CN111487419B - Kl-6在儿童新冠肺炎中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种儿童冠状病毒肺炎的诊断应用,即用涎液化糖链抗原（KL‑6）检测试剂检测新冠肺炎儿童，用KL‑6水平或浓度是KL‑6的基线水平或浓度(群体基线水平或个人基线水平)的2倍及以上的判断指标，可以更准确的预测儿童新冠肺炎的发展严重程度的危险。该方法敏感度高，检测速度快，能够测量全血、血清和血浆等各种样本类型，无拍片等辐射危害，有益于儿童。

Description

KL-6在儿童新冠肺炎中的应用

技术领域

本发明属于医学免疫诊断领域，具体涉及儿童新冠肺炎严重程度的诊断、预后和治疗。

背景技术

冠状病毒是蛋白包膜的RNA病毒，广泛分布于人类、其他哺乳动物和鸟类中。它们会引起呼吸道、肠道、肝脏和神经系统疾病。常见的感染迹象包括呼吸道症状，发烧，咳嗽，呼吸急促和呼吸困难，在更严重的情况下，感染会导致肺炎，严重的急性呼吸道综合症，肾衰竭甚至死亡。儿童新冠肺炎，轻度患者：经常发烧和咳嗽，多为干咳，然后是生产性咳嗽，有些可能有喘息，但没有明显的低氧血症，例如呼吸急促，肺部可以听到痰或干声和/或湿声。有些病例可能没有临床体征和症状，但胸部CT显示肺部病变，属于亚临床。重度患者：急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或呼吸衰竭，还可能患有休克，脑病，心肌损伤或心力衰竭，凝血功能障碍和急性肾损伤。器官功能障碍可能危及生命。有效的诊断、预后和治疗对于减少儿童新冠肺炎严重发展甚至死亡的风险是重要的。早治疗可以明显改善儿童新冠肺炎的预后，因而早诊断是至关重要的。尽早确定儿童个体中新冠肺炎严重程度的可靠的生物或临床标志物及其评判方法是实现早诊断的关键。

发明内容

涎液化糖链抗原(KL-6)是一种跨膜高分子量黏蛋白，属于黏蛋白MUC1家族，含有涎液化糖链结构。该糖链结构具有被特异性抗体识别的空间结构表位。KL-6主要表达于Ⅱ型肺泡细胞和支气管上皮细胞。当肺部发生炎症尤其是与II型肺泡相关的肺炎时，II型肺泡的大量死亡和再生以及肺间质上皮细胞屏障的破损会导致KL-6大量释放到血液中。目前已经有研究工作通过检测血样中的KL-6水平来诊断间质性肺炎。Miriana d'AlessandroBS等人发布了文章Serum KL-6concentrations as a novel biomarker of severeCOVID19(Medical virology，https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jmv.26087，公开日20200530)，公开了一种检测COVID19患者血清中KL-6的水平以用于评估个体是否处于发展严重新型新冠肺炎的危险中的方法，但是该文件中研究对象是22名年龄51-68岁的中老年患者，并没有儿童患者的研究数据，其最佳截断值为406.5U/ML(灵敏度83％、特异性89％)也只能代表中老年群体，且只以最佳截断值作为判断标准，不具有代表性。

儿童新冠肺炎的患者中的KL-6水平与肺炎的严重程度的关系还没有任何研究报道。发明人第一次表明KL-6的水平与儿童新冠肺炎发展程度有显著相关性。根据本发明，我们提供了一种鉴定儿童是否处于新冠肺炎发展严重的危险中的方法，该方法通过测量儿童个体中的KL-6水平，并与KL-6基线水平或浓度比较，从而确定儿童患有新冠肺炎的严重程度、是否处于发展成严重肺炎的风险中。

本发明还提供：

-用于检测KL-6的试剂，用来确定儿童是否处于新冠肺炎发展严重的危险中；

-用于确定儿童是否处于新冠肺炎发展严重的危险中的方法的使用的测试试剂盒，该测试试剂盒灵敏度(敏感度)和特异性较高。

诊断

本发明涉及鉴定儿童受治疗者是否处于发展严重新冠肺炎的危险中的方法。因此本发明涉及儿童对于严重新冠肺炎的易感性诊断。在测试下的儿童通常被怀疑处于发展严重新冠肺炎的危险中。

受测试的儿童通常被怀疑患有新冠肺炎。

受测试的儿童可具有一种或多种新冠肺炎相关的症状，比如发热、干咳、乏力、呼吸急促、呼吸衰竭、嗜睡、惊厥、休克等。

本发明以呼吸急促、呼吸衰竭临床症状来区分儿童严重和轻度新冠肺炎，儿童严重新冠肺炎有呼吸急促、呼吸衰竭临床症状，轻度新冠肺炎无呼吸急促、呼吸衰竭临床症状。

冠状病毒感染可以通过本领域中公知的诊断实践而证实，例如核酸检测等。

根据本发明，儿童个体KL-6水平或浓度是基线水平或浓度的2倍及以上，指示儿童个体对发展严重新冠肺炎是易感性的或儿童个体处于发展严重新冠肺炎的危险中。本发明中的儿童个体KL-6水平或浓度是指儿童确诊新冠病毒感染后且处于轻度新冠肺炎临床状态时测量的体液样本中的KL-6水平或浓度，优选是在核酸检测确诊新冠病毒感染后24h内进行首次KL-6测量，然后监测KL-6水平或浓度的变化。监测频率可以是48h或者更短的时间间隔。本发明的基线水平指：(1)群体基线水平或浓度，即儿童群体处于轻度新冠肺炎时的KL-6水平，以轻度新冠肺炎儿童群体KL-6水平的中值作为参考水平，需要注意的是，群体基线水平可能受种族、性别、饮食、地域等影响，建议根据当地儿童患者群体实际测值结果来确定；或者(2)个体基线水平或浓度，即儿童个体处于轻度新冠肺炎时自身的KL-6水平，以首次测量KL-6值作为个体基线水平，具体是指儿童确诊新冠病毒感染后且处于轻度新冠肺炎临床状态时测量的体液样本中的KL-6水平或浓度，优选是在核酸检测确诊新冠病毒感染后24h内进行首次KL-6测量。。因此本发明中样品中KL-6水平与KL-6的基线水平的比较，指的是：(1)儿童个体与群体基线水平的比较,前提条件是当地儿童群体处于轻度新冠肺炎时的KL-6群体基线水平已经建立；或者(2)儿童个体与个体基线水平的比较，如果当地儿童群体处于轻度新冠肺炎时的KL-6群体基线水平尚未建立时可以采用这种比较方法，比较的是儿童个体自身KL-6水平的变化。

根据本发明，儿童个体样品中KL-6的水平或浓度是KL-6群体基线水平或浓度的2倍及以上，指示伴随增加的发展成儿童严重新冠肺炎的易感性或危险性，优选2倍。

根据本发明，儿童个体样品中KL-6的水平或浓度是KL-6个体基线水平或浓度的2倍及以上，指示伴随增加的发展成儿童严重新冠肺炎的易感性或危险性，优选2倍。

根据本发明，儿童轻度新冠肺炎发展成严重新冠肺炎时的截断值为500U/mL或600U/mL，优选500U/mL。本发明中的截断值仅作为上述基线水平评价方法的一个参考比较，并不单独作为评价伴随增加的发展成儿童严重新冠肺炎的易感性或危险性的指标。

KL-6的检测

本发明通常通过体外测量从个体中获得的样品中的KL-6水平来执行。样品通常包括个体的体液。体液样品可以是全血、血浆、血清、唾液、肺泡灌洗液等样品。样品优选为血液样品。

样品在测定之前例如通过离心可被处理。样品在测定之前通常还可以优选在-20℃或-70℃被储存。

本领域已知的标准方法可用于测定KL-6的水平。这些方法通常包括使用检测KL-6的试剂。试剂通常特异性结合KL-6。试剂可以是对KL-6特异性的抗体、结合KL-6抗体的载体。有关特异性，将理解所述试剂或抗体结合KL-6而对任何其他分子特别是任何其他蛋白没有显著的交叉反应性。例如，对KL-6特异性的试剂或抗体将不会显示与人C反应蛋白的显著的交叉反应性。交叉反应性可以通过任何适宜的方法评价。

在本发明的方法中使用的抗体可以是完整抗体或其能够结合KL-6的片段。抗体可以是单克隆的，也可以是多克隆的。这种完整抗体通常是通过本领域已知的任何适宜方法产生的抗体。例如，多克隆抗体可通过以下获得：在适宜条件下用KL-6免疫哺乳动物，通常是兔或小鼠，并且从例如所述哺乳动物的血清中分离的抗体分子。单克隆抗体可通过杂交瘤或重组方法获得。

杂交瘤方法包括在合适条件下用KL-6免疫哺乳动物，通常是兔、大鼠或小鼠，随后收集所述哺乳动物的脾细胞并将它们与骨髓瘤细胞融合。随后稀释融合细胞的混合物并从单个亲本细胞生长克隆。随后测试由不同克隆分泌的抗体结合KL-6的能力，且随后将最多产并稳定的克隆生长在培养基中达到高体积。收集并纯化分泌的抗体。

重组方法包括将不同免疫球蛋白基因区段克隆到噬菌体或酵母中以创建具有稍微不同的氨基酸序列的抗体的文库。可选择产生结合KL-6的抗体的那些序列并将序列克隆到例如细菌细胞系中用于生产。

通常抗体是哺乳动物抗体，诸如灵长类动物、人、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、兔、羊、猪、马或骆驼抗体。抗体可以是骆驼科抗体(camelid antibody)或鲨鱼抗体。抗体可以是纳米抗体。抗体可以是任何类或同种型抗体，例如IgM，但优选IgG。

可用在本方法中的完整抗体的片段包括抗原结合位点，例如Fab或F(ab)2片段或ScFV。完整抗体或片段可以与可用来将2个或更多个片段或抗体接合在一起的其他部分诸如接头缔合。此类接头可以是化学接头或能够以与片段或完整抗体的融合蛋白的形式存在。接头因而可用于将具有相同或不同结合特异性的完整抗体或片段，例如可结合相同或不同多态性的完整抗体或片段接合在一起。抗体可以是能够结合两种不同抗原，通常为本文提到的多态性中任何两种的双特异性抗体。抗体可以是通过背靠背接合两个可变结构域而形成的“双抗体”。在用于本方法的抗体以具有拥有不同特异性的不同抗原结合位点的上述形式中任一种存在的情况下，这些不同特异性则通常是针对不同位置处或不同蛋白上的多态性的。在一个实施方案中，抗体是包含来自不同天然抗体的序列的嵌合抗体，例如人源化抗体。

评价KL-6水平的方法通常涉及将样品与能够特异性结合KL-6的试剂或抗体接触。此类方法可以是各种免疫分析方法包括化学发光法、免疫荧光层析、胶体金、免疫比浊法和酶联免疫吸附测定(ELISA)等。通常免疫分析法包括特异性结合KL-6的一种或多种抗体或蛋白。如果存在多于一种抗体，则抗体优选地具有不同的非重叠决定簇以使得它们可同时结合KL-6。

ELISA是一种需要试剂分离的异质固相测定。ELISA通常使用夹心技术或竞争技术进行。夹心技术需要两种抗体。第一种特异性结合KL-6并结合于固体支持体。第二种抗体结合标志物，通常为酶缀合物。酶的底物用于定量KL-6抗体复合物和因此定量样品中KL-6的量。抗原竞争性抑制测定通常还需要与支持体结合的KL-6特异性抗体。KL-6酶缀合物被添加到待测定的样品(包含KL-6)中。在KL-6酶缀合物和未标记的KL-6之间的竞争性抑制允许对样品中KL-6的量进行定量。用于ELISA反应的固体支持体优选地包含孔。

本发明还可在直接传感技术中采用KL-6抗体，所述直接传感技术包括但不限于基于表面等离子体共振、表面声波、石英晶体微天平、微量热法或电化学阻抗谱的直接传感技术。

本发明还可以采用不包含抗体的测量KL-6的方法。高效液相色谱(HPLC)分离和荧光检测优选地用作确定KL-6水平的方法。

本发明还提供了诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括用于测量儿童个体中的KL-6水平并从而确定该儿童个体是否处于发展严重新冠肺炎的危险中的装置。试剂盒通常包含特异性结合KL-6的一种或多种抗体。例如，试剂盒可包括单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体或人源化抗体。抗体可以是完整的免疫球蛋白分子或其片段，诸如Fab、F(ab’)2或Fv片段。如果存在多于一种抗体，则抗体优选地具有不同的非重叠决定簇以使得它们可同时结合KL-6。

试剂盒可另外包括一种或多种使得以上提到的方法的实施方案中的任一种能够被执行的其他试剂或器械。此类试剂或器械包括以下的一种或多种：适宜的缓冲液(水溶液)、从样品分离KL-6的工具、从个体获得样品的工具(诸如器皿或包括针的器械)或包括可在其上进行定量反应的孔的支持体。试剂盒可以任选地包括使得试剂盒能够用于本发明的方法的说明书或有关该方法可对哪些个体执行的详细资料。

治疗

本发明还涉及由本发明的方法鉴定为处于发展严重新冠肺炎的危险中的儿童个体的治疗。因此，用于降低发展严重新冠肺炎的危险的物质可用于制备用于治疗通过本发明方法鉴定为处于发展严重新冠肺炎的危险中的儿童个体的药物。因此，通过本发明方法鉴定为处于发展严重新冠肺炎的危险中的儿童个体的状况可通过施用这样的物质而被改善。从而，儿童严重新冠肺炎可被预防或者治疗。可用于降低发展严重新冠肺炎的危险的治疗有效量的物质可给予通过本发明方法鉴定为需要其的儿童个体。适于降低发展儿童严重新冠肺炎的危险的物质通常包括一种或多种抗病毒药物和/或抗生素。

附图说明

图1显示血液KL-6的水平。每个点代表个体血液样品中KL-6的浓度。在方法部分描述了两个患者组。线条代表值的中值。建议的KL-6的临界值被标记在500U/mL处。

图2显示4个轻度新冠肺炎的儿童患者在许可进入严重新冠肺炎组前的48小时的KL-6浓度变化。每条线表示单独的患者。

图3显示3个轻度新冠肺炎的儿童患者被怀疑处于发展严重新冠肺炎的危险中但没有随后发展成严重新冠肺炎的个体中的48小时的KL-6浓度变化。每条线表示单独的患者。

图4显示血液中KL-6的接收者工作特征(ROC)曲线。从0，0至1，1的直线是参考线。连接产生对角线部分。KL-6的ROC曲线下面积(AUC)为0.96(95％置信区间：0.87-1.00)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细阐述。下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

实施例1

方法

研究群体

这项前瞻性的研究包括在2020年初住入医院的23名儿童新冠肺炎患者个体。本研究中患者的选入标准是

1)阳性组的纳入标准：收集儿童新冠肺炎确诊病例(临床诊断及核酸测试为阳性)。

2)轻度阳性组的纳入标准：没有呼吸急促、呼吸衰竭临床症状。

3)严重阳性组的纳入标准：有呼吸急促、呼吸衰竭临床症状。

患者根据临床诊断被分为以下两组：组1)轻度新冠肺炎；组2)严重新冠肺炎。

临床和实验室评价

记录患者临床症状并用冠状病毒核酸检测试剂进行测试。以静脉穿刺收集血液。为确定KL-6水平，在取样1小时内将血液处理成血浆，储存在-20℃直到分析。通过免疫比浊法确定KL-6的浓度。

统计分析

利用SPSS软件进行分析。定义统计显著的水平为双尾检验p值<0.05。确定KL-6的接收者工作特征曲线(ROC)和曲线下面积(AUC)。计算KL-6的敏感度、特异性、阳性和阴性预测值(PPV和NPV)。计算AUC的95％置信区间(95％CI)。

结果

患者特征和实验室征象

23名儿童个体被登记在研究中。患者根据临床诊断被分为以下两组：1)16名轻度新冠肺炎的儿童患者(组1)；2)7名严重新冠肺炎的儿童患者(组2)。

结果的统计分析

与在组1中16名儿童患者相比，严重新冠肺炎组(图1)的KL-6水平显著较高，6/7儿童患者超过500U/mL的截断水平(临界值)。

为了计算敏感度、特异性、阳性预测值和阴性预测值，将组1轻度新冠肺炎组与被称为严重新冠肺炎的组2相比。如在本研究中使用＞500U/mL的KL-6的临界水平，在诊断严重儿童新冠肺炎时具有最高的敏感度和特异性，其敏感度和特异性分别为85.7％和93.8％。用于儿童严重新冠肺炎预测的KL-6的阳性和阴性预测值分别为85.7％和93.8％(表2)。ROC曲线表明，KL-6具有曲线下面积(AUC)值为0.96(p值＝0.001<0.05，置信区间：0.87-1.00)，理论上可以作为儿童严重新冠肺炎的一个预测指标(图4)。

表1.患者特征.临床和实验室数据.

年龄、性别、KL-6的中值。

表2.用于儿童新冠肺炎预测的敏感度、特异性、KL-6的阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV).

实施例2

在实施例1的基础上，KL-6群体基线水平为轻度组的中值312.84U/mL。通过对进入严重组前48h的KL-6水平动态监测和轻度组中被怀疑处于发展严重新冠肺炎的危险中的患者的KL-6水平动态监测，说明基线水平指标能够在标准临床诊断成为可能之前预测儿童严重新冠肺炎，且比截断值500U/mL(实施例1中获得的)更为准确。本实施例中，首次测量的KL-6值为个体的基线水平，动态监测48h后测量的KL-6水平与个体的基线水平进行比较，其中6h、12h、24h动态测值仅作为测值变化的趋势参考。

在严重新冠肺炎组的7个患者中的4个患者，在达到呼吸急促甚至呼吸衰竭(即能够被临床判断许可进入严重组)之前，动态监测发现KL-6值提高(图2)，并且达到了个体基线水平(即首次测量的KL-6水平)或者是群体基线水平(即实施例1中获得的312.84U/mL)的2倍或以上。这4个患者，根据本发明的基线水平标准判断为处于发展严重新冠肺炎的危险中，后期也被许可进入严重组，证实了这个判断的正确性。这个结果表明本发明的KL-6水平相对基线水平(群体或个体基线水平)2倍及以上的判断标准能够在标准临床诊断成为可能之前预测儿童严重新冠肺炎。

在轻度新冠肺炎组中，有3个患者KL-6水平接近截断值500U/mL(实施例1中获得的)，若仅根据截断值的判断标准，是被怀疑处于发展严重新冠肺炎的危险中的，但监测其随后48h的KL-6值(图3)，KL-6水平有所增加，但是没有出现呼吸急促甚至呼吸衰竭症状等严重新冠肺炎的临床判断症状，最终并没有许可进入严重组。这3个患者，48h前是首次测量KL-6值，以此作为各自的个体基线水平，48h后测得的KL-6水平接近甚至大于截断值500U/mL，但是未达到群体基线水平(即实施例1中获得的312.84U/mL)的2倍，也没有达到个体基线水平的2倍。根据本发明的判断标准，他们没有发展成严重新冠肺炎的风险，临床的结果符合本发明的预测判断。这个结果表明本发明的KL-6水平相对基线水平(群体或个体基线水平)2倍及以上的判断标准比截断值指标更能够准确地预测儿童发展成严重新冠肺炎的风险。

Claims (5)

1.用于检测KL-6的试剂在鉴定儿童是否处于发展严重新冠肺炎的危险中的方法中使用的测试试剂盒的制备中的用途，所述方法包括测量体液样品中的KL-6水平或浓度并与KL-6的基线水平或浓度进行比较，所述基线水平或浓度包括儿童群体和病人个体两种基线水平或浓度，即儿童群体处于轻度新冠肺炎时的KL-6水平和儿童病人个体处于轻度新冠肺炎时自身的KL-6水平，当确诊为轻度新冠肺炎的儿童体液样品中KL-6水平相当于KL-6群体基线水平的2倍及以上或当确诊为轻度新冠肺炎的儿童体液样品中KL-6水平相当于KL-6病人个体基线水平的2倍及以上时，怀疑儿童处于发展严重新冠肺炎的危险中。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的KL-6的浓度与基线水平的关系提供了关于新冠肺炎的严重程度的信息。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述儿童被确诊患有新冠肺炎。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于用于检测KL-6的试剂包括KL-6特异性抗体或与KL-6结合的抗体片段。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述体液样品为儿童的全血、血浆或血清样品。

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