CN111455106A - 检测2019新型冠状病毒核酸的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测2019新型冠状病毒核酸的试剂盒，包括：检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA‑1或检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA‑2、LbCas12a核酸酶、核酸检测探针、引物对以及
DNA Amplification试剂盒、水和1×NEbufferTM2.1；本发明的检测2019新型冠状病毒核酸的试剂盒，能够快速、准确地对2019新型冠状病毒核酸进行检测，具有检测特异性好、灵敏度高、可在室温下实现高灵敏检测、操作方便、快捷的优点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域。更具体地,涉及检测2019新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸的试剂盒。
背景技术
2019新型冠状病毒是一种新发现的冠状病毒新毒株，可引起人新型冠状病毒性肺炎，以发热、乏力、干咳为主要表现，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。目前，临床诊断主要依据流行病学、临床表现、实验室检查等。
目前，在对2019新型冠状病毒检测中，金标准仍是实时荧光定量PCR(Real-time-PCR,RT-PCR)检测技术，其灵敏度和特异性都较高。使用实时荧光PCR检测，单是实时荧光PCR检测一般需要两小时左右。整个检测过程还包括采样、处理样本等步骤，通常总时长大于两小时。该方法的主要缺点在于检测花费时间长，进行PCR检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪及其它多种配套设备。在新冠病毒检测中，RT-PCR方法出现较多假阴性结果，影响了对疫情的判断和防控。
因此亟需一种不需要昂贵的仪器，低成本的，并能够快速、准确地检测2019新型冠状病毒的灵敏度高的试剂盒。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-1。
本发明的第二个目的是提供检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-2。
本发明的第三个目的是提供检测2019新型冠状病毒核酸的试剂盒。
本发明的技术方案概述如下：
检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
检测2019新型冠状病毒核酸的试剂盒，包括：检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-1或检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-2、LbCas12a核酸酶、核酸检测探针、引物对以及
DNA Amplification试剂盒、水和1×NEbufferTM2.1；
所述核酸检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述引物对包括上游引物和下游引物；
所述上游引物为第一上游引物、第二上游引物、第三上游引物、第四上游引物或第五上游引物；
所述第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述第三上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述第四上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述第五上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述下游引物为第一下游引物、第二下游引物、第三下游引物、第四下游引物或第五下游引物；
所述第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述第三下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述第四下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述第五下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
本发明的优点：
本发明的检测2019新型冠状病毒核酸的试剂盒，能够快速、准确地对2019新型冠状病毒核酸进行检测，具有检测特异性好、灵敏度高、可在室温下实现高灵敏检测、操作方便、快捷的优点。
附图说明
图1是分别使用两条实施例2、3的试剂盒检测2019新型冠状病毒核酸模拟样本结果图。
图2是使用实施例2检测2019新型冠状病毒核酸的试剂盒检测2019新型冠状病毒核酸模拟样本检测极限结果图。(图中浓度为1.8x10-6ng/ul和浓度为1.8x10-8ng/u的检测结果线重合)
图3是常规RT-PCR检测2019新型冠状病毒核酸模拟样本检测极限结果图。
图4是使用本发明实施例2的试剂盒检测2019新型冠状病毒核酸模拟样本和其他病毒(假病毒、EV71、EV-D68、PR8)检测结果图(图中假病毒、EV71、EV-D68、PR8和空白的检测结果线重合)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
设计得到检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA
获取2019-nCoV的基因组序列，通过生物信息学分析比对，寻找其特异性鉴定区域。
具体操作步骤如下，在NCBI核酸序列库查找2019-nCoV及其他冠状病毒(SARS-nCoV、MERS-nCoV、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、MHV、HCoV-229E、HCoV-NL63、IBV)的全基因组序列，获取其全基因组序列。在2019-nCoV序列中寻找“TTTN”的序列，将这些序列做为crRNA靶向序列的备选数据库。
与其它冠状病毒(SARS-nCoV、MERS-nCoV、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、MHV、HCoV-229E、HCoV-NL63、IBV)相比，寻找备选数据库的中序列的特异性。根据筛选原则，如序列的GC含量、碱基均一性、序列保守性等参数，最终得到一段大小为20-24nt的靶位点识别序列，然后将一段大小为20-21nt的直接重复序列加上前述得到的大小为20-24nt的靶位点识别序列得到检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA，共得到2条，分别为crRNA-1和crRNA-2，crRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，crRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2
检测2019新型冠状病毒核酸的试剂盒(第一种)，包括：检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-1、LbCas12a核酸酶(
Lba Cas12a(Cpf1)，BioLabs)、核酸检测探针(核苷酸5’端用FAM修饰，3’端用BHQ-1修饰)、第五上游引物、第五下游引物以及
DNA Amplification试剂盒(市售)、水(DEPC处理水)和1×NEbufferTM2.1(BioLabs)；
所述核酸检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述第五上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述第五下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
实施例3
检测2019新型冠状病毒核酸的试剂盒(第二种)，包括：检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-2、LbCas12a核酸酶(
Lba Cas12a(Cpf1)，BioLabs)、核酸检测探针(核苷酸5’端用FAM修饰，3’端用BHQ-1修饰)、第五上游引物、第五下游引物以及
DNA Amplification试剂盒(市售)、水(DEPC处理水)和1×NEbufferTM2.1(BioLabs)；
所述核酸检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述第五上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述第五下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
实施例4
实施例2的试剂盒的使用：
(1)将2.4uL浓度为10μM的第五上游引物水溶液、2.4uL浓度为10μM的第五下游引物水溶液和4uL浓度为1.8x10-5ng/uL(随后在进行检测极限的检测时，将该浓度10倍梯度稀释)的检测模拟样本水溶液(2019-nCoV的基因组序列-N蛋白基因，该基因组的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)添加到41.2uL 
DNA Amplification混合体系中(
DNA Amplification混合体系是将
DNA Amplification的试剂盒的各个成分按说明书配成)，39℃扩增20min；
(2)将1uL LbCas12a核酸酶、3uL1×NEbufferTM2.1与4uL浓度为1μM的检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-1水溶液进行孵育，25℃10min；
(3)取20uL步骤(1)获得的扩增产物和步骤(2)获得的8uL孵育产物在384孔板中混合，然后添加2uL浓度为1μM的核酸检测探针。反应体系置于多功能酶标仪，在37℃下反应20min，取荧光值进行结果判读。
有效结果判读：去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阳性，小于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阴性。
实施例5
实施例3的试剂盒的使用：
(1)将2.4uL浓度为10μM的第五上游引物水溶液、2.4uL浓度为10μM的第五下游引物水溶液和4uL浓度为1.8x10-5ng/uL(随后在进行检测极限的检测时，将该浓度10倍梯度稀释)的检测模拟样本水溶液(2019-nCoV的基因组序列-N蛋白基因，该基因组的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)添加到41.2uL 
DNA Amplification混合体系中(
DNA Amplification混合体系是将
DNA Amplification的试剂盒的各个成分按说明书配成)，39℃扩增20min；
(2)将1uL LbCas12a核酸酶、3uL1×NEbufferTM2.1与4uL浓度为1μM的检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-2水溶液进行孵育，25℃10min；
(3)取20uL步骤(1)获得的扩增产物和步骤(2)获得的8uL孵育产物在384孔板中混合，然后添加2uL浓度为1μM的核酸检测探针。反应体系置于多功能酶标仪，在37℃下反应20min，取荧光值进行结果判读。
有效结果判读：去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阳性，小于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阴性。
图1是分别使用两条实施例2、3的试剂盒检测2019新型冠状病毒核酸模拟样本结果图。结果表明，两种试剂盒都可以对2019新型冠状病毒核酸进行检测。
图2是使用实施例2的试剂盒检测2019新型冠状病毒核酸模拟样本检测极限结果图。结果表明：检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-1可激活LbCas12a核酸酶，使其识别靶标位点切割探针并产生荧光信号，说明crRNA-1序列可特异性识别相关的病原靶标序列，且检测极限为1.8x10-11ng/uL。
图3是常规RT-PCR检测体系检测极限结果图，常规RT-PCR检测极限为1.8x10-8ng/uL。结果表明，本发明的试剂盒的灵敏度远远超过常规RT-PCR的灵敏度。且本发明的试剂盒检测时间为40min，而RT-PCR需要至少2h。
图4是使用本发明实施例2的试剂盒检测2019新型冠状病毒核酸模拟样本和其他病毒(假病毒、EV71、EV-D68、PR8)结果图，结果表明本发明实施例2的试剂盒能够特异性检测2019新型冠状病毒核酸。实验证明，实施例3的试剂盒检测2019新型冠状病毒核酸模拟样本和其他病毒(假病毒、EV71、EV-D68、PR8)，其结果与实施例2的试剂盒检测结果相似。
分别用第一上游引物和第一下游引物、第二上游引物和第二下游引物、第三上游引物和第三下游引物、第四上游引物和第四下游引物替代实施例2的第五上游引物和第五下游引物，其它同实施例2，分别构成第三种、第四种、第五种和第六种试剂盒。实施证明，分别使用第三种、第四种、第五种和第六种试剂盒对2019新型冠状病毒核酸模拟样本进行检测，其结果与实施例2的试剂盒检测结果相似。
真实的样本的检测是将待测患者的病例样本替代本实施例的模拟样本，其它同本实施例，进行检测。
序列表
<110> 天津大学
<120> 检测2019新型冠状病毒核酸的试剂盒
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> RNA
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<400> 1
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<212> RNA
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<211> 5
<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgggtttgtt ctggaccacg tc 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggaccacgt ctgccgaaag ct 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgccgaaagc ttgtgttaca tt 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgtgttacat tgtatgcttt ag 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caaaatttcc ttgggtttgt tc 22
<210> 14
<211> 1260
<212> DNA
<213> 2019新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome-relatedcoronavirus SARS-CoV-2)
<400> 14
atgcaccccg cattacgttt ggtggaccct cagattcaac tggcagtaac cagaatggag 60
aacgcagtgg ggcgcgatca aaacaacgtc ggccccaagg tttacccaat aatactgcgt 120
cttggttcac cgctctcact caacatggca aggaagacct taaattccct cgaggacaag 180
gcgttccaat taacaccaat agcagtccag atgaccaaat tggctactac cgaagagcta 240
ccagacgaat tcgtggtggt gacggtaaaa tgaaagatct cagtccaaga tggtatttct 300
actacctagg aactgggcca gaagctggac ttccctatgg tgctaacaaa gacggcatca 360
tatgggttgc aactgaggga gccttgaata caccaaaaga tcacattggc acccgcaatc 420
ctgctaacaa tgctgcaatc gtgctacaac ttcctcaagg aacaacattg ccaaaaggct 480
tctacgcaga agggagcaga ggcggcagtc aagcctcttc tcgttcctca tcacgtagtc 540
gcaacagttc aagaaattca actccaggca gcagtagggg aacttctcct gctagaatgg 600
ctggcaatgg cggtgatgct gctcttgctt tgctgctgct tgacagattg aaccagcttg 660
agagcaaaat gtctggtaaa ggccaacaac aacaaggcca aactgtcact aagaaatctg 720
ctgctgaggc ttctaagaag cctcggcaaa aacgtactgc cactaaagca tacaatgtaa 780
cacaagcttt cggcagacgt ggtccagaac aaacccaagg aaattttggg gaccaggaac 840
taatcagaca aggaactgat tacaaacatt ggccgcaaat tgcacaattt gcccccagcg 900
cttcagcgtt cttcggaatg tcgcgcattg gcatggaagt cacaccttcg ggaacgtggt 960
tgacctacac aggtgccatc aaattggatg acaaagatcc aaatttcaaa gatcaagtca 1020
ttttgctgaa taagcatatt gacgcataca aaacattccc accaacagag cctaaaaagg 1080
acaaaaagaa gaaggctgat gaaactcaag ccttaccgca gagacagaag aaacagcaaa 1140
ctgtgactct tcttcctgct gcagatttgg atgatttctc caaacaattg caacaatcca 1200
tgagcagtgc tgactcaact caggcctaaa ctcatgcaga ccacacaagg cagatgggct 1260
Claims (3)
1.检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-1，其特征是如SEQ ID NO.1所示。
2.检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-2，其特征是如SEQ ID NO.2所示。
3.检测2019新型冠状病毒核酸的试剂盒，其特征是包括：检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-1或检测2019新型冠状病毒核酸的crRNA-2、LbCas12a核酸酶、核酸检测探针、引物对以及
DNA Amplification试剂盒、水和1×NEbufferTM2.1；
所述核酸检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述引物对包括上游引物和下游引物；
所述上游引物为第一上游引物、第二上游引物、第三上游引物、第四上游引物或第五上游引物；
所述第一上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述第二上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述第三上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述第四上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述第五上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述下游引物为第一下游引物、第二下游引物、第三下游引物、第四下游引物或第五下游引物；
所述第一下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述第二下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述第三下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述第四下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述第五下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115786582A (zh) * | 2022-08-08 | 2023-03-14 | 天津大学 | 结合CRISPR/Cas12a与RPA检测猴痘病毒方法、试剂盒及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US20180371487A1 (en) * | 2017-06-22 | 2018-12-27 | Ut-Battelle, Llc | Genes for enhancing drought and heat tolerance in plants and methods of use |
| WO2019089623A1 (en) * | 2017-10-30 | 2019-05-09 | Children's Hospital Medical Center | Fusion proteins for use in improving gene correction via homologous recombination |
| CN110551846A (zh) * | 2019-08-19 | 2019-12-10 | 上海科技大学 | 一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法 |
-
2020
- 2020-04-13 CN CN202010286936.0A patent/CN111455106B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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|---|
| WORLD HEALTH ORGANIZATION: ""Molecular assays to diagnose COVID-19: Summary table of available protocols"", 《MOLECULAR ASSAYS TO DIAGNOSE COVID-19: SUMMARY TABLE OF AVAILABLE PROTOCOLS》 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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