[go: up one dir, main page]

CN111454903A - 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立 - Google Patents

免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立 Download PDF

Info

Publication number
CN111454903A
CN111454903A CN202010371435.2A CN202010371435A CN111454903A CN 111454903 A CN111454903 A CN 111454903A CN 202010371435 A CN202010371435 A CN 202010371435A CN 111454903 A CN111454903 A CN 111454903A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
medium
immune cells
immune
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010371435.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111454903B (zh
Inventor
张炳强
陈梦梦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Re Store Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Qingdao Re Store Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Re Store Biotechnology Co ltd filed Critical Qingdao Re Store Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010371435.2A priority Critical patent/CN111454903B/zh
Priority to PCT/CN2020/092287 priority patent/WO2021223274A1/zh
Priority to JP2022507332A priority patent/JP7332787B2/ja
Priority to EP20934683.2A priority patent/EP4148123A4/en
Priority to US17/634,556 priority patent/US12376584B2/en
Priority to KR1020227004434A priority patent/KR20230008691A/ko
Publication of CN111454903A publication Critical patent/CN111454903A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111454903B publication Critical patent/CN111454903B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
    • A01N1/122—Preservation or perfusion media
    • A01N1/125—Freeze protecting agents, e.g. cryoprotectants or osmolarity regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/16—Physical preservation processes
    • A01N1/162—Temperature processes, e.g. following predefined temperature changes over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/15—Natural-killer [NK] cells; Natural-killer T [NKT] cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0031—Serum-free culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/14—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/231—Interleukin-10 (IL-10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/37—Parathyroid hormone [PTH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C12N2501/392—Sexual steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立。该方法包括：利用免疫细胞专用扩增培养基将单个核细胞进行第一阶段扩增培养，得到初步扩增的免疫细胞；利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增的免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，得到诱导的免疫细胞；利用免疫细胞专用激活培养基将诱导的免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，获得大量的激活功能的免疫细胞；利用免疫细胞专用冻存液冻存免疫细胞，得到冻存的免疫细胞；按ABO/RH分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的免疫细胞信息档案，构建免疫细胞库。

Description

免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存的方法及其细胞库建立的方法。
背景技术
细胞生物治疗己经成为继手术、放化疗及内分泌治疗之后的第五大治疗模式。过继性免疫细胞治疗是细胞生物治疗方法之一，它是指向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤细胞或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。目前临床上应用的免疫细胞包括DC-CIK细胞、TIL细胞、LAK细胞及NK细胞，其中，CIK细胞、LAK细胞和NK细胞都是以自然杀伤细胞为主体的抗癌体系。
NK细胞又称自然杀伤细胞(natural killer cell)，在人体全身巡逻的同时搜寻癌细胞及病毒感染细胞等并对其进行攻击，在人体自然免疫中发挥着重要的作用。NK细胞占血液中淋巴细胞的10-30％，含穿孔素、颗粒酶等细胞毒性因子。NK细胞可释放穿孔素、颗粒酶，穿孔素在靶细胞表面穿孔，使颗粒酶b进入靶细胞诱导靶细胞凋亡。NK细胞同时分泌大量的细胞因子，如ifn-v、tnf-x、gm-csf、il-3、m-csf等，直接作用于靶细胞，或通过进一步激活其他种类免疫细胞攻击靶细胞。
NK细胞在肿瘤免疫、清除非己细胞等方面发挥重要作用：它是天然免疫防御的主要组成，位于机体防御体系的第一道防线，NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，无需抗原预先致敏即可识别并杀死肿瘤及病毒感染的细胞，通过穿孔素-颗粒酶途径和Fas-FasL通路直接对肿瘤细胞发挥细胞毒作用杀伤肿瘤细胞；同时它又能在发病早期分泌多种细胞因子和趋化因子如 TNF-α、IFN-γ和IL-1等，这些细胞因子参与抗癌和调节获得性免疫应答，故NK细胞也是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁。
NK细胞疗法的优势：（1）NK细胞活性高，可杀伤任何癌细胞，目前为止几乎没有发现高活性NK细胞杀不死的癌细胞；（2）有效刺激免疫力，激活免疫系统，没有毒副作用；（3）有效去除手术、放疗后残留的癌细胞；（4）NK细胞能够增强患者的免疫功能，同时具有抗恶性肿瘤和抗病毒的作用；（5）NK细胞是先天性细胞，可破坏任何癌细胞，是免疫细胞治疗的主力队员。
虽然NK细胞的抗癌效果的安全性和疗效得到肯定，但由于它仅占外周血淋巴细胞的10％-30％，因而如何获得高纯度、高质量地NK细胞产品是NK治疗的关键。近几年发现通过体外的刺激培养可进行相对大规模的NK细胞制备，己知IL-2、 IL-15、IL-18和IL-7等细胞因子在对NK细胞的体外扩增上发挥重要作用，它们体外扩增NK 细胞的倍数在几倍至数十倍不等。IL-2是重要的诱导NK细胞增殖的细胞因子，它可以激活 NK细胞、促进NK细胞增殖和细胞因子的产生。IL-15和IL-7的作用与IL-2相似，同时它们还可通过与NK细胞表面表达的复合受体γ链结合，促进造血干细胞定向分化为NK细胞，且对 NK细胞的发育、分化和维持长期体外存活等方面发挥重要作用。IL-15与IL-2的协同作用也使两者联合作用于NK细胞的体外扩增，是目前NK细胞体外扩增最传统的细胞因子组合。据报道IL-18不但能诱导活化的THi细胞分泌产生大量的IFN-γ，更能通过促进Fas-FasL通路的开放，增强NK细胞的细胞毒性，且呈剂量依赖性。
目前市场上已有NK细胞治疗产品，但使用的培养体系繁杂、扩增倍数及杀瘤效果不佳、冻存后复苏效果差、部分培养体系存在安全风险等问题。由此，自然杀伤细胞的培养、诱导、激活、冻存方法有待改进。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立的方法，该方法培养、诱导和激活免疫细胞的效率高、速度快、安全性高且成本低，并且诱导扩增获得的大量功能激活的免疫细胞可建立细胞库进行长期保存，复苏后依然保持良好的细胞活性。
本发明提供了免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
利用免疫细胞专用扩增培养基将单个核细胞进行第一阶段扩增培养，得到初步扩增的免疫细胞；利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增的免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，得到诱导的免疫细胞；利用免疫细胞专用激活培养基将诱导的免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，获得大量的激活功能的免疫细胞；利用免疫细胞专用冻存液冻存免疫细胞，得到冻存的免疫细胞；按ABO/RH分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的免疫细胞信息档案，构建免疫细胞库。
所述免疫细胞专用扩增培养基是添加了500-2000IU/ml IL-2、500-2000IU/mlIL-10、0.5-1ng/ml IL-1α和1-4ng/ml LIF、0.5-2.5ng/ml EPO、1-4ng/ml KGF、2-5ng/ml睾酮、1-4μg/ml甲状旁腺激素、1-4μg/ml层粘连蛋白的无血清淋巴细胞培养基。
所述免疫细胞专用诱导培养基是添加了500-2000IU/ml IL-2、500-2000IU/mlIL-10、1-4ng/ml bFGF、1-4ng/ml BMP-4、0.2-0.8μg/ml雷帕霉素、0.2-0.8μg/ml淫羊藿苷、20-80ng/ml曲美替尼、1-4ng/ml氢化可的松、1-4μg/ml层粘连蛋白的无血清淋巴细胞培养基。
所述免疫细胞专用激活培养基是添加了500-2000IU/ml IL-2、500-2000IU/mlIL-10、1-4ng/ml TGF-β、1-2ng/ml Forskolin、20-80ng/ml白藜芦醇、1-4μg/ml对乙酰氨基酚、1-4μg/ml层粘连蛋白的无血清淋巴细胞培养基。
所述免疫细胞专用冻存液是包含5体积％的DMSO、1-2体积％的白蛋白、1-2体积％氨基乙醇、91-93体积％的无血清淋巴细胞培养基。
所述免疫细胞专用扩增培养基、免疫细胞专用诱导培养基、免疫细胞专用激活培养基和免疫细胞专用冻存液中，所述的无血清淋巴细胞培养基为X-VOVO15无血清培养基或市售其他类型无血清培养基。
根据本发明的实施例，所述免疫细胞为自然杀伤细胞。
利用本发明对单个核细胞进行诱导扩增培养可得到大量功能激活的免疫细胞。本发明具有诱导效率高、扩增速度快、安全性高和成本低等优点。且本发明建立相应的细胞库，分类进行大规模的免疫细胞存储，有效保存时间长，复苏后细胞依然保持良好的细胞活力，细胞回收率高，从而满足临床治疗中大量免疫细胞的需求。
附图说明
图1是本发明方法的流程图；
图2是本发明方法14天内对外周血单个核细胞的扩增效率和细胞活率；
图3是本发明方法14天内对目标细胞的扩增效率；
图4是本发明方法12天内对外周血单个核细胞的扩增效率和细胞活率；
图5是本发明方法12天内对目标细胞的扩增效率。
具体实施方式
本发明提供了一种免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立的方法，具体包括：利用免疫细胞专用扩增培养基将单个核细胞进行第一阶段扩增培养，得到初步扩增的免疫细胞；利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增的免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，得到诱导的免疫细胞；利用免疫细胞专用激活培养基将诱导的免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，获得大量的激活功能的免疫细胞；利用免疫细胞专用冻存液冻存免疫细胞，得到冻存的免疫细胞；按ABO/RH分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的免疫细胞信息档案，构建免疫细胞库。
根据本发明的实施例，免疫细胞专用扩增培养基是添加了500-2000IU/ml IL-2、500-2000IU/ml IL-10、0.5-1ng/ml IL-1α和1-4ng/ml LIF、0.5-2.5ng/ml EPO、1-4ng/mlKGF、2-5ng/ml睾酮、1-4μg/ml甲状旁腺激素、1-4μg/ml层粘连蛋白的无血清淋巴细胞培养基。
根据本发明的实施例，免疫细胞专用诱导培养基是添加了500-2000IU/ml IL-2、500-2000IU/ml IL-10、1-4ng/ml bFGF、1-4ng/ml BMP-4、0.2-0.8μg/ml雷帕霉素、0.2-0.8μg/ml淫羊藿苷、20-80ng/ml曲美替尼、1-4ng/ml氢化可的松、1-4μg/ml层粘连蛋白的无血清淋巴细胞培养基。
根据本发明的实施例，免疫细胞专用激活培养基是添加了500-2000IU/ml IL-2、500-2000IU/ml IL-10、1-4ng/ml TGF-β、1-2ng/ml Forskolin、20-80ng/ml白藜芦醇、1-4μg/ml对乙酰氨基酚、1-4μg/ml层粘连蛋白的无血清淋巴细胞培养基。
根据本发明的实施例，所述免疫细胞为自然杀伤细胞。
根据本发明的实施例，第一阶段免疫细胞扩增培养基过程中，每2-3天传代一次，传代2次；第二诱导和扩增培养过程中，每2-3天传代一次，传代2次；第三阶段大规模激活和扩增培养过程中，每2天传代一次，传代至少2次（可多次传代）。因此，免疫细胞可在短时间内实现高纯度规模化扩增，获得充足的功能激活的免疫细胞，用于可能的临床免疫治疗。
根据本发明的实施例，免疫细胞专用冻存液是包含5体积％的DMSO、1-2体积％的白蛋白、1-2体积％氨基乙醇、91-93体积％的无血清淋巴细胞培养基。每107-108个免疫细胞采用1ml上述免疫细胞专用冻存液。因此，冻存的细胞浓度高，适于大规模免疫细胞的冻存，冻存成本低，并且细胞冻存效果好，复苏后细胞活率和细胞得率高。
根据本发明的实施例，将激活扩增的免疫细胞，按ABO/RH分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的免疫细胞信息档案，构建免疫细胞库。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
利用本发明的免疫细胞培养、诱导、激活扩增方法，将分离的单个核细胞诱导激活扩增为目的免疫细胞（NK细胞），并检测目的免疫细胞的活性。
一、实验方法
1.供体筛选
1.1要求医院须与供体签署知情同意书，一式3份。供体、医疗机构各一份，另一份随标本送交实验室。
1.2医院以询问和填表方式征询供体个人信息、过往治疗史、家族遗传史，以及是否有传染病史及造血或免疫系统的异常情况等信息。要求医院取得供体本人或其授权人员的同意，查阅其体检资料，获得体检信息。供体体检信息应包括如下项目：HIV-1/2抗体（艾滋病抗体）、HBsAg（乙肝表面抗原）、抗-HCV（丙型肝炎抗体）、CMV-IgM抗体（巨细胞病毒抗体）、ALT（转氨酶）、梅毒螺旋体抗体。检测方法分别执行卫生部现行检测标准。供体体检至少应符合《献血者健康检查要求》。
1.3由指定的有经验的医疗人员对收集到的信息进行综合评价，确定供体是否符合要求。供体知情同意书、个人信息采集表、检查信息等需编号密封保存。任何接触资料的人员未经供体本人或其授权人员的同意，不得泄露其隐私。
1.4按ABO/RH分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的免疫供体档案信息库。
2.采集外周血，分离外周血血浆和单个核细胞
2.1用加入抗凝剂的无菌采血袋采集人外周血约100ml，预留1ml外周血做快检和血型鉴定，采血袋立即无菌封装，无菌4℃保存运输，准确记录采集信息。快检筛选合格后将外周血送入GMP实验室，若快检不合格，血样废弃处理。
2.2在GMP实验室中取出血袋，酒精消毒采血袋，观察无凝血和溶血后在超净台中打开血袋，将血液转移到至50ml无菌离心管中(≤45ml/管)，2500rpm离心10min。
2.3转移上层血浆到另一离无菌离心管中，3500rpm离心10min，收集上清血浆到新的无菌离心管中，用口膜密封离心管口，血细胞用于分离单个核细胞。
2.4将血浆放到56℃水浴锅中水浴30-50min灭活补体，3500rpm离心15min去除补体，10ml每支分装到15ml无菌离心管中，-20℃冻存备用；并留取7.5ml血浆进行慢检：病毒五项、支原体、内毒素和微生物。
2.5将步骤2中的血细胞沉淀用血浆等体积的生理盐水重悬后转移到250ml无菌玻璃瓶中，加入血液总体积1/3量的羟乙基淀粉，轻轻晃动盐水瓶使混合均匀，静置使红细胞沉降。
2.6待红细胞层沉降分层后，将上层乳白色悬液轻轻吸取到无菌离心管，1800rpm离心5min，弃去上清，沉淀用10ml生理盐水重悬。
2.7取无菌15ml离心管2支，各加入5ml常温人外周血淋巴细胞分离液，分别在上层轻轻加入各5ml细胞悬液。室温2000rpm慢升慢降离心25min。
2.8轻轻取出离心管，小心吸取界面中间云雾层白细胞至新的15ml离心管中，补加生理盐水洗涤2次。
2.9 1ml生理盐水重悬细胞，取5μl细胞加入到245μl生理盐水中稀释50倍，计数，并用台盼蓝染色计细胞存活率。
2.10预留4.5×106个细胞进行流式抗体标记检测NK细胞的比例；剩余的单个核细胞细胞接种到加有20ml培养基的培养瓶中，加入免疫细胞专用扩增培养基,即添加了1000IU/ml IL-2、1000IU/ml IL-10、0.8ng/ml IL-1α和2ng/ml LIF、1.5ng/ml EPO、2ng/mlKGF、3ng/ml睾酮、2μg/ml甲状旁腺激素、2μg/ml层粘连蛋白的X-VOVO15无血清培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中无菌培养，记为第0天。每日观察细胞，根据培养基的颜色，每2-3天换液传代一次。
2.11换液2次以后，当培养体系已经达到2L时，更换培养体系为免疫细胞专用诱导培养基，即添加了1000IU/ml IL-2、1000IU/ml IL-10、2ng/ml bFGF、2ng/ml BMP-4、0.6μg/ml雷帕霉素、0.6μg/ml淫羊藿苷、50ng/ml曲美替尼、2ng/ml氢化可的松、2μg/ml层粘连蛋白的X-VOVO15无血清培养基。每日观察细胞，根据培养基的颜色，每2-3天换液传代一次。
2.12 继续再换液2次以后，更换培养体系为免疫细胞专用激活培养基，即添加了1000IU/ml IL-2、1000IU/ml IL-10、2ng/ml TGF-β、2ng/ml Forskolin、50ng/ml白藜芦醇、2μg/ml对乙酰氨基酚、2μg/ml层粘连蛋白的X-VOVO15无血清培养基。每日观察细胞，每2天换液传代一次。
2.13培养扩增14天时，进行细胞回收，留取10ml培养基上清进行Elisa分泌因子检测。
2.14将回收的细胞用200ml生理盐水重悬，并加入10ml人血清白蛋白，混匀；并从中取10ml细胞悬液待检，剩余的细胞可注入回输袋中准备回输。从回输袋中抽取10ml细胞悬液进行检测：支原体、内毒素、微生物和病毒五项。
3.流式细胞仪检测细胞中淋巴细胞谱系
将取出的10ml细胞悬液，1800rpm离心回收细胞，进行流式抗体标记。设置同型对照、单标样品和染色管，每管样品细胞数约5×105个，然后加入对应抗体染色。4℃，30min放置，用生理盐水洗涤，然后上机检测分析淋巴细胞群中的NK细胞比例。
4.将剩余10ml细胞悬液上清，进行分装，用以检测病毒五项、内毒素、支原体、微生物。
5.裸鼠致瘤试验SPF级雌性BALB/c裸鼠，4-6周龄，体重18-20g，于空气层流架中带盖鼠笼内饲养，饮用水、标准饲料及其它与动物接触品均经灭菌处理。取阳性对照Ragi细胞和K562细胞及待检测的体外诱导分化的第28天的NK细胞按3×107个/0.2ml接种裸鼠肋部皮下，用苦味酸标记，为期2个月观察成瘤情况。
6.将收细胞的培养基上清进行Elisa分泌因子检测，即IFN-γ、TNF-α和Perforin检测。
二、实验结果
1.培养扩增14天的实验结果
1.1培养扩增14天后细胞可扩增220倍
所述取外周血淋巴细胞分离液分离后的6.0×107个外周血单个核细胞接种到20ml培养体系中，细胞很快进入对数生长阶段。培养扩增14天后，培养体系扩大到4L，细胞数扩增到1.3 ×1010，扩增倍数在最高达220倍，活细胞数在95％以上，培养不同时间的外周血单个核细胞数和细胞活性的结果详见图2。
1.2扩增后的外周血单个核细胞中NK细胞比例明显升高
外周血单个核细胞经14天培养扩增后，淋巴细胞中的NK细胞比例(CD3-CD56+)由18.15％上升到97.64％，与此同时T淋巴细胞(CD3+)比例由71.47％下降到3.22％，辅助性T细胞(Th,CD3+CD4+)和细胞毒性T细胞(Tc,CD3+CD8a+)都有降低，B淋巴细胞(CD3-CD19+)基本消失，细胞均一性显著提高；结合图1中的细胞计数计算可知，培养14天后NK细胞扩增1165倍，培养14天前后的外周血单个核细胞中的淋巴细胞比例的结果见图3，其中，NK细胞：CD3-CD56+；T细胞：CD3+；辅助性T细胞(Th)：CD3+CD4+；细胞毒性T细胞(Tc细胞)：CD3+CD8a+；B细胞：CD3-CD9+。
1.3培养扩增得到的细胞产品检测未发现病原体感染
我们将培养后的细胞和细胞悬液委托检测平台检测了乙肝表面抗原、丙肝抗原、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、巨噬细胞病毒以及支原体、细菌和内毒素，检测结果均呈阴性，说明该批次产品是安全的，培养过程中没有造成污染。
2.培养12天的实验结果
2.1培养12天后细胞可扩增162倍
取外周血淋巴细胞分离液分离后的6.0×107个外周血单个核细胞接种到20ml培养体系中，细胞很快进入对数生长阶段。培养12天后，细胞数扩增到9.7×109，扩增倍数在达162倍，活细胞数在95％以上，实验结果详见图4。
2.2扩增后的外周血单个核细胞中的NK细胞比例明显升高
外周血单个核细胞经12天扩增后，淋巴细胞中的NK细胞比例(CD3-CD56+)从第6天的21.47％上升到第12天的93.22％，与此同时T淋巴细胞(CD3+)比例下降到3.86％，辅助性T细胞(Th,CD3+CD4+)和细胞毒性T细胞(Tc,CD3+CD8a+)都有降低，B淋巴细胞(CD3-CD19+) 基本消失，细胞均一性显著提高，培养12天前后的外周血单个核细胞中的淋巴细胞比例详见图5。
2.3培养扩增得到的细胞产品检测未发现病原体感染
我们将培养后的细胞和细胞悬液委托检测平台检测了乙肝表面抗原、丙肝抗原、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒螺旋体特异性抗体、巨噬细胞病毒以及支原体、细菌和内毒素，检测结果均呈阴性，说明该批次产品是安全的，培养过程中没有造成污染。
3.所培养的细胞均有IFN-γ、TNF-α、Perforin的分泌,结果如表1所示。
表1.培养基上清进行Elisa检测
14天 12天
IFN-γ 298.17ng/ml 262.45ng/ml
TNF-α 113.24pg/ml 98.47pg/ml
Perforin 23.78ng/ml 18.93ng/ml
4.培养扩增后的NK细胞不会在体内形成肿瘤
裸鼠致瘤实验结果：A组生理盐水对照组(成瘤小鼠数/组内小鼠数，0/5)，B组Raji细胞对照组(3/5)，C组K562细胞对照组(4/5)，D组NK细胞组(0/5)，即在2个月观察期内皮下注射0.2ml生理盐水组和3×107个/0.2ml培养28天的NK细胞组小鼠均未见肿瘤形成，注射等量Raji细胞和K562细胞的小鼠B组分别有4/5和5/5只小鼠形成了可见的肿瘤。该结果说明即使培养到28天，NK细胞依然是安全有效的，不会导致肿瘤的形成。
实施例2
对实施例1体外诱导激活扩增的NK细胞进行冻存，比较冻存效果。
将实施例1体外诱导扩增第14天获得的NK细胞分别采用以下四种冻存液进行冻存，其中四种冻存液的成份如下：
冻存液1：5体积％的DMSO、1体积％的白蛋白、1体积％氨基乙醇、93体积％的X-VOVO15无血清培养基；
冻存液2：5体积％的DMSO、2体积％的白蛋白、2体积％氨基乙醇、91体积％的X-VOVO15无血清培养基；
冻存液3：5体积％的DMSO、2体积％的白蛋白、93体积％的X-VOVO15无血清培养基；
冻存液4：5体积％的DMSO、2体积％的氨基乙醇、93体积％的X-VOVO15无血清培养基；
冻存液5：5体积％的DMSO、95体积％的X-VOVO15无血清培养基；
冻存液6：5体积％的DMSO、10体积％自体血浆、85体积％X-VOVO15无血清培养基；
冻存液7：10体积％的DMSO、2体积％的白蛋白、2体积％氨基乙醇、86体积％的X-VOVO15无血清培养基。
按照以下步骤冻存NK细胞：将冷冻保存液与细胞混匀后，速移入冻存管，并放入冻存盒中，-70℃程序降温过夜，次日转入液氮内。其中，每107个NK细胞采用1ml冻存液。冷冻保存NK细胞60天，然后进行复苏。检测冻存前后细胞的存活率，以及复苏后细胞回收率。具体地，冻存前以及冻存并复苏后的细胞存活率计算方法为：【活细胞数/(活细胞数+死细胞数)】×100％。复苏后细胞回收率的计算方法为：(复苏后活细胞数/冻存时活细胞数)×100％。
复苏NK细胞检查结果：
表2.不同冻存液冻存复苏效果比较
细胞活率（%） 细胞得率（%）
冻存液1 97.12 95.99
冻存液2 98.32 96.46
冻存液3 93.21 91.57
冻存液4 94.63 92.49
冻存液5 85.22 81.17
冻存液6 86.33 82.31
冻存液7 93.23 91.62
如表2所示，复苏后细胞存活率均低于冻存前。具体地，冻存液1和2保存的细胞活率和细胞得率明显优于冻存液3和4，冻存液1和2之间未见差别，冻存液3和4之间未见差别，表明添加1-2体积％白蛋白和1-2体积％氨基乙醇对NK细胞具有较好的保护作用。冻存液1保存的细胞活率和细胞得率明显优于冻存液7，表明5%DMSO浓度是最适浓度，增加DMSO浓度将增加DMSO的细胞毒性作用，反而不能提高NK细胞活率和细胞得率。冻存液5和冻存液6细胞活率和细胞得率差别不大，且其活率显著低于冻存液1和冻存液2，说明添加自体血浆不能提高细胞得率和细胞活率。综上，本发明的免疫细胞专用冻存液（即冻存液1和冻存液2）细胞活率和细胞得率显著高于其他类型冻存液。
实施例3
利用本发明实施例的免疫细胞的培养、诱导、激活方法，将分离的单个核细胞诱导扩增为免疫细胞，按ABO/RH分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的免疫细胞信息档案，构建免疫细胞库。
1.供体筛选
医院以询问和填表方式征询供体个人信息、过往治疗史、家族遗传史，以及是否有传染病史及造血或免疫系统的异常情况等信息。医院须与供体签署知情同意书取得供体本人或其授权人员的同意，查阅其体检资料，获得体检信息。供体体检信息应包括如下项目：HIV-1/2抗体、HBsAg、抗-HCV、CMV-IgM抗体、ALT、梅毒螺旋体抗体。个人信息采集表、知情同意书、检查信息等需编号密封保存，建立可供检索的免疫供体档案信息库。
2.采集外周血，分离外周血血浆和单个核细胞
2.1用加入抗凝剂的无菌采血袋采集人外周血约100ml，预留5ml外周血做快检（HIV-1/2抗体、HBsAg、抗-HCV、CMV-IgM抗体、梅毒螺旋体抗体）和ABO/RH分型、HLA分型鉴定，采血袋立即无菌封装，无菌4℃保存运输，准确记录采集信息。快检筛选合格后将外周血送入GMP实验室，若快检不合格，血样废弃处理。
2.2在GMP实验室中取出血袋，酒精消毒采血袋，观察无凝血和溶血后在超净台中打开血袋，将血液转移到至50ml无菌离心管中(≤45ml/管)，2500rpm离心10min。
2.3转移上层血浆到另一离无菌离心管中，3500rpm离心10min，收集上清血浆到新的无菌离心管中，用口膜密封离心管口，血细胞用于分离单个核细胞。
2.4将步骤2中的血细胞沉淀用血浆等体积的生理盐水重悬后转移到250ml无菌玻璃瓶中，加入血液总体积1/3量的羟乙基淀粉，轻轻晃动盐水瓶使混合均匀，静置使红细胞沉降。
2.5待红细胞层沉降分层后，将上层乳白色悬液轻轻吸取到无菌离心管，1800rpm离心5min，弃去上清，沉淀用10ml生理盐水重悬。
2.6取无菌15ml离心管2支，各加入5ml常温人外周血淋巴细胞分离液，分别在上层轻轻加入各5ml细胞悬液。室温2000rpm慢升慢降离心25min。
2.7轻轻取出离心管，小心吸取界面中间云雾层白细胞至新的15ml离心管中，补加生理盐水洗涤2次。
2.8 1ml生理盐水重悬细胞，取5μl细胞加入到245μl生理盐水中稀释50倍，计数，并用台盼蓝染色计细胞存活率。
2.9单个核细胞细胞接种到加有20ml培养基的培养瓶中，培养基配比为免疫细胞专用扩增培养基,即添加了1500IU/ml IL-2、1500IU/ml IL-10、0.7ng/ml IL-1α和2.5ng/ml LIF、1.5ng/ml EPO、2.5ng/ml KGF、3.5ng/ml睾酮、2.5μg/ml甲状旁腺激素、2.5μg/ml层粘连蛋白的X-VOVO15无血清培养基，37℃，5％CO2无菌培养，记为第0天。每日观察细胞，根据培养基的颜色，每2-3天换液传代一次。
2.10换液2次以后，当培养体系已经达到2L时，更换培养体系为免疫细胞专用诱导培养基，即添加了1500IU/ml IL-2、1500IU/ml IL-10、2.5ng/ml bFGF、2.5ng/ml BMP-4、0.5μg/ml雷帕霉素、0.5μg/ml淫羊藿苷、50ng/ml曲美替尼、2.5ng/ml氢化可的松、2.5μg/ml层粘连蛋白的X-VOVO15无血清培养基。每日观察细胞，根据培养基的颜色，每2-3天换液传代一次。
2.11继续再换液2次以后，更换培养体系为免疫细胞专用激活培养基，即添加了1500IU/ml IL-2、1500IU/ml IL-10、2.5ng/ml TGF-β、1.5ng/ml Forskolin、50ng/ml白藜芦醇、2.5μg/ml对乙酰氨基酚、2.5μg/ml层粘连蛋白的X-VOVO15无血清培养基。每日观察细胞，每2天换液传代一次。
2.12按5体积％的DMSO、2体积％的白蛋白、2体积％氨基乙醇、91体积％的X-VOVO15无血清培养基的比例配置免疫细胞专用冻存液。
2.13收集上述激活扩增的免疫细胞。将细胞悬液进行检测：支原体、内毒素、微生物和病毒五项。检测合格的免疫细胞，每107个免疫细胞采用1ml上述配置好的免疫细胞专用冻存液，进行冻存操作，按ABO/RH分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的免疫细胞信息档案，构建免疫细胞库。

Claims (7)

1.一种免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立，其特征在于，包括：利用免疫细胞专用扩增培养基将单个核细胞进行第一阶段扩增培养，得到初步扩增的免疫细胞；利用免疫细胞专用诱导培养基将初步扩增的免疫细胞进行第二阶段诱导和扩增培养，得到诱导的免疫细胞；利用免疫细胞专用激活培养基将诱导的免疫细胞进行第三阶段激活和扩增培养，获得大量的激活功能的免疫细胞；利用免疫细胞专用冻存液冻存免疫细胞，得到冻存的免疫细胞；按ABO/RH分型和HLA分型进行保存，建立可供检索的免疫细胞信息档案，建免疫细胞库。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞专用扩增培养基是添加了500-2000IU/ml IL-2、500-2000IU/ml IL-10、0.5-1ng/ml IL-1α和1-4ng/ml LIF、0.5-2.5ng/ml EPO、1-4ng/ml KGF、2-5ng/ml睾酮、1-4μg/ml甲状旁腺激素、1-4μg/ml层粘连蛋白的无血清淋巴细胞培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞专用诱导培养基是添加了500-2000IU/ml IL-2、500-2000IU/ml IL-10、1-4ng/ml bFGF、1-4ng/ml BMP-4、0.2-0.8μg/ml雷帕霉素、0.2-0.8μg/ml淫羊藿苷、20-80ng/ml曲美替尼、1-4ng/ml氢化可的松、1-4μg/ml层粘连蛋白的无血清淋巴细胞培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞专用激活培养基是添加了500-2000IU/ml IL-2、500-2000IU/ml IL-10、1-4ng/ml TGF-β、1-2ng/ml Forskolin、20-80ng/ml白藜芦醇、1-4μg/ml对乙酰氨基酚、1-4μg/ml层粘连蛋白的无血清淋巴细胞培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞专用冻存液是包含5体积％的DMSO、1-2体积％的白蛋白、1-2体积％氨基乙醇、91-93体积％的无血清淋巴细胞培养基。
6.根据权利要求2、3、4、5所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞专用扩增培养基、免疫细胞专用诱导培养基、免疫细胞专用激活培养基和免疫细胞专用冻存液中，所述的无血清淋巴细胞培养基为X-VOVO15无血清培养基或市售其他类型无血清培养基。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞为自然杀伤细胞。
CN202010371435.2A 2020-05-06 2020-05-06 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立 Active CN111454903B (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010371435.2A CN111454903B (zh) 2020-05-06 2020-05-06 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立
PCT/CN2020/092287 WO2021223274A1 (zh) 2020-05-06 2020-05-26 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立
JP2022507332A JP7332787B2 (ja) 2020-05-06 2020-05-26 免疫細胞のインビトロ培養、誘導、活性化、凍結保存方法及びその細胞バンクの作成
EP20934683.2A EP4148123A4 (en) 2020-05-06 2020-05-26 METHOD FOR IN VITRO CULTURE, INDUCTION, ACTIVATION AND CRYOPRESERVATION AND ESTABLISHMENT OF CELL BANK FOR IMMUNE CELLS
US17/634,556 US12376584B2 (en) 2020-05-06 2020-05-26 In-vitro culture, induction, activation and cryopreservation method and cell bank establishment for immune cells
KR1020227004434A KR20230008691A (ko) 2020-05-06 2020-05-26 면역세포의 생체외 배양, 유도, 활성화, 동결보존 방법 및 그 세포 은행의 구축

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010371435.2A CN111454903B (zh) 2020-05-06 2020-05-06 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111454903A true CN111454903A (zh) 2020-07-28
CN111454903B CN111454903B (zh) 2023-10-20

Family

ID=71677026

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010371435.2A Active CN111454903B (zh) 2020-05-06 2020-05-06 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立

Country Status (6)

Country Link
US (1) US12376584B2 (zh)
EP (1) EP4148123A4 (zh)
JP (1) JP7332787B2 (zh)
KR (1) KR20230008691A (zh)
CN (1) CN111454903B (zh)
WO (1) WO2021223274A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114181901A (zh) * 2021-12-08 2022-03-15 杭州中赢生物医疗科技有限公司 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法
CN114791411A (zh) * 2022-04-21 2022-07-26 广州先康达生物科技有限公司 评估人体免疫功能的指标组合、试剂盒和方法
CN116751745A (zh) * 2023-08-09 2023-09-15 北京圣美细胞生命科学工程研究院有限公司 一种组合免疫细胞外泌体多肽再生因子及其应用
CN117178980A (zh) * 2023-09-08 2023-12-08 苏州依科赛生物科技股份有限公司 一种免疫细胞低温冻存液及其应用
CN118415162A (zh) * 2024-07-05 2024-08-02 吉林省敬博生物技术有限公司 一种nk细胞运输储存液及其制备方法和应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115088708B (zh) * 2022-07-22 2023-05-05 厦门锐杰天川生物科技有限公司 外周血单个核细胞长期保存方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005003335A2 (en) * 2003-06-12 2005-01-13 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Rapamycin resistant t cells and therapeutic uses thereof
WO2016122014A1 (ko) * 2015-01-27 2016-08-04 한국생명공학연구원 자연살해세포의 대량생산 방법 및 상기 방법으로 수득된 자연살해세포의 항암제로서의 용도
CN106591233A (zh) * 2016-12-28 2017-04-26 广州沙艾生物科技有限公司 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法
CN106701681A (zh) * 2016-12-28 2017-05-24 广州沙艾生物科技有限公司 一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6541249B2 (en) * 1999-12-22 2003-04-01 Human Genome Sciences, Inc. Immortalized human stromal cell lines
JP2010501173A (ja) * 2006-08-23 2010-01-21 バイネックス カンパニー リミテッド 免疫治療用活性化リンパ球の製造方法
JP5856025B2 (ja) * 2012-08-02 2016-02-09 阿部　博幸 単球またはｎｋ細胞を入手する方法
CN105524880A (zh) * 2016-01-27 2016-04-27 上海润泉生物技术有限公司 一种免疫细胞库的构建方法
CN106701679B (zh) 2016-12-26 2018-03-16 浙江丹晖生物科技有限公司 Nk细胞体外扩增培养基组合和培养方法
EP3654986A2 (en) * 2017-07-19 2020-05-27 Fate Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immune cell modulation in adoptive immunotherapies
CN108812645A (zh) * 2018-07-20 2018-11-16 吉林济惠生物科技有限公司 一种人脐带间充质干细胞的细胞冻存液
CN108865989A (zh) * 2018-07-23 2018-11-23 吉林济惠生物科技有限公司 一种脐带间充质干细胞的培养基
CN110079499A (zh) * 2019-05-07 2019-08-02 青岛大学附属医院 Nk细胞的分离培养及保存入库的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005003335A2 (en) * 2003-06-12 2005-01-13 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Rapamycin resistant t cells and therapeutic uses thereof
WO2016122014A1 (ko) * 2015-01-27 2016-08-04 한국생명공학연구원 자연살해세포의 대량생산 방법 및 상기 방법으로 수득된 자연살해세포의 항암제로서의 용도
CN106591233A (zh) * 2016-12-28 2017-04-26 广州沙艾生物科技有限公司 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法
CN106701681A (zh) * 2016-12-28 2017-05-24 广州沙艾生物科技有限公司 一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张炳强: "丹参素联合生长因子体外诱导人脐血间充质干细胞分化为神经细胞的研究" *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114181901A (zh) * 2021-12-08 2022-03-15 杭州中赢生物医疗科技有限公司 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法
CN114181901B (zh) * 2021-12-08 2024-02-02 杭州中赢生物医疗科技有限公司 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法
CN114791411A (zh) * 2022-04-21 2022-07-26 广州先康达生物科技有限公司 评估人体免疫功能的指标组合、试剂盒和方法
CN116751745A (zh) * 2023-08-09 2023-09-15 北京圣美细胞生命科学工程研究院有限公司 一种组合免疫细胞外泌体多肽再生因子及其应用
CN117178980A (zh) * 2023-09-08 2023-12-08 苏州依科赛生物科技股份有限公司 一种免疫细胞低温冻存液及其应用
CN117178980B (zh) * 2023-09-08 2024-04-16 苏州依科赛生物科技股份有限公司 一种免疫细胞低温冻存液及其应用
CN118415162A (zh) * 2024-07-05 2024-08-02 吉林省敬博生物技术有限公司 一种nk细胞运输储存液及其制备方法和应用
CN118415162B (zh) * 2024-07-05 2025-02-28 吉林省敬博生物技术有限公司 一种nk细胞运输储存液及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US12376584B2 (en) 2025-08-05
KR20230008691A (ko) 2023-01-16
JP7332787B2 (ja) 2023-08-23
JP2022550246A (ja) 2022-12-01
CN111454903B (zh) 2023-10-20
US20230051425A1 (en) 2023-02-16
EP4148123A4 (en) 2024-06-12
EP4148123A1 (en) 2023-03-15
WO2021223274A1 (zh) 2021-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111454903B (zh) 免疫细胞体外培养、诱导、激活、冻存方法及其细胞库建立
CN106701681B (zh) 一种免疫细胞的体外诱导扩增、冻存和复苏的方法
JP7390473B2 (ja) 間葉系幹細胞のインビトロスクリーニング、活性化、増幅、凍結保存及びその細胞バンクの作成方法
CN106591233B (zh) 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法
US20240197848A1 (en) Therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 in children, application of the cell sorter and the method of multiplying treg cells to produce therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1
CN108251365B (zh) 免疫细胞培养基体系
CN103597072A (zh) 单核细胞增殖剂、单核细胞增殖用培养基、单核细胞的制造方法、树突状细胞的制造方法、及树突状细胞疫苗的制造方法
CN104204195B (zh) 以记忆t细胞为主要成分的淋巴细胞群的制造方法
CN104498434B (zh) 一种大量树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞
US20080014174A1 (en) Method for treating tumors, infectious diseases, and autoimmune diseases with an activated HLA matching donor-originating lymphocyte
CN114085812A (zh) 一种高表达cd106和/或cd142表达降低的间充质干细胞群、其制备方法及应用
Erdmann et al. Automated closed-system manufacturing of human monocyte-derived dendritic cells for cancer immunotherapy
CN106754704B (zh) 免疫细胞体外诱导扩增的方法
CN116445406A (zh) 一种脐带血来源nk细胞的体外简易培养体系和培养方法
CN110747167B (zh) 一种半合子bak细胞的制备方法及其应用
CN103602634B (zh) Dc细胞的制备方法及其在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用
JP7534800B2 (ja) 同種組成物
CN110857435B (zh) 用于培养从脐血中分离的免疫细胞的培养基及其培养方法
CN111154721B (zh) Nk细胞扩增方法
CN114657124A (zh) 一种对肿瘤细胞具有高杀伤能力的复合型免疫细胞制备方法
CN112111453A (zh) 一种免疫细胞培养体系优化方法及活性检测方法
CN110656084B (zh) Bak细胞及其制备试剂盒和制备方法
CN114196629A (zh) 一种高效培养nkt细胞的试剂及其应用和nkt细胞的培养方法
CN105200010B (zh) 艾滋病感染者hla-a2特异性ctl细胞的体外培养方法及其专用培养基
CN119307448A (zh) 一种诱导扩增中央记忆性t细胞的培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: Methods for in vitro culture, induction, activation, and cryopreservation of immune cells and establishment of cell banks

Granted publication date: 20231020

Pledgee: Weihai commercial bank Limited by Share Ltd. Qingdao branch

Pledgor: QINGDAO RESTORE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980009380