目的。

与PCR相比，等温扩增对仪器的要求大大简化甚至不需要仪器，反应时间也大大缩短，能更好满足快速简便检测的需求。目前，等温扩增比较常用的技术有环介导等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(RPA)。环介导等温扩增通常在60℃～65℃进行，反应时间为40分钟左右，结果通过浊度指数或SYBR Green荧光来判定；另一种方法，重组酶聚合酶扩增(RPA)一般在37～42℃进行扩增，测定耗时短(3～15分钟)、灵敏度高，体系组分稳定易保存，读取结果多样化，可以在便携式设备上进行操作。最近，逆转录重组酶聚合酶等温扩增技术(RT-RPA)已用于鉴定核酸靶标，它既不需要高温，也不需要周期控制，因此RPA等温扩增是PCR很好的替代方法。

由于RT-RPA实验反应过程中，需要先将几个成分提前混合，再在一个等温环境里扩增，因此步骤繁琐，操作困难，需要专业人士才能进行实验。而且，在核酸的试纸检测中，RT-RPA扩增产物还需和试纸检测缓冲液混合，再滴加在试纸条的样品垫处，再进行最终的结果观察，整个过程步骤较多，需要实验室专业人员操作完成，不利于现场使用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种核酸检测微流控芯片及其应用；所述核酸检测微流控芯片可以将多步反应包括核酸等温扩增和试纸检测集成在一个密闭的系统内，一步完成，实现核酸的自动化、可视化检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种核酸检测微流控芯片，包括连通的RT-RPA反应区域和试纸检测区域；

所述RT-RPA反应区域包括依次连通的核酸样本加样区、第一缓冲液池、第二缓冲液池、RT-RPA反应液池、等温扩增池、扩增产物池；

所述试纸检测区域包括试纸缓冲液池和试纸储存池。

优选的，所述RT-RPA反应区域和试纸检测区域通过微管道连通。

优选的，所述微管道的宽度为180～220μm，所述微管道的深度为80～120μm。

优选的，所述第一缓冲液池中添加第一缓冲液；所述第一缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：肌型肌酸肌酶80～120ng/μL、磷酸肌酸45～55mmol/L、ATP 2～4mmol/L、聚乙二醇20M 4～6wt％、二硫苏糖醇1～3mmol/L、三羟甲基氨基甲烷45～55mmol/L、特异性引物1μmol/L和乙酸钾80～120mmol/L。

优选的，所述第二缓冲液池中添加第二缓冲液；所述第二缓冲液为10～20mmol/L的乙酸镁水溶液。

优选的，RT-RPA反应液池中添加RT-RPA反应体系；所述RT-RPA反应体系包括以下浓度的组分：莫洛尼小鼠白血病病毒重组逆转录酶M-MoLV RT 25～35ng/μL、T4 UvsX重组蛋白110～130ng/μL、T4 UvsY重组蛋白55～65ng/μL、T4 gp32重组蛋白550～650ng/μL、枯草芽孢杆菌DNA重组聚合酶Bsu DNA polymerase 25～35ng/μL、dNTP 700～900μmol/L、poly(A)0.08～0.12mmol/L和Oligo(dT)_12-18 0.08～0.12mmol/L。

优选的，所述RT-RPA反应体系的添加量为40～60μL。

优选的，所述RT-RPA反应体系以干粉的形式添加。

优选的，所述试纸储存池放置核酸检测试纸。

本发明提供了所述的核酸检测微流控芯片在核酸检测中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的核酸检测微流控芯片，包括连通的RT-RPA反应区域和试纸检测区域；将RT-RPA反应和试纸条检测结合在同一个微流控芯片中，只需添加待检测样本，后续反应在芯片中一步完成，实现核酸的自动化、可视化检测；操作简单、方便。

附图说明

图1为本发明提供的核酸检测微流控芯片结构示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种核酸检测微流控芯片，包括连通的RT-RPA反应区域和试纸检测区域；所述RT-RPA反应区域包括依次连通的核酸样本加样区、第一缓冲液池、第二缓冲液池、RT-RPA反应液池、等温扩增池、扩增产物池；所述试纸检测区域包括试纸缓冲液池和试纸储存池。

在本发明中，所述RT-RPA反应区域和试纸检测区域优选的通过微管道连通；所述RT-RPA反应区域内部的各个反应池之间优选的通过微管道连通；所述试纸缓冲液池和试纸储存池优选的通过微管道连通。在本发明中，所述微管道的宽度优选为180～220μm，更优选为200μm；所述微管道的深度为优选为80～120μm，更优选为100μm。

在本发明中，所述第一缓冲液池中添加第一缓冲液；所述第一缓冲液以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：肌型肌酸肌酶80～120ng/μL、磷酸肌酸45～55mmol/L、ATP 2～4mmol/L、聚乙二醇20M 4～6wt％、二硫苏糖醇1～3mmol/L、三羟甲基氨基甲烷45～55mmol/L、特异性引物1μmol/L和乙酸钾80～120mmol/L；更优选的包括以下浓度的组分：肌型肌酸肌酶100ng/μL、磷酸肌酸50mmol/L、ATP 3mmol/L、聚乙二醇20M 5wt％、二硫苏糖醇2mmol/L、三羟甲基氨基甲烷50mmol/L、特异性引物1μmol/L和乙酸钾100mmol/L。

在本发明中，所述第二缓冲液池中添加第二缓冲液；所述第二缓冲液优选为10～20mmol/L的乙酸镁水溶液，更优选为15mmol/L的乙酸镁水溶液。

在本发明中，所述RT-RPA反应液池中添加RT-RPA反应体系；所述RT-RPA反应体系包括以下浓度的组分：莫洛尼小鼠白血病病毒重组逆转录酶M-MoLV RT 25～35ng/μL、T4UvsX重组蛋白110～130ng/μL、T4 UvsY重组蛋白55～65ng/μL、T4 gp32重组蛋白550～650ng/μL、枯草芽孢杆菌DNA重组聚合酶Bsu DNApolymerase 25～35ng/μL、dNTP 700～900μmol/L、poly(A)0.08～0.12mmol/L和Oligo(dT)_12-18 0.08～0.12mmol/L，更优选的包括以下浓度的组分：莫洛尼小鼠白血病病毒重组逆转录酶M-MoLV RT 30ng/μL、T4 UvsX重组蛋白120ng/μL、T4 UvsY重组蛋白60ng/μL、T4 gp32重组蛋白600ng/μL、枯草芽孢杆菌DNA重组聚合酶Bsu DNApolymerase 30ng/μL、dNTP 800μmol/L、poly(A)0.1mmol/L和Oligo(dT)_12- ₁₈0.1mmol/L。在本发明中，所述dNTP包括A、T、C和G；所述A、T、C和G的浓度比例优选为1:1:1:1。

在本发明中，所述RT-RPA反应液池中所述RT-RPA反应体系的添加量优选为40～60μL，更优选为50μL；在本发明中，所述RT-RPA反应体系以干粉的形式添加，即将40～60μLRT-RPA反应体系制成干粉后，添加到RT-RPA反应液池。

在本发明中，所述试纸检测区域包括试纸缓冲液池和试纸储存池。在本发明中，所述试纸缓冲液池中添加试纸缓冲液，所述试纸缓冲液优选的为1/4SSC+2％BSA+2％PVP。在本发明中，所述试纸储存池放置核酸检测试纸。

在本发明中，所述核酸检测试纸包括顺次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。

在本发明中，所述核酸检测试纸的结合区吸附金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针；所述核酸检测的检测区包括检测线和质控线；所述检测线上喷涂捕获探针，所述质控线上喷涂质控探针；所述质控探针与检测探针互补配对。

在本发明中，所述捕获探针优选的为生物素、链霉亲和素标记的捕获探针。在本发明中，所述捕获探针、质控探针的喷涂浓度优选为1.2～1.8μL/cm，更优选为1.5μL/cm。本发明对所述喷涂的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规的喷涂方法即可。

在本发明中，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在底板上获得核酸检测试纸。在本发明中，所述样品垫的材质优选的采用玻璃纤维膜。所述样品垫的作用是减缓待测样品迁移的速度，有利于待测液在样品垫均匀分布，为后面更好地流到结合垫创造前提条件。在本发明中，所述结合垫的材质优选为玻璃纤维膜；所述结合垫用于吸附金包硅球纳米粒子(Si0₂@Au)修饰的检测探针，在毛细吸附力作用下将样品待测液以一定速度均匀地输送到NC膜上；保持后续标记物颗粒的稳定性及完整性，有助于降低背景信号，提高检测的稳定性及重现性。在本发明中，所述吸收垫优选的使用吸收效率高、容量大及稳定性好的吸收纸。所述吸收垫的目的是为了促进液体在横流试纸条上的迁移能够顺利并完整抵达吸收垫，确保待测物(液)能够通过最后一步的虹吸作用而跨过NC膜，提高检测信号输出值，降低信噪比。

在本发明具体实施过程中，优选的首先将硝酸纤维素膜(NC膜)粘贴在PVC底板上，然后将结合垫固定在其位置上并保证与NC膜有重叠，接着将样品垫粘贴在其位置上并保证与结合垫有重叠，最后粘贴吸收垫并保证与NC膜有重叠以确保液体顺利流动。在本发明中，上述重叠的长度优选为均为2mm。

本发明还提供了所述的核酸检测微流控芯片在核酸检测中的应用。在本发明中，所述检测样本包括但不限于病毒、细菌、支原体、寄生虫等的核酸，即DNA或RNA。在本发明中，在核酸样本加样区加入待检核酸样本后，将核酸检测微流控芯片插入检测仪中，核酸检测微流控芯片自动流动加温反应，30min后取出，观察结果。在本发明中，所述待检核酸样本流经第一缓冲液池、第二缓冲液池、RT-RPA反应液池，最终在等温扩增池中进行扩增获得扩增产物，扩增产物与试纸缓冲液混合，再流入两条试纸存储池内的样本垫处实现试纸条检测；在试纸检测区域观察试纸反应条带，出现2条反应带为阳性，1条反应带为阴性。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种核酸检测微流控芯片，结构如图1所示；整个芯片包括RT-RPA反应区域和试纸检测区域，所述RT-RPA反应区域包括依次连通的核酸样本加样区、第一缓冲液池、第二缓冲液池、RT-RPA反应液池、等温扩增池、扩增产物池；所述试纸检测区域包括试纸缓冲液池和试纸储存池。

在本发明中，所述RT-RPA反应区域和试纸检测区域优选的通过微管道连通；所述RT-RPA反应区域内部的各个反应池之间优选的通过微管道连通；所述试纸缓冲液池和试纸储存池优选的通过微管道连通。

一种核酸检测微流控芯片制备方法：

芯片采用PDMS材料，芯片先通过合理设计后再进行制作，制作方法为：

1)配胶：A胶：B胶＝10:1。A胶与B胶的比越大配出来的胶越软。

2)匀胶：打开真空脱泡搅拌机，放入称好的胶，抽真空将胶搅拌混合。

3)修饰：将处理好的硅片放入挥发缸中，滴1-2滴修饰剂(甲基氯硅烷)修饰约3min。

4)倒胶：锡纸铺平于皿内，放入硅片模具，将硅片轻轻压实后倒胶，务必使硅片上的胶无气泡。

5)干燥：85度恒温干燥箱内干燥约30min。

6)剥胶：稍冷却后撕下锡纸，将固化后的PDMS与硅片分离，小心揭下PDMS，注意不要损坏硅片。

7)切割：用切割刀沿着芯片外框小心切割，注意切割整齐。

8)打孔：用打孔器打孔，注意打孔的位置、孔径大小。

9)清理：清洗芯片。

10)镜检：用显微镜观察芯片通道是否合格。

第一缓冲液：

1.肌型肌酸肌酶 100ng/μl

2.磷酸肌酸 50mM

3.ATP 3mM

4.聚乙二醇20M 5％浓度

5.二硫苏糖醇 2mM

6.三羟甲基氨基甲烷 50mM

7.乙酸钾 100mM

8.引物 1μmol/L

检测引物：新冠病毒RNA的ORF1ab序列检测引物：

Orf1ab F：5-cccccccccc-C3-ccctgtgggttttacacttaaaaac-3 (SEQ ID No.1)

Orf1ab R：5-tttttttttt-C3-acgattgtgcatcagctgactgaag-3 (SEQ ID No.2)

其中C3不是碱基，C3之前的是延伸序列。

第二缓冲液：乙酸镁 15mM

RT-RPA反应液：

1.莫洛尼小鼠白血病病毒重组逆转录酶(M-MoLVRT) 30ng/ul

2.T4 UvsX重组蛋白 120ng/μl

3.T4 UvsY重组蛋白 60ng/μl

4.T4 gp32重组蛋白 600ng/μl

5.枯草芽孢杆菌DNA重组聚合酶(Bsu DNApolymerase) 30ng/μl

6.dNTP(A、T、C、G) 各200μM

7.poly(A) 0.1mM

8.Oligo(dT)_12-18 0.1mM

试纸缓冲液池：1/4SSC+2％BSA+2％PVP

核酸检测试纸条-新型冠状病毒核酸检测试纸条

检测样本：新型冠状病毒核酸

核酸检测试纸的制备：

SiO₂@Au纳米材料的制备：

首先制备直径在150nm的SiO₂硅球液：128mL无水乙醇+18mL去离子水+3mL氨水混合，30℃搅拌10min。再加入3mL正硅酸乙酯TEOS，搅拌反应2h。15000rpm离心20min，收集沉淀，用乙醇洗涤两次，水洗涤两次，离心后将沉淀重悬于50mL去离子水或乙醇中，制得SiO₂硅球液。

金簇液制备：1mL 1％HAuCl₄+50mL双蒸水+0.03M柠檬酸钠混匀20s后+1mL 0.1M硼氢化钠。

金簇液与硅球液比例：8mL金簇中缓慢滴加2mL(5mg)硅球液。

吸附具体条件：在室温下于磁力搅拌器上，搅拌1h即可。

试纸条的制备：

(1)样品垫：材质采用玻璃纤维膜。它的作用是减缓待测样品迁移的速度，有利于待测液在样品垫均匀分布，为后面更好地流到结合垫创造前提条件。

(2)结合垫：玻璃纤维膜。结合垫用于吸附金包硅球纳米粒子(Si0₂@Au)修饰的检测探针，检测探针1：Orf1abDP:5-aaaaaaaaaaaaaaa-3-SH(SEQ ID No.3)；检测探针2：5-gagagcgggttcacg ttt-3-SH(SEQ ID No.4)并在毛细吸附力作用下将样品待测液以一定速度均匀地输送到NC膜上；保持后续标记物颗粒的稳定性及完整性，有助于降低背景信号，提高检测的稳定性及重现性。

DNA探针标记Si0₂@Au步骤：取1mL 3倍浓缩的Si0₂@Au溶液，加入10μL 1mM的dATP，在室温下，用振荡器振荡20min，接着加入15μL 1％SDS，震荡培养10min后，加入50μL 0.2M的NaCl(速度控制在每2～3min加入2μL)，然后加入1OD检测探针，在60℃下反应3h，用离心机(转速12,000rpm，10min)离心，去除上清液，用PBS缓冲液(pH值7.2～7.4)清洗3次，最后将沉淀溶于1mL纳米粒子存储液(20mmol/LNa₃PO₄·12H₂O，5％BSA，0.25％Tween 20，10％蔗糖)中，偶合物溶液放在4℃冰箱保存待用。

(3)NC膜(Nitrocellulose Membrance，硝酸纤维素膜)：包含检测线1、检测线2、质控线。侧流试纸条的检测中心区域主要集中在硝酸纤维素膜上。一般检测结果以检测线和质控线来衡量，检测线上颜色可进行半定量或定量、定性分析。

质控线是为了验证试纸条检测的有效性。如果质控线没有颜色，说明试纸条检测结果不可信。

检测线1喷涂捕获探针1：Orf1abCP:5-ggggggggggggggg-3-Biotin(SEQ ID No.5)

检测线2喷涂捕获探针2核壳CP:5-caggagaagggtttt ttt-3-Biotin(SEQ IDNo.6)

质控线喷涂：5-tttttttttt-3-Biotin(SEQ ID No.7)和5-cgtgaacccg-3-Biotin(SEQ ID No.8)。

喷涂浓度均为：1.5μL/cm。

捕获探针处理步骤：将50nM生物素标记的捕获探针与200μL2.5mg/ml的链霉亲和素(上海生工)在0.01M PBS中混合培养1h后，将混合液转移至透析管(截留分子量30000)中，在冷冻离心机中离心(6000rpm，20min，4℃)去除未结合的适配体探针。加入PBS重复以上步骤两次，最后收集离心后的溶液(是的，收集被截留的溶液)定容至600μL。最后将生物素标记的DNA和链霉亲和素结合的混合物溶液喷涂在试纸条上。

(4)吸收垫：使用吸收效率高、容量大及稳定性好的吸收纸。吸收垫的目的是为了促进液体在横流试纸条上的迁移能够顺利并完整抵达吸收垫，确保待测物(液)能够通过最后一步的虹吸作用而跨过NC膜，提高检测信号输出值，降低信噪比。

位置关系：首先将硝酸纤维素膜(NC膜)粘贴在PVC底板上，然后将结合垫固定在其位置上并保证与NC膜有2mm的重叠，接着将样品垫粘贴在其位置上并保证与结合垫有2mm的重叠，最后粘贴吸收垫并保证与NC膜有2mm的重叠以确保液体顺利流动。

检测过程：在核酸样本加样区加入2μL新型冠状病毒核酸样本后，一次流入并混合：第一缓冲液41.5μL、第二缓冲液2.5μL、RT-RPA反应液50μL的量制成干粉，最终混合物流入等温扩增池进行37℃加热扩增20min。扩增产物再继续流入RT-RPA扩增产物池内，体积为10μL，再将10μL扩增产物与试纸缓冲液混合，再流入两条试纸存储池内的样本垫处。10min后观察试纸检测结果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽科技学院

<120> 一种核酸检测微流控芯片及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

cccccccccc ccctgtgggt tttacactta aaaac 35

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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tttttttttt acgattgtgc atcagctgac tgaag 35

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aaaaaaaaaa aaaaa 15

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<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gagagcgggt tcacgttt 18

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gggggggggg ggggg 15

<210> 9

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

caggagaagg gttttttt 18

<210> 5

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tttttttttt 10

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cgtgaacccg ctctccagac attttgctct caagctg 37

Claims

1.一种核酸检测微流控芯片，其特征在于，包括连通的RT-RPA反应区域和试纸检测区域；

所述试纸检测区域包括试纸缓冲液池和试纸储存池。

2.根据权利要求1所述的核酸检测微流控芯片，其特征在于，所述RT-RPA反应区域和试纸检测区域通过微管道连通。

3.根据权利要求1所述的核酸检测微流控芯片，其特征在于，所述微管道的宽度为180～220μm，所述微管道的深度为80～120μm。

4.根据权利要求1所述的核酸检测微流控芯片，其特征在于，所述第一缓冲液池中添加第一缓冲液；所述第一缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：肌型肌酸肌酶80～120ng/μL、磷酸肌酸45～55mmol/L、ATP 2～4mmol/L、聚乙二醇20M 4～6wt％、二硫苏糖醇1～3mmol/L、三羟甲基氨基甲烷45～55mmol/L、特异性引物1μmol/L和乙酸钾80～120mmol/L。

5.根据权利要求1所述的核酸检测微流控芯片，其特征在于，所述第二缓冲液池中添加第二缓冲液；所述第二缓冲液为10～20mmol/L的乙酸镁水溶液。

6.根据权利要求1所述的核酸检测微流控芯片，其特征在于，RT-RPA反应液池中添加RT-RPA反应体系；所述RT-RPA反应体系包括以下浓度的组分：莫洛尼小鼠白血病病毒重组逆转录酶M-MoLV RT 25～35ng/μL、T4 UvsX重组蛋白110～130ng/μL、T4 UvsY重组蛋白55～65ng/μL、T4 gp32重组蛋白550～650ng/μL、枯草芽孢杆菌DNA重组聚合酶Bsu DNApolymerase 25～35ng/μL、dNTP 700～900μmol/L、poly(A)0.08～0.12mmol/L和Oligo(dT)_12-180.08～0.12mmol/L。

7.根据权利要求6所述的核酸检测微流控芯片，其特征在于，所述RT-RPA反应体系的添加量为40～60μL。

8.根据权利要求6或7所述的核酸检测微流控芯片，其特征在于，所述RT-RPA反应体系以干粉的形式添加。

9.根据权利要求1所述的核酸检测微流控芯片，其特征在于，所述试纸储存池放置核酸检测试纸。

10.权利要求1～9任意一项所述的核酸检测微流控芯片在核酸检测中的应用。