CN111380895A - 一种鉴别配方粉中添加乳清蛋白粉的核磁共振氢谱法 - Google Patents
一种鉴别配方粉中添加乳清蛋白粉的核磁共振氢谱法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是一种鉴别配方粉中添加乳清蛋白粉的核磁共振氢谱法，通过称取待鉴别的配方粉，用超纯水溶解后加入适量三氯甲烷涡旋离心，量取少量处理后的上层样品并加入含2,2,3,3‑四氘代三甲基硅烷丙烯酸和叠氮化钠的重水溶液，混合均匀后采用液体核磁共振仪分析。获得样品的核磁共振氢谱指纹图谱如具有以下特征：在0.80‑1.0 ppm位移内存在一个凸起的包峰连接锯齿状多峰，1.37‑1.43 ppm位移内存在一簇多峰，3.011‑3.025 ppm位移内存在一个尖峰，则证明所鉴别配方粉中添加乳清蛋白粉。本发明提供的方法简单高效，能够准确鉴别出牛初乳粉、配方奶粉和复合蛋白粉等配方粉中的乳清蛋白粉。
Description
技术领域
本发明属于保健食品检测技术领域，具体的是涉及一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别配方粉中添加乳清蛋白粉的方法。
背景技术
乳清蛋白是从牛奶中提取的一种蛋白质，占牛乳总蛋白的20％，主要有β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白等。乳清蛋白具有营养价值高、易消化吸收，富含多种生物活性成分等优点，对人类机体代谢平衡、免疫、疾病防治等均具有重要作用，被称为“蛋白之王”，是生产各种配方粉及运动营养补充剂等保健食品的重要原料。然而，一些不良生产商为了谋取私利，在配方粉的实际生产中并未添加乳清蛋白或者在某些配方粉原料如牛初乳粉中添加乳清蛋白，因此分析配方粉中是否添加乳清蛋白粉对配方粉品质的监控非常重要。
目前国内有关乳清蛋白的检测仅限于检测其含量而非鉴定其成分，标准“婴幼儿配方食品和乳粉乳清蛋白的测定”（标准号为GB/T 5413.2 1997）及专利“一种测定乳基婴幼儿配方粉中乳清蛋白含量的方法”（申请号为201410722848.5）均基于SDS-PAGE技术分析蛋白质的谱带，分析步骤复杂，测试结果易产生误差；专利“超高效液相色谱测定奶粉和牛奶中牛乳清蛋白含量的方法”（申请号为201110283264.9）需要借助于特定的色谱柱，存在有机试剂消耗多，检测成本较高的缺陷。因此，急需一种可以快速鉴定配方粉如牛初乳粉、配方奶粉和复合蛋白粉等中是否添加乳清蛋白粉的技术。核磁共振氢谱法指纹图谱技术作为一种新型的检测手段，已经被许多学者用于乳制品的来源及代谢物的研究中，但目前尚无将其用于鉴定配方粉中添加乳清蛋白粉的研究报道。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明提供了一种定性检测配方粉如牛初乳粉，配方奶粉或复合蛋白粉中添加乳清蛋白粉的方法，基于液体核磁共振氢谱法指纹图谱技术，具有样品前处理简单，检测灵敏度高及检测效率高等优点，能够对配方粉中乳清蛋白粉实现快速鉴定，适用于配方粉品质的日常分析。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术手段实现的：
本发明是一种鉴别配方粉中添加乳清蛋白粉的核磁共振氢谱法，该方法包括如下步骤：
步骤1：称取待鉴别的配方粉0.8-1.5 g，用10-15 mL超纯水溶解；
步骤2：向步骤1中加入10 mL三氯甲烷，充分涡旋后高速离心10min；
步骤3：从经步骤2处理后的样品上清液中取600-900 µL，加入含质量分数为0.1%-0.2%的2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和质量分数为0.01-0.02%的叠氮化钠的重水溶液，定容到1 mL，涡旋均匀后量取500-600 µL装入核磁管；
步骤4：采用液体核磁共振仪测定核磁管中的样品，测定条件为：采用预饱和方法压制水峰；脉冲程序为：noesygppr1d；O1：4.7-4.8；P1=10.4µs；TD=64K；NS=32；DS= 4；SWH=8023Hz；D1= 4 s；D8=0.01s；
步骤5、获得核磁共振氢谱指纹图谱，将内标TSP的化学位移设置为0，然后进行基线校正和相位校正，图谱在0.80-1.0 ppm位移内存在一个凸起的包峰连接锯齿状多峰，1.37-1.43 ppm位移内存在一簇多峰，3.011-3.025 ppm位移内存在一个尖峰，则证明所鉴别的配方粉中添加乳清蛋白粉。
本发明的进一步改进在于：所述步骤1中的配方粉为调制牛初乳粉或配方奶粉或复合蛋白粉。
本发明的进一步改进在于：所述步骤1中的溶解为室温超声10min或40℃水浴加热。
本发明的进一步改进在于：所述步骤4中的液体核磁共振仪的测定温度为20-30℃。
本发明的有益效果是：本发明提供的方法，待鉴别的配方粉处理方式简单灵活，所消耗的氘代试剂少，成本低，检测结果准确可靠，通过设定液体核磁共振仪的相关测定参数，观察和分析所获得的图谱，可直观准确地判断配方粉中是否添加乳清蛋白粉，此方法可应用于鉴定市场上宣称添加乳清蛋白粉的各类营养保健牛初乳粉、配方奶粉及复合蛋白粉，对于分析其他添加乳清蛋白粉的营养保健品具有参考价值。
本发明提供的方法简单高效，能够准确鉴别出牛初乳粉、配方奶粉和复合蛋白粉等配方粉中的乳清蛋白粉。
附图说明
图1为实施例1-3中纯乳清蛋白粉、纯牛初乳粉、未添加乳清蛋白的配方奶粉、添加乳清蛋白的牛初乳粉、添加乳清蛋白的配方奶粉和添加乳清蛋白的复合蛋白粉样品在0.65-1.66 ppm内的核磁谱图。
图2为实施例1-3中纯乳清蛋白粉、纯牛初乳粉、未添加乳清蛋白的配方奶粉、添加乳清蛋白的牛初乳粉、添加乳清蛋白的配方奶粉和添加乳清蛋白的复合蛋白粉样品在2.10-3.28 ppm内的核磁谱图。
具体实施方式
以下将以图式揭露本发明的多个实施方式，为明确说明起见，许多实务上的细节将在以下叙述中一并说明。然而，应了解到，这些实务上的细节不应用以限制本发明。也就是说，在本发明的部分实施方式中，这些实务上的细节是非必要的。
另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
实施例1
1、仪器、试剂及样品：
1.1 主要仪器：
瑞士布鲁克公司的400 MHz液体核磁共振谱仪，BBI探头；梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司的IT0079电子天平；美国Wilmad-labglass公司的5mm核磁管；昆山禾创超声仪器有限公司是KH-500B型超声清洗器；上海安亭科学仪器厂的离心机。
1.2 试剂 ：
叠氮化钠（NaN3）纯度规格为分析纯，购于天津福晨化学试剂厂；重水（D2O），氘代率为99.9％，购于上海安耐吉化学有限公司；2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸钠盐（TSP）氘代率为98％；三氯甲烷（CHCl3），纯度规格为分析纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司；质量分数为0.15%的TSP及质量分数为0.015%的NaN3的混合溶液用重水配置。
1.3、样品收集
乳清蛋白粉、纯正未添加乳清蛋白粉的牛初乳粉和添加乳清蛋白粉的牛初乳粉由相应生产企业提供样品原料，每种样品数不少于5个。
一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别配方粉中添加乳清蛋白粉的方法，该方法包括如下步骤：
步骤1：称取乳清蛋白粉、纯正牛初乳粉及添加乳清蛋白粉的牛初乳粉1.0 g，用12 mL超纯水超声溶解10 min；
步骤2：向步骤1中加入10 mL三氯甲烷，充分涡旋后高速离心10min；
步骤3：从分层后的样品上清液中量取900 µL，加入含质量分数为0.15%的2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和质量分数为0.015%的叠氮化钠的重水溶液100 µL，涡旋均匀后量取600 µL装入核磁管；
步骤4：核磁共振氢谱（1H NMR）分析的关键条件为：测定温度：25℃；采用预饱和方法压制水峰；脉冲程序为：noesygppr1d；O1：4.7-4.8，视水峰压制条件而定；P1=10.4µs；TD=64K；NS=32；DS= 4；SWH=8023Hz；D1=4 s；D8=0.01s；
步骤5：核磁共振氢谱（1H NMR）指纹图谱的分析：使用软件Topspin3.5分析所得样品的1H NMR数据，将内标TSP的化学位移设置为0，然后进行基线校正和相位校正；
确定牛初乳粉中添加乳清蛋白粉的特征标记：如获得的核磁共振氢谱指纹图谱在0.80-1.0 ppm位移内存在一个凸起的包峰连接锯齿状多峰，见附图1，1.37-1.43 ppm位移内存在一簇多峰，见附图1，3.011-3.025 ppm位移内存在一个尖峰，见附图2，则证明所鉴别的牛初乳粉中添加乳清蛋白粉，见附图1-2，否则为未添加乳清蛋白粉的纯牛初乳粉，见附图1-2。
实施例2
1、仪器、试剂及样品：
1.1 主要仪器：
瑞士布鲁克公司的400 MHz液体核磁共振谱仪，BBI探头；梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司的IT0079电子天平；美国Wilmad-labglass公司的5mm核磁管；；常州国华电器有限公司的HH-4数显水浴锅；上海安亭科学仪器厂的离心机
1.2 试剂 ：
叠氮化钠（NaN3）纯度规格为分析纯，购于天津福晨化学试剂厂；重水（D2O），氘代率为99.9％，购于上海安耐吉化学有限公司；2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸钠盐（TSP）氘代率为98％；三氯甲烷（CHCl3），纯度规格为分析纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司；质量分数为0.2%的TSP及质量分数为0.015%的NaN3的混合溶液用重水配置。
1.3、样品收集
添加乳清蛋白和无添加乳清蛋白的配方奶粉均采自各大超市，每种样品数不少于5个。
一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别配方粉中添加乳清蛋白粉的方法，该方法包括如下步骤：
步骤1： 称取不添加乳清蛋白的配方奶粉和添加乳清蛋白的配方奶粉各0.8 g，将奶粉用10 mL超纯水40°C加热溶解；
步骤2：加入10 mL三氯甲烷，充分涡旋后高速离心10min；
步骤3：从分层后的样品上清液中量取800 µL，加入含质量分数为0.2%的2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和质量分数为0.015%的叠氮化钠的重水溶液200 µL，涡旋均匀后量取550 µL装入核磁管；
步骤4：核磁共振氢谱（1H NMR）分析的关键条件为：测定温度：25℃；采用预饱和方法压制水峰；脉冲程序为：noesygppr1d；O1：4.7-4.8:，视水峰压制条件而定；P1=10.4µs；TD=64K；NS=32；DS= 4；SWH=8023Hz；D1=4 s；D8=0.01s；
步骤5：核磁共振氢谱（1H NMR）指纹图谱的分析：使用软件Topspin3.5分析所有原料蜜种的1H NMR数据，将内标TSP的化学位移设置为0，然后进行基线校正和相位校正；
确定配方奶粉中添加乳清蛋白粉的特征标记：如获得的核磁共振氢谱指纹图谱在0.80-1.0 ppm位移内存在一个凸起的包峰连接锯齿状多峰，见附图1，1.37-1.43 ppm位移内存在一簇多峰，见附图1，3.011-3.025 ppm位移内存在一个尖峰，见附图2，则证明所鉴别的配方奶粉中添加乳清蛋白粉，见附图1-2，否则为未添加乳清蛋白粉的配方奶粉，见附图1-2。
实施例3
1、仪器、试剂及样品：
1.1 主要仪器：
瑞士布鲁克公司的400 MHz液体核磁共振谱仪，BBI探头；梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司的IT0079电子天平；美国Wilmad-labglass公司的5mm核磁管；昆山禾创超声仪器有限公司是KH-500B型超声清洗器；上海安亭科学仪器厂的离心机。
1.2 试剂 ：
叠氮化钠（NaN3）纯度规格为分析纯，购于天津福晨化学试剂厂；重水（D2O），氘代率为99.9％，购于上海安耐吉化学有限公司；2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸钠盐（TSP）氘代率为98％；三氯甲烷（CHCl3），纯度规格为分析纯，购于上海国药集团化学试剂有限公司；质量分数为0.12%的TSP及质量分数为0.015%的NaN3的混合溶液用重水配置。
1.3、样品收集
添加乳清蛋白的复合蛋白质粉采自大型超市，样品数不少于5个。
一种采用核磁共振氢谱指纹图谱鉴别配方粉中添加乳清蛋白粉的方法，该方法包括如下步骤：
步骤1：称取待鉴别的添加乳清蛋白粉的复合蛋白粉1.0 g，将蛋白粉用10 mL超纯水超声溶解；
步骤2：加入10 mL三氯甲烷，充分涡旋后高速离心10min；
步骤3：从分层后的样品上清液中量取800 µL，加入含质量分数为0.12%的2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和质量分数为0.015%的叠氮化钠的重水溶液200 µL，涡旋均匀后量取600 µL装入核磁管；
步骤4：核磁共振氢谱（1H NMR）分析的关键条件为：测定温度：25℃；采用预饱和方法压制水峰；脉冲程序为：noesygppr1d；O1：4.7-4.8，视水峰压制条件而定；P1=10.4µs；TD=64K；NS=32；DS= 4；SWH=8023Hz；D1=4 s；D8=0.01s；
步骤5：核磁共振氢谱（1H NMR）指纹图谱的分析：使用软件Topspin3.5分析所有原料蜜种的1H NMR数据，将内标TSP的化学位移设置为0，然后进行基线校正和相位校正；
验证复合蛋白粉中添加乳清蛋白粉：如获得的核磁共振氢谱指纹图谱在0.80-1.0 ppm位移内存在一个凸起的包峰连接锯齿状多峰，见附图1，1.37-1.43 ppm位移内存在一簇多峰，见附图1，3.011-3.025 ppm位移内存在一个尖峰，见附图2，则证明所鉴别的复合蛋白粉中添加乳清蛋白粉，见附图1-2。
本发明提供的方法简单高效，能够准确鉴别出牛初乳粉、配方奶粉和复合蛋白粉等配方粉中的乳清蛋白粉。
以上所述仅为本发明的实施方式而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理的内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的权利要求范围之内。
Claims (4)
1.一种鉴别配方粉中添加乳清蛋白粉的核磁共振氢谱法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
步骤1：称取待鉴别的配方粉0.8-1.5 g，用10-15 mL超纯水溶解；
步骤2：向步骤1中加入10 mL三氯甲烷，充分涡旋后高速离心10min；
步骤3：从经步骤2处理后的样品上清液中取600-900 µL，加入含质量分数为0.1%-0.2%的2,2,3,3-四氘代三甲基硅烷丙烯酸和质量分数为0.01-0.02%的叠氮化钠的重水溶液，定容到1 mL，涡旋均匀后量取500-600 µL装入核磁管；
步骤4：采用液体核磁共振仪测定核磁管中的样品，测定条件为：采用预饱和方法压制水峰；脉冲程序为：noesygppr1d；O1：4.7-4.8；P1=10.4µs；TD=64K；NS=32；DS= 4；SWH=8023Hz；D1= 4 s；D8=0.01s；
步骤5、获得核磁共振氢谱指纹图谱，将内标TSP的化学位移设置为0，然后进行基线校正和相位校正，图谱在0.80-1.0 ppm位移内存在一个凸起的包峰连接锯齿状多峰，1.37-1.43 ppm位移内存在一簇多峰，3.011-3.025 ppm位移内存在一个尖峰，则证明所鉴别的配方粉中添加乳清蛋白粉。
2.根据权利要求1所述一种鉴别配方粉中添加乳清蛋白粉的核磁共振氢谱法，其特征在于：所述步骤1中的配方粉为调制牛初乳粉或配方奶粉或复合蛋白粉。
3.根据权利要求1所述一种鉴别配方粉中添加乳清蛋白粉的核磁共振氢谱法，其特征在于：所述步骤1中的溶解为室温超声10min或40℃水浴加热。
4.根据权利要求1所述一种鉴别配方粉中添加乳清蛋白粉的核磁共振氢谱法，其特征在于：所述步骤4中的液体核磁共振仪的测定温度为20-30℃。
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