CN111386130A - 长效单链胰岛素类似物及其缀合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及长效单链胰岛素类似物、其缀合物、及两者的用途。此外，本发明涉及制备长效单链胰岛素类似物及其缀合物的方法。

Description

长效单链胰岛素类似物及其缀合物

技术领域

本发明涉及长效单链胰岛素类似物、其缀合物、及其用途。此外，本发明涉及用于制备长效单链胰岛素类似物及其缀合物的方法。

背景技术

胰岛素是由胰腺的β细胞分泌的51个氨基酸组成的多肽激素，并且参与动物中血糖的调节。胰岛素由通过二硫键连接的A链和B链组成，并且C-肽在体内被胰岛素原中的蛋白酶移除(水解)，以从胰岛素原产生胰岛素。

胰岛素制剂是向以下患者给予的血糖调节剂：在胰岛素产生中具有先天缺陷的I型糖尿病患者；由于胰岛素抗性、胰岛素分泌不足等，血糖水平二次升高，以及口服糖尿病药物控制不良或口服糖尿病药物禁忌的Ⅱ型糖尿病患者；或妊娠期糖尿病患者。

早年，牛和猪的胰岛素在纯化后被使用，但是遗传工程和DNA操纵技术的发达使得利用细菌和酵母的人胰岛素的大量生产成为可能(欧洲专利申请公开号EP 0055945)，并且可以通过修饰人胰岛素来产生以改善作用时间等的胰岛素类似物等。

然而，胰岛素像其它蛋白质、肽类激素一样，在体内具有很短的半衰期，很难持续表现出治疗效果，而且为了显示效果，需要持续重复给予。此外，蛋白质和肽药物大部分时间是以注射剂的形式给予给患者，其被频繁地注射以维持生物活性肽的血液浓度(bloodlevel)，并其会导致患者中的巨大痛苦。因此，研究已经聚焦于几种蛋白质制剂及其化学修饰的开发，以便通过经由这些蛋白质的体内半衰期的增加来减少给予频率，从而增加治疗效果和改善患者的生活质量。

单链胰岛素类似物可被用于解决胰岛素制剂的持续时间和低血糖水平问题的方法中。单链胰岛素可以通过将其作为单链制备和使用来控制半衰期和效能，而不是以现有的由二硫键连接的A链和B链的形式制备。单链胰岛素类似物可按B链和A链的顺序、或按A链和B链的顺序连接，并且在连接各链时可在其间插入肽作为连接体。

在过去的几十年中，许多类型的单链胰岛素类似物已经被制成。这些类似物用由各种长度的肽或化合物组成的连接体将B链的C-末端和A链的N-末端连接。然而，其中位于B链C-末端的LysB29被直接连接到在A链N-末端的GlyA1的单链胰岛素类似物显示了生物无活性(Derewenda,U.等人,J.Mol.Biol.,1991,220:425-433)。

改善胰岛素制剂的持续时间的另一种方法是使用胰岛素原——胰岛素的前体。胰岛素原本身是弱胰岛素激动剂，其具有比胰岛素低的活性，但具有比胰岛素长的半衰期。

在胰岛素原中，与胰岛素不同，B链和A链是通过C-肽连接(C-肽在维持胰岛素的稳定性中起着重要作用)，而且胰岛素原比胰岛素具有更长的血液半衰期。因此，许多研究者已经做了各种尝试，以将胰岛素原开发成长效胰岛素。然而，在其活性中起重要作用的A链的氨基末端甘氨酸残基被C-肽隐藏，因此导致低于胰岛素的活性(William F等人,TheJournal of Biological Chemistry,1992,267:419-425)，并且目前还没有将其开发为药物。

通过遗传重组技术生产的大部分蛋白质都是以其中甲硫氨酸被结合到蛋白质N末端的形式生产的。作为用于移除非必需氨基酸甲硫氨酸的现有胰岛素制备方法之一，存在使用胰蛋白酶(其是丝氨酸蛋白酶)的方法(欧洲专利申请公开号EP 1926749)。然而，由于胰蛋白酶识别序列存在于胰岛素原中，这种方式不适合于单链胰岛素类似物的制备。作为可替代方法，存在使用传统上已被广泛使用的溴化氰(CNBr)移除在蛋白质的N末端的甲硫氨酸的方法，但CNBr的极端毒性、生产过程的增加的复杂性、低产率等作为问题已被提出。因此，需要可维持增加的持续时间和活性的胰岛素制剂。

发明内容

[技术问题]

本发明的目的是提供单链胰岛素类似物。

本发明的另一个目的是提供单链胰岛素类似物缀合物，其中单链胰岛素类似物与能够增加其体内半衰期的物质连接。

本发明的又一个目的是提供用于制备单链胰岛素类似物缀合物的方法，其包括连接单链胰岛素类似物和能够增加其体内半衰期的物质。

本发明的又一个目的是提供具有增强的体内持续时间和稳定性的长效单链胰岛素制剂，其包含单链胰岛素类似物和/或单链胰岛素类似物缀合物。

本发明的又一个目的是提供用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包含单链胰岛素类似物和/或单链胰岛素类似物缀合物。

本发明的又一个目的是提供用于预防或治疗糖尿病的方法，其包括将药物组合物向需要其的对象给予。

本发明的又一个目的是提供单链胰岛素类似物缀合物或单链胰岛素类似物在制备用于预防或治疗糖尿病的药物中的用途。

本发明的又一个目的是提供单链胰岛素类似物缀合物或单链胰岛素类似物用于预防或治疗糖尿病的用途。

本发明的又一个目的是提供编码单链胰岛素类似物的分离核酸、包含该核酸的重组表达载体、以及包含该重组表达载体的转化体。

本发明的又一个目的是提供利用转化体制备单链胰岛素类似物的方法。

[技术方案]

本发明的一方面是提供具有以下化学式1的单链胰岛素类似物缀合物：

[化学式1]

X-Y-Z-La-F

其中：

X是天然胰岛素A链、B链或其类似物，

Y是天然胰岛素C-肽或其类似物，

Z是天然胰岛素B链、A链或其类似物，

L是连接体，

a为0或自然数，条件是当a为2或更大时，每个L彼此独立，

F是能够增加胰岛素类似物体内半衰期的物质，

条件是其中X、Y和Z分别是天然胰岛素的B链、C-肽和A链，或者分别是天然胰岛素的A链、C-肽和B链的情况被排除，以及

X-Y-Z形成单链胰岛素类似物。

本发明的一具体方面提供了单链胰岛素类似物缀合物，其中单链胰岛素类似物是其类似物、变体或片段，与天然胰岛素原相比，单链胰岛素类似物是通过选自至少一个氨基酸的取代、添加和修饰以及排列顺序(胰岛素B链、C-肽和A链的顺序等)中的改变的至少一种方法修饰的。

本发明的另一个具体方面提供了单链胰岛素类似物缀合物，其中单链胰岛素类似物是其中X、Y和Z各自通过连接体被连接的单链胰岛素类似物。

本发明的又一个具体方面提供了单链胰岛素类似物缀合物，其中C-肽的类似物是其中选自天然胰岛素C-肽的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第34位氨基酸和第35位氨基酸的至少一个氨基酸由另一个氨基酸取代或缺失的C-肽的类似物。

本发明的又一个具体方面提供了单链胰岛素类似物缀合物，其中能够增加胰岛素类似物的体内半衰期的物质选自聚乙二醇、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合物质、特定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合物质、体内结缔组织、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖和聚合物。

本发明的又一具体方面提供单链胰岛素类似物缀合物，其中L选自肽、聚乙二醇、脂肪酸、糖、聚合物、低分子量化合物、核苷酸及其组合。

本发明的又一个具体方面是提供单链胰岛素类似物缀合物，其中X-Y-Z和F经由L通过共价化学键、非共价化学键或其组合被连接。

本发明的又一个具体方面提供单链胰岛素类似物缀合物，其中聚合物选自聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸及其组合。

本发明的又一个具体方面提供了单链胰岛素类似物缀合物，其中FcRn结合物质是免疫球蛋白Fc区。

本发明的又一个具体方面是提供单链胰岛素类似物缀合物，其中免疫球蛋白Fc区是非糖基化的。

本发明的又一个具体方面是提供单链胰岛素类似物缀合物，其中免疫球蛋白Fc区由选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的1至4个结构域组成。

本发明的又一具体方面是提供单链胰岛素类似物缀合物，其中免疫球蛋白Fc区是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc区。

本发明的又一个具体方面是提供单链胰岛素类似物缀合物，其中免疫球蛋白Fc区的每个结构域是衍生自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白的具有不同来源的结构域的杂合体。

本发明的又一个具体方面是提供单链胰岛素类似物缀合物，其中免疫球蛋白Fc区是单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体，单链免疫球蛋白由相同来源的结构域组成。

本发明的又一个具体方面是提供单链胰岛素类似物缀合物，其中免疫球蛋白Fc区是IgG4 Fc区。

本发明的又一个具体方面是提供单链胰岛素类似物缀合物，其中免疫球蛋白Fc区是人非糖基化IgG4 Fc区。

本发明的另一方面提供具有以下化学式2的单链胰岛素类似物：

[化学式2]

X-Y-Z

其中，

X是天然胰岛素A链、B链或其类似物，

Y是天然胰岛素C-肽或其类似物，

Z是天然胰岛素B链、A链或其类似物，并且

条件是其中X、Y和Z分别是天然胰岛素的B链、C-肽和A链，或者分别是天然胰岛素的A链、C-肽和B链的情况被排除。

本发明的又一个具体方面提供了单链胰岛素类似物，其中C-肽的类似物是其中选自天然胰岛素C-肽的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第34位氨基酸和第35位氨基酸的至少一个氨基酸由另一个氨基酸取代或缺失的C-肽的类似物。

本发明的又一个具体方面提供了用于制备单链胰岛素类似物缀合物的方法，其包括将单链胰岛素类似物与能够增加其体内半衰期的物质连接。

本发明的又一个具体方面提供了用于制备单链胰岛素类似物缀合物的方法，其中单链胰岛素类似物和能够增加其体内半衰期的物质经由连接体被连接。

本发明的又一个具体方面提供了用于制备单链胰岛素类似物缀合物的方法，其中连接体是非肽基连接体，其具有选自醛基团、丙醛基团、丁醛基团、马来酰亚胺基团和琥珀酰亚胺衍生物的反应性基团。

本发明的又一个具体方面提供了用于制备单链胰岛素类似物缀合物的方法，其中琥珀酰亚胺衍生物是琥珀酰亚胺基丙酸酯、甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基羧甲基、N-羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺基碳酸酯。

本发明类似物的又一个具体方面是通过包括以下(a)和(b)的方法获得的：

(a)以其中将由包含蛋白酶切割位点的5至20个氨基酸组成的肽融合到单链胰岛素类似物的N-末端的形式表达单链胰岛素类似物；以及

(b)移除与单链胰岛素类似物融合的肽。

本发明的又一个具体方面提供了具有增强的体内持续时间和稳定性的长效单链胰岛素制剂，其包含单链胰岛素类似物缀合物；或单链胰岛素类似物。

本发明的又一个具体方面提供了用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包含单链胰岛素类似物缀合物；或单链胰岛素类似物。

本发明的又一个具体方面提供了用于预防或治疗糖尿病的方法，其包括将药物组合物向需要其的对象给予。

本发明的又一个方面提供了单链胰岛素类似物缀合物或单链胰岛素类似物在制备用于预防或治疗糖尿病的药物中的用途。

本发明的又一个方面提供单链胰岛素类似物缀合物或单链胰岛素类似物用于预防或治疗糖尿病的用途。

本发明的又一个方面提供了编码单链胰岛素类似物的分离核酸、包含该核酸的重组表达载体、以及包含该重组表达载体的转化体。

本发明的又一个方面提供了使用转化体制备单链胰岛素类似物的方法。

本发明的又一个方面提供了制备单链胰岛素类似物的方法，其包括：

a)通过培养包含编码单链胰岛素类似物的核酸的转化体来表达单链胰岛素类似物；以及

b)分离和纯化表达的单链胰岛素类似物。

[有益效果]

根据本发明的单链胰岛素类似物及其缀合物可在体内维持稳定的降血糖作用，并具有显著增加的血液半衰期，从而改善给予方便性和副作用，并具有简化制备工艺的效果。

附图说明

图1是单链胰岛素类似物的基因扩增的示意图。

图2是单链胰岛素类似物纯化后其纯度分析的结果(C18,C4:RP-HPLC；SEC:SE-HPLC)。

图3是单链胰岛素类似物缀合物纯化后其纯度分析的结果(SEC:SE-HPLC；IEX:IE-HPLC)。

图4是确认单链胰岛素类似物缀合物的葡萄糖摄取的结果。

图5是确认单链胰岛素类似物缀合物的药动学的结果。

具体实施方式

进行本发明的详细描述如下。同时，本文公开的描述和实施方式中的每个也可应用于其它描述和实施方式中的每个。也就是说，本文公开的各种元素的所有组合都在本发明的范围内。此外，本发明的范围不受下面描述的具体描述的限制。

本发明的方面提供了单链胰岛素类似物，其具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力。

如本文所用，术语“单链胰岛素类似物”是指具有降低体内血糖特性并且其中胰岛素的A链和B链通过一条链连接的胰岛素类似物。为了本发明的目的，单链胰岛素类似物优选是与天然胰岛素相比具有降低的胰岛素受体结合亲和力和体外活性的物质。

天然胰岛素是由胰腺分泌的激素，它一般促进细胞内葡萄糖的摄取，抑制脂肪的分解，以调节体内的血糖水平。不具有血糖控制功能的胰岛素原形式的胰岛素被加工并变成具有血糖控制功能的胰岛素。在体内胰岛素以B链-C肽-A链的胰岛素原形式被表达，经受酶处理，并以具有A链和B链两条多肽链(其中每条链分别包括21和30个氨基酸残基)通过两个二硫键连接的胰岛素形式存在。天然胰岛素原的A链、B链和C-肽可分别包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3的氨基酸序列，但不限于此。

A链：

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO:1)

B链：

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO:2)

C-肽：

Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg(SEQID NO:3)

此外，本发明的单链胰岛素类似物可以是胰岛素原类似物，但不限于此。胰岛素原类似物是指按照B链、C-肽和A链的顺序排列的野生型或天然胰岛素原，以及其中A链、B链和C-肽的排列相差一个或多个的肽。具体地，胰岛素原类似物可以具有A链、C-肽和B链的排列，但不限于此。

本发明中的单链胰岛素类似物可与胰岛素原类似物互换使用。

本发明的胰岛素原类似物的A链、B链和C-肽中的每一个的氨基酸序列可以是野生型序列，或在野生型序列中添加、取代或缺失天然或非天然的一个或多个氨基酸的序列，但不限于此。

本发明的胰岛素原类似物分别与天然胰岛素原的A链、B链和C-肽具有至少80％、具体地至少90％、更具体地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，并且可以是一些氨基酸残基基团可以被化学取代(例如，α-甲基化、α-羟基化)、缺失(例如，脱氨基化)、或修饰(例如，N-甲基化)的形式，并且可以包括所有具有在体内调节血糖水平的功能的肽，但不限于此。

术语“同源性”意图代表与野生型蛋白质的氨基酸序列或编码其的核苷酸序列的相似程度，以及具有本发明的氨基酸序列或碱基序列的序列以及具有至少与本发明的以上相同百分比的序列也被包括在本发明中。虽然这种同源性可以通过由裸眼比较两个序列来确定，它也可以使用生物信息学算法来确定，算法通过并排排列待比较的序列来分析同源性程度。两个氨基酸序列之间的同源性可以以百分比来表示。在Wisconsin GeneticsSoftware Package(Genetics Computer Group,Madison,WI,USA)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA计算机软件模块中提供了有用的自动化算法。模块中的自动排列算法包括Needleman&Wunsch、Pearson&Lipman和Smith&Waterman序列排列算法。在软件(包括FASTP、BLAST、BLAST2、PSIBLAST和CLUSTAL W)中，对于其它有用排列的算法和同源性确定是自动的。

本发明的单链胰岛素类似物是在体内具有血糖控制功能的肽，且这个肽包括胰岛素原激动剂、衍生物、片段、变体等，但不限于此。

本发明的胰岛素原激动剂是指与胰岛素原的结构无关地与胰岛素的体内受体结合并表现出与胰岛素相同的生物活性的物质。

本发明的胰岛素原片段是指其中添加一个或多个氨基酸至胰岛素原或从胰岛素原缺失一个或多个氨基酸的形式，且添加的氨基酸可以是自然界中不存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)，且这个胰岛素原片段在体内具有血糖控制功能。

本发明的胰岛素原变体是指作为在体内具有血糖控制功能的肽，该肽为具有至少一个与胰岛素原的氨基酸序列不同的氨基酸序列的肽。

用于本发明的胰岛素原激动剂、衍生物、片段和变体中的制备方法可以独立使用或组合使用。例如，包括具有彼此不同的一个或多个氨基酸序列且对在N末端的氨基酸残基脱氨的，在体内具有血糖控制功能的肽。

在一个具体实施方式中，单链胰岛素类似物可以通过重组方法产生，或者可以通过固相合成方法产生。

在一个具体实施方式中，本发明的单链胰岛素类似物可以是天然胰岛素A链或其类似物；天然胰岛素C-肽或其类似物；和B链或其类似物以各种顺序直接或通过连接体连接。

在一个具体实施方式中，本发明的单链胰岛素类似物可以是，与天然胰岛素原相比，通过选自至少一个氨基酸的取代、添加和修饰以及排列顺序(B链、C肽和A链的顺序等)的改变中的至少一种方法修饰的类似物、变体或其片段。

在一个具体实施方式中，本发明的单链胰岛素类似物可以是天然胰岛素A链或其类似物；天然胰岛素C-肽或其类似物；和天然胰岛素B链或其类似物按上述顺序连接，但顺序不限于此。

在一个具体实施方式中，本发明的单链胰岛素类似物可包含C-肽或其类似物。C-肽(连接肽)是由35个氨基酸组成，连接胰岛素原中的B链和A链的肽。虽然C-肽在胰岛素的生物合成期间被移除，当它不被移除并存在于胰岛素中时，与天然型相比，其降低了胰岛素的体外活性。本发明的单链胰岛素类似物中包含的C-肽可以是其中氨基酸被缺失、取代、和/或插入到天然C-肽中的类似物。

在一个具体实施方式中，C-肽的类似物可以是其中选自天然胰岛素C-肽的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第34位氨基酸和第35位氨基酸的至少一个氨基酸被另一个氨基酸取代或缺失的C-肽的类似物，但类似物不限于此。更具体地，C-肽的类似物可以是其中天然胰岛素C-肽的第1位和第2位精氨酸、第34位赖氨酸残基、和第35位精氨酸残基被移除，从而在单链胰岛素类似物的生产时能够增加生产效率的C-肽的类似物，但类似物不限于此。

在一个具体实施方式中，本发明的单链胰岛素类似物可以是天然胰岛素A链；C肽的类似物；和天然胰岛素B链按上述顺序被连接，并且具体地，可以具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列，但是单链胰岛素类似物不限于此。

在一个具体实施方式中，本发明的单链胰岛素类似物可以是其中肽被融合到单链胰岛素类似物的N-末端的融合物(fusion)。融合到单链胰岛素N-末端的肽有助于单链胰岛素类似物的表达产率的增加，并且具有蛋白酶(例如，胰蛋白酶)切割位点，使得其在单链胰岛素类似物的生产期间有效地被移除。只要其有助于增加单链胰岛素类似物的表达产率并且其包括蛋白酶切割位点，待添加到单链胰岛素类似物的N-末端的肽不被限制，并且具体地，它可以由5至20个氨基酸组成，更具体地，7至18或9至16个氨基酸组成，并且更具体地，它可以包括MATTSTATTR(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，与肽融合的单链胰岛素类似物可以是肽被融合到单链胰岛素类似物的N-末端，其中天然胰岛素A链；C肽的类似物；和天然胰岛素B链按上述顺序连接，并且具体地，其可以具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列，但不限于此。

根据本发明的单链胰岛素类似物与天然胰岛素相比涵盖具有降低的胰岛素受体结合亲和力的任何肽，其中天然胰岛素原的A链、B链和C肽的氨基酸序列中的氨基酸的取代、添加、缺失、或翻译后修饰(例如，甲基化、酰化、泛素化、分子内共价键)被引入。在氨基酸的取代或添加时，不仅可以使用人类蛋白质中通常观察到的20种氨基酸，还可以使用非典型或非天然存在的氨基酸。非典型氨基酸的商业来源可包括Sigma-Aldrich、ChemPep和Genzyme Pharmaceuticals。包括这种氨基酸和典型肽序列的肽可以通过商业肽合成公司(诸如美国的American Peptide Company和Bachem或韩国的Anygen)合成和购买。

更具体地，本发明的单链胰岛素类似物可具有以下化学式2：

[化学式2]

X-Y-Z

其中：

X是天然胰岛素A链、B链或其类似物，

Y是天然胰岛素C-肽或其类似物，

Z是天然胰岛素B链、A链或其类似物，并且

条件是其中X、Y和Z分别是天然胰岛素的B链、C-肽和A链，或者分别是天然胰岛素的A链、C-肽和B链的情况被排除。

胰岛素A链、B链、C肽及其类似物与上面描述相同。

“-”是指X、Y和Z之间的每个键，并且代表X、Y和Z之间的直接键(direct bond)或连接体。连接体可以是肽连接体或非肽基连接体。

此外，“-”可以是诸如非共价键、共价键等的任何化学键，且具体地，其可以是共价键，但不限于此。

本发明的另一个方面提供了编码单链胰岛素类似物的多核苷酸、包含该多核苷酸的表达载体、以及包含该表达载体的转化体。

单链胰岛素类似物与上面描述相同。

多核苷酸是以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)，并具有包括基因组DNA、cDNA和由其转录的RNA的含义，且作为基本结构单元的核苷酸不仅包括天然核苷酸，还包括其中糖或碱基位点被修饰的类似物(Scheit,NucleotideAnalogs,John Wiley,New York,1980；Uhlman and Peyman,Chemical Reviews,90:543-584,1990)。本发明的多核苷酸可使用标准分子生物学技术分离或制备。例如，合适的引物序列可用于从天然胰岛素原基因序列(NM_000207.2，NCBI)经由聚合酶链反应(PCR)扩增，并可使用标准合成技术使用自动化的DNA合成仪被制备。多核苷酸可与核酸互换使用。

编码单链胰岛素类似物的多核苷酸可以包括编码上面描述的A链、B链和C-肽的氨基酸序列的多核苷酸。

根据本发明的重组载体典型地可以被构建为用于克隆的载体或用于表达的载体，以及用于将原核细胞或真核细胞作为宿主细胞使用的载体。

如本文所用，术语“载体”是指核酸构建体，其是能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白的重组载体，并且其包括可操作地连接以表达核酸插入物的必需调节元件。本发明可以产生包含编码胰岛素类似物的核酸的重组载体，以及通过将重组载体转化或转染到宿主细胞中，可以获得本发明的单链胰岛素类似物。

在本发明中，编码单链胰岛素类似物的核酸被可操作地连接到启动子。如本文所用，术语“可操作地连接”是指在核酸表达控制序列(例如：启动子、信号序列、核糖体结合位点、转录终止序列等)和其它核酸序列之间的功能性连接，并且调节序列从而调节其它核酸序列的转录和/或翻译。

如本文所用，术语“启动子”是指编码区上游的未翻译核酸序列，其包括聚合酶的结合位点并具有对位于启动子下游的基因的mRNA的转录起始活性，即，聚合酶结合以起始基因转录的DNA区，并且位于mRNA转录起始位点的5’位点。

例如，当本发明的载体是重组载体并且原核细胞是宿主细胞时，其一般包括进行转录的强启动子(例如：tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子、T7启动子等)、用于起始翻译的核糖体结合位点、以及转录/翻译终止序列。

此外，可用于本发明中的载体可通过操纵本领域中经常使用的质粒(例如：pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pET系列、pPICZα系列、pUC19等)、噬菌体(例如：λgt4·λB、λ-Charon、λΔz1、M13等)、或病毒(例如：SV40等)而产生。

同时，当本发明的载体是重组载体且真核细胞是宿主细胞时，可以使用衍生自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如：金属硫蛋白(metallothionine)启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如：腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子、和HSV的tk启动子)，并且其一般具有多聚腺苷酸化序列(例如：牛生长激素终止子和衍生自SV40的多聚腺苷酸化序列)。

此外，本发明的重组载体包含本领域常规使用的抗生素抗性基因作为选择标记，且例如可以使用对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素抗性的基因。

本发明的重组载体可根据需要进一步包含其他序列，以促进待回收的靶蛋白(即胰岛素类似物)的纯化。可以另外被包括的序列可以是蛋白片剂的标签序列，如谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，USA)、麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)和六聚组氨酸(hexahistidine)等，但是实例不限制靶蛋白的纯化所需的序列类型。

由包含这种标签序列的重组载体表达的融合蛋白可以通过亲和层析被纯化。例如，当谷胱甘肽-S-转移酶被融合时，可以使用作为酶底物的谷胱甘肽，以及当使用六聚组氨酸标签时，可以使用Ni-NTA柱容易地回收靶蛋白。

使用包含编码单链胰岛素类似物的多核苷酸的重组载体，可以构建用载体转化的转化体。

如本文所用，术语“转化”是指其中DNA被引入到宿主细胞中，以允许DNA作为染色体的因子或通过染色体整合的完成而被复制，并且外部DNA被引入到细胞中以人工地导致基因变化的现象。

作为本发明的转化方法，可以使用任何转化方法，并且可以根据本领域中的常规方法容易地进行。一般来说，对于转化方法，有CaCl₂沉淀法，通过在CaCl₂沉淀法中使用称为二甲基亚砜(DMSO)的还原物质来提高效率的Hanahan法、电穿孔法、磷酸钙沉淀法、等离子体融合法、用碳化硅纤维的搅拌法、农杆菌介导的转化法、使用PEG的转化法、葡聚糖硫酸酯、脂质转染胺(lipofectamine)、干燥/抑制介导的转化法等。

根据本发明的转化包含编码单链胰岛素类似物的核酸的重组载体的方法不限于上述实例，且可以不受限制地使用本领域中常规使用的转化或转染方法。

本发明的转化体可以通过将包含编码作为靶核酸的单链胰岛素类似物的核酸的重组载体引入到宿主细胞中而获得。

只要适用于本发明的宿主允许本发明的核酸被表达，适用于本发明的宿主没有特别地被限制。可用于本发明中的宿主的具体实例包括埃希氏菌属(genus Escherichia)的细菌，如大肠杆菌(E.coli)；芽孢杆菌属(genus Bacillus)的细菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；假单胞菌属(genus Pseudomonas)的细菌，如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；酵母，如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；昆虫细胞，如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF9)等；和动物细胞，如CHO、COS、BSC等，但不限于此。具体地，大肠杆菌被用作宿主细胞。

实施本发明的另一个方面提供了使用转化体制备单链胰岛素类似物的方法。

具体地，本发明提供了制备单链胰岛素类似物的方法，其包括：

a)通过培养包含编码单链胰岛素类似物的核酸的转化体，表达单链胰岛素类似物；以及

b)分离并纯化表达的单链胰岛素类似物。

单链胰岛素类似物、核酸和转化体与上面描述的相同。

本发明中用于培养转化体的培养基应以适当的方式满足宿主细胞培养的要求。可包括在用于宿主细胞生长的培养基中的碳源可根据制备的转化体的类型在本领域技术人员判断下适当地选择，并可采用适当的培养条件以控制培养的时机和量。

可以使用的糖源可以包括糖和碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素)；油和脂肪(如大豆油、葵花籽油、蓖麻油、椰子油)；脂肪酸(如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸)；醇(如甘油、乙醇)；和有机酸(如乙酸)。这些物质可以单独使用或组合使用。

可使用的氮源可包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆小麦(soybean wheat)和尿素，或无机化合物(如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)。氮源也可以单独使用或作为混合物使用。

可使用的磷源可包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾、或其相应的含钠盐。此外，培养基可以含有生长所需的金属盐(如硫酸镁或硫酸铁)。

最后，除了这些物质之外，还可以使用必需的生长物质(如氨基酸和维生素)。此外，可以使用适合于培养基的前体。上述原料可在培养期间以适合培养物的方式分批式或连续地被添加。碱性化合物(如氢氧化钠、氢氧化钾、和氨)、或酸性化合物(如磷酸或硫酸)可以以适当的方式被用于调节培养物的pH。此外，可以使用消泡剂(如脂肪酸聚乙二醇酯)来抑制气泡的产生。为了维持有氧条件，氧气或含氧气体(例如：空气)被注射到培养物中。

根据本发明的转化体的培养通常在20℃至45℃，具体地25℃至40℃的温度下进行。此外，继续培养直到获得期望的单链胰岛素类似物的最大量，且为了这个目的，培养通常可持续10小时至160小时。

如上面描述的，如果依据宿主细胞建立适当的培养条件，根据本发明的转化体将产生单链胰岛素类似物，并且依据载体的组成和宿主细胞的特性，产生的单链胰岛素类似物可以被分泌到宿主细胞的细胞质中、到周质间隙中、或细胞外。

在宿主细胞中或宿主细胞外表达的蛋白质可以以常规方式纯化。纯化方法的实例包括盐析(例如：硫酸铵沉淀、磷酸钠沉淀等)、溶剂沉淀(例如：使用丙酮、乙醇等的蛋白质分级沉淀)、透析、凝胶过滤、离子交换、层析(如反相柱层析)、超滤等可单独使用或组合使用。

在本发明的具体实施方式中，用于制备单链胰岛素类似物的方法可包括：

(a)以其中由包含蛋白酶切割位点的5至20个氨基酸组成的肽被融合到单链胰岛素类似物的N-末端的形式表达单链胰岛素类似物；以及

(b)移除与单链胰岛素类似物融合的肽。

融合到单链胰岛素N-末端的肽有助于单链胰岛素类似物表达产率的增加，并且具有蛋白酶(例如，胰蛋白酶)切割位点，以及从而在单链胰岛素类似物的产生时其被有效地移除。只要其有助于单链胰岛素类似物的表达产率的增加并且其包括蛋白酶切割位点，待添加到单链胰岛素类似物的N-末端的肽不受限制。肽可以由5至20个氨基酸组成，更具体地，7至18、或9至16个氨基酸组成，更加具体地，可以包括MATTSTATTR(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列。与肽融合的单链胰岛素类似物可具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列，但不限于此。

在一个具体示例性的实施方式中，与肽融合的单链胰岛素类似物可以是将肽融合在单链胰岛素类似物的N-末端，其中天然胰岛素A链；C肽的类似物；和天然胰岛素B链按上述顺序被连接，并且具体地，可以具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列，但不限于此。

在本发明的实施方式中，可进一步包括以下步骤以从转化体分离和纯化以内含体形式表达的单链胰岛素类似物。

b-1)从步骤a)的培养基中收获并破碎转化体；

b-2)回收以及复性(refolding)在破碎的细胞裂解物中表达的单链胰岛素类似物；

b-3)通过阳离子交换层析纯化复性的(refolded)单链胰岛素类似物；

b-4)用蛋白酶(例如，胰蛋白酶或羧肽酶B)处理纯化的单链胰岛素类似物；和/或

b-5)通过阳离子交换层析、阴离子交换层析、反相层析、或其组合纯化被处理的单链胰岛素类似物。

此外，分离和纯化步骤进一步可包括当单链胰岛素类似物以将包含蛋白酶切割位点的肽融合到单链胰岛素类似物的形式表达时，移除与单链胰岛素类似物融合的肽。

本发明的又一个方面提供了制剂，其可增加单链胰岛素类似物的半衰期和生物利用率、或持续地维持活性。具体地，制剂是指包含直接共价键合到单链胰岛素类似物的运载体的制剂、或包含即使在不存在直接共价键的情况下能够增加单链胰岛素类似物的体内活性的组分的制剂。

此外，本发明的又一个方面提供了作为长效胰岛素的单链胰岛素类似物缀合物，其中单链胰岛素类似物和可增加其体内半衰期的物质被连接在一起。此外，本发明的单链胰岛素类似物具有比天然胰岛素低的活性，从而降低了低血糖的风险——其是现有天然胰岛素的最大问题。这个长效制剂可维持低活性，且因此在没有低血糖风险的情况下，有利于血糖水平的长期控制。

在一个具体实施方式中，本发明的单链胰岛素类似物缀合物具有以下化学式1的结构：

[化学式1]

X-Y-Z-La-F

其中：

X是天然胰岛素A链、B链或其类似物，

Y是天然胰岛素C-肽或其类似物，

Z是天然胰岛素B链、A链或其类似物，

L是连接体，

a为0或自然数，条件是当a为2或更大时，每个L彼此独立，

F是能够增加胰岛素类似物体内半衰期的物质，

条件是其中X、Y和Z分别是天然胰岛素的B链、C-肽和A链，或者分别是天然胰岛素的A链、C-肽和B链的情况被排除，以及

X-Y-Z形成单链胰岛素类似物。

“-”意指每个键，并表明直接键或连接体。连接体可以是肽基连接体或非肽基连接体。

此外，“-”可以是诸如非共价键或共价键的任何化学键，且具体地，可以是共价键，但不限于此。

L可以是肽基聚合物或非肽基聚合物。

当L是肽基聚合物时，它可以包括一个或多个氨基酸，例如可以包括1至1000个氨基酸，但不特别限于此。各种已知的肽基连接体可用于本发明中以连接本发明中的F和Z，并且包含例如[GS]_x连接体、[GGGS]_x连接体和[GGGGS]_x连接体等，并且这里，x可以是1或更大的自然数。然而，不限于上述实施方式。

当L是非肽基聚合物时，非肽基聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合，且更具体地，其可为聚乙二醇，但不限于此。

X-Y-Z和F可以通过共价或非共价化学键彼此被键合，并且X-Y-Z和F可以通过L经由共价化学键、非共价化学键、或其组合彼此被键合。

如本文所用，术语“长效胰岛素”是指其中单链胰岛素类似物与能够延长半衰期的生物相容性物质结合的物质。与天然胰岛素相比，长效胰岛素具有增加的半衰期。

单链胰岛素类似物与上面描述的相同。

在本发明中，“生物相容性物质或能够增加体内半衰期的物质”是指可被连接到单链胰岛素类似物并延长其半衰期的物质。“生物相容性物质”或“能够增加体内半衰期的物质”可与本发明中的“运载体”互换使用。

生物相容性物质或运载体包含可被连接到单链胰岛素类似物并延长其半衰期的任何物质，并且例如可选自聚乙二醇、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合物质(albumin binding agent)、特定氨基酸序列重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合物质、体内结缔组织或其衍生物、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖和聚合物，但不限于此。

生物相容性物质或运载体可以通过共价键或非共价键被连接到单链胰岛素类似物。此外，单链胰岛素类似物与生物相容性物质或运载体的连接包括遗传重组方法和使用聚合物、低分子量化学物质(chemicals)等的体外结合，但不限于任何结合方法。

在本发明中，当使用聚乙二醇作为运载体时，它可以包括Ambrx的Recode技术(其可以以位点特异性的方式附接聚乙二醇)，以及可以包括Neose的糖基聚乙二醇化(glycopegylation)技术(其可以将聚乙二醇特异性地附接到糖链位点)。此外，它可以包括其中聚乙二醇在体内缓慢地被移除的可释放PEG技术，但不限于此，并且它可以包括使用PEG增强生物利用率的技术。

此外，可以使用上述技术将诸如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、和透明质酸的聚合物连接到胰岛素类似物。

在本发明中，当白蛋白被用作运载体时，可包括以下技术：白蛋白或白蛋白片段可被直接共价结合到胰岛素类似物以增加体内稳定性的技术；其中白蛋白结合物质(例如，白蛋白特异性结合抗体或抗体片段)可被连接到胰岛素类似物从而允许胰岛素类似物被结合到白蛋白(尽管白蛋白本身不直接结合到胰岛素类似物)的技术，和其中对白蛋白具有结合亲和力的特定肽/蛋白质(例如，使用AffiBody的albumod技术产生的白蛋白结合肽)可以被连接到胰岛素类似物的技术；以及其中对白蛋白具有结合亲和力的脂肪酸等可以被连接到胰岛素类似物的技术，但待使用的技术不限于此，且可以包括可使用白蛋白增加体内稳定性的任何技术、结合方法等。

本发明中还包括使用抗体或抗体片段作为运载体(carrier)连接胰岛素类似物以增加体内半衰期的技术。它可以是具有FcRn结合位点的抗体或抗体片段，且也可以是不包括FcRn结合位点(如Fab等)的任何抗体片段。使用通过CovX的催化抗体的CovX-body技术可以被包括其中，以及使用免疫球蛋白Fc区增加体内半衰期的技术也可以包括在本发明中。

FcRn结合物质可以是免疫球蛋白Fc区。

如本文所用，术语“免疫球蛋白Fc区”是指免疫球蛋白排除重链和轻链可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区(CL)之外的其余部分，并且免疫球蛋白Fc区进一步可以在重链恒定区中包括铰链区。特别地，它可以是包括免疫球蛋白Fc区的部分或全部的片段，使得免疫球蛋白Fc区可以与免疫球蛋白片段或免疫球蛋白恒定区互换使用。

虽然天然Fc在重链恒定区1的Asn297位点具有糖链，但大肠杆菌衍生的重组Fc以不具有糖链的形式表达。当糖链从Fc被移除时，结合到重链恒定区1的Fcγ受体1、2、3和补体(c1q)的结合亲和力被降低，从而降低或消除抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性。

如本文所用，术语“免疫球蛋白恒定区”是指Fc片段，其包括重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)(或包括重链恒定区4(CH4))部分(排除免疫球蛋白的重链和轻链可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区(CL))，并且它可以在重链恒定区中包括铰链区。此外，只要本发明的免疫球蛋白恒定区与天然形式相比具有基本上等同或提高的效果，它可以是包括重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区(CL)的部分或全部的扩展的免疫球蛋白恒定区(排除免疫球蛋白的重链和轻链可变区)。此外，免疫球蛋白恒定区也可以是从其已经移除了相当长的对应于CH2和/或CH3的氨基酸序列的区域。即，本发明的免疫球蛋白恒定区可以是(1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域，(2)CH1结构域和CH2结构域，(3)CH1结构域和CH3结构域，(4)CH2结构域和CH3结构域，(5)一个或两个或更多个恒定区结构域和免疫球蛋白铰链区(或铰链区的部分)的组合，以及(6)重链恒定区和轻链恒定区的各结构域的二聚体。包括免疫球蛋白Fc片段的恒定区作为药物的运载体使用是安全的(因为它们是在体内代谢的可生物降解的多肽)。此外，因为与整个免疫球蛋白分子相比，免疫球蛋白Fc片段具有相对低的分子量，所以它们在缀合物的制备、纯化和产率方面是有利的。此外，由于抗体和抗体的氨基酸序列不同，表现出高度非同质性的Fab部分被移除，使得可以预期物质的同质性(homogeneity)被大大增加，并且诱导血液抗原的可能性也被降低的效果。

同时，免疫球蛋白恒定区可以是人或动物(如牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等)来源，且具体地，是人来源。此外，免疫球蛋白恒定区可选自衍生自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM、或其组合、或其杂合体的恒定区。具体地，免疫球蛋白恒定区可以衍生自在人血液中最丰富的IgG或IgM，且最具体地，衍生自已知增强配体结合蛋白的半衰期的IgG。在本发明中，免疫球蛋白Fc区可以是单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体，单链免疫球蛋白由相同来源的结构域组成。

如本文所用，术语“组合”意指当形成二聚体或多聚体时，编码相同来源的单链免疫球蛋白恒定区(具体地Fc区)的多肽与不同来源的单链多肽形成键。即，从选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE的片段的两个或更多个片段制备二聚体或多聚体是可能的。

如本文所用，术语“杂合体”意指在单链免疫球蛋白恒定区(具体地，Fc区)中存在对应于不同来源的两个或更多个免疫球蛋白恒定区的序列。在本发明的情况下，各种类型的杂合体是可能的。即，选自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4中的1至4种结构域组成的结构域的杂合体是可能的，并且可进一步包括铰链区。

IgG也可被划分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的亚类，且其组合或杂合形式在本发明中也是可能的。具体地，IgG可以是IgG2和IgG4亚类，且更具体地，几乎没有效应子功能(如补体依赖性细胞毒性(CDC))的IgG4的Fc区。

此外，免疫球蛋白恒定区可以是天然糖链的形式、与天然形式相比增加的糖链、与天然形式相比减少的糖链、或糖链被移除。常规方法如化学方法、酶促法、以及利用微生物的遗传工程可用于增加或减少免疫球蛋白恒定区的糖链。在这种情况下，在从免疫球蛋白恒定区移除糖链的免疫球蛋白恒定区中，补体(c1q)的结合亲和力被显著降低。特别地，由于抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性被降低或消除，免疫球蛋白恒定区在体内不会导致不必要的免疫应答。在这方面，更符合其作为药物运载体的原始目的的形式将是其中糖链被移除或非糖基化的免疫球蛋白恒定区。因此，更加具体地，可以使用衍生自人的非糖基化的Fc区，即人非糖基化的IgG4Fc区。人衍生的Fc区可以是比可导致不期望的免疫应答(如在人体内充当抗原并产生针对它们的新抗体)的非人衍生的Fc区优选的。

此外，本发明的免疫球蛋白恒定区包括天然氨基酸序列以及其序列衍生物(突变体)。氨基酸序列衍生物意指天然氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基通过缺失、插入、非保守或保守取代，或其组合而具有不同的序列。例如，在IgG Fc的情况下，已知对结合重要的第214至第238、第297至第299、第318至第322、或第327至第331位氨基酸残基可用作用于修饰的合适位点。此外，各种类型的衍生物是可能的，其中可以形成二硫键的位点被移除、在天然Fc中N末端的一些氨基酸被移除、或者在天然Fc的N末端添加甲硫氨酸残基等。此外，可以移除补体结合位点，如C1q结合位点，或者可以移除ADCC位点以消除效应子功能。制备这种免疫球蛋白恒定区的序列衍生物的技术被公开于WO 97/34631、WO 96/32478等中。

总体上不改变分子活性的蛋白质和肽中的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常规发生的交换是氨基酸残基Ala/Ser,Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly之间的交换。依据情况，它可通过磷酸化、硫酸化、酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等被修饰。

虽然上面描述的免疫球蛋白恒定区衍生物表现出与本发明的免疫球蛋白恒定区相同的生物活性，但它可以是其中免疫球蛋白恒定区的对热、pH等的结构稳定性增强的衍生物。此外，这种免疫球蛋白恒定区可以从由人和动物(如牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等)体内分离的天然形式获得，并且这些可以是从转化的动物细胞或微生物获得的重组类型或其衍生物。在这种情况下，从天然形式获得的方法是通过从人或动物的活体分离出完整的免疫球蛋白，然后用蛋白酶处理来获得。当用木瓜蛋白酶处理时，完整的免疫球蛋白被切割为Fab和Fc，而当用胃蛋白酶处理时，完整的免疫球蛋白被切割为pF′c和F(ab)2。Fc或pF′c可以通过使用尺寸排阻层析等从这些片段分离出来。

具体地，人衍生的免疫球蛋白恒定区可以是从微生物获得的重组免疫球蛋白恒定区。

在一个具体实施方式中，在本发明的缀合物中，单链胰岛素类似物和能够增加其体内半衰期的物质可经由连接体连接。

在本发明中，连接体可以是处于其中连接体被连接到单链胰岛素类似物或能够增加其体内半衰期的物质中的每一个的N-末端、C-末端、赖氨酸、组氨酸或半胱氨酸的形式中。

连接体可以是肽基连接体或非肽基连接体。

作为非肽基连接体，抗蛋白酶聚合物可用于维持单链胰岛素类似物的血液半衰期，类似于能够增加单链胰岛素类似物的体内半衰期的物质。因此，只要非肽基连接体是具有上述作用的非肽基聚合物，即在体内具有对蛋白酶的抗性，则可以在本发明中使用的非肽基连接体可以不受限制地使用。

如本文所用，术语“非肽基聚合物”包括具有结合到其上的两个或更多个重复单元的生物相容性聚合物，并且可与术语“非肽基连接体”互换使用。重复单元通过不是肽键的任何共价键彼此结合。在本发明中，非肽基聚合物可在其端包括反应器(reactor)，以通过与构成缀合物的其它组分的反应形成缀合物。

如本文所用，术语“非肽连接部分”是指通过将在两端具有反应性基团的非肽基聚合物与免疫球蛋白Fc区和单链胰岛素类似物通过各反应性基团结合而形成的缀合物中的组分。

在一个具体实施方式中，单链胰岛素类似物缀合物可以是免疫球蛋白Fc区和单链胰岛素类似物通过非肽基聚合物彼此共价结合，非肽基聚合物包括能够连接在非肽基聚合物两端的免疫球蛋白Fc区和单链胰岛素类似物的反应性基团。

具体地，虽然不特别限定于此，但非肽基聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚，诸如聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(polylactic-glycolic acid)(PLGA)的生物可降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸及其组合。在更具体的实施方式中，非肽基聚合物可以是聚乙二醇，但不限于此。此外，那些在本领域已知的衍生物和在本领域的技术水平上可以容易地制备的衍生物也包括在本发明的范围内。

通过连接体的连接可以是任何化学键，如非共价化学键或共价化学键，但不限于此。

更具体地，在本发明中，非肽基聚合物包括具有连接到其上的两个或更多个重复单元的生物相容性聚合物，并且重复单元通过不是肽键的任何共价键彼此结合。这种非肽基聚合物可以具有两端或三端。

只要非肽基聚合物是对体内蛋白酶具有抗性的聚合物，可用于本发明的非肽基聚合物可以不受限制地使用，并且具体地，非肽基聚合物的分子量可以在0kDa至200kDa的范围内，具体地，1kDa至100kDa的范围内，更具体地，1kDa至50kDa的范围内，更加具体地，1kDa至20kDa的范围内，更加具体地，3.4kDa至10kDa的范围内，和更加具体地，约3.4kDa，但不限于此。

此外，对于运载体，特别地，与免疫球蛋白Fc区连接的本发明的非肽基聚合物，不仅可以使用一种类型的聚合物，而且可以使用不同类型的聚合物的组合。

在一个具体的示例性实施方式中，非肽基聚合物的两端可以各自结合到免疫球蛋白Fc区或单链胰岛素类似物的胺基、硫醇基或羟基。

具体地，非肽基聚合物可以包括能够在两端连接免疫球蛋白Fc和单链胰岛素类似物中的每一个的反应性基团，具体地，能够连接位于单链胰岛素类似物或免疫球蛋白Fc区的N-末端、赖氨酸和/或组氨酸的胺基，位于C-末端的羟基和/或半胱氨酸的硫醇基的反应性基团，但不限于此。

更具体地，非肽基聚合物的反应性基团可以是选自醛基团、丙醛基团、丁醛基团、马来酰亚胺基团、和琥珀酰亚胺衍生物中的一种或多种，但不限于此。

在上述中，醛基团的实例包括但不限于丙醛基团或丁醛基团，但不限于此。

在上述中，对于琥珀酰亚胺衍生物，可以使用琥珀酰亚胺基羧甲基、琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺磷(N-hydroxysuccinimide phosphorus)或琥珀酰亚胺基碳酸酯，但不限于此。

非肽基聚合物可经由上述反应性基团被连接到免疫球蛋白Fc和单链胰岛素类似物，并转化为非肽基聚合物连接部分。

此外，由醛键通过还原性烷基化产生的最终产物比通过酰胺键连接时稳定得多。醛反应基团在低pH下选择性地在N-末端反应，而在高pH(例如，pH 9.0的条件)下，可与赖氨酸残基形成共价键。

本发明的非肽基聚合物的反应性端基团可以彼此相同或不同。非肽基聚合物可以在端处具有醛基(aldehyde group)反应性基团，并且非肽基聚合物可以在端处具有醛基团和马来酰亚胺反应性基团中的每一个，或者可以在端处具有醛基团或琥珀酰亚胺基团中的每一个，但不限于此。

例如，非肽基聚合物可以在一端具有马来酰亚胺基团，而在另一端具有醛基团、丙醛基团、或丁醛基团。作为另一个实例，它可以在一端处具有琥珀酰亚胺基团，而在另一端具有丙醛基团或丁醛基团。

当在二乙酮(propion)侧端具有羟基反应性基团的聚乙二醇被用作非肽基聚合物时，本发明的缀合物可以使用已知的化学反应来将羟基活化成各种反应性基团，或者通过使用商业上可获得的具有修饰反应性基团的聚乙二醇来制备。

在一个具体实施方式中，非肽基聚合物的反应性基团可以被连接到单链胰岛素类似物的半胱氨酸残基，更具体地，连接到半胱氨酸的-SH基团，但不限于此。

如果使用马来酰亚胺-PEG-醛，则马来酰亚胺基团可以通过硫醚键被连接到单链胰岛素类似物的-SH基团，并且醛基团可以通过还原性烷基化反应被连接到免疫球蛋白Fc的-NH₂基团，但连接不限于此，且这仅仅是一种实施方式。

通过这种还原性烷基化，免疫球蛋白Fc区的N-末端氨基和位于PEG的一端的氧原子经由具有-CH₂CH₂CH₂-结构的连接体反应性基团彼此连接，以形成诸如-PEG-O-CH₂CH₂CH₂NH-免疫球蛋白Fc的结构，且硫醚键可以形成其中PEG的一端被连接到位于单链胰岛素类似物的半胱氨酸中的硫原子的结构。上面描述的硫醚键可以包括

的结构。

然而，连接并不特别限于上述实例，并且这仅仅是一种实施方式。

此外，在缀合物中，非肽基聚合物的反应性基团可以被连接到位于免疫球蛋白Fc区的N-末端的-NH₂，但这仅仅是一种实施方式。具体地，本发明的单链胰岛素类似物可以经由C-末端与具有反应性基团的非肽基聚合物连接。

在本发明中，“C-末端”是指肽的羧基末端，并且是指为本发明的目的能够与非肽基聚合物结合的位置。例如，虽然不特别限定于此，但C-末端可以包括C-末端附近的所有氨基酸残基以及C-末端的最末端氨基酸残基，且具体地，它可以包括自最末端的第1至20个氨基酸残基。

在一个具体实施方式中，单链胰岛素类似物与能够延长体内半衰期的物质的连接可以通过遗传重组方法进行。

本发明的另一方面提供了用于制备单链胰岛素类似物的方法，其包括将单链胰岛素类似物连接到能够增加其体内半衰期的物质。

单链胰岛素类似物、能够增加其体内半衰期的物质、和单链胰岛素类似物缀合物与上面描述相同。

具体地，方法可以包括：

(a)通过使具有两个或更多个反应性端基团的非肽基聚合物与单链胰岛素类似物或运载体中的一个反应来制备连接部分，以将单胰岛素类似物或运载体附接到非肽基聚合物的一端，并且以在其另一端具有反应性端基团；以及

(b)通过使在上述步骤(a)中制备的连接部分与运载体或单链胰岛素类似物中未附接到连接体(connective body)的的另一个反应来制备缀合物，使得单链胰岛素类似物与运载体经由非肽基聚合物连接。

上述描述适用于非肽基聚合物、运载体、单链胰岛素类似物、及它们的连接构成。

如本文所用，术语“连接部分”是指其中非肽基聚合物和单链胰岛素类似物或运载体中的仅一个被共价连接的中间体，并且在连接部分中，未附接到连接体的单链胰岛素类似物或运载体可以被附接到非肽基聚合物(未被连接到单链胰岛素类似物或运载体)的端。

单链胰岛素类似物可根据用于制备上面描述的单链胰岛素类似物的方法获得，并可按商业要求制备。

本发明的另一方面提供了具有增强的体内持续时间和稳定性的长效单链胰岛素制剂，其包括单链胰岛素类似物缀合物或单链胰岛素类似物。

同时，对于可增加生物利用率或维持持续性活性的制剂，通过使用利用PLGA、透明质酸、壳聚糖等的微粒、纳米颗粒等制备的缓释制剂可以被包括在其中。

此外，对于能够增加生物利用率或维持持续性活性的其他形式的制剂，可能有植入物、吸入剂、鼻用制剂、以及贴片形式的制剂。

本发明的这些单链胰岛素类似物或单链胰岛素类似物缀合物不仅维持了现有胰岛素的体内活性，如能量代谢和糖代谢，而且显著增加了胰岛素类似物的血液半衰期和肽的体内活性持续效应，并因此它可用于糖尿病的治疗。

本发明的另一个方面提供用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包含单链胰岛素类似物或单链胰岛素类似物缀合物。

单链胰岛素类似物和单链胰岛素类似物缀合物与上面描述相同。

如本文所用，术语“预防”是指通过药物组合物的给予抑制或延迟糖尿病发病的任何行为，和术语“治疗”是指通过药物组合物的给予改善糖尿病症状或使之好转的任何行为。

如本文所用，术语“给予”意指以任何合适的方式将某种物质引入到患者中，并且药物组合物的给予途径没有特别地被限制，但是组合物可以经由任何能够到达体内靶标(targets)的一般途径(例如，腹膜内给予、静脉内给予、肌肉内给予、皮下给予、皮内给予、口服给予、局部给予、鼻内给予、肺内给予或直肠内给予等)给予。

本发明的药物组合物可进一步包含药学上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂。这种药学上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂可能是非天然存在的。运载体没有特别地被限制，但是对于口服给予，可以使用粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、香料(fragrances)等。在注射剂的情况下，可组合使用缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等张剂、稳定剂等。对于局部给予，可以使用基质、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。

如本文所用，术语“药学上可接受的”意指其是产生治疗效果的足够量且不导致副作用，并且其可由本领域技术人员根据医学领域中公知的要素(如疾病类型、患者的年龄、体重、健康和性别，患者对药物的敏感度、给予途径、给予方法、给予频率、治疗的持续时间、组合或同时使用的药物等)容易地确定。

本发明组合物的制剂可以与上面描述的药学上可接受的运载体以各种组合制备。例如，对于口服给予，它可被制备成片剂、锭剂(troches)、胶囊剂、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)等形式，以及在注射剂的情况下，它可被制备成单位剂量安瓿或多种剂型形式。它可被配制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂等。

同时，对于适用于制剂的运载体、赋形剂和稀释剂的实例，可以使用乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶(acacia)、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。此外，可进一步包括填料、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、防腐剂等。

此外，本发明的药物组合物可以具有选自片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮液、内用液体溶液(liquid solutions for internal use)、乳剂、糖浆、无菌水溶液、非水溶剂、冻干制剂和栓剂的任何一种制剂。

此外，将组合物根据药学领域中的常规方法以适合于患者体内给予的单位剂型配制，具体地，配制成可用于蛋白质药物的给予的形式，并且可以通过使用本领域中常规使用的给予方法，(如口服，或胃肠外给予途径，包括皮肤、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、肺、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、消化道、局部、舌下、阴道内或直肠的途径)给予，但不限于此。

此外，缀合物可以通过与被接受为药物的各种运载体(如生理盐水或有机溶剂)混合来使用，并且为了增加稳定性或吸收，碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)；抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)；其它稳定剂(如螯合剂、低分子量蛋白质等)可被用作药物。

本发明的药物组合物的剂量和频率根据作为活性成分的药物的类型、以及各种相关因素(如要治疗的疾病、给予途径、患者的年龄、性别和体重、疾病的严重程度等)来确定。

本发明组合物的总有效量可以以单剂量向患者给予，以及可以通过以多剂量长时间段给予的分次治疗方案给予。根据疾病的严重程度，本发明的药物组合物可以具有变化的活性成分含量。具体地，本发明的缀合物的优选总剂量可以是每kg患者体重每天约0.0001mg至500mg。然而，由于考虑药物组合物的给予途径和治疗频率以及各种因素(如患者的年龄、体重、健康状况和性别、疾病的严重程度、饮食、排泄率等)来确定用于患者的有效剂量的缀合物的剂量，因此本领域技术人员将能够确定用于本发明组合物的特定用途的适当的有效剂量。根据本发明的药物组合物，只要显示本发明的效果，关于其制剂、给予途径和给予方法，没有特别地被限制。

本发明的又一个方面提供了用于预防或治疗糖尿病的方法，其包括将包含单链胰岛素类似物或单链胰岛素类似物缀合物的药物组合物给予给需要其的对象。

单链胰岛素类似物、单链胰岛素类似物缀合物、预防和治疗与上面描述相同。

如本文所用，术语“对象”是怀疑患有糖尿病疾病的对象，并且怀疑患有糖尿病疾病的对象是指包括具有疾病或可能发展疾病的人的，包括小鼠、家畜等的哺乳动物。此外，包括但不限于可用单链胰岛素类似物、单链胰岛素类似物缀合物、或包含其的组合物治疗的对象。

本发明的方法可以药物有效量给予药物组合物。适当的每日总剂量可由医师在良好的医学判断范围内确定，并可一次或多次分剂量被给予。然而，为了本发明的目的，具体的治疗有效量优选基于各种因素和医学领域中公知的类似因素(如要实现的应答的类型和严重程度，以及在一些情况下是否使用其它药剂，以及具体组合物，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，给予时间，给予途径，组合物的分泌率，治疗持续时间，与具体组合物组合使用或同时使用的药物)而不同地应用。

下文，将参考实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例1：单链胰岛素类似物表达载体的制备

1.胰岛素原类似物(A链-C肽-B链)的制备

制备了具有核苷酸序列的表达载体，以允许胰岛素类似物和胰岛素原类似物在大肠杆菌中的表达。为了释放(free)胰岛素A链的N-末端，表达载体包括能够表达天然胰岛素原(B链-C肽-A链；SEQ ID NO:4和5)和其它胰岛素原类似物(A链-C肽-B链，SEQ ID NO:6和7)的核苷酸序列，并且如下被制备。

[表1]

为了制备编码86个氨基酸的胰岛素原类似物的表达载体，基于已报道的胰岛素原基因序列(NM_000207.2，NCBI)合成了6种引物。此外，以胰岛素原cDNA(Origene)为模板，用PCR方法分别扩增了A链、C肽和B链，然后通过将3种PCR扩增产物与引物混合进行了PCR，以合成胰岛素原类似物基因。

具体地，为了胰岛素原类似物基因的A链的合成，合成了包含起始ATG密码子和Ndel限制酶位点的正向引物(SEQ ID NO:8)，并且合成了包含A链的3′末端区域序列和C肽的5′区域序列的反向引物(SEQ ID NO:9)。为了合成编码C-肽的基因，合成了包含A链的N-末端序列和C肽序列的正向引物(SEQ ID NO:10)，并且合成了包含C肽的3′末端序列和B链的5′末端序列的反向引物(SEQ ID NO:11)。为了合成编码B链的基因，合成了包含C肽的3′末端序列和B链序列的正向引物(SEQ ID NO:12)，并且合成了包含B链的5′末端序列和限制酶BamHI序列的反向引物(SEQ ID NO:13)。上述引物的序列如下。

5'GGAATTCCATATGGGCATTGTGGAACAATGCTGT 3'(SEQ ID NO:8)

5'CTGCCTCCCGGCGGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTG 3'(SEQ ID NO:9)

5'GAACTACTGCAACCGCCGGGAGGCAGAGGACCTG 3'(SEQ ID NO:10)

5'GTTGGTTCACAAAACGCTTCTGCAGGGACCCCTC 3'(SEQ ID NO:11)

5'CCTGCAGAAGCGTTTTGTGAACCAACACCTGTGC 3'(SEQ ID NO:12)

5'CGCGGATCCCTAGGTCTTGGGTGTGTAGAAGAAG 3'(SEQ ID NO:13)

利用上述引物扩增各基因后，将各PCR扩增产物、SEQ ID NO:8代表的寡核苷酸、和SEQ ID NO:13代表的引物混合在一起，以合成具有最终A链-C肽-B链序列的胰岛素原类似物(图1)。为了胰岛素原类似物的扩增，进行了PCR(在60℃下退火20秒并在68℃下延伸20秒)。

将上面获得的胰岛素原类似物片段克隆到pET22b载体(Novagen)中。为了以细胞内内含体的形式表达胰岛素原类似物，用限制酶Ndel和BamHI处理了pET22b载体以移除信号序列，用相同的限制酶Ndel和BamHI处理了胰岛素原类似物PCR产物，以及利用T4DNA连接酶将每个分离的DNA插入到pET22b克隆载体中。由上述结果获得的表达载体命名为pET22b-InvPI。

2.单链胰岛素类似物(InvPIΔRRKR)的制备

在上面获得的胰岛素原类似物的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)中，利用以下SEQ IDNO:14至17的引物移除了C肽的第1和第2位氨基酸、精氨酸(SEQ ID NO:3的第1和第2位)和C肽的最后两位氨基酸(SEQ ID NO:3的第34和第35位氨基酸)。

5'GCTGGAGAACTACTGCAACGAGGCAGAGGACCTGCAGG 3'(正向方向,SEQ ID NO:14)

5'CCTGCAGGTCCTCTGCCTCGTTGCAGTAGTTCTCCAGC 3'(反向方向,SEQ ID NO:15)

5'GGGGTCCCTGCAGTTTGTGAACCAACACCTGTGC 3'(正向方向,SEQ ID NO:16)

5'GTTGGTTCACAAACTGCAGGGACCCCTCCAGGGC 3'(反向方向,SEQ ID NO:17)

将上面获得的胰岛素原类似物的表达载体命名为pET22b-InvPIΔRRKR，并且将单链胰岛素类似物命名为InvPIΔRRKR(SEQ ID NO:18和19)。

[表2]

天然胰岛素原序列和单链胰岛素类似物序列

3.插入有结合蛋白序列的单链胰岛素类似物(FInvPIΔRRKR)及其表达载体的制 备

为了帮助在上述实施例中制备的pET22b-InvPIΔRRKR中的蛋白质表达和促进N-末端甲硫氨酸缺失的目的，合成了以下引物，以将编码10个氨基酸的序列(MATTSTATTR:SEQID NO:20)的核苷酸序列添加到InvPIΔRRKR的序列的5′部分。

具体地，为了SEQ ID NO:20的10个氨基酸的序列插入，合成了包含起始ATG密码子、Ndel限制酶位点、和10个氨基酸的序列的正向引物(SEQ ID NO:21)，并且合成了包含限制酶BamHI序列的反向引物(SEQ ID NO:22)。上述引物的序列如下。

5'TTTAAGAAGGAGATATACATCATATGGCAACAACATCAACAGCAACTACGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTG 3'(SEQ ID NO:21)

5'

CAGCATTGTTCCACAATGCCACGCGTAGTTGCTGTTGATGTTGTTGCCATATGATGTATATCTCCTTCTTAAA 3'(SEQ ID NO:22)

为了插入有结合蛋白的单链胰岛素类似物的扩增，利用上述引物进行了PCR(在60℃下退火30秒且在68℃下延伸30秒)。

将插入有上面获得的结合蛋白的单链胰岛素类似物片段克隆到pET22b载体(Novagen)中。为了使单链胰岛素类似物以细胞内内含体的形式表达，用限制酶NdeI和BamHI处理了pET22b载体以移除信号序列，并且用相同的限制酶NdeI和BamHI处理了插入有结合蛋白的单链胰岛素类似物PCR产物，并且利用T4 DNA连接酶将每个分离的DNA插入到pET22b克隆载体中。将由上述结果获得的表达载体命名为pET22b-FInvPIΔRRKR，将插入有结合蛋白的单链胰岛素类似物命名为FInvPIΔRRKR(融合-A-C-B RRKR；SEQ ID NOS:23和24)。

[表3]

插入有结合蛋白的单链胰岛素类似物(FInvPI△RRKR)的序列

pET22b-FInvPIΔRRKR表达载体在T7启动子控制下编码SEQ ID NO:24的氨基酸序列，且胰岛素原类似物蛋白在宿主细胞中以内含体形式表达。

实施例2：单链胰岛素类似物的表达

在T7启动子控制下，利用了上述实施例1中构建的表达载体以表达重组单链胰岛素类似物。用每个重组单链胰岛素类似物表达载体转化了大肠杆菌BL21DE3(E.coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)galλ(DE3)；Novagen)。对于转化方法，使用了由Novagen推荐的方法。收集了用每个重组表达载体转化的每个转化的单菌落，接种到含氨苄青霉素(50μg/mL)的2X Luria Broth培养基中，并且在37℃下温育15小时。将重组菌株培养物与含30％甘油的2X LB培养基以1:1(v/v)的比例混合，并且将各1mL分配到冷冻管(cryo-tube)中以及在-140℃下保存。所得物(resultant)被用作用于产生重组融合蛋白的细胞原液(cellstock)。

为了重组单链胰岛素类似物的表达，将一个小瓶的每种细胞原液溶解并接种在500mL的2X LB中，然后在37℃下振荡培养14小时至16小时。当OD 600nm的值到达4.0或更高时，结束培养，并且所得物被用作种子培养液。利用5L发酵罐(Bioflo-320,NBS,USA)，将种子培养物接种到1.6L发酵培养基中并开始初始发酵。将培养条件维持在pH为6.70，使用37℃的温度，2.0L/min(1vvm)的空气量，650rpm的搅拌速度和30％氨水。对于发酵过程，当培养物中的养分有限时，添加了额外的培养基(补料溶液(feeding solution))以进行补料分批培养。通过OD值监测了菌株的生长，并且在OD值70或更高时引入了终浓度为500μM的IPTG。在向其引入IPTG后，培养进一步进行长至约23小时至约25小时，以及在培养完成后，使用离心机收获了重组菌株并在-80℃下保存直至使用。

实施例3：重组单链胰岛素类似物的提取和复性

从上述实施例中获得的表达单链胰岛素类似物的大肠杆菌中破碎以及复性了细胞，以将单链胰岛素类似物转化为可溶性形式。将相当于1L培养物的细胞沉淀(pellets)悬浮在1L裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 9.0,1mM EDTApH 8.0,0.2M NaCl,0.5％Triton X-100)中，并且使用微流化(microfludizer)器在15,000psi下破碎了重组大肠杆菌。在12,000g下离心30分钟后，丢弃上清液，并且用1L裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 9.0,1mMEDTA pH 9.0,0.2M NaCl,0.5％Triton X-100)洗涤了沉淀。在与上述相同的条件下离心后，弃去了上清液，并且用蒸馏水重悬浮了沉淀。在相同条件下离心后，获得了洗涤的大肠杆菌内含体沉淀。将洗涤的内含体沉淀重悬浮在1L增溶缓冲液(6M尿素，15mM甘氨酸，pH10.6)中，并在室温下搅拌了3小时。为了溶解的单链胰岛素类似物的还原，将终浓度为15mM的L-半胱氨酸-HCl引入到其中，并且将混合物在室温下搅拌了1.5小时。通过将还原的单链胰岛素类似物与3L的95mM甘氨酸pH 10.5溶液在4℃下混合并且搅拌40小时至70小时来进行复性过程。加入了相当于溶液体积7％的反应停止溶液(1M Na-Cit pH 2.0:乙酸＝1:1.67(v/v))以终止复性反应。通过在12,000g下的离心30分钟移除了悬浮液，然后通过穿过0.45μm过滤器以移除额外的悬浮液。

实施例4：一级阳离子柱层析

通过施加到阳离子SP FF(GE Healthcare)柱纯化了上述实施例3中获得的单链胰岛素类似物复性溶液。在引入复性溶液之前，用结合缓冲液(20mM柠檬酸钠pH 3.0，45％乙醇)平衡了柱，并且使4-柱体积的洗脱缓冲液(20mM柠檬酸钠pH 3.0，0.5M KCl，45％乙醇)以0％至100％的梯度流动用于洗脱。

实施例5：使用蛋白酶的结合蛋白的移除

为了促进蛋白质表达，在单链胰岛素类似物的N-末端存在融合蛋白。为了移除这个结合蛋白，使用了胰蛋白酶(Roche)——其是蛋白酶。利用Sephadex G-25(GEHealthcare)柱以用用于酶反应的缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0)置换阳离子柱层析中获得的洗脱液。处理从柱洗脱的每克蛋白质163.28单位胰蛋白酶后，反应在15℃下进行了15小时。为了在15小时后停止移除反应，利用具有20mM磷酸钠缓冲液溶液(pH 2.0)的柱进行了缓冲液置换。

实施例6：二级阳离子柱层析

为了纯化移除了结合蛋白的单链胰岛素类似物，使用了SP HP(GE Healthcare)柱。用结合缓冲液溶液(20mM柠檬酸钠pH 3.0，45％乙醇)平衡了柱，以及使8-柱体积的洗脱缓冲液溶液(20mM柠檬酸钠pH 3.0，0.5M KCl，45％乙醇)以0％至56％的梯度流动用于洗脱。

实施例7：反相层析

为了用反相柱进一步纯化在实施例6的阳离子柱层析中洗脱的蛋白质，使用了Source 30RPC(GE Healthcare)。为了制备在纯化过程中待使用的缓冲液溶液，制备基本缓冲液溶液(0.05M磷酸钠、0.1M高氯酸钠(Na-percholate)(pH 2.3))并且将其通过0.22μm过滤器(Sartorious)过滤。通过混合90％的基本缓冲液溶液与10％的异丙醇(w/v)制备结合缓冲液溶液，以及通过混合55％的基本缓冲溶液与45％的异丙醇制备洗脱缓冲液溶液。使12.5-柱体积的洗脱缓冲液溶液以0％至100％的梯度流动用于洗脱。通过RP-HPLC(C18，C4)和SE-HPLC分析，测量洗脱的样品的纯度。纯度测量结果示于表2中。

实施例8：单链胰岛素类似物的聚乙二醇化

将通过上述实施例7的过程纯化至高纯度的单链胰岛素类似物用100mM磷酸钾(pH6.0)进行缓冲液交换以调节浓度至5mg/mL，并且为了将3.4kDa PropionylALD2 PEG聚乙二醇化至单链胰岛素类似物的N-末端，加入PEG至单链胰岛素类似物与PEG的摩尔比为1:10并完全溶解了PEG。然后，加入了作为还原剂的氰基硼氢化钠(NaCNBH₃)至20mM的浓度，并且在室温下反应了70分钟。然后，用含有30％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液将所得物稀释10倍，并且将所得物注射到Source S柱(15mm/15.5cm，GE Healthcare)中。Source S柱是用含有30％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0q)缓冲液平衡了的柱，且流速被设定为2.5mL/min。为了纯化一种聚乙二醇化的单链胰岛素类似物，通过使10-柱体积的20mM柠檬酸钠，pH 2.0，含30％乙醇的0.25M KCl缓冲液流动至浓度为0％至100％来纯化一种聚乙二醇化的单链胰岛素类似物。

实施例9：单链胰岛素类似物的制备

将使用上述实施例8的方法获得的聚乙二醇化单链胰岛素类似物与免疫球蛋白Fc偶联。单链胰岛素类似物与免疫球蛋白Fc的摩尔比被设定为1:4，并且总蛋白浓度被设定为30mg/mL，以在4℃下反应18小时。在这种情况下，作为还原剂，添加氰基硼氢化钠(NaCNBH₃)至20mM的浓度。然后，使用Sephadex G25柱将缓冲液与20mM Tris(pH7.5)缓冲液交换，然后将缓冲液注射到Source Q柱(25mm/17.6cm，GE Healthcare)中。Source Q柱是用20mM Tris(pH7.5)缓冲液平衡了的柱，且流速被设定为7mL/min。为了洗脱偶联蛋白，20mM Tris，pH7.5，0.5M NaCl缓冲液以10-柱体积从0％线性流动至30％用于洗脱。未反应的免疫球蛋白Fc可用Source Q柱移除。1.5M硫酸铵被添加到Source Q中洗脱的偶联蛋白溶液，并且混合物被注射到Source Iso柱(Source Isocolumn)(25mm/12.3cm，GE Healthcare)中。SourceIso柱是用20mM Tris-HCl(pH 7.5)，1.5M硫酸铵缓冲液平衡了的柱，且流速被设定为7.5mL/min。为了纯化单链胰岛素类似物-PEG-免疫球蛋白Fc，37-柱体积的20mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液以从0％至100％的浓度下线性流动。

Source Iso柱中最终纯化的单链胰岛素类似物缀合物(单链胰岛素类似物-PEG-免疫球蛋白Fc)通过SE-HPLC和IE-HLPC分析，且结果示于图3中。

实施例10：单链胰岛素类似物和单链胰岛素类似物缀合物的胰岛素受体结合亲和 力的确认

为了测量单链胰岛素类似物的胰岛素受体结合亲和力，使用闪烁亲近测定(SPA)方法进行了分析。在96孔pico平板(pico-plate)上，将其中表达胰岛素受体的CHO细胞系的质膜和PVT SPA珠(beads)放置在一起。为了确认与胰岛素受体的结合亲和力，将稀释到10或更多不同浓度的人胰岛素和各胰岛素类似物，以及附接有作为竞争物的放射性同位素125碘的胰岛素放置在一起，并在室温下经受竞争反应4小时。4小时后，使用β计数器测量了胰岛素受体的结合亲和力。使用GraphPad Prism 6软件通过IC50计算了各物质的结合亲和力，并通过相对于天然胰岛素的胰岛素受体结合亲和力的单链胰岛素类似物的胰岛素受体结合亲和力将其量化。

结果，与天然胰岛素相比，分别确认了单链胰岛素类似物69％的结合亲和力和单链胰岛素类似物缀合物1.9％的结合亲和力(表4)。如上所述，与天然胰岛素相比，本发明的单链胰岛素类似物显示了降低的胰岛素受体结合亲和力。

[表4]

实施例11：单链胰岛素类似物缀合物的体外功效的确认

为了测量单链胰岛素类似物缀合物的体外功效，使用分化成脂肪细胞的衍生自小鼠的3T3-L1细胞系进行了葡萄糖摄取(或脂质合成)试验。使用包括10％新生小牛血清(NBCS)的DMEM(Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium,Gibco,Cat.No.12430)每周继代培养3T3-L1细胞2至3次。使用分化培养基(包括10％FBS的DMEM)悬浮3T3-L1细胞，然后将细胞接种到48孔板中每孔5×10⁴个细胞的密度并被培养48小时。为了分化成脂肪细胞，将1μg/mL人胰岛素(Sigma,Cat.No.I9278)、0.5μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX,Sigma,Cat.No.I5879)、和1μM地塞米松(Sigma,Cat.No.D4902)混合在用于分化的培养基中，并且在移除现有培养基后，将其以每孔250μL的量添加。48小时后，再次用向用于分化的培养基中仅添加1μg/mL人胰岛素的培养基将其置换。然后，在每48小时置换包括1μg/mL人胰岛素的用于分化的培养基的同时，确认分化成脂肪细胞的诱导，持续12天。对于葡萄糖摄取试验，完成分化的细胞用无血清的DMEM培养基洗涤一次，然后各放置250μL以诱导血清耗竭4小时。用无血清DMEM培养基通过10倍连续稀释制备了从10μM至0.001nM的人胰岛素，以及用无血清DMEM培养基通过10倍连续稀释制备了从20μM至0.002nM的单链胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物。将由此制备的样品中的各250μL添加到细胞，然后在37℃下，5％CO₂培养箱中培养24小时。为了测量培养基的葡萄糖残留量，分别收集200μL的培养基并将其用D-PBS稀释5倍，并且对其进行了GOPOD测定试剂盒(GOPOD,Megazyme,Cat.No.K-GLUC)分析。基于葡萄糖标准溶液的吸光度，分别计算了培养基的残留葡萄糖浓度，并且计算了对于葡萄糖摄取的EC₅₀。

结果，确认了单链胰岛素类似物缀合物(单链胰岛素类似物-PEG-免疫球蛋白Fc)与人胰岛素相比具有8.1％的葡萄糖摄取(表5、图4)。

[表5]

单链胰岛素类似物的葡萄糖摄取

物质	EC<sub>50</sub>(nM)	％vs.人胰岛素
			人胰岛素	7.5	100
单链胰岛素类似物缀合物	92.8	8.1

实施例12：单链胰岛素类似物缀合物的药动学确认

为了确认单链胰岛素类似物缀合物的药动学，在正常大鼠(SD大鼠，雄性，6周龄)随时间进行了血药浓度对比试验(blood concentration comparison test)。分别以65.1nmol/kg和260.4nmol/kg的量皮下给予了单链胰岛素类似物缀合物，并且分别在0、1、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192和216小时收集了血液。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测量了每次单链胰岛素类似物缀合物在血液中的残留浓度，且所用试剂盒为Insulin ELISA(ALPCO,USA)。作为检测抗体，使用了小鼠抗人IgG4 HRP缀合物(AlphaDiagnostic Intl,Inc,USA)。

作为观察单链胰岛素类似物缀合物的药动学的结果，单链胰岛素类似物缀合物的半衰期为31小时至32小时，这比报道的甘精胰岛素(insulin glargine)(其是目前市场上的一种长效胰岛素类似物)在大鼠体内的半衰期(4.3小时)长约7倍(图5)。

这些结果暗示，当本发明的单链胰岛素类似物(其被修饰以降低胰岛素受体结合亲和力)与免疫球蛋白Fc区形成缀合物时，实际的体内血液半衰期可大幅增加，以提供为稳定的胰岛素制剂，并可有效地用作糖尿病治疗剂。此外，这些结果还建议，即使当与多种运载体结合时，根据本发明的单链胰岛素类似物本身，可以通过具有与胰岛素受体降低的结合亲和力和降低的效能而表现出相同的效果。

从以上描述中，本领域技术人员将理解，在不改变技术精神或基本特征的情况下，可以以其它具体形式实施本发明。在这方面，上述实施方式应在所有方面被理解为说明性的而不是限制性的。本发明的范围应当被解释为，从以下权利要求的含义和范围及等同概念而不是详细描述得出的所有改变或修改都被包括在本发明的范围内。

<110> 韩美药品株式会社

<120> 长效单链胰岛素类似物及其缀合物

<130> OPA18290-PCT

<150> KR 10-2017-0126476

<151> 2017-09-28

<160> 24

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn

20

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

20 25 30

<210> 3

<211> 35

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly

1 5 10 15

Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu

20 25 30

Gln Lys Arg

35

<210> 4

<211> 261

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

tttgtgaacc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60

gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120

caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180

tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240

ctggagaact actgcaacta g 261

<210> 5

<211> 86

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg

20 25 30

Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro

35 40 45

Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys

50 55 60

Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln

65 70 75 80

Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

85

<210> 6

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链胰岛素类似物 (A-C-B)

<400> 6

ggcattgtgg aacaatgctg taccagcatc tgctccctct accagctgga gaactactgc 60

aaccgccggg aggcagagga cctgcaggtg gggcaggtgg agctgggcgg gggccctggt 120

gcaggcagcc tgcagccctt ggccctggag gggtccctgc agaagcgttt tgtgaaccaa 180

cacctgtgcg gctcacacct ggtggaagct ctctacctag tgtgcgggga acgaggcttc 240

ttctacacac ccaagaccta g 261

<210> 7

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链胰岛素类似物 (A-C-B)

<400> 7

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln

20 25 30

Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala

35 40 45

Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly

50 55 60

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe

65 70 75 80

Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

85

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于胰岛素原类似物的A链的正向引物

<400> 8

ggaattccat atgggcattg tggaacaatg ctgt 34

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于胰岛素原类似物的A链的反向引物

<400> 9

ctgcctcccg gcggttgcag tagttctcca gctg 34

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于胰岛素原类似物的C肽的正向引物

<400> 10

gaactactgc aaccgccggg aggcagagga cctg 34

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于胰岛素原类似物的C肽的反向引物

<400> 11

gttggttcac aaaacgcttc tgcagggacc cctc 34

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于胰岛素原类似物的B链的正向引物

<400> 12

cctgcagaag cgttttgtga accaacacct gtgc 34

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于胰岛素原类似物的B链的反向引物

<400> 13

cgcggatccc taggtcttgg gtgtgtagaa gaag 34

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于单链胰岛素类似物的正向引物 (InvPI ΔRRKR)

<400> 14

gctggagaac tactgcaacg aggcagagga cctgcagg 38

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于单链胰岛素类似物的正向引物 (InvPI ΔRRKR)

<400> 15

cctgcaggtc ctctgcctcg ttgcagtagt tctccagc 38

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于单链胰岛素类似物的正向引物 (InvPI ΔRRKR)

<400> 16

ggggtccctg cagtttgtga accaacacct gtgc 34

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于单链胰岛素类似物的反向引物 (InvPI ΔRRKR)

<400> 17

gttggttcac aaactgcagg gacccctcca gggc 34

<210> 18

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链胰岛素类似物 (InvPI ΔRRKR)

<400> 18

ggcattgtgg aacaatgctg taccagcatc tgctccctct accagctgga gaactactgc 60

aacgaggcag aggacctgca ggtggggcag gtggagctgg gcgggggccc tggtgcaggc 120

agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc ctgcagtttg tgaaccaaca cctgtgcggc 180

tcacacctgg tggaagctct ctacctagtg tgcggggaac gaggcttctt ctacacaccc 240

aagacctag 249

<210> 19

<211> 82

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链胰岛素类似物 (InvPI ΔRRKR)

<400> 19

Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu

1 5 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu

20 25 30

Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu

35 40 45

Gly Ser Leu Gln Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val

50 55 60

Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro

65 70 75 80

Lys Thr

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白酶切割位点

<400> 20

Met Ala Thr Thr Ser Thr Ala Thr Thr Arg

1 5 10

<210> 21

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于单链胰岛素类似物的正向引物 (FInvPI ΔRRKR)

<400> 21

tttaagaagg agatatacat catatggcaa caacatcaac agcaactacg cgtggcattg 60

tggaacaatg ctg 73

<210> 22

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于单链胰岛素类似物的反向引物 (FInvPI ΔRRKR)

<400> 22

cagcattgtt ccacaatgcc acgcgtagtt gctgttgatg ttgttgccat atgatgtata 60

tctccttctt aaa 73

<210> 23

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链胰岛素类似物 (FInvPI ΔRRKR)

<400> 23

atggcaacaa catcaacagc aactacgcgt ggcattgtgg aacaatgctg taccagcatc 60

tgctccctct accagctgga gaactactgc aacgaggcag aggacctgca ggtggggcag 120

gtggagctgg gcgggggccc tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc 180

ctgcagtttg tgaaccaaca cctgtgcggc tcacacctgg tggaagctct ctacctagtg 240

tgcggggaac gaggcttctt ctacacaccc aagacctag 279

<210> 24

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 单链胰岛素类似物 (FInvPI ΔRRKR)

<400> 24

Met Ala Thr Thr Ser Thr Ala Thr Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys

1 5 10 15

Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Glu

20 25 30

Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly

35 40 45

Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Phe Val

50 55 60

Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val

65 70 75 80

Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

85 90

Claims (30)

1.具有以下化学式1的单链胰岛素类似物缀合物：

[化学式1]

X-Y-Z-La-F

其中：

X是天然胰岛素A链、B链或其类似物，

Y是天然胰岛素C-肽或其类似物，

Z是天然胰岛素B链、A链或其类似物，

L是连接体，

a为0或自然数，条件是当a为2或更大时，每个L彼此独立，

F是能够增加胰岛素类似物体内半衰期的物质，

条件是其中X、Y和Z分别是天然胰岛素的B链、C-肽和A链，或者分别是天然胰岛素的A链、C-肽和B链的情况被排除，以及

X-Y-Z形成单链胰岛素类似物。

2.权利要求1所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中与天然胰岛素原相比，所述单链胰岛素类似物是通过选自以下中的至少一种方法修饰的类似物、变体或其片段：至少一个氨基酸的取代、添加和修饰以及胰岛素A链、C-肽和B链的排列顺序中的改变。

3.权利要求1或权利要求2所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中所述单链胰岛素类似物是其中X、Y和Z各自通过连接体连接的单链胰岛素类似物。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中所述C-肽的所述类似物是其中选自天然胰岛素C-肽的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第34位氨基酸和第35位氨基酸中的至少一个氨基酸被另一种氨基酸取代或缺失的所述C-肽的类似物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中能够增加胰岛素类似物的体内半衰期的物质选自聚乙二醇、脂肪酸、胆固醇、白蛋白及其片段、白蛋白结合物质、特定氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合物质、体内结缔组织、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖和聚合物。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中L选自肽、聚乙二醇、脂肪酸、糖、聚合物、低分子量化合物、核苷酸及其组合。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中X-Y-Z和F经由L通过共价化学键、非共价化学键或其组合彼此连接。

8.权利要求6所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中所述聚合物选自聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸及其组合。

9.权利要求5所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中所述FcRn结合物质是免疫球蛋白Fc区。

10.权利要求9所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是非糖基化的。

11.权利要求9或10所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区由选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的1至4个结构域组成。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是衍生自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc区。

13.权利要求12所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区的每个结构域是衍生自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白的具有不同来源的结构域的杂合体。

14.根据权利要求9至12中任一项所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是由单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体，所述单链免疫球蛋白由相同来源的结构域组成。

15.根据权利要求9至14中任一项所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区进一步包含绞链区。

16.权利要求9所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4 Fc区。

17.权利要求9所述的单链胰岛素类似物缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是人非糖基化IgG4 Fc区。

18.具有以下化学式2的单链胰岛素类似物：

[化学式2]

X-Y-Z

其中：

X是天然胰岛素A链、B链或其类似物，

Y是天然胰岛素C-肽或其类似物，

Z是天然胰岛素B链、A链或其类似物，以及

条件是其中X、Y和Z分别是天然胰岛素的B链、C-肽和A链，或者分别是天然胰岛素的A链、C-肽和B链的情况被排除。

19.权利要求18所述的单链胰岛素类似物，其中所述C-肽的所述类似物是其中选自天然胰岛素C-肽的第1位氨基酸、第2位氨基酸、第34位氨基酸和第35位氨基酸中的至少一个氨基酸被另一种氨基酸取代或缺失的所述C-肽的类似物。

20.具有增强的体内持续时间和稳定性的长效单链胰岛素制剂，其包括：

根据权利要求1至17中任一项所述的单链胰岛素类似物缀合物；或

权利要求18或权利要求19所述的单链胰岛素类似物。

21.用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，所述药物组合物包括：

根据权利要求1至17中任一项所述的单链胰岛素类似物缀合物；或

权利要求18或权利要求19所述的单链胰岛素类似物。

22.用于制备根据权利要求1至17中任一项所述的单链胰岛素类似物缀合物的方法，所述方法包括将权利要求18或权利要求19所述的单链胰岛素类似物与能够增加其所述体内半衰期的物质连接。

23.权利要求22所述的方法，其中所述单链胰岛素类似物和所述能够增加其所述体内半衰期的物质经由连接体被连接。

24.权利要求23所述的方法，其中所述连接体是非肽基连接体，所述非肽基连接体具有选自醛基团、马来酰亚胺基团和琥珀酰亚胺团衍生物的反应性基团。

25.权利要求24所述的方法，其中所述琥珀酰亚胺衍生物是琥珀酰亚胺基羧甲基、琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺、或琥珀酰亚胺基碳酸酯。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述单链胰岛素类似物通过包括以下(a)和(b)的方法获得：

(a)以其中将由包含蛋白酶切割位点的5至20个氨基酸组成的肽融合到所述单链胰岛素类似物的N-末端的形式表达单链胰岛素类似物；以及

(b)移除与所述单链胰岛素类似物融合的所述肽。

27.编码权利要求18或19所述的单链胰岛素类似物的分离的核酸。

28.包含权利要求27所述的核酸的重组表达载体。

29.包含权利要求28所述的重组表达载体的转化体。

30.用于制备权利要求18或19所述的单链胰岛素类似物的方法，所述方法包括：

a)通过培养包含编码权利要求18或19所述的单链胰岛素类似物的核酸的转化体来表达单链胰岛素类似物；以及

b)分离和纯化表达的所述单链胰岛素类似物。

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