CN111366671B - 同时检测血清中18种类固醇激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种同时检测血清中18种类固醇激素的化学衍生‑超高效液相色谱‑串联质谱法，采用一种新型衍生化试剂O‑[(3‑吡啶基)甲基]羟胺进行衍生化后，用于超高效液相色谱‑串联质谱进行检测。该方法同时检测18种类固醇激素的仅需10分钟，通过衍生化后，疏水性指标logP极大提高，改善了高效液相反相色谱柱中的峰形和分离度，且具有更好的离子化效率，从而提高质谱检测灵敏度。该方法具有操作简便，准确性好，特异性强，检测范围广等特点。

Description

同时检测血清中18种类固醇激素的化学衍生-超高效液相色 谱-串联质谱法

技术领域

本发明涉及医疗分析检测技术领域，更具体地，涉及一种同时检测血清中18种类固醇激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法。

背景技术

内分泌系统直接控制着人类重要的生理过程，如生长、发育、生殖和代谢。类固醇激素在增强免疫功能、钠、盐、水平衡、炎症和性特征等方面有着重要的作用。人体内分泌激素水平的高低与疾病诊断，病情评估等方面发挥着重要作用，例如肾上腺皮质增生症，多囊卵巢综合症，肾上腺皮质功能不全等。

然而，由于类固醇激素通常在非常低的浓度下以纳摩尔或皮摩尔水平的浓度在人体内与受体结合而发挥强烈的生理作用。由于类固醇激素在生物体内含量极低，且其结构十分相似，立体异构体很多导致类固醇激素的检测挑战性很大。

免疫法是过去几十年临床上的主流检测类固醇激素的方法，其具有高通量和检测时间短等优点；然而，该方法由于容易受到体液基质或结构类似物的干扰，而导致出现检测特异性和结果准确性欠佳的问题。随着分析检测技术的进一步发展，气相色谱串联质谱技术由于具有检测结果准确度高的优势，被认为是类固醇激素定量法的“金标准”，然而，气相色谱串联质谱技术的前处理过程常常需要30min甚至更久，而且在某些特定情况下其灵敏度也有待进一步提升。

尽管气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)在类固醇激素的分析检测中有很长的历史，但是，就目前的发展趋势而言，类固醇激素的检测中使用更多的仍然是液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)。具体而言，通常都是采用非衍生化直接液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)检测甾体激素，其操作简单，但是存在灵敏度低的问题。究其原因，是由于类固醇激素潜在的结构特性导致其离子化效率很低，从而降低了灵敏度，在质谱中，电离效率与类固醇激素结构中所含的羟基、双键、羰基有着密切的关系，一些痕迹量不易电离的激素在常规方法下仍然不能被检测到。

随着离子化技术不断的发展，化学衍生化技术在提高类固醇激素的灵敏度方面也愈趋成熟。化学衍生化方法通过在分析物上加入易电离基团，既提高了ESI的离子化效率，使更多分析物带上电荷而进入质谱，又使分析物的结构发生变化，色谱分离行为也发生变化，从而使更多结构类似物或者干扰物得已分开，获得更高的特异性，能有效提高检测方法的灵敏度和准确率。

在类固醇激素中，雌激素可以用丹磺酰氯或脂化的方法来进行衍生化，雄激素可以用吡啶酸来衍生化，通过衍生化后用LC-MS/MS分析后其检测限都可以达到10pg/mL以下。其中，磺酰氯类衍生化试剂只能衍生含酚羟基的类固醇激素，其激素定量覆盖率低；且采用其他诸如烷基化、硅烷化和2-肼基吡啶化等的衍生化方法后用LC-MS/MS检测后，其平均检测限最低也都能达到10pg/mL的水平。在上述衍生化方法中，羟胺溶液衍生化反应是能同时衍生化雌激素、雄激素、皮质激素和孕激素的衍生化试剂，但是，常规羟胺试剂虽然可以选择性与类固醇激素的羰基发生衍生反应，但其反应活性低，很难与20-位羰基类固醇激素完全标记，而且，羟胺不含质子亲和部分(质子亲和势193.8kcal/mol)，不能有效提高ESI-MS的检测灵敏度；而苯甲酸类试剂需要活化剂，如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和咪唑等，通过活化目标物后才能与标记试剂反应，且副反应多，特异性差。

综上所述，如何准确定量检测低丰度的类固醇激素是本领域技术人员亟需解决的关键技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测血清中18种类固醇激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，该方法具有前处理简单，灵敏度高，检测速度快，精确度高，通量大可批量检测的优点。

本发明采用如下技术方案：

同时检测血清中18种类固醇激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，

所述18种类固醇激素分别为：孕烯醇酮、孕酮、17-羟孕烯醇酮、17α-羟孕酮，11α-羟孕酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、皮质酮、氢化可的松、脱氢表雄酮、睾酮、4-雄烯二酮、双氢睾酮、雄酮、11-脱氧皮质醇、可的松、醛固酮和雌酮。

以上18种类固醇激素的信息表如下表1所示：

表1 18种类固醇激素信息表

具体包括如下步骤：

S1、将待测血清样品与稳定同位素内标溶液混匀后，通过液-液萃取提取目标激素；

S2、采用O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺衍生化试剂进行衍生化处理；

S3、采用超高效液相色谱-串联质谱技术对所述衍生化后的检测液进行检测。

详细地，在上述技术方案中，采用O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺标记类固醇激素后，疏水性指标log P极大提高，从而与液-液萃取样品前处理方式更加匹配；另一方面，吡啶基的质子亲和势为223.35kcal/mol，且水中酸解离常数pKa为5.18，乙腈中酸解离常数pKa为12.60，表明吡啶基易于接收质子，在ESI-MS中具有良好的离子化效率。因此，O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺能更有效提高类固醇激素反相色谱分离效果和ESI-MS检测灵敏度。

具体地，在上述技术方案中，所述衍生化后的检测液的检测进样量为5μL。

在上述技术方案中，步骤S2中，所述衍生化处理的试剂为O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺，具体为，样品中依次加入三氟乙酸和O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺/乙腈溶液，且所述O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺/乙腈溶液与三氟乙酸的体积比8.5-9.5：1。

详细地，在上述技术方案中，通常Schiff碱反应需有机酸催化，如甲酸、乙酸、三氟乙酸或缓冲体系等，在三氟乙酸(pKa＝0.23)催化下，衍生化的效率更高(越难反应的用酸强度越高)；此外，为了保证衍生化效率并防止残留物复溶时残留三氟乙酸导致衍生产物水解，控制O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺/乙腈溶液与三氟乙酸的体积比为8.5-9.5：1，既能提高检测的准确性，还可以使衍生反应衍生效率较高，同时确保三氟乙酸在氮气下完全吹干，不影响后续分析。

优选地，在上述技术方案中，为了使上述类固醇激素完全衍生化，所述O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺/乙腈溶液的浓度为2-10mg/mL。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述衍生化处理具体为，往样品管中依次加入5-15μL三氟乙酸和85-95μL O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺/乙腈溶液，在30℃下反应45-90min后，N₂吹干，并用体积比为1：4的ACN/H₂O复溶。

再进一步地，在上述技术方案中，所述超高效液相色谱条件为：

流动相A为0.1％(v/v)甲酸/水溶液；

流动相B为0.1％(v/v)甲酸/甲醇溶液；

流动相梯度洗脱参数为：

其中，流动相A和流动相B的比例均为体积比。

本发明通过大量的研究得出，在上述流动相梯度洗脱参数下，可以在短时间(10分钟)内非常有效且准确地测定出18种类固醇激素，灵敏度高。采用上述工艺条件，一方面，目标物疏水性提高，所需洗脱条件中有机相比例增加，离子更易于去溶剂化，使得目标物离子化效率提高；另一方面，有机相比例提高在一定程度上改变质谱二级碎片丰度比，从而提高质谱MRM模式检测灵敏度。

在本发明的超高效液相色谱-串联质谱技术中超高效液相色谱可以使用本领域中常用的色谱柱，为了提高分离效果和分离度，优选使用型号为Shim-pack GIST C18(2μm，100*2.1mm)的色谱柱。

再进一步地，在上述技术方案中，所述质谱条件具体为：

电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为2.4-3.5L/min，干燥气流量为2-7.5L/min，加热气流量为10-22L/min，接口温度320-450℃，DL温度130-175℃，加热块温度320-480℃；

质谱检测参数为：

具体地，在上述技术方案中，所述质谱检测具体采用岛津8050三重四极杆质谱仪，模式为正离子模式，采用多反应监测的质谱扫描模式。

又进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述液-液萃取采用甲基叔丁基醚。

在本发明一个优选方案中，为了提高稳定性，准确度和灵敏度以及分离效率，所述液-液萃取和化学衍生的前处理具体包括：

向待测血清样品与稳定同位素内标溶液的混合溶液中加入800-1000μL甲基叔丁基醚，涡旋3min后，在8000-12000r/min、2-5℃下冷冻离心2-4min，取上层清液800-1200μL，N₂吹干。

又进一步地，在上述技术方案中，所述衍生化处理具体包括：往样品管中依次加入5-15μL三氟乙酸和85-95μL O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺/乙腈溶液，在30℃下反应45-90min后，N₂吹干，并用体积比为1：4的ACN/H₂O复溶。

在本发明一个优选方案中，所述流动相梯度洗脱参数为：

其中，所述流动相的流速优选为0.5ml/min，色谱柱的柱温优选为40℃。

在本发明中，可以使用本领域中常用的方法来得到各激素的具体浓度值。具体为：

结合步骤S3得到的检测结果和各类固醇激素的标准工作曲线，得到各类固醇激素在血清中的含量值。

详细地，在上述技术方案中，所述类固醇激素的标准工作曲线采用同位素内标定量法制得，具体步骤包括，

将已知且不同浓度的孕烯醇酮、孕酮、17α-羟孕烯醇酮、17α-羟孕酮，11α-羟孕酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、皮质酮、氢化可的松、脱氢表雄酮、睾酮、4-雄烯二酮、双氢睾酮、雄酮、11-脱氧皮质醇、可的松、醛固酮和雌酮的甲醇溶液分别与内标溶液和空白血清基质混合，经过前处理得到不同浓度的标准待测液，使用化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱技术对所述不同浓度的标准待测液分别进行检测，以标准待测液中各类固醇激素与内标物峰面积比为Y轴，标准待测液中各类固醇激素浓度为X轴，得到各类固醇激素的标准工作曲线；所述化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱技术中的检测条件为步骤S3中的检测条件。

其中，

上述前处理步骤与在制备检测液的前处理步骤相同；

上述超高效液相色谱-串联质谱技术中所有的参数与测定检测液的相应参数相同；

上述标准待测液是将空白血清基质、混合内标溶液以及不同浓度含有18种激素的标准混合液混合制得。

在本发明中，优选使用0.1％牛血清白蛋白溶液为空白血清基质。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所提供的同时检测血清中18种类固醇激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，通过采用O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺标记类固醇激素后，疏水性指标logP极大提高，从而与液-液萃取样品前处理方式更加匹配，另一方面，吡啶基的质子亲和势为223.35kcal/mol，且水中酸解离常数pKa为5.18，乙腈中酸解离常数pKa为12.60，表明吡啶基易于接收质子，在电喷雾离子源中具有良好的离子化效率，因此，O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺能更有效改善和提高类固醇激素反相色谱峰峰形及分离度，及提高ESI-MS检测灵敏度，此外，所采用的O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺同时含有高反应活性的羟胺基团与具有疏水部分和质子亲和部分的吡啶基，可准确有效地定量检测低丰度的类固醇激素；

(2)本发明所提供的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法能同时检测血清中的18种类固醇激素，总耗时只有10分钟，效率远远高于分别检测各个激素含量的方法以及传统的放射免疫分析法(RIA)，大大缩短了检测时间，增大了检测通量，适合大批量样品的检测，具有较高的应用价值；

(3)本发明所提供的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法通过液-液萃取，分离富集待测类固醇激素组分，使得检测结果稳定性大大提高，与其他激素检测提取方法相比，该方法操作简便，耗时少；

(4)本发明所提供的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法使用超高液相色谱-质谱串联检测技术，特异性强，选择性好，灵敏度高且无交叉污染，该方法的检测限低，检测范围广，精密度好，能准确定量体内低浓度的激素，可以真实反应人体内激素的水平，适用于临床医疗的生化检测。

附图说明

图1为本发明实施例1的血清样品中18种类固醇激素的MRM检测色谱图；

图中：

醛固酮1，皮质醇2，可的松3，11-脱氧皮质醇4，17α-羟孕酮5，21-脱氧皮质醇6，11-脱氧皮质酮7，皮质酮8，睾酮9，17α-羟孕烯醇酮10，11α-羟孕酮11，去氢表雄酮12，雌酮13，孕酮14，4-雄烯二酮15，二氢睾酮16，雄酮17，孕烯醇酮18。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例所提供的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱技术同时检测18种类固醇激素的方法，包括以下步骤：

1、材料

方法学研究的实验样本来自于武汉康圣达医学检验所有限公司的2012年6月体检的血清样本。

2、仪器与试剂耗材

仪器：岛津8050三重四极杆质谱仪，岛津30A超高效液相色谱仪，超纯水仪(Millipore超纯水机)，电子分析天平(FA1004，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)，高速冷冻离心机(GL-20M高速冷冻离心机)，涡旋混匀仪(美国SCILOGEX公司)，GM-12水浴氮吹仪(北京成萌伟业科技有限公司)，移液枪(大龙兴创实验仪器有限公司，北京)，容量瓶，EP管。

试剂耗材：色谱柱为岛津Shim-pack GIST C18(2.1*100mm，2μm)，色谱纯甲醇(Sigma-Aldrich公司)，甲基叔丁基醚(阿拉丁试剂有限公司，中国)，乙酸(国药集团化学试剂有限公司)。

18种激素的标准品和9种同位素的内标物均购自Sigma-Aldrich公司。

3、方法

(1)混合标准溶液配制：

分别准确称取10mg上述18种激素的标准品分别加入10ml甲醇完全溶解，得到浓度为1×10^-4g/ml的标准品母液，将其混合后接着用甲醇稀释成不同浓度的混合标准溶液。

(2)混合内标溶液配制：

分别准确称取10mg氘代同位素标品，包括：孕酮-D₉、17α-羟孕酮-D₈、11-脱氧皮质酮-¹³C₃、醛固酮-D₄、皮质酮-D₄、氢化可的松-D₄、11-脱氧皮质醇-D₅、睾酮-D₃和脱氢表雄酮-D₆，分别加入10ml甲醇完全溶解，得到浓度为1×10^-4g/ml的9种内标品母液，将其接着用甲醇稀释成所需浓度的混合内标溶液。

(3)标准待测液配制：

取一定量0.1％牛血清白蛋白溶液，分别加入内标溶液和不同浓度的混合标准溶液，得到不同浓度的标准待测液。

(4)检测液配制：

取一定量待测血清样品，加入混合内标溶液，得到检测液。

(5)目标激素的提取：

对标准待测液和检测液中分别进行液-液萃取：向标准待测液和检测液中分别加入900μL甲基叔丁基醚(MTBE)，涡旋3min后，在10000r/min、4℃下冷冻离心3min，取上层清液900μL，N₂吹干。

(6)衍生化处理

向上述样品中，分别加入10μL三氟乙酸和90μL 0.5mg/L的O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺/乙腈溶液，在30℃下反应60min后，N₂吹干，并用体积比为1：4的ACN/H₂O复溶，待超高液相色谱-质谱分析。

(7)色谱条件：

色谱柱为岛津Shim-pack GIST C18(2.1*100mm，2μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸/水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸/甲醇溶液，流速为0.5ml/min，柱温为40℃；

流动相梯度洗脱参数为：

(8)质谱条件：

采用正离子离子化模式，多反应监测的质谱扫描模式，电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为3L/min，干燥气流量为4L/min，加热气流量为14L/min，接口温度400℃，DL温度150℃，加热块温度450℃。

质谱检测参数为：

4、检测结果

检测结果如图1所示，包括3组同分异构体在内的18种类固醇激素均能用该检测方法进行准确定量分析，分离效果好、灵敏度高，按照出峰顺序对应的色谱峰分别为：1、醛固酮，2、皮质醇，3、可的松，4、11-脱氧皮质醇，5、17α-羟孕酮，6、21-脱氧皮质醇，7、11-脱氧皮质酮，8、皮质酮，9、睾酮，10、17α-羟孕烯醇酮，11、11α-羟孕酮，12、去氢表雄酮，13、雌酮，14、孕酮，15、4-雄烯二酮，16、二氢睾酮，17、雄酮，18、孕烯醇酮。

采用同位素内标定量法，以标准物与内标物峰面积比为Y轴，标准物浓度为X轴，建立标准工作曲线。

实施例2

本实施例所提供的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱技术同时检测18种类固醇激素的方法，其步骤与实施例1的步骤相同，区别仅在于：

流动相梯度洗脱参数为：

实施例2与实施例1相比，18种类固醇激素的MRM质谱响应信号和灵敏度均有所下降，具体地，其灵敏度(依据最低检测定量限)降低了8.5-15.0％。

对比例1

本对比例所提供的超高效液相色谱-串联质谱技术同时检测18种类固醇激素的方法，其步骤与实施例1的步骤相似，色谱条件和质谱参数均进行了优化，区别仅在于：

未采用O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺进行衍生化处理。

实验例

对实施例1和对比例1中18种类固醇激素的检测方法进行灵敏度对比分析。

灵敏度对比实验结果如表3示。

表3灵敏度对比实验结果

对比分析表1中实施例1与对比例1的灵敏度对比实验结果可以发现，本申请实施例1中的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法检测18种类固醇激素的灵敏度明显提高，灵敏度(依据最低检测定量限)提高了2-454倍。

最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.同时检测血清中18种类固醇激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，

所述18种类固醇激素分别为：孕烯醇酮、孕酮、17α-羟孕烯醇酮、17α-羟孕酮，11α-羟孕酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、皮质酮、氢化可的松、脱氢表雄酮、睾酮、4-雄烯二酮、双氢睾酮、雄酮、11-脱氧皮质醇、可的松、醛固酮和雌酮；

具体包括如下步骤：

S1、将待测血清样品与稳定同位素内标溶液混匀后，通过液-液萃取提取目标激素；

S2、采用O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺衍生化试剂进行衍生化处理；

S3、采用超高效液相色谱-串联质谱技术对所述衍生化后的检测液进行检测；

步骤S3中，所述超高效液相色谱条件为：

色谱柱为Shim-pack GIST C18；

流动相A为0.1% (v/v) 甲酸/水溶液；

流动相B为0.1% (v/v) 甲酸/甲醇溶液；

流动相梯度洗脱参数为：

。

2.根据权利要求1所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，

步骤S2中，依次加入三氟乙酸和O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺/乙腈溶液进行衍生化反应，所述O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺/乙腈溶液与三氟乙酸的体积比8.5-9.5：1。

3.根据权利要求2所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，

所述O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺/乙腈溶液的浓度为2-10 mg/mL。

4.根据权利要求1-3任一项所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，

步骤S2中，所述衍生化处理具体为，依次加入三氟乙酸和O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺/乙腈溶液，在30 ℃下反应45-90 min后，N₂吹干，并用体积比为1：4的ACN/H₂O复溶。

5.根据权利要求1-3任一项所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，

所述质谱条件具体为：

电离源为电喷雾电离ESI源，其中雾化气流量为2.4-3.5 L/min，干燥气流量为2-7.5L/min，加热气流量为10-22 L/min，接口温度320-450 ℃，DL温度130-175 ℃，加热块温度320- 480 ℃；

质谱检测参数为：

。

6.根据权利要求1所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，

步骤S1中，所述液-液萃取采用甲基叔丁基醚；

和/或，步骤S2中，所述衍生化处理具体包括：往样品管中依次加入5-15 μL三氟乙酸和85-95 μL O-[(3-吡啶基)甲基]羟胺/乙腈溶液，在30 ℃下反应45-90 min后，N₂吹干，并用体积比为1：4的ACN/H₂O复溶。

7.根据权利要求6所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，

步骤S1中，所述液-液萃取具体包括：向待测血清样品与稳定同位素内标溶液的混合溶液中加入800-1000 μL甲基叔丁基醚，涡旋3 min后，在8000-12000 r/min、 2-5℃下冷冻离心2-4 min，取上层清液800-1200 μL，N₂吹干。

8.根据权利要求1-3任一项所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，

所述流动相梯度洗脱参数为：

。

9.根据权利要求1-3任一项所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，还包括，结合步骤S3得到的检测结果和各类固醇激素的标准工作曲线，得到各类固醇激素在血清中的含量值。

10.根据权利要求9所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，所述类固醇激素的标准工作曲线采用同位素内标定量法制得，具体步骤包括，将已知且不同浓度的孕烯醇酮、孕酮、17α-羟孕烯醇酮、17α-羟孕酮，11α-羟孕酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质酮、皮质酮、氢化可的松、脱氢表雄酮、睾酮、4-雄烯二酮、双氢睾酮、雄酮、11-脱氧皮质醇、可的松、醛固酮和雌酮的甲醇溶液分别与内标溶液和空白血清基质混合，经过前处理得到不同浓度的标准待测液，使用化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱技术对所述不同浓度的标准待测液分别进行检测，以标准待测液中各类固醇激素与内标物峰面积比为Y轴，标准待测液中各类固醇激素浓度为X轴，得到各类固醇激素的标准工作曲线；所述化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱技术中的检测条件为步骤S3中的检测条件。

11.根据权利要求10所述的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于，所述空白血清基质为0.1%牛血清白蛋白溶液。

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