CN111458515A - 一种外周血中的肺小细胞肿瘤细胞数量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为肺小细胞检测提供一个可靠的内控质量控制方法，在精确的知道检测技术上限的同时准确的计算出细胞的回收率而得出整体循环肿瘤细胞的数目，极大的提升检测的可信度。本发明所述的方法，包括以下步骤：1)外周血样本的获得，2)向外周血样本注入200颗人工合成的仿细胞荧光圆珠，3)采用以下技术对外周血小细胞进行富集，4)在显微镜下辨认及计数富集后外周血中余下的仿细胞荧光圆珠，根据圆珠回收率计算公式计算外周血中肺小细胞的数目。
Description
技术领域：
本发明涉及一种外周血中的肺小细胞肿瘤细胞数量的检测方法。
背景技术：
小细胞肺癌(SCLC)在肺癌中所占的比例约百分之二十到百分之二十五。小细胞肺癌是肺癌中恶性程度最高的，预后最差，因此日常如果发现该病的症状时，需及早诊断，及时治疗；早诊断的方法包括，检测外周血中的肺小细胞肿瘤细胞数量。
现有技术公开了外周血中的肺小细胞肿瘤细胞富集方法，如：
C.Wu,H.Hao,L.Li,X.Zhou,Z.Guo,L.Zhang,X.Zhang,W.Zhong,H.Guo,R.Bremner,and P.Lin(2009)Preliminary investigation of the clinical significance ofdetecting circulating tumor cells enriched from lung cancer patients.J.ThoracOncol 4:30-6文献，公开了以下内容：肺癌临床检测及富集循环细胞。
Q.Chen,F.Ge,W.Cui,F.Wang,Z.Yang,Y.Guo,L.Li,R.Bremner,and P.Lin(2013)Lung Cancer Circulating Tumor Cells Isolated by the EpCAM-IndependentEnrichment Strategy Correlate with Cytokeratin 19-Derived CYFRA21-1 andPathological Staging.Clin Chim Acta 419:57-61文献，公开了以下内容：非EpCAM依赖性富集肺癌循环肿瘤细胞。
Application Value and Evaluation of Circulating Tumor Cells(CTC)Inspection of Small Cell Lung Cancer Patients GE Han-tian；WANG et al Chinaand Foreign Medical Treatment 2017-22文献，公开了以下内容：循环肿瘤细胞在肺小细胞病患的应用与评估。
但现有技术的缺陷在于，没法知道捕获到的细胞占整体肺小细胞总数的比例和准确数目，无法定量。
我们知道，肺小细胞的数目相对其它肿瘤类高非常多，因此需要提供定量数据，并制定一种捕获到的细胞占整体肺小细胞总数的比例的标准，根据该标准，判断小细胞肺癌的发生，发展，治疗效果等，可用于小细胞肺癌的检测，排除假阳性，判断药物的治疗效果。
发明目的：
本发明为肺小细胞检测提供一个可靠的内控质量控制方法，在精确的知道检测技术上限的同时准确的计算出细胞的回收率而得出整体循环肿瘤细胞的数目，极大的提升检测的可信度。
本发明的检测方法，步骤如下：
1)外周血样本的获得
采集6ml人的外周血于任何一种含抗凝剂(如EDTA、肝素、或ACD等)的采血管中(BD，New Jersey，USA)。
2)向外周血样本注入200颗人工合成的仿细胞荧光圆珠
3)采用以下技术对外周血小细胞进行富集
离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白。向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟。加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升，该细胞分离介质包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖和泛影酸钠；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物)隔离液的离心管，将样品标本再次离心(900×g，6分钟)。取上清液，将上清液再离心1000×g，4分钟。弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞及仿细胞荧光圆珠。
4)在显微镜下辨认及计数富集后外周血中余下的仿细胞荧光圆珠，根据圆珠回收率计算公式计算外周血中肺小细胞的数目。
以下为本发明名词术语的解释：
肺小细胞肿瘤细胞，定义如下：肺小细胞癌(SCLC)是一种由小细胞组成的恶性上皮肿瘤，肿瘤细胞胞浆稀少，细胞边界不清，核染色质细颗粒状，无核仁或不明显，细胞呈圆形、卵圆形或梭形，核切迹明显，坏死典型呈广泛性，核分裂计数高。
外周血，定义如下：外周血是除骨髓之外的血液
人工合成的仿细胞荧光圆珠，定义如下：荧光染料混合在珠子上的聚苯乙烯荧光微球，密度为1.095—1.120g/cm～3，与淋巴细胞及单核白细胞密度一样，可广泛应用于血流测定、示踪、体内成像、影像校准和流式细胞仪等。
肺小细胞的富集，定义如下：从全血样本中分离出外周血单个核细胞(PeripheralBlood Mononuclear Cell，PBMC)，再通过偶联了抗人CD45单克隆抗体的免疫磁珠去除肿瘤病人PBMC细胞中的CD45+细胞，从而有效的富集了病人外周血标本的循环肿瘤细胞(CTCs)。
肺小细胞的辨认及计数，定义如下：肿瘤细胞的辨认是通过免疫荧光细胞化学通过PE标记的抗人CD45抗体(PE-anti-CD45)和DAPI对细胞进行免疫荧光染色，加上CEP8荧光探针对染色体线粒体的原位杂交，CD45表达阴性(DAPI+/CD45-/CEP8异倍体)的细胞被鉴定为CTC。
圆珠回收率计算公式，定义如下：荧光圆珠富集率＝最后显微镜鉴别到的荧光珠数目/已知加入健康人血的荧光圆珠。
本发明的方法，是经过以下实验后经过筛选获得的，实验如下:
分别加入10颗、100颗、400颗及1000颗的肺小细胞株到相应抽取健康人的6mL血液里模拟肿瘤细胞的真实环境，完成整个富集流程，在显微镜下辨认并计数余下肺小细胞株，得取实验的细胞富集率，从而推算出真实的肿瘤细胞富集率及检测技术的上下限。
以下为该实验的详细描述：
一、实验目的
在6mL血液里加入已知数目的细胞株，模拟真实的检测环境，完成整个富集流程，得取细胞富集率。
二、实验方法
采集6ml人的外周血于任何一种含抗凝剂(如EDTA、肝素、或ACD等)的采血管中(BD，New Jersey，USA)。离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白。向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟。加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升，该细胞分离介质包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖和泛影酸钠；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物)隔离液的离心管，将样品标本再次离心(900×g，6分钟)。取上清液，将上清液再离心1000×g，4分钟。弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞。
三、实验步骤
离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白。向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟。加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升，该细胞分离介质包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖和泛影酸钠；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物)隔离液的离心管，将样品标本再次离心(900×g，6分钟)。取上清液，将上清液再离心1000×g，4分钟。弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的细胞株。对富集到的细胞进行免疫荧光细胞化学染色，通过PE标记的抗人CD45抗体(PE-anti-CD45)和DAPI对细胞进行免疫荧光染色，加上CEP8荧光探针对染色体线粒体的原位杂交
四、实验数据和结果
CD45表达阴性(DAPI+/CD45-/CEP8异倍体)的细胞被鉴定为细胞株。计数鉴定的细胞株数目。用以下公式计算细胞回收率：细胞株富集率＝最后鉴别到的细胞株/已知加入健康人血的细胞株数目
五、结论
在6mL健康人外周血加入已知数目细胞株，依据标准完成整个富集及鉴别流程，得出的细胞回收率反映到真实的肿瘤细胞回收率。依据10颗、100颗、400颗及1000颗细胞株的回收率得出非常高的富集精准度。
本发明通过加入已知数目的肺小细胞株及仿真人工合成荧光圆珠，完成整个富集流程后，在显微镜下辨认及计数余下的肺小细胞株及荧光圆珠，得出肺小细胞株及荧光圆珠的富集率。经过多次实验证实荧光珠与肺小细胞株的富集率高度一致并可以替代细胞株作为检测的可靠质量内控。经过多次的实验证明在检测的外周血中注入200颗人工合成的仿细胞荧光圆珠作为标本的内控，完成整个富集流程后，在显微镜下可以轻松的辨认及计数余下的圆珠，再根据圆珠回收率计算出整体肺小细胞的数目及检测的成功率，同时还没触碰到检测的上限。
本发明的优点在于：
其它现有的肺小细胞富集技术都缺乏有效的内控而不能提供准确的细胞回收率还不知道检测的上限，本技术利用人工合成的仿细胞圆珠，模仿循环肿瘤细胞在检测整个流程的状态，在检测技术的有效范围内(上下限)真实的反映了最终的细胞回收率，极大的提升检测可靠性及可信度。
本发明和现有技术和方法进行比较，结果如下：
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
提供一例具体的真实的检测过程：
在检测的6mL外周血中注入200颗仿细胞圆珠，继续按标准流程完成检测，在10倍物镜的显微镜下查看，辨认并计数圆珠，按余下公式计算回收率：辨认圆珠数目/总注入圆珠数目＝回收率。用回收率计算总循环肿瘤细胞数目：鉴别到的肺小细胞数目/回收率＝整体肺小细胞数目。
1)外周血样本的获得
采集6ml人的外周血于任何一种含抗凝剂(如EDTA、肝素、或ACD等)的采血管中(BD，New Jersey，USA)。
2)向外周血样本注入200颗人工合成的仿细胞荧光圆珠
3)采用以下技术对外周血小细胞进行富集
离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白。向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟。加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升，该细胞分离介质包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖和泛影酸钠；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物)隔离液的离心管，将样品标本再次离心(900×g，6分钟)。取上清液，将上清液再离心1000×g，4分钟。弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞及仿细胞荧光圆珠。
4)在显微镜下辨认及计数富集后外周血中余下的仿细胞荧光圆珠，根据圆珠回收率计算公式计算外周血中肺小细胞的数目。
实施例2
提供另一例具体的真实的检测过程：
在检测的6mL外周血中注入200颗仿细胞圆珠，继续按标准流程完成检测，在10倍物镜的显微镜下查看，辨认并计数圆珠，按余下公式计算回收率：辨认圆珠数目/总注入圆珠数目＝回收率。用回收率计算总循环肿瘤细胞数目：鉴别到的肺小细胞数目/回收率＝整体肺小细胞数目。
1)外周血样本的获得
采集6ml人的外周血于任何一种含抗凝剂(如EDTA、肝素、或ACD等)的采血管中(BD，New Jersey，USA)。
2)向外周血样本注入200颗人工合成的仿细胞荧光圆珠
3)采用以下技术对外周血小细胞进行富集
离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白。向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟。加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升，该细胞分离介质包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖和泛影酸钠；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物)隔离液的离心管，将样品标本再次离心(900×g，6分钟)。取上清液，将上清液再离心1000×g，4分钟。弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞及仿细胞荧光圆珠。
4)在显微镜下辨认及计数富集后外周血中余下的仿细胞荧光圆珠，根据圆珠回收率计算公式计算外周血中肺小细胞的数目。
Claims (4)
1.一种外周血中的肺小细胞肿瘤细胞数量的检测方法，包括以下步骤：
1)外周血样本的获得
采集6ml人的外周血于任何一种含抗凝剂的采血管中，
2)向外周血样本注入200颗人工合成的仿细胞荧光圆珠
3)采用以下技术对外周血小细胞进行富集
离心后，去掉血浆蛋白，向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟，加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方隔离液的离心管，将样品标本再次离心，取上清液，将上清液再离心，弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞及仿细胞荧光圆珠，
4)在显微镜下辨认及计数富集后外周血中余下的仿细胞荧光圆珠，根据圆珠回收率计算公式计算外周血中肺小细胞的数目。
2.根据权利要求1所述的的检测方法，包括以下步骤：
1)外周血样本的获得
采集6ml人的外周血于任何一种含抗凝剂(如EDTA、肝素、或ACD等)的采血管中(BD，NewJersey，USA)，
2)向外周血样本注入200颗人工合成的仿细胞荧光圆珠
3)采用以下技术对外周血小细胞进行富集
离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白，向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟，加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升，该细胞分离介质包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖和泛影酸钠；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物)隔离液的离心管，将样品标本再次离心(900×g，6分钟)，取上清液，将上清液再离心1000×g，4分钟，弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞及仿细胞荧光圆珠，
4)在显微镜下辨认及计数富集后外周血中余下的仿细胞荧光圆珠，根据圆珠回收率计算公式计算外周血中肺小细胞的数目。
3.根据权利要求1所述的的检测方法，包括以下步骤：
1)外周血样本的获得
采集6ml人的外周血于任何一种含抗凝剂(如EDTA、肝素、或ACD等)的采血管中(BD，NewJersey，USA)，
2)向外周血样本注入200颗人工合成的仿细胞荧光圆珠
3)采用以下技术对外周血小细胞进行富集
离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白，向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟，加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升，该细胞分离介质包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖和泛影酸钠；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物)隔离液的离心管，将样品标本再次离心(900×g，6分钟)，取上清液，将上清液再离心1000×g，4分钟，弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞及仿细胞荧光圆珠，
4)在显微镜下辨认及计数富集后外周血中余下的仿细胞荧光圆珠，根据圆珠回收率计算公式计算外周血中肺小细胞的数目。
4.根据权利要求1所述的的检测方法，包括以下步骤：
1)外周血样本的获得
采集6ml人的外周血于任何一种含抗凝剂(如EDTA、肝素、或ACD等)的采血管中(BD，NewJersey，USA)，
2)向外周血样本注入200颗人工合成的仿细胞荧光圆珠
3)采用以下技术对外周血小细胞进行富集
离心(1000×g，15分钟)后，去掉血浆蛋白，向其中加入50微升包被有抗CD14，CD45RO/CD45RA的单克隆抗体的磁珠后(Invitrogen，California，USA)，颠倒混匀10次,室温孵育20分钟，加6毫升细胞缓冲液，轻轻将标本转移到盛有3毫升的细胞分离介质上方(该细胞分离介质在20℃下的比重为1.07260～1.07650克/毫升，该细胞分离介质包含下列成份：聚乙烯吡咯烷酮包被的胶质二氧化硅；多聚糖和泛影酸钠；含右旋糖苷的糖溶液；由蔗糖和表氯醇聚合而成的非离子聚合物)隔离液的离心管，将样品标本再次离心(900×g，6分钟)，取上清液，将上清液再离心1000×g，4分钟，弃去上清液，得到的沉积细胞即为富集的非血缘性有核细胞及仿细胞荧光圆珠，
4)在显微镜下辨认及计数富集后外周血中余下的仿细胞荧光圆珠，根据圆珠回收率计算公式计算外周血中肺小细胞的数目。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5635600A (en) * | 1986-07-07 | 1997-06-03 | Trustees Of Dartmouth College | Bifunctional and heteroantibodies specific for the high affinity Fc receptor for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes |
| US20070071762A1 (en) * | 2005-09-21 | 2007-03-29 | Ccc Diagnostics, Llc | Comprehensive diagnostic testing procedures for personalized anticancer chemotherapy (pac) |
| CN101880650A (zh) * | 2009-05-04 | 2010-11-10 | 李彦萍 | 一种从外周血中快速提取循环的非血缘性有核细胞的组合物和试剂盒及其应用 |
| US20110195413A1 (en) * | 2008-05-20 | 2011-08-11 | Cyttel Biosciences Co., Ltd-Beijing | Integrated Method for Enriching and Detecting Rare Cells from Biological Body Fluid Sample |
| US20150211072A1 (en) * | 2012-09-27 | 2015-07-30 | Cynvenio Biosystems, Inc. | Stimulus-sensitive microparticles and methods of use |
| CN109777775A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-05-21 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 一种循环肿瘤细胞分离方法 |
-
2019
- 2019-12-18 CN CN201911305892.5A patent/CN111458515A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5635600A (en) * | 1986-07-07 | 1997-06-03 | Trustees Of Dartmouth College | Bifunctional and heteroantibodies specific for the high affinity Fc receptor for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes |
| US20070071762A1 (en) * | 2005-09-21 | 2007-03-29 | Ccc Diagnostics, Llc | Comprehensive diagnostic testing procedures for personalized anticancer chemotherapy (pac) |
| US20110195413A1 (en) * | 2008-05-20 | 2011-08-11 | Cyttel Biosciences Co., Ltd-Beijing | Integrated Method for Enriching and Detecting Rare Cells from Biological Body Fluid Sample |
| CN101880650A (zh) * | 2009-05-04 | 2010-11-10 | 李彦萍 | 一种从外周血中快速提取循环的非血缘性有核细胞的组合物和试剂盒及其应用 |
| US20150211072A1 (en) * | 2012-09-27 | 2015-07-30 | Cynvenio Biosystems, Inc. | Stimulus-sensitive microparticles and methods of use |
| CN109777775A (zh) * | 2019-01-28 | 2019-05-21 | 武汉海吉力生物科技有限公司 | 一种循环肿瘤细胞分离方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 梁俊国等: "非小细胞肺癌的循环肿瘤细胞计数的临床研究" * |
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