CN111466902B - 利用荧光信号差值测量斑马鱼心率的方法 - Google Patents
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Abstract
一种对生物体损害更小、更稳定、更精确的非接触式斑马鱼心跳频率的测量方法。基因标记的斑马鱼心脏中的GFP荧光蛋白对应激发波长的激光照明后，会发出荧光信号。利用搭配滤光片的倒置式显微镜滤除激发光的信号(488nm)采集荧光信号(507nm)，并且利用高速CCD相机采集一段时间内的心跳图像形成一个视频。将得到的视频逐帧提取并对帧与帧之间的差值区域面积进行统计绘图，得到差值随时间的变化曲线。通过统计波峰出现的平均间隔帧数和波谷出现的平均间隔帧数的平均值得到心脏跳动周期，利用已知的视频帧率即可求得心跳的频率。该方法在生物测量、生物活体显微成像等方面有重要的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于光学、生物测量技术领域，涉及微光学器件加工、显微成像系统设计以及 生物活体成像。其特点是使用逐帧做差的方法提取心脏跳动的信号，能较完整的复原心脏 跳动。
背景技术
斑马鱼由于其发育迅速，透明度较高等特点被广泛应用于生物实验中，其心率的测量 在生物实验以及相关的药物研究方面起着重要的作用。目前测量斑马鱼心率的方法有以下 几种。
一、针刺法测量斑马鱼的心电图：该方法是将两个电极刺入斑马鱼的心脏检测电信号， 经过放大处理后得到斑马鱼的心电图。该方法对斑马鱼的损害较大，对于未成年的斑马鱼 也无法测量，且电极的刺入会导致心脏频率的改变。
二、利用CCD相机拍摄的测量方法：该方法是直接用CCD相机拍摄斑马鱼的心脏区域，利用后续图像处理的方法求出各帧图片之间的相关性来评价斑马鱼的心跳。该方法对生物体的影响较小但是应用条件较为复杂，对成像质量的要求较高并且无法得到精确的斑马鱼心跳信号。
三、绿色荧光蛋白的标记方法：该方法使用绿色荧光蛋白标记斑马鱼的心脏，一般利 用共聚焦显微系统或者其他荧光显微系统测量斑马鱼的心率。该方法未提供较好的后期处 理的相关技术。
目前存在的方法难以提高测量的精度，本发明在算法上做出改进，可以得到更多心跳 信号的细节。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对生物体损害更小，更稳定，更精确的非接触式斑马鱼心 跳频率的测量方法。
斑马鱼心脏中的荧光蛋白对应激发波长的激光照明后，会激发出荧光信号。利用搭配 滤光片的倒置式显微镜滤除激发光的信号(488nm)采集荧光信号(507nm)，并且利用高速 CCD相机采集一段时间内的心跳图像形成一个视频。
将得到的视频做后续处理：首先利用自主编写的程序将视频逐帧提取为图片并得到视 频的帧率(fps)，仅提取视频中绿色通道进一步减少激发光的影响。选取适当的灰度阈值 对所有图片进行二值化处理，阈值选取时需考虑既不影响心脏细节又能有效的去除心脏之 外的其他信号。选取某一帧f0作为初始图像，后续每一帧fi对初始帧做差，对帧与帧之间 的差值区域面积fi-f0进行统计绘图，每一帧与初始帧的差值作为心脏状态的表征。当第 i帧与初始帧的差最小时认为进行了一个完整的周期，得到差值随时间的变化曲线。寻找 到上述曲线中的波峰坐标和波谷坐标，去除干扰的次级波峰，统计波峰出现的平均间隔帧 数Tp和波谷出现的平均间隔帧数Tv，二者求平均值得到心脏跳动周期，利用已知的视频帧 率即可求得心跳的频率。
其中fps为视频帧率，Tp为波峰出现的平均间隔帧数，Tv为波谷出现的平均间隔帧数。该 方法的测量精度依赖于CCD相机的成像速度，高速CCD相机可以提高视频帧率，体现出 更多的心脏细节，也会使心率的测量更加精准。但同时，CCD相机的成像速度受到成像区域的面积和成像曝光时间的限制，因此首先找到心脏所在的区域并使用高倍镜可以提高成像速度。另一方面，曝光时间是与荧光信号的强度相关联的，太弱的荧光信号会要求更长的曝光时间及更大的增益，从而大幅降低成像速度。但是，荧光信号的增强需要更强的激发光，从而增加激发光对生物体的损害，影响实验结果的可信度。因此，应用本发明提供 的方法时需要根据应用的需求，在提高成像速度和降低对生物体的损害之间取得平衡。 测量斑马鱼心跳频率的具体操作步骤归纳如下：
1、培养绿色荧光蛋白(GFP)标记心脏的斑马鱼。
2、搭建如图1所示的实验系统，接入电源检测是否正常工作。
3、将斑马鱼麻醉后放置于方形毛细管中，并调整斑马鱼的姿态。使用4×显微物镜找 到心脏位置并移至视野中央。
4、使用适当的放大倍数(比如10×)的显微物镜观测到清晰的斑马鱼心脏。
5、利用高速CCD采集心脏跳动的图像。如图3(a)和3(b)所示。
6、利用本发明提供的方法处理视频，得到心跳曲线。如图3(c)所示。
本发明利用改良的光片荧光显微成像系统，结合我们自己开发的图像处理程序，可以 在极大降低对生物体光毒性和荧光蛋白的光漂白性的同时，非接触地测量得到斑马鱼的心 率数据。
本发明的优点和积极效果：
本发明提供的斑马鱼心跳频率测量方法相对于针刺法应用范围更加广泛，非接触式的 测量方法提高了数据的可信度；相对于利用CCD直接拍照成像的方法能提供更多的心跳 细节，减少斑马鱼内其他器官活动对于心率测量的干扰，在测量精度方面更加具有优势； 荧光显微系统的应用使测量过程中对心脏的定位更加准确，细节展现更加丰富。该方法在 显微照明、成像领域和生物活体实验领域有着重要的应用需求和潜力。
附图说明
图1是本发明提供的荧光显微系统的光路图，其中1为方形毛细管，斑马鱼放置在其 内部，激发光为波长488nm的激光，功率为50mW；2为10×显微物镜，用于探测心跳信 号；3为滤波片，滤除照明光；4为高速CCD相机。
图2是本发明提供的利用差值数据处理方法计算斑马鱼心率的流程图。
图3是利用本发明提供的光片晶格照明荧光显微系统得到的斑马鱼的心率，其中(a)是 斑马鱼心脏收缩时的图像；(b)是斑马鱼心脏舒张时的图像；(c)是斑马鱼心率的图像。
图4是不同给药情况下的斑马鱼心率统计图。
具体实施方式
测量不同浓度心脏药物对斑马鱼心率的影响：
1、培养绿色荧光蛋白(GFP)标记心脏的斑马鱼。
2、搭建如图1所示的实验系统，接入电源检测是否正常工作。
3、对五组斑马鱼给药(药物为双酚芴)，前四组给药的浓度分别为1μM、2μM、5μM、10μM，第五组不给药。
4、将某一浓度的一条斑马鱼麻醉后放置于方形毛细管中，并调整斑马鱼的姿态。使 用适当的放大倍数的显微物镜观测到清晰的斑马鱼心脏。
5、利用高速CCD采集心脏跳动的图像。
6、利用编写好的程序处理视频，求出心脏的心率。
7、将同一给药浓度的另外四条斑马鱼依次进行上述步骤，得到该给药浓度下的五条 斑马鱼的心率，求出该给药浓度下心率的平均值。
8、对五种给药浓度下的斑马鱼依次进行上述测量，统计不同给药浓度下心率的平均 值，绘制斑马鱼心率统计图。如图4所示。
Claims (1)
1.一种利用荧光信号差值测量斑马鱼心率的方法，其特征步骤如下：
将心脏被绿色荧光蛋白基因标记的斑马鱼放置在方形毛细管中，斑马鱼心脏中的荧光蛋白对应激发波长的激光照明后，会激发出荧光信号；利用搭配滤光片的倒置式显微镜滤除波长488nm激发光的信号采集波长507nm的荧光信号，并且利用高速CCD相机采集一段时间内的心跳图像形成一个视频；利用自主编写的程序将视频逐帧提取为图片并得到视频的帧率，仅提取视频中绿色通道进一步减少激发光的影响，选取适当的灰度阈值对所有图片进行二值化处理；选取某一帧f0作为初始图像，后续每一帧fi对初始帧做差，对帧与帧之间的差值fi-f0进行统计绘图，每一帧与初始帧的差值作为心脏状态的表征；当第i帧与初始帧的差最小时认为进行了一个完整的周期，得到差值随时间的变化曲线；寻找到上述曲线中的波峰坐标和波谷坐标，去除干扰的次级波峰，统计波峰出现的平均间隔帧数Tp和波谷出现的平均间隔帧数Tv，二者求平均值得到心脏跳动周期，利用已知的视频帧数即可求得心跳的频率：
其中fps为视频帧率，Tp为波峰出现的平均间隔帧数对应的时间间隔，Tv为波谷出现的平均间隔帧数对应的时间间隔。
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