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CN111435130A - 用于临床癌症评估的srm和dia测定法 - Google Patents

用于临床癌症评估的srm和dia测定法 Download PDF

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CN111435130A
CN111435130A CN202010024974.9A CN202010024974A CN111435130A CN 111435130 A CN111435130 A CN 111435130A CN 202010024974 A CN202010024974 A CN 202010024974A CN 111435130 A CN111435130 A CN 111435130A
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CN
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peptides
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托德·A·哈姆布拉夫
法比奥拉·切基
K·M·斯科特
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Nantomics LLC
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Abstract

本发明提供了定量福尔马林固定组织/细胞的生物样品中的CBL、FPGS、HSP90A、HSP90B、INSR、MCL1和/或TrkA蛋白的方法。定量可以通过使用质谱测定法定量蛋白质消化物中来源于蛋白质的一种或多种片段肽的含量来进行。

Description

用于临床癌症评估的SRM和DIA测定法
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求在2019年1月11日提交的美国临时专利申请第62/791,495号的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明提供了定量福尔马林固定组织/细胞的生物样品中的CBL、FPGS、HSP90A、HSP90B、INSR、MCL1和/或TrkA蛋白的方法。定量可以通过使用质谱测定法定量蛋白质消化物中来源于蛋白质的一种或多种片段肽的含量来进行。
背景技术
通过定量从每个全长蛋白的子序列源的特定肽，测定患者肿瘤组织中选自CBL、FPGS、HSP90A、HSP90B、INSR、MCL1和TrkA的一种或多种蛋白的蛋白表达水平。使用基于质谱的选择反应监测(SRM)(也称为多重反应监测(MRM)(本发明称为SRM测定))或通过数据无关采集(Data Independent Acquisition)(DIA)检测每种肽。SRM测定用于直接在获自癌症患者组织的细胞中，例如福尔马林固定的癌症组织中检测特定片段肽的存在并定量测量其含量。
用于开发单个蛋白质的单一SRM/MRM测定的候选肽理论上可以是由完全蛋白酶消化，例如用胰蛋白酶消化完整全长蛋白质而产生的任何单个肽。然而，令人惊讶的是，许多肽不适合用于任何给定蛋白质的可靠检测和定量——实际上，对于一些蛋白质，尚未发现合适的肽。因此，不可能预测对于给定的蛋白质，哪个肽是通过SRM/MRM测定最有利的，因此必须凭经验发现和确定关于每种肽的具体定义的测定特征。当鉴定用于在蛋白质裂解物如来自福尔马林固定的石蜡包埋的组织的液体裂解物中分析的最佳SRM/MRM肽时，尤其如此。本发明所述的SRM/MRM测定对每种蛋白质指定一种或多种蛋白酶消化的肽(胰蛋白酶消化的肽)，由此发现每种肽是SRM/MRM测定的有利肽，特别是从福尔马林固定的患者组织制备的肽。所述肽还可用于数据无关采集(DIA)分析，以相对定量检测表达。
定量是相对的或绝对的。当需要绝对定量时，将每种肽的测量水平与已知量的具有与测量的肽相同的氨基酸序列的标记的参照肽进行比较。所述肽对于特定蛋白质是独特的，因此一个肽分子来源于一个蛋白质分子，因此肽的定量水平允许定量肽所来源于的完整蛋白质。蛋白质表达的测量可以用于癌症的诊断、癌症的分期、癌症进展的预后、预测对各种癌症治疗和疗法的临床反应的可能性等。
发明内容
提供了SRM/MRM和DIA测定，其可用于检测和定量直接从癌症患者肿瘤组织制备的蛋白质组裂解物中特定蛋白质的水平。这些蛋白质可用于通知癌症治疗的选择并作为治疗方案的一部分。本发明所述的SRM/MRM和DIA测定可用于直接在患者肿瘤组织中开发肿瘤细胞的个性化分子谱。一旦确定了这些蛋白质的表达状态，就可以给患者施用特定的治疗剂，由此这些试剂可以与通过本发明所述的测定检测和测量的蛋白质相互作用，并且抑制或增强这些蛋白质杀伤肿瘤细胞的功能。此外，可将诱导癌症患者自身免疫系统以杀死患者自身肿瘤细胞的治疗剂作为该治疗方案的一部分施用给癌症患者。特异性靶向肿瘤相关蛋白的治疗剂和免疫系统导向的治疗剂都可以直接与癌症患者的分子谱匹配，如通过本发明所述确定的，提供了靶向和基于免疫的癌症治疗的个性化策略。
提供了直接在患者组织中检测和/或定量来自一种或多种蛋白质的特定片段肽的方法。所述一种或多种蛋白质选自CBL、FPGS、HSP90A、HSP90B、INSR、MCL1和TrkA。提供了改进的治疗方法，其中向获得生物样品的患者或受试者施用治疗有效量的癌症治疗剂，其中癌症治疗剂和/或癌症治疗剂的施用量基于一种或多种蛋白质的任何一种或多种(多重)片段肽的检测和/或含量，其中癌症治疗剂是免疫调节癌症治疗剂，其功能是启动、增强、操纵和/或以其他方式调节患者对攻击和杀死患者中肿瘤细胞的免疫应答。片段肽可以是，例如，SEQ ID NO1-7所示的肽。
具体地，提供了用于检测和测量人生物样品(例如福尔马林固定的组织样品)中的一种或多种蛋白质中的一种或多种的水平的方法，其中所述方法包括通过质谱分析检测和定量从生物样品制备的蛋白质消化物中的一种或多种蛋白质片段肽的含量，并计算样品中的一种或多种蛋白质的水平，其中所述量是相对量或绝对量。在通过例如液相色谱、纳米反相液相色谱、高效液相色谱法和/或反相高效液相色谱法检测和/或定量一种或多种片段肽的含量之前，可以将蛋白质消化物分级。蛋白质消化物可以含有蛋白酶消化物，例如胰蛋白酶消化物。蛋白质消化物最好可通过液体组织方案(Liquid
Figure BDA0002362125460000031
protocol)制备。
质谱分析方法可以包括串联质谱分析、离子阱质谱分析、三重四极杆质谱分析、轨道阱质谱分析、混合离子阱/四极杆质谱分析、MALDI-TOF质谱分析、MALDI质谱分析和/或飞行时间质谱分析。用于测定一种或多种蛋白质的绝对量的质谱分析模式可以是，例如，选择反应监测(SRM)、多重反应监测(MRM)、智能选择反应监测(iSRM)、平行反应监测(PRM)和/或多重选择反应监测(mSRM)。质谱分析的方法可以是数据无关采集方法。被测量的蛋白质片段肽可以是例如SEQ ID NO：1-7中列出的一种或多种肽。
用于制备消化物的组织可以是石蜡包埋的组织，并且可以从肿瘤获得，例如原发性肿瘤或继发性肿瘤。
一种定量一种或多种蛋白质的方法包括将一个生物样品中的片段肽的含量与不同且单独的生物样品中的相同片段肽的含量进行比较。定量一种或多种蛋白质的进一步方法包括将生物样品中片段肽的含量与相同生物样品中来自其它和不同蛋白质的其它和不同片段肽进行比较。定量一种或多种蛋白质的进一步方法包括通过与具有相同氨基酸序列的已知量的添加的内标肽比较来确定生物样品中片段肽的含量。内标肽可以是同位素标记的肽，其可包括一种或多种选自18O、17O、34S、15N、13C、2H或其组合的重稳定同位素。
在这些方法中，检测和定量蛋白质消化物中的至少一种蛋白质片段肽表明患者或受试者中存在相应的蛋白质并且与癌症相关。所述方法可进一步包括将检测和定量一种或多种片段肽的结果或相应蛋白质的含量与癌症的诊断组织学/阶段/等级/状况相关联。将检测和定量至少一种片段肽的结果与癌症的诊断组织学/分期/分级/状况相关联可以与以多重形式检测和/或定量其它蛋白质或来自其它蛋白质的片段肽的含量组合，以提供关于癌症的诊断组织学/分期/分级/状况的额外信息。
具体实施方式
提供了用于测量患者组织(例如福尔马林固定组织)中的蛋白质CBL、FPGS、HSP90A、HSP90B、INSR、MCL1和TrkA的方法。每种蛋白质的测量水平，单独或组合，可以用作诊断工具作为改进的癌症治疗方法的一部分。例如，一种或多种蛋白质的水平可以与从其获取样品的受试者中癌症的诊断阶段/等级/状态相关。相关性也可与以多重形式检测和/或定量其它蛋白质或来自其它蛋白质的肽的含量结合，以提供用于受试者的改进的癌症治疗方法。
测定的蛋白质
CBL(也称为FRA11B、NSLL和RNF55)是参与细胞信号传导和蛋白质泛素化的E3泛素-蛋白质连接酶(E3 ubiquitin-protein ligase)。CBL作为E3连接酶起作用，因此能够催化泛素及其蛋白质底物(通常是受体酪氨酸激酶)之间共价键的形成。CBL作为许多信号传导途径的负调节因子起作用，所述信号传导途径由细胞表面受体的激活触发并识别激活的受体酪氨酸激酶，包括KIT、FLT1、FGFR2、PDGFRA、PDGFRB、EGFR、CSF1R、EPHA8和KDR，导致细胞信号传导的终止。CBL识别膜结合的HCK、SRC和SRC家族的其它激酶，并介导它们的泛素化(ubiquitination)和降解。CBL参与造血细胞中的信号转导，并在成骨细胞分化和凋亡的调节中起重要作用，所述成骨细胞分化和凋亡是破骨细胞性骨吸收(osteoclastic boneresorption)所必需的。
FPGS(也称为多聚-γ-谷氨酸合成酶(Folylpoly-gamma-glutamate synthetase)和多聚谷氨酸合成酶(Folylpolyglutamate synthase))是催化叶酸盐转化成聚谷氨酸衍生物的蛋白质，其允许细胞中叶酸化合物的浓缩和这些辅因子的细胞内保留，所述辅因子是大多数叶酸依赖性酶(folate-dependent enzymes)的重要底物，所述叶酸依赖性酶参与嘌呤、嘧啶和氨基酸合成中涉及的一碳转移反应。未取代的还原叶酸盐是优选的底物。FPGS还在氨甲喋呤(MTX)代谢为聚谷氨酸中起作用。
热休克蛋白90A(HSP90A)和热休克蛋白90B(HSP90B)是具有相同功能的几乎相同的蛋白，作为辅助其它蛋白适当折叠、稳定蛋白对抗热应激和帮助蛋白降解的伴侣蛋白。这些蛋白也稳定了肿瘤生长所需的许多其它蛋白，这就是为什么HSP90A和HSP90B的抑制剂已经被研究作为抗癌药物的原因。热休克蛋白，作为一类，是所有物种中表达最高的细胞蛋白，并且通常在受高温应激时起保护细胞的作用，在无应激细胞中占总蛋白的1-2％。然而，当加热细胞时，热休克蛋白的比例增加至细胞蛋白的4-6％。HSP90A蛋白具有2种同工型，二者均在细胞质中发现。HSP90 AA的表达是可诱导的，而HSP90AB是结构型表达(constitutively expressed)的。HSP90B蛋白仅具有一种形式，并且位于内质网中。药物靶向热休克蛋白90A和热休克蛋白90B在临床试验中显示出良好的效果。HSP90B也被鉴定为与导致卵巢衰竭并由此导致不育的人卵巢自身免疫疾病有关的自身抗原生物标志物和靶标之一。
INSR(也称为胰岛素受体，IR)是一种跨膜受体，它被胰岛素、IGF-I、IGF-II激活，属于酪氨酸激酶受体的大类。在代谢上，胰岛素受体在葡萄糖稳态的调节中起关键作用，葡萄糖稳态是在退化条件下可导致一系列临床表现包括糖尿病和癌症的功能过程。胰岛素受体由单一基因INSR编码，转录过程中交替剪接(alternate splicing)产生IR-A或IR-B同种型。任一同工型的下游翻译后事件导致蛋白水解切割的α和β亚基的形成，其在结合后最终能够同聚或异源二聚化(homo or hetero-dimerization)产生约320kDa二硫键连接的跨膜胰岛素受体。
MCL1(也称为骨髓细胞白血病1(myeloid cell leukemia 1)，BCL2家族凋亡调节剂，和BCL2家族凋亡调节剂)是Bcl-2蛋白家族中的蛋白。已经鉴定了MCL1的两种不同的同工型。较长的基因产物产生该蛋白质的较长形式(同工型1)，其通过抑制凋亡而增强细胞存活，而交替剪接的较短基因产物(同工型2)促进凋亡并且诱导死亡。
TrkA(也称为原肌球蛋白受体激酶A(Tropomyosin receptor kinase A))是酪氨酸激酶的Trk受体家族的成员，其调节哺乳动物神经系统中的突触强度和可塑性。Trk受体通过若干信号级联影响神经元存活和分化。然而，这些受体的活化对神经元的功能特性也具有显著影响。通过神经营养因子(neurotrophin)结合激活Trk受体可以导致信号级联的激活，从而促进细胞的存活和其它功能调节。TrkA对神经生长因子(nerve growth factor)(NGF)的结合具有最高亲和力。NGF在局部和核作用中都是重要的，调节生长锥、运动性和编码神经递质酶的生物合成的基因的表达。TrkA响应配体结合而二聚化，其它酪氨酸激酶受体也是如此。这些二聚体相互磷酸化并增强通过激活不同的信号级联而影响神经元生长和分化的激酶的催化活性。三种已知的途径是PLC、Ras/MAPK(促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase))和PI3K(磷脂酰肌醇3-激酶)途径。这些途径涉及核细胞和线粒体细胞死亡程序的拦截，最终导致转录因子CREB(cAMP应答元件结合)的活化，其又活化促进肿瘤发生的特定基因。
这些蛋白中的每一种在目前的临床实践或临床开发中是癌症治疗剂的靶标，并且因此，测定这些蛋白中的每一种在患者肿瘤细胞中的表达水平可以用作做出关于癌症治疗剂的决定的过程的一部分。
测定方法
下面的方法提供了定量的基于蛋白质组学的测定，其可用于定量来自癌症患者的福尔马林固定的组织中的每种测量的蛋白质。例如，来自测定的数据可用于作出改进的癌症治疗的治疗决定。
如下面更详细描述地，蛋白质可以通过SRM分析或通过DIA方法测量。SRM分析可用于测量来自每种测量的蛋白质的特异性肽的相对或绝对定量水平，而DIA仅可测量蛋白质的相对水平。这两种测定都提供了通过质谱分析测量从生物样品获得的给定蛋白质制剂中的每种蛋白质的含量的手段。更具体地说，所述测定可以直接在复杂的蛋白质裂解物样品中测量这些肽，所述样品是从患者组织样品(例如福尔马林固定的癌症患者组织)获得的细胞制备的。从福尔马林固定的组织制备蛋白质样品的方法描述于美国专利号7,473,532中，其内容通过引用整体并入本发明。美国专利号7,473,532中描述的方法可以方便地使用液体试剂和从Expression Pathology公司(Rockville，MD)获得的方案来进行。
福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPE)是来自癌症患者的最广泛和最有利的组织形式，包括肿瘤组织。外科手术切除组织的甲醛/福尔马林固定是迄今为止世界范围内最常见的保存癌症组织样品的方法，并且是标准病理学实践中公认的惯例。甲醛水溶液被称为福尔马林。“100％”福尔马林由在水中的饱和甲醛溶液(约40体积％或37质量％)和少量限制氧化和聚合度的稳定剂(通常为甲醇)组成。保存组织的最常见方式是将整个组织在甲醛水溶液(通常称为10％中性缓冲福尔马林)中浸泡一段时间(8小时至48小时)，然后将固定的整个组织包埋在石蜡中，并在室温下长期储存。分析福尔马林固定的癌组织的分子分析方法可能是用于分析癌症患者组织的最被接受和最常用的方法。
SRM或DIA测定的结果可用于关联收集和保存组织(生物样品)的患者或受试者的特定组织样品(如癌症组织样品)中每种特定蛋白质的准确和精确定量水平。这不仅提供了关于癌症的诊断信息，而且允许医师或其他医学专业人员确定对患者的适当治疗。这种提供关于患病组织或其它患者样品中蛋白质表达水平的诊断和治疗重要信息的测定称为伴侣诊断测定(companion diagnostic assay)。例如，这种测定可设计用于诊断癌症的阶段或程度，并确定患者最可能响应的治疗剂。
本发明所述的测定测量来自指定蛋白质的特定未修饰的肽的相对或绝对水平，并且还可以测量来自指定蛋白质中的每一种的特定修饰的肽的绝对或相对水平。修饰的实例包括存在于肽上的磷酸化氨基酸残基和糖基化氨基酸残基。
通过SRM或DIA方法测定每种蛋白质的相对定量水平。对于SRM测定，比较源自不同样品中的蛋白质的单个片段肽的SRM特征峰面积(例如，特征峰面积或积分片段离子强度(integrated fragment ion intensity))。或者，可以比较多个特征肽的多个SRM特征峰面积，其中每个肽具有其自己的特定SRM特征峰，以确定一个生物样品中的相对蛋白质含量与一个或多个附加的或不同的生物样品中的相同蛋白质的含量。这样，在相同的实验条件下，在2个或更多个生物样品中，来自目标蛋白质的特定肽的含量，以及因此指定蛋白质的含量，相对于相同的肽而确定。此外，通过SRM方法比较肽的特征峰面积与来自生物样品的相同蛋白质制剂中的来自一种或多种不同蛋白质的另一种和不同的肽的特征峰面积，可以确定来自单一样品中给定蛋白质的一种或多种给定肽的相对定量。这样，来自指定蛋白质的特定肽的量，以及该蛋白质的量，在同一样品中彼此相对确定。这些方法产生来自指定蛋白质的单个肽或多个肽到在样品之间和样品内所述另一个肽或多个肽的定量，由特征峰面积确定的量彼此相关，其中通过特征峰面积确定的含量是彼此相对的，而与来自生物样品的蛋白质制剂中的所选肽的绝对重量体积比或重量比重量的含量无关。将关于不同样品之间的个体特征峰面积的相对定量数据相对于每个样品分析的蛋白质的含量进行标准化。可以在单个样品中同时对来自多种蛋白质的许多肽和一种或多种指定蛋白质进行相对定量，和/或对许多样品进行相对定量，以深入了解相对蛋白质的含量，例如一种肽/蛋白质相对于其它肽/蛋白质的含量。
与SRM分析不同，DIA不需要预先选择靶肽。相反，选择前体质量范围，且接着将所述范围划分成一系列隔离窗。质谱/质谱数据是从第一隔离窗口中所有检测到的前体离子获得的。对每个连续的相邻隔离窗口重复该操作，直到覆盖整个前驱体质量范围。质谱/质谱谱库用于从采集的数据中鉴定感兴趣的肽，如下文更详细描述的。
指定蛋白质的绝对定量水平通过例如SRM方法测定，其中将生物样品中来自指定蛋白质的单个肽的SRM特征峰面积与掺加的内标的SRM特征峰面积进行比较。在一个实施方案中，内标是源自指定蛋白质的相同精确肽的合成形式，所述指定蛋白质含有一个或多个用一种或多种重同位素标记的氨基酸残基。合成这种同位素标记的内标物，使得当通过质谱分析时，标准物产生可预测且一致的SRM特征峰，该特征峰不同于天然肽特征峰，并且可以用作比较峰。因此，当将内标物以已知量掺入来自生物样品的蛋白质制剂中并通过质谱分析时，将天然肽的SRM特征峰面积与内标肽的SRM特征峰面积比较，并且该数值比较指示来自生物样品的原始蛋白质制剂中存在的天然肽的绝对摩尔浓度和/或绝对重量。根据每个样品分析的蛋白质的含量显示片段肽的绝对定量数据。可以在单个样品中和/或在多个样品中同时对多个肽和蛋白质进行绝对定量，以深入了解单个生物样品和单个样品的整个群组中的绝对蛋白质含量。
本发明所述的测定方法可用于帮助诊断癌症阶段，例如，直接在患者来源的组织，如福尔马林固定的组织中，和帮助确定哪种治疗剂对于用于治疗该患者将是最有利的。分析通过手术(例如治疗性切除部分或整个肿瘤)或通过活组织检查程序(进行该程序以确定疑似疾病的存在与否)从患者体内切除的癌组织，以确定在该患者组织中是否存在一种或多种特定蛋白质以及何种形式的蛋白质。此外，可以测定一种蛋白质或多种蛋白质的表达水平，并与健康组织中发现的“正常”或参考水平进行比较。在健康组织中发现的正常或参考水平的蛋白质可以来源于例如一个或多个没有癌症的个体的相关组织。或者，通过分析未受癌症影响的相关组织，可获得癌症个体的正常或参考水平。
通过使用蛋白质水平，对一种、一些或所有指定蛋白质的蛋白质水平的测定也可用于诊断被诊断患有癌症的患者或受试者的癌症阶段。源自指定蛋白质的单个肽的绝对水平定义为通过SRM测定确定的肽的摩尔量/分析的蛋白质裂解物的总量。因此，通过将蛋白质(或来自蛋白质的片段肽)的水平与正常组织中观察到的水平相关联，关于指定的蛋白质的信息可用于帮助确定癌症的阶段或等级。一旦在癌细胞中确定了一种或多种指定蛋白质的定量，该信息可以与开发用于特异性治疗癌组织的治疗剂(化学和生物)列表相匹配，所述癌组织的特征在于例如所测定的蛋白质或蛋白质的异常表达。将来自蛋白质测定的信息与特异性靶向例如指定蛋白质或表达该蛋白质的细胞/组织的治疗剂列表进行匹配，定义了治疗疾病的所谓个性化医学方法(personalized medicine)。本发明所述的测定方法通过使用来自患者自身组织的蛋白质的分析作为诊断和治疗决定的来源而形成个体化医疗方法的基础。
原则上，任何从指定蛋白衍生的预测肽，例如通过用已知特异性的蛋白酶(例如胰蛋白酶)消化制备的，可以用作替代报道分子(surrogate reporter)，以使用基于质谱的SRM或DIA测定法确定样品中指定蛋白的丰度。类似地，在已知在指定蛋白中潜在被修饰的位点处含有氨基酸残基的任何预测肽序列也可潜在地用于测定样品中指定蛋白的修饰程度。
从指定蛋白衍生的合适片段肽可通过多种方法产生，包括通过使用美国专利7,473,532中提供的液体组织方案。液体组织方案和试剂能够通过蛋白质III的蛋白水解消化从福尔马林固定的石蜡包埋的组织/生物样品产生适于质谱分析的肽样品。在液体组织方案中，组织/生物在缓冲液中加热延长的时间段(例如，从约80℃至约100℃持续从约10分钟至约4小时的时间段)以逆转或释放蛋白质交联。所用的缓冲液是中性缓冲液(例如，基于Tris的缓冲液，或含有去污剂的缓冲液)。热处理后，用一种或多种蛋白酶处理组织/生物样品，所述蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和内切蛋白酶Lys-C，处理时间足以破坏所述生物样品的组织和细胞结构。加热和蛋白水解的结果是液体、可溶的、可稀释的生物分子裂解物。
令人惊讶地，发现来自上述蛋白质的许多潜在肽序列用于基于质谱的测定时不适合或无效，原因尚不明显。由于不可能预测最适于分析的肽，因此有必要在实际的液体组织裂解物中实验性地鉴定修饰的和未修饰的肽，以开发对每种指定蛋白质的可靠和准确的分析。虽然不希望受任何理论的束缚，但据信一些肽可能例如难以通过质谱法检测，因为它们不能很好地电离或产生不同于其它蛋白质的片段。肽在分离(例如液相色谱)中也可能不能很好地溶解，或者可能粘附到玻璃或塑料器皿上。
表1中发现的肽是通过在从福尔马林固定的癌组织获得的细胞制备的复合液体裂解液中蛋白酶消化所有蛋白质而从各自指定的蛋白质衍生的。除非另有说明，在每种情况下蛋白酶是胰蛋白酶。然后通过质谱分析液体组织裂解液，以确定那些通过质谱检测和分析的来源于指定蛋白质的肽。鉴定用于质谱分析的肽法特定优选子集是基于；1)在液体组织裂解物质谱分析中，对从蛋白质中电离出的一种或多种肽的实验测定，和2)肽在用于制备液体组织裂解物的方案和实验条件下存活的能力。后一种特性不仅延伸到肽的氨基酸序列，还延伸到肽中修饰的氨基酸残基在样品制备过程中以修饰形式存活的能力。
使用液体组织试剂和方案制备从福尔马林(甲醛)固定的组织直接获得的细胞的蛋白质裂解物，所述方案需要通过组织显微解剖将细胞收集到样品管中，然后在液体缓冲液中加热细胞持续延长的时间段。一旦福尔马林诱导的交联受到负面影响，然后使用蛋白酶以可预测的方式消化组织/细胞至完全，所述蛋白酶例如包括但不限于蛋白酶胰蛋白酶。通过用蛋白酶消化完整多肽，将每种蛋白质裂解物还原成肽的集合。分析(例如，通过离子阱质谱分析)每种液体裂解液以进行肽的多个全局蛋白质组研究，其中数据表示为从每个蛋白质裂解物中存在的所有细胞蛋白质中鉴定的尽可能多的肽。通常使用离子阱质谱仪或能够进行全局性分析以从单一复杂蛋白质/肽裂解物中识别尽可能多的肽的其它形式的质谱仪。然而，离子阱质谱仪可能是用于进行肽的全局谱分析(global profiling)的最好类型的质谱仪。
尽管SRM分析可以在任何类型的质谱仪上开发和执行，包括MALDI、离子阱或三重四极杆，但是用于SRM分析的最有利的仪器平台通常被认为是三重四极杆仪器平台。一旦在所采用的条件下，在单个裂解物的单个质谱分析中鉴定出尽可能多的肽，然后就整理核对肽列表并用于确定在该裂解物中检测到的蛋白质。对多个液体组织裂解物重复该过程，并将非常大的肽列表整理成单个数据集。这种类型的数据集可以被认为代表可以在所分析的生物样品类型中(蛋白酶消化后)检测到的肽，特别是在生物样品的液体组织裂解物中，因此包括每个指定蛋白质的肽。
一种新兴的方法，称为数据无关采集(DIA)，利用全局蛋白质组学和靶向方法两者的力量，通过将SRM的再现性与在全局鸟枪蛋白质组学分析中鉴定的大量蛋白质/肽组合。DIA方法通常避免在分析期间检测个别前体离子的需要，因为MS/MS扫描在整个采集过程中被系统地(独立地而无前体信息)收集。多种DIA格式正在使用和/或当前正在开发，并且以下任意一种都可以应用在本发明所述的方法中。
与DDA或SRM实验相比，DIA的数据生成更灵活和简单。DIA采集所有MS/MS扫描，而不考虑从调查扫描或全MS扫描中选择前体离子，这是DDA必需的。SRM/PRM需要的靶片段肽的预定义对于DIA实验是不必要的。在数据获取之后可以提取宽范围的前体和相应的转变。因此，在靶向蛋白质组学中，DIA的目的在于使用靶向数据提取策略进行包容性蛋白质组范围的定量。然而，当与SRM相比时，基于DIA的靶向方法通常具有较低的灵敏度、特异性和再现性，以及蛋白质定量中具有较小的动态范围。
D DIA的方法最初是使用LTQ-线性离子阱(LIT)质谱仪引入的，其应用了宽的前体分离窗(10m/z)以执行预定的m/z范围的顺序隔离和碎片化。与MS水平定量相比，发现信噪比(S/N)大大提高(高于350％)，具有良好的线性动态范围。还证明了离子提取在DIA定量的MS/MS水平中的适用性。然而，具有宽前体分离窗口的这种低分辨率DIA MS/MS降低了质量准确度和肽鉴定的置信度，这潜在地导致增加假阳性发现率。
从那时起，已经引入了其它修饰的DIA。在此基础上引入MSE，并可在QqTOF仪器上有效操作。使用较小的分离窗口(2.5U)导致蛋白质鉴定的改善，尽管覆盖整个靶质量范围的总体数据采集需要多次注射(67次注射，持续5天)。更快的扫描离子阱MS(例如LTQOrbitrapVelors MS)将整个数据采集时间减少到约2天。使用台式提取质谱(a bench topExactive MS)的引入来证明全离子碎裂(AIF)的应用，其中将肽注入HCD碰撞池中用于碎片化而无需前体选择，并且将碎片返回到C-阱中并通过轨道阱质谱仪(Orbitrap massanalyzer)进行分析。通过高分辨率(100000，m/z200)和高质量精度，促进碎片离子到共洗脱前体离子的分配。这个概念显著地减少了占空比时间，但是在某个保持时间引入了来自AIF的更多干扰。随后引入了另一种DIA方法，称为扩展的数据无关采集(XDIA)，其在不同类型的具有电子转移解离(ETD)能力的轨道阱质谱仪上进行。当与基于DDA的ETD分析相比时，基于DIA的ETD方法显著增加了鉴定谱的数量(约250％)和独特肽的数量(约30％)，这可能潜在地促进低丰度PTM研究。
最近，随着快速扫描HR/AM仪器的发展，DIA已经得到了显著的改善，由此使用QqTOF MS，被称为SWATH，证明了DIA的变化，在概念上是指使用由多重光谱组成的宽隔离窗(通常25m/z)。使用QqTOF MS的一个关键特征是最快的数据采集速率。另一种DIA策略是通过使用QqOrbi MS引入的，其中引入了一种称为MSX的新的获得方法，以改善仪器速度、选择性和灵敏度。最近在DIA数据获取和处理方面的改进已经得到了更新版本的Orbitrap MS仪器的帮助。第一个被称为pSMART的分离窗口，其在QExactiveMS上实现，在质量范围上使用不对称分离窗口：5Da的窗遮盖物(window covering)400-800m/z，10Da的窗遮盖物800-1000m/z，20Da的窗遮盖物1000-1200m/z。在另一种称为宽选择离子监测DIA(WiSIM-DIA)的DIA方法中，其在新的混合Q-HCD-Orbitrap-LIT MS(即Orbitrap Fusion和Lumos)上实施，使用具有200Da隔离窗的三次HR/AM SIM扫描来覆盖400-1000m/z的所有前体离子。与每次SIM扫描并行地，获得17个具有12Da隔离窗的连续离子阱MS/MS以覆盖相关联的200Da SIM质量范围。与标准的宽窗口MS/MS-only DIA方法不同，对于pSMART和wiSIM-DIA，MS1数据(即，具有较长填充时间和足够的跨LC洗脱曲线的前体离子数据点的HR/AM前体数据)用于灵敏的检测和量化，而来自快速离子阱MS/MS扫描的MS/MS数据仅用于肽识别/确认。
与具有可检测肽前体的所有碎片离子的完整记录但具有复杂数据分析的标准DIA方法相比，pSMART和wiSIM-DIA仅能够以相对更容易的数据分析提供用于可检测前体的更小数目的MS/MS谱，因为大部分占空比时间用于生成高质量MS1数据。因此，它们的灵敏度和精确度高于标准DIA方法提供的灵敏度和精确度，而它们的定量准确度(即特异性或选择性)可能比标准DIA方法的定量准确度稍低，因为MS1比MS/MS具有共洗脱干扰的机会增加。最近，一种称为超反应监测(hyper reaction monitoring,HRM)的新DIA方法被证明其包括Q Exactive MS平台上的综合DIA采集和具有保留时间标准化(iRT)光谱库的靶数据分析。已经证明HRM在一致鉴定的肽的数目和在多次测量中不同丰度蛋白的可靠定量方面均优于全局鸟枪法蛋白质组学。
目前正在开发用于DIA分析的更有效的生物信息学工具，并且在本发明所述的方法中可以应用以下任一工具。DIA谱是高度复用的，因此与DDA或SRM/PRM相比需要更精细的数据解释算法。目前，有三种方法用于译解DIA谱。第一种是从DIA谱，例如Demux、MaxQuant、XDIA处理器和互补Finder，构建伪DDA谱。然后，通过常规的搜索引擎工具，例如MSGF+、MaxQuant、MASCOT或其它光谱库，处理那些重构的伪DDA光谱。一些方案使用色谱洗脱图谱来改进肽的鉴定。Tsou等人最近公开描述了一种称为DIA-Umpire的计算方法的发展。DIA-Umpire从二维(m/z和保留时间)特征检测算法开始，以发现MS和MS/MS数据中所有可能的前体和碎片离子信号。碎片离子与前体离子分组，前体离子与LC洗脱峰与峰顶处的保留时间相关。然后用包括上述工具的常规数据库搜索引擎处理每一前体——碎片群组的所产生伪MS/MS光谱。参见Tsou et al.,“DIA-Umpire:comprehensive computational frameworkfor data-independent acquisition proteomics(用于数据无关采集蛋白质组的综合计算框架),”Nat Methods 12:258-264(2015)。
另一种方法是将多重MS/MS与肽的理论光谱(例如ProbIDtree，离子计算(IonAccounting)，M-SPLIT，MixDB和FT-ARM)匹配。评分算法直接基于在具有高质量准确性的多重谱上发现了多少来自序列数据库或谱库的肽的理论碎片离子。前两种方法在进一步定量之前已经大大解决了从DIA光谱鉴定肽的问题。自由可用的自动或半自动工具，例如Skyline、mPProhet、OpenSWATH和DI-ANA，以及两种商业软件，来自AB/Sciex的PeakView和来自Biognosys的Spectronaut，已经被用于使用目标数据提取策略处理定量目标DIA数据。
检测的肽
在一个实施方案中，表1中列出了鉴定为可用于确定指定蛋白质的绝对或相对量的胰蛋白酶肽。这些肽中的每一种通过质谱分析在由福尔马林固定石蜡包埋的组织制备的液体裂解物中通过质谱检测的。因此，每种肽可用于开发对人生物样品中指定蛋白质的定量测定，包括直接在福尔马林固定的患者组织中。
表1
SEQ ID NO 蛋白质 肽序列
SEQ ID NO 1 CBL LDLLPQR
SEQ ID NO 2 FPGS SGLQVEDLDR
SEQ ID NO 3 HSP90A ALLFVPR
SEQ ID NO 4 HSP90B ALLFIPR
SEQ ID NO 5 INSR TIDSVTSAQELR
SEQ ID NO 6 MCL1 LLFFAPTR
SEQ ID NO 7 TrkA WELGEGAFGK
表1中所列胰蛋白酶肽通常是从不同人器官的多种不同福尔马林固定组织的多种液体组织裂解物中检测到的，所述器官包括例如前列腺、结肠和乳房。
进行SRM或DIA分析时的一个考虑是可以用于肽分析的仪器类型。尽管SRM分析可以在任何类型的质谱仪上开发和进行，包括MALDI、离子阱或三重四极杆，SRM分析的最有利的仪器平台通常被认为是三重四极杆仪器平台。这种类型的质谱仪可以被认为是用于分析非常复杂的蛋白质裂解物内的单个分离的目标肽的最合适的仪器，所述蛋白质裂解物可以由来自细胞内包含的所有蛋白质的数十万至数百万个单独的肽组成。所述方法用于：1)从每个指定的蛋白质中鉴定候选肽，其可用于针对指定的蛋白质的基于质谱的SRM测定法，2)开发针对来自指定的蛋白质的靶肽的单个SRM测定法，以便关联，和3)将定量测定法应用于癌症诊断和/或最佳疗法的选择。有关DIA分析方法的细节将在下面进一步提供。
测定方法
1.蛋白质的SRM候选片段肽的鉴定
a.使用一种或多种蛋白酶(可以包括或不包括胰蛋白酶)从福尔马林固定的生物样品制备液体组织蛋白质裂解物，以消化蛋白质
b.在离子阱串联质谱仪上分析液体组织裂解物中的所有蛋白质片段，并从指定蛋白质中鉴定所有片段肽，其中，单个片段肽不包含任何肽修饰，例如磷酸化或糖基化
c.在离子阱串联质谱仪上分析液体组织裂解物中的所有蛋白质片段，并从携带肽修饰(例如磷酸化或糖基化残基)的蛋白质中鉴定所有片段肽
d.通过特定消化方法从全长蛋白质中产生的所有肽都可能被测量，但是用于开发SRM测定的优选肽是那些通过质谱直接在由福尔马林固定的生物样品制备的复杂液体组织蛋白质裂解物中鉴定的肽
2.指定蛋白质片段肽的质谱分析
a.在三重四极杆质谱仪上对液体组织裂解物中鉴定的单个片段肽进行SRM测定，并将其应用于来自蛋白质的肽
i.确定最佳色谱条件下片段肽的最佳保留时间，所述色谱条件包括但不限于凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反相液相色谱、高效液相色谱或反相高效液相色谱
ii.确定肽的单同位素质量、每个肽的前体电荷状态、每个肽的前体m/z值、每个肽的m/z跃迁离子以及每个片段肽的每个跃迁离子的离子类型，以便开发每个肽的SRM测定。
iii.然后，可以使用来自(i)和(ii)的信息在三重四极杆质谱仪上进行SRM测定，其中，每个肽具有特征性和独特的SRM特征峰，该特征峰精确定义了在三重四极杆质谱仪上进行的独特的SRM测定
b.进行SRM分析，使得被检测的蛋白质的片段肽的含量，作为来自SRM质谱分析的独特SRM特征峰面积的函数，可以指示特定蛋白质裂解物中蛋白质的相对和绝对量。
i.相对定量可以通过以下方式实现：
1.通过将来自一个福尔马林固定的生物样品的液体组织裂解物中检测到的给定片段肽的SRM特征峰面积与来自至少一个第二、第三、第四或更多福尔马林固定的生物样品的至少一个第二、第三、第四或更多液体组织裂解物中相同片段肽的相同SRM特征峰面积进行比较来确定蛋白质的增加或减少
2.通过比较从一个福尔马林固定的生物样品的液体组织裂解物中检测到的给定片段肽的SRM特征峰面积与从其他蛋白质的片段肽、从不同和分离的生物来源获得的其他样品中产生的SRM特征峰面积来确定蛋白质的增加或减少，其中，肽片段的两个样品之间的SRM特征峰面积比较被标准化为每个样品中分析的蛋白质量。
3.通过将给定片段肽的SRM特征峰面积与来自福尔马林固定生物样品的同一液体组织裂解物中来自不同蛋白质的其他片段肽的SRM特征峰面积进行比较来确定蛋白质的增加或减少，以便将蛋白质的变化水平标准化为在各种细胞条件下不改变其表达水平的其他蛋白质的水平。
4.这些测定可应用于蛋白质的未修饰片段肽和修饰片段肽，其中，修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，并且其中，修饰肽的相对水平以与确定未修饰肽的相对量相同的方式确定。
ii.给定肽的绝对定量可以通过将来自单个生物样品中指定蛋白质的给定片段肽的SRM特征峰面积与加入生物样品蛋白质裂解物的内部片段肽标准物的SRM特征峰面积进行比较来实现
1.内标是被审核的指定蛋白质片段肽的标记合成版本。将该标准物加入已知量的样品中，可以分别测定生物样品中内部片段肽标准物和天然片段肽的SRM特征峰面积，然后比较两个峰面积
2.这可以应用于未修饰的片段肽和修饰的片段肽，其中，修饰包括但不限于磷酸化和/或糖基化，并且其中，修饰肽的绝对水平可以以与确定未修饰肽的绝对水平相同的方式来确定。
3.将片段肽定量应用于癌症诊断和治疗
a.对指定蛋白质的片段肽水平进行相对和/或绝对定量，并证明先前确定的指定蛋白质的表达与患者肿瘤组织中癌症的阶段/等级/状态的关联得到确认，这在癌症领域中是众所周知的
b.对指定蛋白的片段肽水平进行相对和/或绝对定量，并证明与不同治疗策略的临床结果的相关性，其中，这种相关性已经在现场得到证明，或者可以在未来通过跨群组患者和来自这些患者的组织的相关性研究得到证明。一旦先前建立的相关性或将来导出的相关性通过该分析得到确认，则该分析方法可用于确定最佳治疗策略
通过在离子阱和三重四极杆质谱仪上分析所有片段肽，开发了关于来自每个指定蛋白质的特定片段肽的特异性和独特特征。必须在来自福尔马林固定的样品/组织的液体裂解物中直接实验测定每个和每个候选SRM肽的信息；因为，有趣的是，并非所有来自任何指定蛋白质的肽都可以使用本发明所述的SRM在这样的裂解物中检测到，这表明未检测到的片段肽不能被视为用于开发SRM分析的候选肽，该分析用于直接定量福尔马林固定样品/组织的液体组织裂解物中的肽/蛋白质。
在三重四极杆质谱仪上进行特定片段肽的特定SRM测定。通过特定蛋白质SRM测定分析的实验样品例如是从福尔马林固定和石蜡包埋的组织制备的液体组织蛋白质裂解物。此类分析的数据表明福尔马林固定样品中存在该片段肽的独特SRM特征峰。
该肽的特定过渡离子特性用于定量测量福尔马林固定的生物样品中的特定片段肽。这些数据表明该片段肽的绝对量是每微克被分析的蛋白质裂解物中肽的摩尔量的函数。基于福尔马林固定的患者来源组织的分析来评估组织中相应的蛋白质水平可以提供关于每个特定患者的诊断、预后和治疗相关信息。在一个实施方式中，本发明描述了一种用于测量生物样品中在表1中列出的每种蛋白质水平的方法，包括使用质谱检测和/或定量从所述生物样品制备的蛋白质消化物中一种或多种修饰或未修饰片段肽的量；以及计算所述样品中修饰或未修饰蛋白质的水平；并且其中，所述水平是相对水平或绝对水平。在相关实施方式中，定量一个或多个片段肽包括通过与已知量的添加的内标肽相比较来确定生物样品中每个片段肽的量，其中，生物样品中的每个片段肽与具有相同氨基酸序列的内标肽相比较。在一些实施方式中，内标是同位素标记的内标肽，其包含一种或多种选自18O、17O、34S、15N、13C、2H或其组合的重稳定同位素。
本发明所述的用于测量生物样品中指定蛋白质(或作为其替代物的片段肽)的水平的方法可用作患者或受试者中癌症的诊断指示物。在一个实施方案中，通过将组织中发现的蛋白质的水平与正常和/或癌前组织中发现的蛋白质的水平相关联(例如，比较)，可以使用来自指定蛋白质的水平的测量的结果来确定癌症的诊断阶段/等级/状态。
因为核酸和蛋白质都可以从相同的液体组织生物分子制剂中分析，所以可以从分析蛋白质的相同样品中的核酸产生关于疾病诊断和药物治疗决定的额外信息。例如，如果指定的蛋白由某些细胞以增加的水平表达，当通过SRM测定时，数据可以提供关于细胞状态和它们不受控制的生长、潜在的药物抗性和癌症发展的可能性的信息。同时，可从存在于相同液体生物分子制剂中的核酸获得关于相应基因和/或它们编码的核酸和蛋白质的状态的信息(例如，mRNA分子和它们的表达水平或剪接变异)，可与指定蛋白质的SRM分析同时评估。不是来自指定蛋白质并且存在于相同生物分子制品中的任何基因和/或核酸可以与指定蛋白质的SRM分析同时进行评估。在一个实施方案中，关于指定蛋白质和/或一种、两种、三种、四种或更多种另外的蛋白质的信息可以通过检查编码那些蛋白质的核酸来评估。这些核酸可以通过例如以下一种或多种、两种或更多种、或三种或更多种来检查：测序方法、聚合酶链式反应方法、限制性片段多态性分析、缺失、插入的鉴定和/或突变存在的确定，包括但不限于单碱基对多态性、转换、颠换或其组合。
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<150> 62/791,495
<151> 2019-01-11
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Leu Asp Leu Leu Pro Gln Arg
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ser Gly Leu Gln Val Glu Asp Leu Asp Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ala Leu Leu Phe Val Pro Arg
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ala Leu Leu Phe Ile Pro Arg
1 5
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Leu Leu Phe Phe Ala Pro Thr Arg
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Trp Glu Leu Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys
1 5 10

Claims (16)

1.一种用于测量福尔马林固定组织的生物样品中蛋白质的含量的方法，该方法包括：
使用质谱分析检测和/或定量从所述生物样品制备的蛋白质消化物中源自所述蛋白质的一种或多种片段肽的含量；和计算所述样品中所述蛋白质的含量；
其中，所述蛋白质选自由CBL、FPGS、HSP90A、HSP90B、INSR、MCL1和TrkA组成的组。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括在检测和/或定量所述一种或多种片段肽之前对所述蛋白质消化物进行分级的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述分级的步骤选自由凝胶电泳、液相色谱、毛细管电泳、纳米反相液相色谱、高效液相色谱法和反相高效液相色谱法组成的组。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质消化物包含蛋白酶消化物，优选胰蛋白酶消化物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述质谱分析包括串联质谱分析、离子阱质谱分析、三重四极杆质谱分析、离子阱/四极杆混合质谱分析、MALDI-TOF质谱分析、MALDI质谱分析和/或飞行时间质谱分析。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所使用的质谱分析模式是选择反应监测(SRM)、多重反应监测(MRM)和/或多重选择反应监测(mSRM)。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所使用的质谱的模式是数据无关采集(DIA)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
所述蛋白质是CBL，所述片段肽是SEQ ID NO：1所示的肽；
所述蛋白质是FPGS，所述片段肽是SEQ ID NO：2所示的肽；
所述蛋白质是HSP90A，所述片段肽是SEQ ID NO：3所示的肽；
所述蛋白质是HSP90B，所述片段肽是SEQ ID NO：4所示的肽；
所述蛋白质是INSR，所述片段肽是SEQ ID NO：5所示的肽；
所述蛋白质是MCL1，所述片段肽是SEQ ID NO：6所示的肽；和/或
所述蛋白质是TrkA，所述片段肽是SEQ ID NO：7所示的肽。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述组织是石蜡包埋的组织。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述组织获自肿瘤，例如为原发性肿瘤或继发性肿瘤。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，定量所述一种或多种片段肽包括将所述生物样品中所述一种或多种片段肽的含量与不同且单独的生物样品中相同的一种或多种片段肽的含量进行比较。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，定量所述一种或多种片段肽包括通过与添加的具有相同氨基酸序列的已知量的内标肽比较来确定生物样品中所述一种或多种片段肽的含量。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述内标肽为同位素标记的肽，所述同位素标记的肽选自18O、17O、34S、15N、13C和2H以及它们的组合标记的肽。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，检测和/或定量所述蛋白质消化物中所述一种或多种片段肽的含量指示相应蛋白质的存在以及与受试者中癌症的诊断阶段/等级/状况的关联。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，该方法还包括将所述检测和/或定量所述一种或多种片段肽的含量或所述相应蛋白质的含量的结果与告知所述受试者最佳癌症治疗疗法相关联。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述关联与以多重形式检测和/或定量其他蛋白质或来自其他蛋白质的肽的含量相组合。
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