CN111484980A

CN111484980A - 一种单克隆细胞株及其构建方法和在热原测定中的应用

Info

Publication number: CN111484980A
Application number: CN202010193245.6A
Authority: CN
Inventors: 王灿; 陈钢; 邵泓; 王自强; 郭怀祖; 段徐华; 王鸣人; 王盛; 聂丽; 郑璐侠; 厉高慜
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Current assignee: SHANGHAI INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Priority date: 2020-03-18
Filing date: 2020-03-18
Publication date: 2020-08-04

Abstract

本发明公开了一种单克隆细胞株及其构建方法和在热原测定中的应用，该单克隆细胞株为携带有受NF‑κB反应元件调控的萤光素酶基因且能稳定表达萤光素酶的体外培养的哺乳动物细胞，在给予热原刺激的情况下可稳定表达萤光素酶；本发明通过检测该细胞株所表达的萤光素酶的活性可以对热原进行定性和定量测定，在保证结果准确稳定的同时，免去了酶联免疫的操作步骤，简化了操作，将现有方法的耗时从48小时缩短至3小时，降低了相应的试剂耗材的成本，可有利于单克隆抗体、细胞治疗类药物的研究开发，质量控制和临床应用，具有较高的应用价值。

Description

一种单克隆细胞株及其构建方法和在热原测定中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种单克隆细胞株及其构建方法和在热原测定中的应用。

背景技术

热原(pyrogen)指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热性物质。各国药典收载的热原检测法包括家兔热原检查法和细菌内毒素检查法 (bacterialendotoxins test，BET)。家兔法于1942年被美国药典首次收录，至今被认为是检测热原的“黄金标准”，但其也存在一些缺点：如只能给出阴性或阳性的定性结果、灵敏度低、结果重复性差，结果准确与否依赖于兔子品系的选择和实验条件的控制；费用较高；使用活体动物进行体内实验等。细菌内毒素检查法，也被称作鲎试验法(limulus amoebocyte lysatetest，LAL)，LAL法主要的优点是利用细菌内毒素标准品，可以半定量或全定量检测细菌内毒素、灵敏度高。但该方法最大的缺点是它只能特异性地检测革兰氏阴性菌来源的细菌内毒素，不适用于检测其他种类的热原物质。然而随着人们对动物福利问题的日益关注、鲎资源日益匮乏及药品研制技术的发展，尤其是以病毒、细菌为原料的相关生物技术制品的出现，传统热原检测方法用于产品的质量控制正面临严峻的挑战。因此，目前倾向于采用细胞系法或全血法来检测热原刺激后细胞因子的变化来代替传统的检测方法。

近年来，单核细胞系法成为热原检测研究热点。目前已有7种方法(新鲜人全血-IL-1β、新鲜人全血-IL-6、PBMC-IL-6、MM6-IL-6、THP-1-新蝶呤(Neo)、 THP-1-TNF-α和冻存人全血-IL-1β)分别于2004、2005年得到欧洲权威机构(例如欧洲替代方法论证中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)，英国国家生物制品检定所(National Institute for BIOLOGICAL Standards and Control，NIBSC)等)的正式验证与推荐。但由于上述方法均需采用酶联免疫法对IL-6、IL-1β等热原刺激反应标志物进行定量测定后才能报告热原测定结果，存在耗时长、操作复杂、结果稳定性差等亟待解决的问题。

目前，对结构研究较为清楚的热原主要包括革兰氏阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)也称为细菌内毒素、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸 (lipoteichoicacid，LTA)、真菌的酵母多糖(zymosan)，上述三者刺激人体的机制均依赖NF-κB反应元件的激活。针对上述原理的快速、稳定并可实现定量测定的热原测定的方法还未有报告。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种单克隆细胞株及其构建方法和在热原测定中的应用，该细胞株可以稳定地表达NF-κB反应元件-萤光素酶报告基因，在给予热原刺激的情况下可稳定表达萤光素酶；本发明通过检测该细胞株所表达的萤光素酶的活性可以对热原进行定性和定量测定。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种单克隆细胞株，为携带有受NF-κB反应元件调控的萤光素酶基因且能稳定表达萤光素酶的体外培养的哺乳动物细胞。

进一步地，哺乳动物细胞为人白血病细胞株HL-60细胞。

进一步地，单克隆细胞株的命名为HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE，其分类命名为含NF-κB报告基因的人白血病稳转细胞株，保藏编号为CGMCC No.18524，保藏日期为2019年10月11日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二方面是提供一种上述单克隆细胞株的构建方法，包括如下步骤：

步骤一，构建携带有受NF-κB反应元件调控的萤光素酶基因的质粒；

步骤二，利用细胞电穿孔转染技术将步骤一构建的质粒转染入HL-60细胞；

步骤三，在步骤二转染后的细胞中加入潮霉素b，经过加压筛选，分离获得单克隆细胞株HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE并冻存。

进一步地，上述构建方法还包括单克隆细胞株HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE的萤光素酶活性的鉴定步骤。

进一步地，步骤二中潮霉素b的浓度为0.1～0.5mg/ml。

进一步优选地，潮霉素b的浓度为0.1～0.2mg/ml。

进一步地，单克隆细胞株HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE置于液氮介质中进行冻存。

本发明的第三方面是提供上述单克隆细胞在热原测定中的应用，具体的操作方法包括如下步骤：

(1)单克隆细胞株HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE的复苏、传代及接种：取出冻存的HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE细胞，将细胞快速融化复苏后，于5％CO₂，37℃ 的培养箱中培养；收集入无菌离心管中，1000rpm离心2分钟，弃上清液，将细胞沉淀用新鲜的完全培养液重悬，转入细胞培养瓶，继续培养。取生长状态良好的细胞进行铺板，1000rpm离心2min，弃上清，加入维持培养液重悬细胞，调节细胞浓度为5×10⁵个/mL，以50μL/孔加入到96孔培养板中；

(2)标准溶液及待检样品溶液的制备：根据测定需求分别将内毒素(LPS)、酵母多糖(Zysoman)、脂壁酸(LTA)标准溶液及待检样品溶液稀释后，加入已接种单克隆细胞株HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE的孔板中；

(3)将化学发光底物与含有细胞裂解液的底物缓冲液混匀，加至孔板，室温震荡一定时间；

(4)以标准品溶液浓度的对数对其相应的化学光强度(RFU)值作四参数逻辑回归，拟合标准曲线。将供试品溶液测得RFU值带入标准曲线中，计算供试品溶液热原含量。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

(1)与动物饲养相比，细胞培养简单，重复性较好，利于保证测定结果的稳定性；

(2)与现在的基于单核细胞激活的检测方法相比，测定时间短，在保证测定质量的基础上可以在3h内完成全部实验；

(3)本发明以NF-κB通路的激活情况为研究对象，设计一种能够稳定表达 NF-κB反应元件-萤光素酶报告基因的人白血病细胞株，其更接近样品在人体内作用的实际情况，测定结果更为准确。

综上所述，本发明构建的一种能够稳定表达NF-κB反应元件-萤光素酶报告基因的HL-60细胞株在给予热原刺激的情况下可稳定表达萤光素酶；本发明利用上述细胞株建立一种更加简单、快速、廉价的热原测定方法，可有利于单克隆抗体、细胞治疗类药物的研究开发，质量控制和临床应用，具有较高的应用价值。

附图说明

图1为本发明一实施例中不同HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE细胞单克隆的萤光素酶活性鉴定结果；其中，1-B1、1-B2、1-B3、1-B4、1-B5、1-B6、1-D1、1-D2、 1-D3、1-D4、1-D5、1-D6为不同细胞单克隆的编号；

图2为本发明一实施例中不同HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE细胞亚克隆的萤光素酶活性鉴定结果；其中，1-D5-1-A7、1-D5-1-A9、1-D5-1-B7、1-D5-1-C8、 1-D5-1-C10、1-D5-1-D9、1-D5-1-D11、1-D5-1-D12、1-D5-1-E10为不同细胞亚克隆的编号；

图3为本发明一实施例中热原标准品测定的化学发光强度结果图；其中，图 A为内毒素标准品测定结果；图B为脂壁酸标准品测定结果；图C为酵母多糖标准品测定结果。

具体实施方式

本发明提供了一种单克隆细胞株及其构建方法和在热原测定中的应用，下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

其中，本发明使用的单克隆细胞株HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE为携带有受 NF-κB调控的萤光素酶基因且能稳定表达萤光素酶的体外培养的人白血病细胞 HL-60，其已进行保藏，其分类命名为含NF-κB报告基因的人白血病稳转细胞株，保藏编号为CGMCC No.18524，保藏日期为2019年10月11日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例1

本实施例提供单克隆细胞株HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE的构建方法，包括如下步骤：

(1)潮霉素b最佳筛选浓度的确定；

HL-60细胞接种于24孔细胞培养板中，加入不同筛选浓度潮霉素b，浓度范围：0.1mg/ml～2mg/ml培养1～2周，观察细胞生长形态，确认潮霉素b筛选浓度为100-200μg/ml。

(2)细胞转染；

收集HL-60细胞，离心弃上清，用无血清培养基洗涤两遍，重悬计数，调整细胞密度至合适范围，加入PNL3.2 NF-κB-RE/Hygro⁺质粒，混合均匀，置于电转杯中，用电转仪电击后，将细胞悬液重悬于完全培养基中，置于二氧化碳培养箱培养24小时后，加入潮霉素b筛选3～6周，挑选耐药克隆。

(3)细胞克隆萤光素酶活性鉴定；

检测前一天取耐药克隆细胞离心重悬于检测培养基中，各铺2孔，二氧化碳培养箱培养过夜。检测当天，将培养上清吸除，稀释酵母多糖至终浓度2μg/ml 加入板内，二氧化碳培养箱培养6.5h，加入发光底物(Promega)孵育3min发光。计算方法为：相对发光强度＝实验组发光强度/对照组发光强度

结果如图1所示，编号为1-D1、1-D3、1-D5的细胞克隆具有显著的萤光素酶活性。其中，1-D5的萤光素酶活性最高。

实施例2

本实施例提供HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE细胞亚克隆的筛选方法，其包括如下步骤：

(1)建库；

将1-D5细胞用完全培养基扩增，收集细胞计数重悬于冻存液中，1.5ml/管分装于冻存管中，-70以下冻存2周后，移至液氮中长期保存。

(2)细胞的复苏；

从液氮罐中取出冻存的1-D5细胞，将细胞快速融化复苏后，转入5ml完全培养基中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)亚克隆化培养；

将复苏后的1-D5细胞用完全培养基进行有限稀释获得单克隆，将单克隆扩增培养后获得亚克隆细胞。

(4)细胞亚克隆萤光素酶活性鉴定；

检测前一天取亚克隆细胞离心重悬于检测培养基中，各铺2孔，二氧化碳培养箱培养过夜。检测当天，将培养上清吸除，稀释酵母多糖至终浓度2μg/ml加入板内，二氧化碳培养箱培养6.5h，加入发光底物(Promega)孵育3min发光。

结果如图2所示，编号为1-D5-1-B7的细胞亚克隆具有最显著的萤光素酶活性。

实施例3

本实施例提供单克隆稳转细胞株的热原报告基因检测方法。

采用HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE细胞株测定热原的方法包括如下步骤：

(1)细胞传代培养和铺板：稳转细胞株使用所述完全培养液传代培养于5％， 37℃二氧化碳培养箱内，每3天换液一次，收集入无菌离心管中，1000rpm离心 2分钟，弃去上清液，将细胞沉淀用新鲜的完全培养液重悬，转入细胞培养瓶，继续培养。取生长状态良好的细胞进行铺板，1000rpm离心2min，弃上清，加入维持培养液重悬细胞，调节细胞浓度为5×10⁵个/mL，以50μL/孔加入到96孔培养板中。

(2)标准溶液及待检样品溶液的制备：

内毒素(LPS)标准溶液的制备：取LPS标准品(购自中国食品药品检定研究院)一支，用所述维持培养液复溶并稀释成约1000Eu/mL的溶液，然后用所述维持培养液继续稀释，获得400Eu/mL、200Eu/mL、80Eu/mL、40Eu/mL、 20Eu/mL、10Eu/mL、5Eu/mL、2.5Eu/mL、0.5Eu/mL、0.1Eu/mL和0.02Eu/mL 共11个稀释度。

酵母多糖(Zysoman)标准溶液的制备：称取酵母多糖粉末(购自Sigma) 适量，用所述维持培养液复溶并稀释成约100μg/ml的溶液，然后用所述维持培养液继续稀释，获得100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/ml、0.032μg/ml、 0.006μg/ml和0.001μg/ml共8个稀释度。

脂壁酸(LTA)标准溶液的制备：称取脂壁酸粉末(购自Sigma)适量，用所述维持培养液复溶并稀释成约100μg/ml的溶液，然后用所述维持培养液继续稀释，获得100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/ml、0.032μg/ml、 0.006μg/ml和0.001μg/ml共8个稀释度。

待检样品溶液的制备：可以根据情况选择稀释待检样品或者直接加入待检样品进行检测，如果需要稀释待检样品，则用维持培养液进行稀释，但须在最大有效稀释倍数(MVD)以内，MVD＝cL/λ。其中，L表示待检样品中热原物质的限值；c表示待检样品的溶液的浓度，当L以Eu/mL表示时，c等于1.0mL/mL； λ为该方法的检测限(参考中华人民共和国药典2010版，第二增补本，第455 页)。

(3)加样：取标准溶液或待检样品溶液各50μL，分别加入96孔细胞培养板内，阴性对照(至少设4个复孔)加入维持培养液50μl，37℃，5％二氧化碳条件下培养3小时。

(4)显色和结果计算：每孔加入100μL显色剂，在酶标仪上读数。以标准品溶液浓度的对数对其相应的化学光强度(RFU)值作四参数logistic回归，拟合标准曲线。将供试品溶液测得RFU值带入标准曲线中，计算供试品溶液热原含量。

结果如图3所示，利用本发明的测定方法分别对LPS、Zysoman、LTA三种热原标准品进行测定，所测得浓度与RFU值呈现很好的量效关系。

实施例4

此实施例提供上述单克隆细胞在热原测定中的应用，具体的操作方法包括如下步骤：

(1)测定步骤：细胞用完全培养液(取热灭活胎牛血清FBS 10ml，加IMDM 培养液90ml，50mg/ml潮霉素200μl，混匀，4℃保存)于37℃，5％二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×10⁵～1.0×10⁶个细胞，取生长状态良好的细胞用于试验。无菌条件下，取细胞悬液，1000rpm离心2分钟，弃去上清液，用维持培养液(取热灭活胎牛血清FBS 2ml，加IMDM培养液98ml，混匀，4℃ 保存)洗涤细胞1遍，重悬并调整细胞浓度至每1ml约含2.0～5.0×10⁵个细胞，每孔50μl接种于96孔板。加入不同浓度标准品溶液、供试品溶液或干扰试验供试品溶液，每孔50μl，阴性对照(至少设4个复孔)加入维持培养液50μl，37℃， 5％CO₂条件下培养3小时。加入显色剂100μl。以标准品溶液浓度的对数对其相应的化学光强度(RFU)值作四参数logistic回归，拟合标准曲线。将供试品溶液测得RFU值带入标准曲线中，计算供试品溶液热原含量。

(2)供试品干扰试验：当首次应用本法进行供试品热原检测时，须进行供试品的干扰试验；当供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行供试品的干扰试验。

照细菌内毒素检查法(通则1143)，确定供试品最大有效稀释倍数(MVD)。其中L为供试品的热原限值；λ为测定法检测限：将测定法项下测得阴性对照平均吸光度值与其3个标准差(SD)和带入标准曲线，计算对应的热原值，即为测定法的检测限。

选择标准曲线中点或靠近中点的内毒素标准品浓度，作为供试品干扰试验中添加的内毒素标准品浓度。取供试品溶液(n/2倍稀释液，n不得超过MVD)， 2倍浓度的内毒素标准品溶液，等体积混匀，即为干扰试验供试品溶液。按测定法项下进行试验，将干扰试验供试品溶液测得的内毒素值(A)，供试品溶液(n 倍稀释液)测得内毒素值(B)和添加的内毒素值(C)，带入下式，计算本试验条件下内毒素回收率(R)。

R＝(A-B)/C×100％

当回收率在50％～200％之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。当回收率不在指定的范围内，须排除干扰因素，并重复干扰试验来验证处理的有效性。

结果如表1所示，内毒素(LPS)在16批脑蛋白水解物中的回收率均在50％～ 200％之间，表明脑蛋白水解物对内毒素的测定无干扰作用。该方法可用于脑蛋白水解物热原测定。16批脑蛋白水解物内毒素含量均低于0.2EU/mg，符合质量标准规定。

表1热原的回收率及样品中热原含量测定结

由上述实施例可知，本发明构建了一种能够稳定表达NF-κB反应元件-萤光素酶报告基因的人白血病细胞株，上述细胞株在给予外源热原刺激的情况下可稳定表达萤光素酶，通过检测该细胞株所表达的萤光素酶的活性可以测定样品的热原含量，本发明提供的方法测定时间短、操作简单、实验成本低。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种单克隆细胞株，其特征在于，所述单克隆细胞株为携带有受NF-κB反应元件调控的萤光素酶基因且能稳定表达萤光素酶的体外培养的哺乳动物细胞。

2.根据权利要求1所述的单克隆细胞株，其特征在于，所述哺乳动物细胞为人白血病细胞株HL-60细胞。

3.根据权利要求1所述的单克隆细胞株，其特征在于，所述单克隆细胞株的命名为HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE，其分类命名为含NF-κB报告基因的人白血病稳转细胞株，保藏编号为CGMCC No.18524，保藏日期为2019年10月11日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的单克隆细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤二，利用细胞电穿孔转染技术将步骤一构建的所述质粒转染入所述HL-60细胞；

步骤三，在步骤二转染后的所述HL-60细胞中加入潮霉素b，经过加压筛选，分离获得单克隆细胞株HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE并冻存。

5.根据权利要求4所述的单克隆细胞株的构建方法，其特征在于，还包括所述单克隆细胞株HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE的萤光素酶活性的鉴定步骤。

6.根据权利要求4所述的单克隆细胞株的构建方法，其特征在于，步骤二中所述潮霉素b的浓度为0.1～0.5mg/ml。

7.根据权利要求6所述的单克隆细胞株的构建方法，其特征在于，所述潮霉素b的浓度为0.1～0.2mg/ml。

8.根据权利要求4所述的单克隆细胞株的构建方法，其特征在于，所述单克隆细胞株HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE置于液氮介质中进行冻存。

9.一种如权利要求1-3任一项所述的单克隆细胞株在热原测定中的应用，其特征在于，具体的操作方法包括如下步骤：

(1)所述单克隆细胞株HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE的复苏、传代及接种；

(2)标准溶液及待检样品溶液的制备：根据测定需求分别将内毒素、酵母多糖、脂壁酸标准溶液及待检样品溶液稀释后，加入已接种所述单克隆细胞株HL-60-pNL3.2.NF-κB-RE的孔板中；

(4)以标准品溶液浓度的对数对其相应的RFU值作四参数逻辑回归，拟合标准曲线，将供试品溶液测得的RFU值带入标准曲线中，计算供试品溶液热原含量。