CN111356761B - 用于植物病原体的生物防治的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了命名为MH71和MH243的链霉菌分离株、其培养物以及包含它们的组合物。本发明还提供了分离株、培养物和组合物的用途，例如，用于治疗和预防由植物病原体感染引起的或与植物病原体感染相关的感染和疾病，降低植物对由植物病原体感染引起的或与植物病原体感染相关的疾病的易感性，以及用于抑制或减少病原体在植物上的生长。

Description

用于植物病原体的生物防治的方法和组合物

技术领域

本发明总体上涉及新型放线菌(Actinobacteria)和包含其的组合物。本发明还提供了用于植物病原体的生物防治的方法。

背景技术

作为病原体感染的结果的植物病害给现代农业带来了巨大的经济成本。当前的农业系统通常需要大面积种植一种或几种类型的农作物或植物。这种生态上不平衡的系统易罹患疾病。仅植物真菌病原体就使全球农业生产损失数十亿美元。例如，土壤/残茬负载(stubble-borne)的真菌导致小麦和加拿大油菜(canola)患病，仅澳大利亚的谷物和油料种子产业每年就为此付出超过2.5亿$的代价((Murray GM&Brennan JP.(2009),‘Thecurrent and potential costs of diseases of wheat in Australia’.GrainsResearch and Development Corporation,Barton,ACT,Australia和Murray GM&BrennanJP.(2012),‘The current and potential costs from diseases of oilseed crops inAustralia’.Grains Research and Development Corporation,Barton,ACT,Australia)。其中一些疾病的发病率正在上升，包括小麦的镰刀菌冠腐病(Fusarium crown rot)和加拿大油菜菌核病(Sclerotinia Stem Rot)。

核盘菌属(Sclerotinia)是最具破坏性的植物病原体之一，其对超过500种植物引起茎腐病，并且对加拿大油菜生产的限制越来越大。作为全球性问题，核盘菌属仅在短短一年(2010年)内使全球最大的加拿大油菜生产国(加拿大)损失了约6亿美元，而在2005年至2009年之间，澳大利亚每年损失了1,010万澳元。自2009年以来，澳大利亚的加拿大油菜产量增加了一倍，核盘菌属茎腐病的成本也因此增加了一倍，仅西澳大利亚州在2013年就由其造成了约5,900万美元的损失。众所周知，由于多种混杂因素，该病难以控制，例如，所有加拿大油菜的商业品种都易感，病原体具有广泛的宿主范围，其孢子在空气中迅速传播，其“休眠(dormant)”阶段在土壤中保持数年，澳大利亚的加拿大油菜产量的增加导致了病原体含量(pathogen load)的积聚。在澳大利亚，引起加拿大油菜的丝核菌属根和下胚轴腐烂的真菌病原体也具有很高的致病性。如果不加以控制，这些疾病预计将导致每年损失2,940万美元(Murray GM&Brennan JP.(2012).‘The current and potential costs fromdiseases of oilseed crops in Australia’.Grains Research and DevelopmentCorporation,Barton,ACT,Australia)。

禾谷镰孢(Fusarium graminearum)，真菌子囊菌门(fungal phylum Ascomycota)的成员，是引起小麦赤霉病(fusarium head blight)的植物病原体。这是小麦和大麦的毁灭性疾病。该病原体每年在全球造成数十亿美元的经济损失。感染导致小麦氨基酸组成发生变化，导致籽粒干瘪(shrivelled kernel)并且其余的谷物被霉菌毒素(主要是抑制蛋白质的生物合成的脱氧雪腐镰刀菌烯醇和为动情素性霉菌毒素的玉米赤霉烯酮)污染。这些毒素会引起牲畜呕吐、肝脏损害和生殖缺陷，并通过被污染的食物危害人类。子囊菌霉的另一个成员是引起小麦冠腐病的伪禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)。小麦冠腐病是一种重要的植物病害，如果不加以管理，可能会对整个小麦田产生严重的有害影响，引起没有谷粒的白穗(white head)，导致大量减产。在田间胁迫性(stressful)水分亏缺(waterdeficit)期间，伪禾谷镰刀菌(F.pseudograminearum)的疾病表达会发展。

细菌植物病原体在农业中造成了类似的问题。例如，引起细菌性枯萎病(bacterial blight)的水稻黄单胞菌(Xanthomonas ozyrae)是水稻最重要的病原体之一，导致产量损失高达50％。同样，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)也是多种植物宿主(包括重要的大田(broadacre)作物和园艺作物，例如大麦、番茄、芸苔属蔬菜和果树)上细菌性枯萎病的病原体。由于防治策略的有限利用度和不断增长的抗药性，使产量损失更加严重。

由于有效防治策略的有限利用度和不断增长的抗药性，真菌和细菌病原体引起的作物产量损失更加严重。植物育种计划已经成功地产生了对某些疾病的耐受性更高的品种，但是这些都没有显示出对多种病原体的有效抗病性。在某些情况下，尽管付出了巨大的努力来寻找抗性基因，但是例如针对毁灭性的病原体伪禾谷镰刀菌，目前尚无完全抗性的品种。此外，许多病原体可以通过在土壤、残茬或夏季杂草的根部上存活或生长而持久存在，并成为随后农作物的感染源。

传统上，已经通过使用化学杀真菌剂(fungicide)、杀细菌剂或农药(pesticide)来控制植物病原体，例如真菌和细菌。根据病原体和施用(喷洒)时间，用作拌种剂和叶面喷洒剂的这类药剂可提供不同的保护。但是，消费者越来越关注植物上的化学残留物及其对环境的影响。而且，尽管当前可用的化学物质可以减少疾病的发生，但是施用的时间是关键的并且难以实现。常规的预防性应用是不经济的并且是不希望的。此外，病原体对可用的化学物质的抵抗力越来越强。

许多真菌和细菌性疾病的难治性、其增加的和/或零星的发病率、对化学品及其相关残留物的管理成本高且具有挑战性，因此需要开发替代性的无害环境控制措施进行植物的致病性疾病的预防和治疗。

植物病原体的生物防治(biocontrol)正成为植物病害管理中越来越重要的组成部分。已知许多微生物利用多种活性模式来控制各种植物病原体，从而降低了产生抗性虫害种群的风险。已经研究了包括细菌、酵母和真菌在内的多种生物防治剂，用于防治植物病害。当前，有许多可商购的基于微生物的生物防治产品，包括含有木霉菌属(Trichodermaspp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)和链霉菌属(Streptomyces spp.)的产品。

尽管可以发现具有拮抗特性的潜在生物防治剂，但必须仔细筛选与它们的拟议用途有关的一系列特性。这些特性包括植物的致病性、拮抗活性和特异性、在输送系统和配方中的操作顺从性、以及目标植物在田间条件变化下的表现。田间的建立(establishment)和表现通常是最难克服的挑战。任何生物防治剂都必须能够以对目标植物无害的方式成功建立并与众多现有的田间微生物竞争。此外，目前澳大利亚市场上针对大多数植物病原体和疾病(包括镰刀菌冠腐病、菌核病和细菌性枯萎病)的商业生物防治产品数量有限。因此，需要植物病原体的新生物防治剂，其减少环境中合成农药、杀真菌剂和杀细菌剂及其残留物的使用，并提供非遗传修饰的方法来控制病原体疾病。

发明内容

本发明的第一方面提供了于2017年2月21日以保藏号V17/004100保藏于澳大利亚国家度量学会(NMI)的链霉菌(Streptomyces)菌株MH71。

本发明的第二方面提供了于2017年2月21日以保藏号V17/004101保藏于澳大利亚国家度量学会(NMI)的链霉菌菌株MH243。

在一个实施方案中，分离本文公开的链霉菌菌株。在另一个实施方案中，以培养物的形式提供菌株，包括纯的或基本纯的培养物。

链霉菌菌株MH71和MH243能够减少或抑制引起植物病害的病原生物体的生长。

因此，在特定的实施方案中，将选自MH71和MH243的链霉菌掺入用于治疗或预防由植物病原体引起的或与植物病原体相关的疾病，或用于降低植物对由植物病原体引起或与植物病原体相关的疾病的易感性的组合物中。

在一个实施方案中，组合物包含培养物，以及农业上可接受的载体、稀释剂或辅料，所述载体、稀释剂或辅料用作链霉菌的支持介质(midum)和/或增强微生物向植物的递送。在一个实施方案中，该组合物包含其他添加剂，这取决于所处理植物的种类、感染植物的病原体的种类和数量、待施用的组合物的性质、待施用该组合物的形式以及施用时感染或疾病的严重程度。

因此，本发明的第三方面提供了一种组合物，其包含链霉菌MH71和/或MH243的培养物以及农业上可接受的载体、稀释剂或辅料。

在一个实施方案中，用于组合物中的链霉菌是可繁殖的(reproductivelyviable)。在一个示例性的实施方案中，链霉菌以可繁殖的孢子的形式或作为菌丝(例如孢子丝(spore-bearing mycelium))的形式存在于组合物中。

因此，在第四方面，本发明提供了一种组合物，其以可繁殖的形式和量包含至少一种选自以下的链霉菌分离株：

(a)保藏号为V17/004100的链霉菌MH71；和

(b)保藏号为V17/004101的链霉菌MH243；以及

农业上可接受的载体、稀释剂或辅料。

根据以上方面，在一个实施方案中，组合物包含分离的菌株(a)和菌株(b)。

本发明的第五方面提供了一种组合物，其通过以下方法产生：

(a)使链霉菌MH71或MH243的培养物生长；

(b)从培养物中收获孢子、细胞或菌丝；和

(c)将孢子、细胞或菌丝与农业上可接受的载体、稀释剂或辅料合并。

根据以上方面和实施方案，组合物的活性成分可以由本发明的链霉菌产生并被分泌到细胞培养物中。在一个示例性的实施方案中，组合物包含链霉菌MH71和/或MH243培养物的无细胞培养滤液。无细胞培养滤液可以与农业上可接受的载体、稀释剂或辅料组合。在一个实施方案中，活性成分为一种或多种代谢物。在另一个实施方案中，活性成分为一种或多种抗生素。

本发明的第六方面提供了一种组合物，其通过以下方法制备：

(a)使链霉菌MH71或MH243的培养物生长；

(b)任选地收获无细胞培养滤液；和

(c)将(a)的培养物或(b)的无细胞培养滤液与农业上可接受的载体、稀释剂或辅料合并。

根据以上方面，在一个实施方案中，所述组合物还可包含能够治疗或预防由植物病原体引起的或与植物病原体相关的感染或疾病和/或能够促进要施用组合物的植物的生长的其他试剂或生物体。此类试剂或生物体的实例包括如上所述的其他链霉菌种、或其他细菌种、生物防治真菌菌种、发芽促进剂、杀真菌剂、杀虫剂(insecticide)、添加剂和惰性载体，条件是它们与链霉菌MH71或MH243的存活和生长相容。

在一个实施方案中，组合物用于治疗或预防由植物病原体引起的或与植物病原体相关的感染或疾病。在一个实施方案中，组合物用于降低植物对植物病原体感染的易感性。在一个实施方案中，优选将组合物施用至植物、植物部分、植物种子或植物周围，以治疗或预防由植物病原体引起的或与植物病原体相关的疾病，或降低植物对病原体感染的易感性。

组合物可以以适于浸湿或浸渍植物部分的液体形式或作为喷洒剂存在。在一个实施方案中，植物部分是植物的根或叶。在一个实施方案中，组合物为叶面喷洒剂的形式。在另一个实施方案中，用作喷洒剂的组合物包含辅料，包括例如酯化的植物油、植物油或乳化剂或它们的组合(例如Hasten^TM)。

组合物还可以是乳液、糊剂(paste)或粉末的形式，以使得能够涂覆包括种子的植物部分，或者是用于土壤施用的颗粒形式。当用作种子包衣(coating)时，组合物还可包含一种或多种化合物，以使得能够配制可涂覆的糊剂。在一个示例性的实施方案中，适合种子施用的组合物包含黄原胶。

因此，本发明的第七方面提供了一种治疗或预防由植物病原体感染引起的或与植物病原体感染相关的疾病，或用于降低植物对病原体感染的易感性的方法，其包括将选自MH71和MH243的链霉菌分离株或其组合物施用至植物的根、茎、花、叶或种子或植物周围(例如土壤)。

在另一个示例性的实施方案中，将组合物施用至植物的种子。在一个具体的实施方案中，组合物被用作种子包衣(coat)。

本发明的第八方面提供了治疗或预防由植物病原体引起的或与植物病原体相关的疾病，或用于降低植物对病原体感染的易感性的方法，其包括用选自MH71和MH243的链霉菌分离株或其组合物涂覆植物种子。

本发明的第九方面提供了一种治疗或预防由植物病原体引起的或与植物病原体相关的疾病，或用于降低植物对病原体感染的易感性的方法，其包括将选自MH71和MH243的链霉菌分离株或其组合物施用至植物的根部。

在第十方面，本发明还涉及治疗或预防由植物病原体引起的或与植物病原体相关的疾病，或用于降低植物对病原体感染的易感性的方法，其包括将选自MH71和MH243的链霉菌分离株或其组合物的无细胞培养滤液施用至植物、植物部分、种子或植物周围。

在第十一方面，本发明涉及抑制或减少病原体在植物上生长的方法，该方法包括将选自MH71和MH243的链霉菌分离株或其组合物施用至植物、植物部分、种子或植物周围。

在第十二方面，本发明涉及抑制或减少病原体在植物上生长的方法，该方法包括将选自MH71和MH243的链霉菌分离株的无细胞培养滤液施用至植物、植物部分、种子或植物周围。

根据以上方面，将链霉菌分离株或其组合物或无细胞培养滤液施用至植物的叶、根、花、茎或种子或植物土壤。

在一个实施方案中，无细胞培养滤液包含一种或多种抗病原体代谢物(anti-pathogen metabolite)。在一个示例性的实施方案中，代谢物为抗生素和/或增强抗生素在抑制或减少病原体在植物或植物部分、种子或植物周围的生长方面所发挥的作用。

在另一个实施方案中，无细胞培养滤液可以包含一种或多种蛋白质，这些蛋白质有助于抑制或减少病原体在植物或植物部分、种子或植物周围的生长。在一个实施方案中，蛋白质具有酶活性。

根据以上方面和实施方案，病原体的生长被抑制或减少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

在一个实施方案中，病原体为真菌病原体。在一个特定的实施方案中，真菌病原体为选自核盘菌属(Sclerotinia)、镰刀菌属(Fusarium)、顶囊壳属(Gaeumannomyces)、小球腔菌属(Leptosphaeria)、腐霉属(Pythium)、链格孢属(Alternaria)和丝核菌属(Rhizoctonia)的属的成员。在另一个示例性的实施方案中，所述真菌病原体为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、伪禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、禾顶囊壳菌(Gaeumannomyces graminis)、Pythiumirregulare、立枯丝核菌AG2-1(Rhizoctonia solani AG2-1)、立枯丝核菌AG8(Rhizoctonia solaniAG8)、禾本科布氏白粉菌(Blumeria graminis)、十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)和芸苔生链格孢菌(Alternaria brassicicola)中的一种或多种。

在一个实施方案中，病原体为细菌病原体。在一个具体的实施方案中，细菌病原体为选自黄单胞菌属(Xanthomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、劳尔氏菌属(Ralstonia)、农杆菌属(Agrobacterium)、欧文氏菌属(Erwinia)、木质部小菌属(Xylella)、Dickeya、果胶杆菌属(Pectobacterium)、棒形杆菌属(Clavibacter)和Candidatus的属的成员。在一个特定的实施方案中，细菌病原体为选自黄单胞菌属和假单胞菌属的成员。在另一个示例性的实施方案中，细菌病原体为丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、半透明黄单胞菌(Xanthomonas translucens)或水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)，任选地为水稻黄单胞菌水稻致病变种((Xanthomonas oryzae pv.oryzae)。

在示例性实施方案中，植物选自农作物，例如广田作物(broad acre crop)、园艺作物或用于纤维生产或观赏植物的作物。在特定的示例性实施方案中，植物为小麦或加拿大油菜(canola)。

在第十三方面，本发明提供了用于降低正在发芽的种子对病原性感染的易感性的方法，其包括将植物种子浸入包含如本文所述的链霉菌MH71或MH243的组合物中，以及在适合发芽的条件下将种子种植在合适的生长介质中。

本文所述的链霉菌MH71或MH243将已经暴露于植物病原体、被植物病原体感染或对植物病原体易感的植物的生长和/或植物作物的产量维持在与未暴露于植物病原体、未被植物病原体感染或对植物病原体不易感的植物或植物作物的生长相同或相似的水平。

因此，本发明的第十四方面提供了一种用于维持植物生长和/或植物作物产量的方法，其中该植物或植物作物已经暴露于植物病原体、被植物病原体感染或对植物病原体易感，该方法包括将如本文所述的链霉菌或其组合物施用至植物、植物部分、种子或植物周围，其中植物的生长和/或产量与未暴露于病原体、未被病原体感染或对病原体不易感的对照植物的生长或植物作物的产量相同或基本相同。

在本发明的第十五方面，提供了用于获得有效减少或抑制植物病原体生长的诸如抗生素化合物的抗真菌代谢物的方法。该方法包括在足以允许产生诸如抗生素化合物的一种或多种抗真菌代谢物的条件下培养本文所述的纯化的链霉菌MH71或MH243；收获含有一种或多种抗真菌代谢物/化合物的培养基；任选地过滤培养基以获得无细胞培养滤液。

以下公开内容涉及所有以上方面和实施方案。

附图说明

在此，仅通过非限制性示例的方式，参考以下附图描述了本发明的实施方案。

图1.示出了放线菌(Actinobacteria)体外抑制真菌病原体的结果。在每对图像中，左侧的平板在平板的顶部接种抗真菌放线菌，在平板的底部接种真菌病原体，而右侧的平板仅在平板的底部接种真菌病原体。上部的图显示了链霉菌MH243抑制伪禾谷镰刀菌(冠腐病)，中部的图显示了MH243抑制立枯丝核菌AG2-1(下胚轴/根腐病)，下部的图显示了MH71抑制核盘菌属茎腐病。

图2.示出了放线菌的20种不同分离株体外抑制(以抑制百分比表示)加拿大油菜的真菌病原体的结果。请注意，当针对CSIRO放线菌培养物保藏中的分离株进行筛选时，分离株MH71和分离株MH243对所有测试病原体的抑制水平最高。

图3.示出了接种选定的放线菌显著增加了感染Pythium irregulare的小麦植物的生物量。

图4.示出了在小型植物试验中通过放线菌分离株抑制镰刀菌冠腐病的结果。分离株MH71和分离MH243在多种试验中始终有效地以75％-94％抑制疾病。

图5.示出了放线菌对加拿大油菜的核盘菌的体内抑制结果。用放线菌悬浮液(生物防治剂)、放线菌无细胞悬浮液(含有分泌到肉汤培养基中的生物活性物质的培养滤液)喷洒10天大的加拿大油菜籽苗或不进行处理。24小时后，将核盘菌菌丝体悬浮液施用至疾病处理(disease treated)的植物中的两个子叶。病原体接种后第20天，接种放线菌的植物存活并生长繁盛。“仅疾病(disease only)”处理的幼苗在5-7天内死亡。

图6.示出了放线菌培养滤液体外抑制伪禾谷镰刀菌(A)和核盘菌(B)的结果。一系列稀释的分离株MH243培养滤液(无细胞)抑制了伪禾谷镰刀菌(稀释度高达1/100)和核盘菌(S.sclerotiorum)菌丝(稀释度高达1/1000)的生长。MH60显示为代表性的非抑制性放线菌分离株。

图7.示出了放线菌对三种伪禾谷镰刀菌菌株的体外抗真菌活性的结果。

图8.呈现了分析结果，其显示在两种具有不同疾病易感性的小麦品种中，MH71和MH243抑制伪禾谷镰刀菌的一致反应。对于每种处理，左手条代表小麦品种Wyalkatchem，右手条代表小麦品种Tamaroi。

图9.示出了生长至成熟的小麦植物的温室试验的结果，并证明了MH71和MH243分别使疾病减少了27％和25％。灰色条代表患病的植物；黑色条代表健康的植物。

图10.显示了在4天(a)、7天(b)、14天(c)和5周(d)之后，半强度马铃薯-葡萄糖琼脂上的MH71形态。

图11.显示了在4天(a)、7天(b)、14天(c)和5周(d)后，半强度马铃薯-葡萄糖琼脂上的MH243形态。

图12.显示了在体外抑制试验中，MH71和MH243抑制尖孢镰刀菌和芸苔生链格孢菌的结果。分离株MH71和分离株MH243分别持续有效地抑制90％的芸苔生链格孢菌的真菌生长，和74-85％的尖孢镰刀菌的真菌生长。

图13.显示了与对照接种植物和用防治核盘菌(Sclerotinia)用商业杀真菌剂(Prosaro，Bayer)处理的植物相比，使用以下处理的、成熟加拿大油菜植物盆栽的研究的结果：对接种了核盘菌的植物进行放线菌微生物或无细胞滤液处理。在30％开花(bloom)或10％和30％开花(flowering)阶段喷洒植物。

图14.显示了来自MH71的无细胞提取物对水稻的细菌病原体(黄单胞菌属)的体外抑制(显示为光密度(OD)的降低)的结果。提供了代表性真菌病原体核盘菌的抑制作用，作为生物杀细菌剂功效与生物杀真菌剂功效的比较。

图15.显示了来自MH71和MH243的无细胞提取物对大麦细菌病原体(假单胞菌属)的体外抑制(显示为光密度(OD)降低)的结果。提供了代表性真菌病原体核盘菌的抑制作用，作为生物杀细菌剂功效与生物杀真菌剂功效的比较。

发明详述

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是描述了典型的方法和材料。

在本文中，除非上下文另外明确指出，冠词“一种(a)”和“一个(an)”用于指代该冠词的语法对象中的一个或多个(即至少一个)。举例来说，“一种菌株”可以指一种菌株或一种以上菌株。

在本说明书的上下文中，术语“约”应理解为是指本领域技术人员在实现相同功能或结果的情况下被认为等同于所述值的数字范围。

在整个本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”或“含有”之类的变体将被理解为暗示包括所述整数或步骤或一组整数或步骤，但不排除任何其他整数或步骤或一组整数或步骤。

本发明基于发明人出乎意料的分离属于链霉菌属的新型放线菌菌株，命名为MH71和MH243，其在预防或减少植物中广泛的病原体生长方面非常有效。本发明人还发现，将MH71和/或MH243施用至暴露于植物病原体的植物，会使植物的生长和发育与未暴露于植物病原体的对照植物的生长和发育相同或基本相同。因此，分离的链霉菌菌株可用于降低对由植物病原体引起的或与植物病原体相关的疾病的易感性、或用于治疗或预防由植物病原体引起的或与植物病原体相关的疾病的方法。

为了专利程序的目的，已经根据布达佩斯条约将新型放线菌菌株保藏于澳大利亚维多利亚州墨尔本港伯蒂街(Bertie Street,Port Melbourne,Victoria,Australia)的国家度量学会实验室(NMI)中。分离株分别具有保藏号V17/004100和V17/004101。

用于获得分离株的分离和选择过程的细节在实施例中列出。

因此，本发明的第一方面提供于2017年2月21日以保藏号V17/004100保藏于澳大利亚国家度量学会(NMI)的链霉菌菌株MH71。

本发明的第二方面提供了于2017年2月21日以保藏号V17/004101保藏于澳大利亚国家度量学会(NMI)的链霉菌菌株MH243。

根据以上方面，链霉菌菌株MH71和MH243优选为分离的形式。如本文所用，“分离的”菌株是已经从其通常与自然界相关的材料(例如土壤)中分离的菌株。尽管一种或多种菌株可以与相同或不同属的其他细菌组合存在，无论是通过人工将细菌聚集在一起并共同培养，或者将自然界中存在的细菌从自然界中与其共存的其他细菌中部分纯化出来

这样，术语“分离的”不一定反映菌株已经纯化的程度。此外，当菌株与其在自然界中通常不一起存在的其他菌株或化合物或材料相关时，该菌株仍被定义为“分离的”。

通常，MH71和/或MH243菌株在培养物中。在示例性的实施方案中，MH71和/或MH243菌株在纯的或基本纯的培养物中。

本文所用的术语“培养物”是指液体和平板培养物。如本文所用，“培养”是指生物在各种介质之上或之中的繁殖。

“纯的”培养物是在没有其他物种或种类的情况下生长的生物体群体。所述一种或多种菌株的“基本上纯的培养物”是指除所需要的一种或多种菌株之外基本上不含其他微生物的培养物。换句话说，基本上纯的培养物基本上不含其他污染物，所述污染物可以包括微生物污染物以及不期望的化学污染物。

根据本发明可预防或治疗的植物病害可由任何病原体引起。如本文所用，术语“病原体”应理解为是指引起植物病害的任何生物。说明性实例包括致病性细菌、真菌、霉菌、诸如线虫类的寄生虫和植物物种特有的引起疾病症状的病毒。在本发明的特定实施方案中，病原体为土壤或残茬负载的病原体。在示例性的实施方案中，病原体为真菌病原体。

如本文所用，术语“植物”应理解为是指植物界的任何成员和任何其他光合植物类生物，例如藻类。特别地，本文所用的术语“植物”是指易于罹患由病原体引起或与病原体相关的疾病的任何植物。

在根据本发明的链霉菌菌株或其组合物的应用中，术语“植物”在其含义内包括整株植物、其任何繁殖或发育形式或阶段或植物的部分或片段。因此，术语“植物”可用于涵盖植物繁殖体、幼苗、发芽植物、试管苗和成熟植物或其任何部分或片段，包括但不限于下胚轴、叶、枝、茎、根、头/核、冠、组织样本、种子、果实、坚果、花或球果(cone)。

对“种子”和“籽(seed)”的引用在本文中可互换使用，是指可以向其施用根据本发明的组合物的种子，通常是可育性种子(viable seed)。还应当理解，本文所提供的“种子”是指能够发芽至所关注的相关植物物种典型的至少常规发芽水平的种子。

本文所用的“维持植物生长”是指与未暴露于病原体、未被病原体感染或对病原体不易感的对照植物或其部分相比，或与预定标准相比，已经暴露于病原体、被病原体感染或对病原体易感的植物或其部分(例如根和芽)的生长是相同或基本相同的。或者，“植物生长的维持(maintenance)”可以通过记录与未暴露于病原体、未被病原体感染或对病原体不易感的对照植物或其部分相比，或与预定标准相比，已经暴露于病原体、被病原体感染或对病原体易感的植物或其部分的生物量的差异来确定。

如本文所用，术语“植物生物量”是指源自活的或最近活的植物的生物材料。测量植物生物量的方法可以采用，例如通过采集植物组织(可能是根、枝、叶、头或谷粒)的样品并在+60℃下干燥，直到质量在进一步干燥后不再变化。不受任何理论或作用方式的限制，植物生物量通常取自重复样本(最少3个)，并表示为平均干质量+/-平均值的标准误差。干物质可以单独用作“组织生物量”，也可以合计为“地面以上生物量”、“地面以下生物量”或“总生物量”。

在本说明书的上下文中，“维持植物农作物的产量”应理解为是指与对照相比，该作物的任何产出度量(通常是农业或园艺输出量)的增加，包括：仅作为示例，维持植物或一个或多个植物部分(例如食用植物部分)的生物量，或维持植物生长，例如作为实例，维持一个或多个植物部分(例如水果、蔬菜、块茎、种子、坚果、花、秆、茎、叶或任何具有经济价值的其他植物部分)的数量、大小、体积、生存力或质量。

在本说明书的上下文中，术语“降低”、“减少”、“抑制”等当与根据本发明的实施方案将链霉菌分离株施用至植物后的病原体生长、发育、功能或行为的任何参数有关时，应理解为与不进行施用相比，作为施用的结果的所选参数的降低、减少或抑制。

术语“植物周围”是指植物在其中生长或维持并且紧邻植物的土壤或其他介质，使得在施用时，活性剂能够达到并接触植物的根部。

如本文所用，术语“治疗(treating)”，“治疗(treatment)”，“预防”和“阻止”是指用于补救由病原体感染引起的或与病原体感染相关的疾病状况或症状，防止由病原体感染引起的或与病原体感染相关的疾病的形成，或以任何方式阻止、阻碍、延缓或逆转由病原体感染引起的或与病原体感染相关的疾病或其他不良症状的进展的任何和所有用途。因此，术语“治疗”和“预防”等应在其最广泛的范围内考虑。例如，治疗并不一定意味着要对植物进行治疗直到完全恢复。在表现出多种症状或以多种症状为特征的病症中，治疗或预防不一定需要补救、预防、阻碍、延缓或逆转所有所述症状，而是可以预防、阻碍、延缓或逆转一种或多种所述症状。在某些由病原体感染引起的或与病原体感染相关的植物病害的情况下，本发明的方法涉及在减少或改善与疾病相关的高度不良事件或疾病发展的不可逆转结果的发生方面“治疗”该疾病，但本身并不能阻止事件或结果的最初发生。因此，治疗包括改善特定疾病的症状或预防或以其他方式降低发展特定疾病的风险。

如本文所用，术语“治疗(treating)”，“治疗(treatment)”，“预防”和“阻止”也应理解为是指抑制(suppressing)、抑制(inhibiting)或减少植物病原体生长的过程。

如本文所用，“减少植物对病原体感染的易感性”应理解为是指保护植物免受植物病原体感染的过程，包括保护健康的植物免受疾病侵害。应当理解，易感性的降低并不一定意味着植物将不再发展出病原性感染。相反，易感性的降低是指植物发生由病原体感染引起的或与病原体感染相关的疾病的可能性小于未接受处理的植物发生由病原体感染引起的或与病原体感染相关的疾病的可能性。

在一个实施方案中，病原体生长被抑制或减少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。

本发明提供了一种用于控制由植物中的病原体引起的或与植物中的病原体相关的疾病的有效、简单、经济的手段，其通过减少植物病原体的负载并使植物能够在易发疾病的环境中生存甚至生长来维持植物生长和/或农作物产量，其具有减少或最小化对生态系统或环境的损害的特别益处。

特别是，真菌植物病使澳大利亚谷物和油料种子产业每年损失数百万美元的收入。当前的管理策略对包括例如镰刀菌属、顶囊壳属、丝核菌属、腐霉属、核盘菌属、链格孢属和布氏白粉菌属的那些植物真菌病原体的效力有限。如在别处所指出的，发明人惊奇地发现，将包含链霉菌分离株MH71和MH243的组合物施用至包括植物种子的植物，表现出对多种植物真菌病原体的高的生物杀真菌剂功效。

在本发明的特定实施方案中，病原体为真菌病原体。本发明所涵盖的真菌病原体的说明性实例包括但绝不限于属于以下的那些病原体：镰孢菌属(Fusarium spp.)(例如香蕉镰刀菌枯萎病(Fusarium wilt disease)、镰刀菌冠腐病和小麦赤霉病的病原(causalagent))、小麦全蚀病菌(Graeumannomyces graminis)(例如顶囊壳属的病原)、十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)(例如黑腿病(blackleg)的病原)、白霉菌(Sclerotiania sclerotiorum)(例如菌核病的病原，也被称为白色霉菌/霉菌(whitemould/mold)、棉状腐病；菌核病(watery soft rot)；和花枯病(blossom blight))、链格孢属(Alternaria spp.)(例如芸苔生链格孢菌枯萎病)、黑粉菌属(Ustilago spp.)(例如黑穗病的病原)、丝核菌属(Rhizoctonia spp.)(例如根腐病和下胚轴腐烂和秃块(barepatch)的病原)、Pythium irregulare(例如腐霉根腐病(Pythium root rot)的病原)、根念珠属(Thielaviopsis spp.)(例如腐烂病(canker rot)、黑根腐病、根念珠属根腐病(Thielaviopsis root rot)的病原))、黄萎病菌属(Verticillium spp.)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(例如稻瘟病的病原)、葛锈病菌(Phakospora pachyrhizi)(例如大豆锈病的病原)、锈菌属(Puccinia spp.)(例如几乎所有谷物和耕种草的严重锈病的病原)、禾本科布氏白粉菌(Blumeria graminis)(小麦的白粉病)、白粉属(Erysiphe spp.)(例如葡萄白粉病的白粉菌(Erysiphe necator)病原)、葡萄孢菌(Botrytis cinerea)(灰霉病(botrytis bunch rot)和灰色霉菌/灰霉菌(grey mould/gray mold)的病原)和蜜环菌属(Armillaria spp.)(例如所谓的蜜环菌(honey fungus)物种，它们是树木和生产食用菌的致病性病原体)。

根据本发明可治疗的由核盘菌属菌株介导的植物病害的说明性实例包括核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。

根据本发明可治疗的由镰刀菌属物种介导的植物病害的说明性实例包括假伪禾谷镰刀菌、禾谷镰孢和尖孢镰刀菌感染。

根据本发明可治疗的由顶囊壳属物种介导的植物病害的说明性实例包括禾顶囊壳菌感染。

根据本发明可治疗的由丝核菌属物种介导的植物病害的说明性实例包括立枯丝核菌感染。

根据本发明可治疗的由腐霉属物种介导的植物病害的示例性实例包括瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、Pythium irregulare和/或终极腐霉感染。

发明人还发现、包含来自链霉菌分离株MH71和MH243的无细胞提取物的组合物表现出对抗植物细菌病原体的高的功效。

本发明预期的细菌病原体的说明性实例包括但不限于属于选自以下的那些病原体：黄单胞菌属(例如水稻黄单胞菌水稻致病变种(；野油菜黄单胞菌致病变种(Xanthomonas campestris pathovars)；半透明黄单胞菌致病变种(Xanthomonastranslucens pathovars)；以及地毯草黄单胞菌致病变种(Xanthomonas axonopodispathovars)、假单胞菌属(例如丁香假单胞菌致病变种(Pseudomonas syringaepathovars)；和褐鞘假单胞菌(Pseudomonas fuscovaginae))、劳尔氏菌属(例如青枯病菌(Ralstonia solanacearum))、农杆菌属(例如根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens))、欧文氏菌属(例如梨火疫病菌(Erwinia amylovora)，也被称为火疫病(fireblight))、木质部小菌属(例如叶缘焦枯病菌(Xylella fastidiosa))、Dickeya属(例如dadantii和solani)、果胶杆菌属(例如胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)和黑胫病病毒(Pectobacterium atrosepticum)、棒形杆菌属(例如密西根棒状杆菌(Clavibacter michiganensis)(环腐)和马铃薯环腐病菌(Clavibactersepedonicus))和Candidatus属(例如亚洲柑桔黄龙病菌(Candidatus Liberibacterasiaticus))。

治疗或预防由病原体引起的或与病原体相关的植物病害，以及降低植物对病原体感染的易感性的潜力具有显著的潜在商业和环境效益，包括在大面积农作物生产、食品或纤维园艺、观赏植物、原生生态系统的建立和恢复、人工林、矿场恢复、园林改造、农业、苗圃中的植物繁殖以及其他相关产业。因此，本发明可以应用于任何植物物种。这些益处可能会在多种条件下种植的植物中体现出来(例如，包括田间、温室、容器或大桶种植(vatgrown))。

因此，根据本发明，植物物种可以是单子叶植物或双子叶植物，并且可以是常绿的或落叶的。植物可以是草或谷类，例如小麦、大麦、玉米、燕麦、水稻、黑麦、高粱、玉米、粟；草药；果树，例如柑橘、苹果、鳄梨、椰子、梨、枣椰；油料植物，包括大豆、向日葵、油菜籽(加拿大油菜)、棉花、花生、亚麻(亚麻籽)和蓖麻；豆类作物，例如鹰嘴豆、蚕豆(faba)/蚕豆(broadbean)、红豌豆、扁豆、羽扇豆和绿豆、红豆、海军豆、豇豆、野豌豆(vetch)和木豆；来自例如豆科(Fabaceae)(pea family)的蔬菜，例如豌豆、豆类、小扁豆；茄科(Solanaceae)(nightshade family)，例如西红柿、茄子、灯笼椒(bellpepper)、土豆；十字花科(mustardfamily)，例如花椰菜、卷心菜、抱子甘蓝、西兰花；葱属植物科，例如洋葱、大蒜、韭菜、葱、细香葱；胡萝卜(伞形科)；生菜(菊科)；葫芦科植物，包括甜瓜、哈密瓜、黄瓜、葫芦、倭瓜(squash)和南瓜；来自芭蕉属(genus Musa)的草本开花植物，例如香蕉、园艺开花植物、或木本植物(例如CAM、C3和C4植物)，包括但不限于桉树、松树、云杉、柳树等；或其他农作物物种，例如棉花、咖啡、茶。所列出的植物物种仅以举例说明的方式提供，并且本发明的范围应理解为不限于所提供的说明。同样以举例说明的方式，在将本发明用于矿场恢复的情况下，植物可以是草或木本植物物种，例如桉树，例如斑皮桉(Corymbia maculata)(斑桉(spotten gum))、扭叶栲(Acacia falcata)、细叶桉(Eucalyptus tereticornis)(红胶树(forestred gum))、和赤桉树(Eucalyptus camaldulensis)(大叶桉(riverred gum))。其他商业相关的物种包括锡特卡柳(Sitka willow)(Salix sitchensis)、裂叶桤木(Sitkaalder)(绿赤杨(Alnus viridis))、杰克松(Jack pine)(北美短叶松(Pinus bankiana))、白云杉(White spruce)(灰绿云杉(Picea glauca)、黑松(Lodgepole pine)(扭叶松(Pinuscontorta))。本发明还预期采用与生物燃料作物(例如绿藻(例如小球藻(Chlorellaprotothecoides))、甘蔗、向日葵和大豆)有关的本文公开的方法。

在示例性实施方式中，植物为农作物或油料种子植物。在一个实施方案中，植物选自小麦和加拿大油菜。

在系统发育上(Phylogenetically)，链霉菌属于放线菌门，也称为放线菌，是一组革兰氏阳性细菌，与其他细菌(例如大肠杆菌(50％))相比，其遗传物质(DNA)富含GC(70％)。链霉菌在各种环境中生长，其形状类似于丝状真菌。放线菌通过孢子繁殖；更具体地说，菌丝生长之后是孢子的分裂(fragmentation)和释放。链霉菌的形态学分化涉及形成菌丝层，该菌丝可以分化为孢子链。

因此，如本文所用，对根据最近公开的链霉菌分离株的引用也应理解为对链霉菌的可繁殖(reproductively viable)部分(例如但不限于孢子和菌丝)的引用。

在本发明的上下文中，链霉菌分离株可以配制成适合于施用至植物、植物部分、植物种子或植物在其中生长或将在其中生长的植物周围(例如土壤)的组合物。

如本文所描述和举例说明的，本发明人做出了令人惊讶和有利的发现，即本文所公开的链霉菌分离株的无细胞培养滤液抑制或减少了广泛的真菌和细菌病原体的生长。将无细胞培养滤液施加到植物上可以保护植物免受这些病原体的侵害或减少这些病原体的感染。

因此，还可以使用衍生自链霉菌微生物培养物的无细胞滤液材料来制备适用于本发明的组合物。

可以使用本领域技术人员众所周知的一种或多种方法来制备无细胞培养物。在特定的实例中，将根据本发明鉴定的链霉菌分离株从琼脂斜面接种到合适的营养培养基中，并生长至对数后期。例如，将培养物在半强度的马铃薯-葡萄糖琼脂平板上生长至少3周(直到菌落出现黑色光泽)。为了制备滤液，使用无菌环挑菌落并接种无菌YME肉汤(pH 7.2)。或者，可以用来自水孢子悬浮液的孢子直接接种YME肉汤。在培养物中生长约4-6周后，通过使溶液通过米拉布过滤器(miracloth filter)来收获细菌细胞，并且将上清液(“培养滤液”)通过0.2μm过滤器过滤灭菌以去除残留的细胞。然后将培养滤液冷冻干燥并在去离子水中以浓缩形式重构。然后如上所述，可将培养滤液过滤灭菌，并稀释至合适的浓度以进行测试。在另一个实例中，无细胞滤液可以在无菌水中稀释(例如1/10稀释)，而无需冷冻干燥。为了喷洒，将增加润湿性、铺展性和/或改变液滴形成和行为的添加剂例如辅料加入到所得溶液中。

不希望受到理论的束缚，链霉菌的特性是产生生物活性次级代谢产物(例如抗真菌剂、抗病毒剂、抗肿瘤剂、抗高血压药，并且主要是抗生素和免疫抑制剂)的能力。大多数抗生素的生产都是物种特异性的，这些次级代谢产物很重要，因此链霉菌属可以例如与其他可能与之接触的微生物竞争。

因此，在本发明的一个实施方案中，无细胞培养物包含由本文公开的链霉菌分离株分泌的代谢物。

如本文所用，术语“代谢物”是指微生物发酵的、具有杀生物活性的任何化合物、物质或副产物。在某些细菌的情况下，其生长阶段可以分为初级代谢阶段和次级代谢阶段。次级代谢产物是细菌活跃的生长阶段后产生的代谢物。在一个实施方案中，代谢物是抗生素。在另一个实施方案中，代谢物是增强抗生素在植物或植物部分、种子或植物周围中抑制或减少病原体生长的作用的物质。

当与本文所述链霉菌分离株或其组合物的施用有关使用时，本文所用的术语“施加”、“应用”或“施用”应理解为还包括用链霉菌分离株或其组合物“接触”植物、植物部分、种子和/或植物将要在其中生长或正在其中生长的土壤、或植物周围，以及用链霉菌分离株或其组合物“接种”植物、植物部分或种子。

例如，如本文所用，术语“用链霉菌分离株或其组合物接种植物”是指将链霉菌分离株或其组合物施用至植物(包括其根、茎、叶或种子)或使植物(包括其根、茎、叶或种子)与链霉菌分离株或其组合物接触的过程。

可以使用本领域已知的标准技术，例如静态干燥和液体发酵来制备用于本发明的组合物中的链霉菌。链霉菌可以使用本领域技术人员众所周知的一种或多种方法来生产/生长，包括例如使用生物反应器。

生物反应器是指支持生物活性环境的任何装置或系统。如本文所述，生物反应器是其中可以生长包括链霉菌的微生物的容器。对于小规模操作，例如，可以使用间歇式生物反应器(batch bioreactor)来测试和开发新的工艺，以及用于不能转换为连续操作的工艺。

在生物反应器中生长的微生物可以被悬浮或固定。生物反应器中的生长通常在有氧条件下在合适的温度和pH下进行生长。技术人员可以使用本领域的知识容易地确定所需的最佳生长条件(例如温度、营养物浓度、pH和溶解气体)。在一个实例中，典型的生长温度为25-30℃，生长培养基的pH通常为约7.2。

生长培养基可以是适合于链霉菌物种培养的任何已知技术的培养基，例如酵母麦芽提取物(YME)、淀粉酪蛋白琼脂(SCA)培养基、放线菌分离琼脂培养基(ActinomyceteIsolation Agar

)。在这些条件下生长的菌株通常在一周内产生菌丝，在2-3周内产生孢子。细胞培养物、孢子或菌丝可以使用常规的洗涤、过滤或沉淀技术(例如离心)来收获，或者可以使用旋风系统(例如孢子分离器MKV(MycoHarvester MKV)(MycoHarvester,Bateman,Berks,UK))干燥收获。在另一个实例中，可通过用无菌刀片或接种环刮擦来从成熟平板上收获孢子。

细胞培养物、孢子或菌丝可立即使用或使用本领域已知的标准条件储存，例如细胞培养物、孢子或菌丝可在室温下于水悬浮液中储存并涂覆在种子上，保持时间超过12个月。在另一个实例中，细胞培养物、孢子或菌丝可以在冷藏条件下(例如1℃-10℃、1-7℃、2-4℃或2℃)存储，也可以冻干。可以使用干细胞培养物、孢子或菌丝制剂，只要它们能保持繁殖力即可。

适用于本发明的组合物可以是液体或固体形式。上面讨论的含有孢子和/或菌丝的生长培养基为液体。这种液体本身可以用作浸剂(dip)或喷洒剂，以接种种子、植物、土壤、牧草或草皮。随后可以将涂覆有液体组合物的种子干燥并储存以备将来使用。

液体组合物可以进一步与农业上可接受的稀释剂或载体一起配制以形成喷雾剂、泡沫剂、浸泡剂(drench)、浆料、凝胶、浸剂、乳剂或糊剂，并任选地与助剂(co-formulant)或营养改良剂(例如海藻)组合。合适的载体包括水、水溶液、浆液、颗粒或粉末。

在一个实施方案中，组合物为固体形式。该组合物可以通过干燥本发明的液体组合物来制备。或者，可通过将链霉菌细菌或其细胞、孢子或菌丝与农业上可接受的载体(例如种子、石灰、高岭土、玉米片、腐殖酸盐和硅藻土或其混合物)组合来制备可用于本文的固体组合物。一种制剂包括组合物的粉末形式，其可以撒在植物上。

在一个实施方案中，使用已知技术将固体组合物制成微丸(pellet)或小球(prill)的形式。在一个实施方案中，小球生产包括在任何合适的旋转混合碗中涂覆本发明的链霉菌。

根据本发明，链霉菌或包含链霉菌的组合物可单独施用，或与其他添加剂组合施用，其他添加剂例如但不限于：表面活性剂、辅料、湿润剂(wetting agent)、湿润剂(humectant)、胶粘剂、散布剂(spreader)、稳定剂、增强活性的渗透剂、改善孢子活力的应激剂、紫外线保护剂和植物保护物质或它们的混合物。这样的添加剂可以分别施用到用链霉菌处理的植物的相同或不同部分，并且可以在用链霉菌处理的同时、之前或之后施用。在另一个实施方案中，这样的添加剂可以包含在含有链霉菌菌种的组合物中。

植物保护物质的实例包括例如化学肥料、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、有机肥料、除草剂、营养物或微量营养物。应激剂的实例包括氯化钾、氯化钠、甘油和葡萄糖。

本文所用的“辅料”包括具有改善、修饰或促进包含本文所定义的链霉菌分离株的组合物的活性或应用特性的功能的任何添加剂。例如，关于水溶液，辅料可以起到改善组合物的铺展性和/或润湿性，或改变液滴形成和/或行为的作用。

可以包含在待施用至植物的水溶液中的辅料的实例包括，例如，酯化油(例如酯化植物油)、植物油、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂或两亲型表面活性剂，它们可以用于改善分散性、润湿性、渗透性和/或易位性(translocation)，以及在即用型稀释液中影响制剂的混溶性和稳定性。辅料可以是上述的混合物，例如，酯化油基产品与非离子表面活性剂的混合物。在一个实施方案中，辅料包含酯化植物油和表面活性剂的组合。一种这样的辅料的实例是Hasten^TM。

组合物还可包含其他辅料，例如pH调节剂、载体、消泡剂、增稠剂、抗冻剂、有机溶剂(优选水溶性溶剂)、防腐剂和着色剂。惰性的无机化合物(例如二氧化硅、盐)或有机(例如纤维素、聚丙烯酸酯、尿素)化合物的固体形式(例如颗粒剂、粉剂和片剂)可用作稀释有机酸或吸收水分的载体。可以通过本领域技术人员已知的多种标准方法来制备这样的固体形式，例如，通过盘式制粒、喷雾干燥、流化床制粒，通过立式混合机或桨式混合机的混合制粒，或通过挤出、压实、离心喷射层或喷雾/冷却制粒。

在一个特定的实例中，当放线菌的孢子作为种子涂层施用时，将其与黄原胶混合并直接施用至种子，而没有任何其他添加剂。

添加剂还可以包括有助于在长期储存中保持微生物生存力的组合物，例如未精制的玉米油和所谓的反相乳液(invert emulsion)，该反相乳液在外部包含油和蜡的混合物，在内部包含水、藻酸钠和分生孢子。表面活性剂、散布剂、渗透剂和胶粘剂的实例包括

Codacide

D-C.

Supamet Oil、

和

在选择包含(inclusion)的情况下，则希望根据已知方案将常见的农业表面活性剂(例如Hasten^TM)包括在组合物中。此添加剂清单仅用于说明的目的。重要的是，所使用的任何添加剂以不干扰本文示例的链霉菌菌株的效力的量存在。

无论任何形式的根据本发明的组合物，也可以包括酸化剂、藻酸盐、甘露聚糖、甘油、多糖、纤维素、木聚糖、角叉藻胶、营养物、微量元素、矿物质、蛋白质、脂肪、可溶性碳水化合物、不溶性碳水化合物以及维生素和添加剂以延长保质期。

在一个实施方案中，小球(prill)包括玉米片、硅藻土、腐殖酸盐和营养物混合物。营养混合物包含小球中常用的可溶性和不溶性碳水化合物、蛋白质、脂肪和微量元素。微丸或小球特别适合用于播种到新牧场或补播(over-sowing)旧牧场。

根据以上方面，在一个实施方案中，组合物还可包含能够治疗或预防由植物病原体引起的或与植物病原体相关的感染或疾病和/或能够促进组合物将要施用至其上的植物生长的其他试剂或生物体(organism)。此类试剂或生物体的实例包括如上所述的其他链霉属菌种或其他细菌种、生物防治真菌菌种、发芽促进剂、杀真菌剂、杀虫剂、添加剂和惰性载体，只要它们与链霉菌MH71或MH243的存活和生长相容。

类似地，用于本发明的组合物中的任何载体、稀释剂、辅料和添加剂都不应具有植物毒性或杀菌作用。

如本文所用，术语“有效浓度”在其含义内包括无毒但足够量的本文公开的链霉菌分离株或其组合物或无细胞培养滤液以提供所需的效果。所需的确切浓度将因应用而异，具体取决于以下因素：待处理的植物种类；植物的年龄和一般状况；是否在种植之前或就地处理过该植物；土壤条件，例如土壤类型、盐分、水含量、酸度、营养水平和有机物质组成；气候因素，例如温度和降雨量；施用方式；施用该组合物的形式；感染植物的病原体的身份(identity)和数量；组合物中单个菌株的身份和数量、施用时的感染或疾病的严重程度等。因此，不可能指定确切的“有效浓度”。本领域技术人员可以容易地确定链霉菌分离株或其组合物或细胞培养滤液的量或浓度，或应施用至植物或植物种子和/或植物土壤的细胞培养滤液的量或浓度，以治疗、预防或降低对由病原体引起疾病的易感性和/或促进植物生长。

为了将包含链霉菌的组合物施用至根据本发明的植物，可以使用适合于该目的的任何方法。包含一种或多种本文公开的链霉菌分离株的组合物可以通过干制剂或湿制剂例如以液体、粉末、乳剂或糊剂的形式施用至植物。施用方法通常取决于要治疗的或易受病原体感染的植物部分。例如，基于黄原胶的种子涂层用于治疗或预防根部病害，而包括辅料或表面活性剂以帮助改善叶片润湿的水性喷洒剂用于叶面疾病。

根据本发明，可以将包含本文公开的链霉菌分离株或其组合物的水溶液直接施用至植物、种子或植物生长培养基(例如植物周围，例如土壤、盆栽混合物、无土栽培营养液)。可以例如通过将包含链霉菌的水溶液施用至植物的叶、花、茎或基部、植物繁殖体或植物根部来处理植物。在一个实施方案中，将链霉菌或其组合物施用至叶或根。在一个具体的实施方案中，可以通过将包含微生物的液体组合物喷洒到植物的叶上来处理植物。在一个实施方案中，将植物的根浸泡在包含链霉菌分离株或其组合物的液体溶液中。

在一个具体的实施方案中，将本文公开的链霉菌分离株或其组合物施用至植物繁殖体，例如种子。在一个特定的实施方案中，植物或植物繁殖体可以在种植于植物生长介质(例如生长植物的位置处的土壤)中之前进行处理，例如以种子、幼苗、幼芽、试管块(tubestock)或盆栽植物的其他形式。在本发明的特定实施方案中，在种植之前通过用包含链霉菌分离株或其组合物的溶液(通常为水溶液)浸泡或接触种子来对植物进行处理。在特别优选的实施方案中，种子用组合物涂覆。

在另一个实施方案中，当将植物或植物繁殖体种植在其将要生长的位置处(即原地)时，可以对其进行处理。

在另一个实施方案中，链霉菌分离株或其组合物可以例如以粉末或颗粒状施用至土壤，然后向土壤浇水。在一个实施方案中，为了施用至土壤、牧场或草皮，将微丸或小球播种到带有种子的土壤中、或补播到有或没有种子的牧场或草皮中。在另一个实施方案中，将根据本发明的链霉菌分离株或其组合物以可湿性粉剂的形式作为根浸剂施用至现有的牧场或草皮。

本领域技术人员将理解，本发明的组合物也可直接添加至将要种植如本文定义的植物的土壤或生长介质中。这样的组合物可以以粉末形式加入并与土壤混合，或使用常规方法以液体悬浮液形式施用。

如本文所用，术语“植物土壤”应理解为包括植物当前正在其中生长的土壤，包括牧场和草皮，以及植物将在其中生长的土壤，包括牧场和草皮。

本文公开的组合物可以通过高压或低压喷洒施用而施加到叶子上。也可以通过涂覆、浸入或撒粉进行叶面施涂。本文公开的组合物和链霉菌分离株也可以用于水培系统(hydroponic system)，包括无土的袋子和岩棉。

应理解，本文所述的用于本文所述的链霉菌分离株或其组合物的应用的方法和用途适用于本发明所述的所有方法和用途，例如，用于治疗或预防由植物病原体引起的或与植物病原体相关的疾病，降低植物对植物病原体的易感性，以及在植物病原体存在的情况下维持植物生长和/或植物农作物产量。

还包括根据本发明的用一种或多种链霉菌分离株或其组合物处理的植物、土壤和种子。

不希望受理论的束缚，易感的未处理植物的病原体感染影响了这种植物的某些生长特性。例如，与未暴露于病原体的植物相比，暴露于植物病原体的未处理植物可能显示出植物高度、植物生物量和农作物产量的显著降低。如本文所例示的，与未暴露于植物病原体、未被植物病原体感染或对植物病原体不易感的植物相比，暴露于植物病原体、感染植物病原体或对植物病原体易感的并用链霉菌分离株MH71和MH243处理的植物显示出相似的根和芽的生长和/或生物量。

因此，在本发明的一个实施方案中，与暴露于病原体的未处理植物相比，用链霉菌分离株MH71和MH243或其组合物处理并随后暴露于病原体的植物在植物高度、植物生物量和/或农作物产量方面的降低程度较小。

在一个特定的实施方案中，用本发明的链霉菌分离株或其组合物处理并暴露于病原体的植物将显示出与未暴露于病原体的未处理植物相似的生长特征。

将理解，上述术语和相关定义仅用于解释的目的，而不是限制性的。

在本说明书中对任何在先出版物(或来自它的信息)或任何已知事项的引用均不是、也不应被视为承认、认可或以任何形式暗示在先出版物(或来自它的信息)或已知事项构成本说明书所涉的领域中的公知常识的一部分。

现在将参考以下具体实施例描述本发明，该具体实施例不应以任何方式限制本发明的范围。

实施例

以下实施例是对本文公开的方法的说明，并且在整个说明书中不应将其解释为以任何方式限制说明书的公开内容的一般性质。

实施例1

内生放线菌的采集和分离

放线菌是从西澳大利亚小麦产区中健康小麦植物的根中分离出来的。从围场地区选择植物，传闻证据显示与同一农场的其他地区相比，这些地方的生长和产量更高、病害更少，而没有明显的环境或气候解释。通过手工采摘从这些区域中随机取样植物以采集根和芽。返回实验室后，通过在99％乙醇中洗涤根，然后在漂白剂和乙醇中再次洗涤根来对植物根进行表面消毒，然后将根放在火焰中燃烧掉残留的乙醇。然后将根部无菌切割以暴露植物内部的微生物。将暴露的微生物接种在对放线菌有选择性的琼脂培养基上。这是一种低营养的培养基(含有矿物质盐以及少量葡萄糖)。将平板在28℃孵育6周。当形成可见的菌落时，通过数次将单菌落转移到新鲜琼脂平板上来分离培养物。在室温下将纯培养物保持在半强度马铃薯葡萄糖琼脂平板上。来自每种纯培养物的孢子储存在室温下的水悬浮液中或-20℃和/或-80℃下的20％甘油中。通过大约6个月或根据需要将孢子悬浮液接种到新鲜的半强度马铃薯葡萄糖琼脂平板上来维持分离株。

分离株被命名为MH71和MH243，并保藏于澳大利亚国家度量学会(NMI)。MH71于2017年2月21日以保藏号V17/004100保藏，MH243于2017年2月21日以保藏号V17/004101保藏。

MH71和MH243通常具有以下形态特征。当在半强度的马铃薯-葡萄糖-琼脂平板上培养时，两种培养物的外观相似，但是它们的形态在其整个生命周期中都不同。平板接种3-5天后，出现深入琼脂表面的圆形、无光泽、凸起、不透明的奶油菌落。在这些早期生长阶段，菌落是坚固和坚硬的，并且非常难以通过接种环去除。随着菌落(colony)年龄的增长，它们开始变成灰色。生长3周后，菌落形成有光泽的黑色并软化到非常具有延展性的质地。在此阶段，菌落开始形成孢子。后来，白色的(孢子)条纹出现在菌落的外边界上(见图10和图11)。

当在酵母麦芽提取物(YME)肉汤中生长时，两种培养物的外观非常相似。大约1周后，大量的生物质似乎漂浮在整个肉汤中。再过几天后，在空气与水的界面上会出现明显的圆形白色菌落，特别是在水与玻璃或塑料汇合的生长容器边缘附近。仔细观察时，这些菌落的外观与平板上的成熟菌落相似(中间为灰色，边缘为亚光白色)。

在琼脂培养和小型植物试验中评估了分离株抑制单种病原体的能力。

抗真菌代谢物的产生-琼脂平板试验-通过在马铃薯-葡萄糖琼脂平板的相对的两个末端共同接种测试生物体(test organism)和真菌病原体，进行测试分离株对致病真菌的抑制作用的琼脂平板试验。在一端用单独的真菌病原体接种第二块平板作为对照。将平板在黑暗中于28℃孵育，直到对照板完全被病原体覆盖。分离株对真菌病原体的抑制水平以在真菌完全覆盖对照平板的那一天的测试生物体生长前沿与真菌之间的距离来衡量。

小型植物试验-在小型植物试验中测试了包括MH71和MH243的多种放线菌控制由病原体伪禾谷镰刀菌(Fusarium pseudogramininarum)(冠腐病)、腐霉菌属物种(Pythiumspp.)(腐霉菌幼苗立枯病(pythium damping off))、立枯丝核菌(Rhizoctonia solanii)(秃块)和禾顶囊壳菌(全蚀病(take all))引起的根部病害的有效性。还进行了小型植物试验，以测试控制加拿大油菜的叶部病害菌核病和对小麦的白粉病的有效性。

对于根部病害的小型植物试验，将经表面灭菌的小麦(普通小麦(Triticumaestivum))种子用测试生物体的孢子涂覆。然后将种子包裹在湿纸巾中(Yang X,Ma J,LiH,Ma H,Yao J,Liu C(2010).‘Different genes can be responsible for crown rotresistance at different development stages of wheat and barley’.EuropeanJournal of Plant Pathology v128,495-502)，将湿纸巾放在烧杯中并保持湿润。一旦小麦植物从纸卷的顶部突出，就引入2ml的10⁶/ml测试病原体的孢子悬浮液。2周后，对植物的病害严重程度以及根和芽的长度进行评分。

对于核盘菌的小型植物试验，将加拿大油菜种植在直径为15cm的盆中。建立幼苗后，对其喷洒测试放线菌(包括MH71和MH243)的水溶液。二十四小时后，给它们接种10uL的核盘菌菌丝悬液的液滴。在4天后对疾病严重度评分。

实施例2

放线菌分离株对真菌病原体的直接抑制

抗真菌代谢物的产生–体外试验

体外(琼脂平板)试验用作初始筛选，以评估由于放线菌分离株产生生物活性化合物(例如代谢物)而引起的对真菌病原体生长的抑制。通过在营养琼脂平板的相对的两个末端共同接种测试生物体(放线菌)和真菌病原体，进行琼脂平板抑制试验。在一端用单独的真菌病原体接种第二块平板作为对照。将平板在黑暗中于28℃下孵育，直到对照平板完全被病原体覆盖。放线菌对真菌病原体的抑制水平以在真菌完全覆盖对照平板的那一天的测试生物体生长前沿与真菌之间的距离来衡量(图1所示实例)。然后相对于测试真菌接种点和测试放线菌生长边缘之间的距离计算抑制百分比。

在体外试验中，由放线菌分离株产生并假定分泌到琼脂培养基中的代谢物抑制了78-100％的小麦病原体伪禾谷镰刀菌的生长(图7)，高达49％的Pythium irregulare的生长，和13-82％的禾顶囊壳菌(全蚀病)的生长。还评估了对芸苔属植物病原体尖孢镰刀菌Fo5176和芸苔生链格孢菌的活性。已证明这些病原体分别被抑制74-85％和90％(图12)。对于加拿大油菜病原体，分离株MH71和分离株MH243抑制98-100％的核盘菌的生长，87-98％的立枯丝核菌AG2-1的生长，96-100％的十字花科小球腔菌的生长(图2)。总体而言，对于小麦和加拿大油菜，分离株MH71和分离株MH243在抑制病原体生长方面最有效。进一步评估了这些放线菌分离株抑制小麦和加拿大油菜植物(体内)病害的能力。

实施例3

小麦植物病害的生物防治

丝核菌和腐霉

最初对这些疾病中的每一种进行的温室试验均集中于，在有无测试放线菌分离株(与黄原胶一起用作种子涂层，用于治疗根部病害)的情况下，接种和未接种该病的4周龄小麦植株的植物生长。记录植物生物量的差异作为疾病防护的度量。与仅疾病的对照(disease-only control)相比，分离株MH71在存在丝核菌和腐霉的情况下增加了植物的生物量(例如图3)。

镰刀菌冠腐病

在小型植物试验中(无土壤)，将经表面灭菌的小麦(普通小麦)种子用测试放线菌的孢子涂覆。然后将种子包裹在湿纸巾中，将湿纸巾放在烧杯中并保持湿润。一旦小麦植物从纸卷的顶部突出，就引入2ml的10⁶/ml测试病原体的孢子悬浮液。2周后，对植物的病害严重程度以及根和茎的长度进行评分(图4)，MH71和MH243将冠腐病抑制了75％-94％。在温室盆栽试验中，小麦植株生长到成熟，MH71和MH243分别将冠腐病的严重程度降低了27％和25％。

实施例4

加拿大油菜植物中疾病的生物防治

在体内试验中，作为叶面喷洒剂施用的放线菌微生物抑制100％的加拿大油菜病原体核盘菌的疾病症状发展，并具有100％的植物存活率，而“仅病害”的对照植物的存活率为0％(图5)。当测试抗立枯丝核菌AG-2时，放线菌分离株作为种子涂层，与对照(仅病害)加拿大油菜植物相比，存活率提高了2-3倍。

实施例5

无细胞培养滤液抑制真菌病

由分离株MH71和分离株MH243分泌的化合物(以培养滤液的形式)表现出高的生物杀真菌剂效力，其在加拿大油菜的针对伪禾谷镰刀菌和核盘菌的体外试验(图6)中以及针对病原体核盘菌的体内试验(图5)中得到证实。

将分离株分别在作为纯培养物在无菌酵母麦芽提取物(YME)肉汤中室温(约25℃)不摇动下培养至少4周。对于无细胞滤液，将肉汤通过米拉布过滤，然后通过0.22微米的Milli-pore注射器式过滤器。

在体外试验中，MH71和MH243的放线菌培养滤液(无细胞)以高达1/10的稀释度阻止小麦病原体伪禾谷镰刀菌的真菌生长，并且以高达1/100的稀释度阻止加拿大油菜的病原体核盘菌的真菌生长。分别以1/100和1/1000的稀释度强烈抑制了伪禾谷镰刀菌和核盘菌的真菌生长。

在体内(幼苗)试验中，MH71和MH243的放线菌培养滤液(无细胞)抑制100％的加拿大油菜病原体核盘菌的病状发展，并具有比“仅病害”对照植物高的100％的存活率。

实施例6

成熟植物盆栽研究

将成熟的加拿大油菜植物在30％开花时进行喷洒，或接受两次喷洒(一次在开花前(约10％的花期)，第二次在30％的花期)。用两种放线菌中的一种或无细胞滤液喷洒植物(图13)。

包括对照处理的植物和用核盘菌防治用的商业杀真菌剂(Prosaro,Bayer)处理的植物。在核盘菌接种后21天记录结果。与对照处理的植物相比，放线菌微生物或无细胞滤液处理也积极地影响了最终谷物的产量和谷物重量。

实施例7

全基因组测序和鉴定

MH71和MH243的基于PCR的16s核糖体DNA测序无法提供物种水平的鉴定。16s测序证实MH71和MH243均属于链霉菌属。进行全基因组测序并确认MH71和MH243均为链霉菌属物种。通过几个管家基因(atpD、gyrB、recA、rpoB和trpB)的分析获得的最佳BlastN命中结果表明，MH71和MH243属于吸水链霉菌进化枝(Streptomyces hygroscopicus clade)。此外，全基因组blast2go分析揭示了紫黑链霉菌(Streptomyces violaceusniger)被鉴定为与MH71和MH243的亲缘关系最近(closestneighbour)。

实施例8

无细胞培养滤液对细菌病原体的抑制

由分离株MH71分泌的化合物(以培养滤液的形式)表现出生物杀细菌效力，其在针对黄单胞菌属物种、针对黄单胞菌属物种，针对导致小麦细菌性叶斑病/黑颖病的半透明黄单胞菌(DAR61454)，和针对导致包括水稻(Oryza sativa)的稻属(Oryza)成员的细菌性枯萎病的水稻黄单胞菌水稻致病变种(DAR61714)的体外试验中得到验证(图14)。分离株MH71和分离株MH243分泌的化合物(以培养滤液的形式显示)表现出很高的生物杀细菌功效，其已在针对导致包括大麦(Hordeum vulgare)的大麦属(Hordeum)成员的腐烂病的假单胞菌属物种、丁香假单胞菌(BRIP47231和BRIP34869)的体外试验中得到验证(图15)。

MH71和MH243分离株分别在作为纯培养物在无菌酵母麦芽提取物(YME)肉汤中室温(约25℃)不摇动下培养至少4周。对于无细胞滤液，将肉汤通过米拉布过滤，然后通过0.22微米的Milli-pore注射器式过滤器。

如图14所示，在体外试验中，MH71的培养滤液(无细胞)以1/10的稀释度阻止稻属病原体水稻黄单胞菌水稻致病变种((DAR61714)的细菌生长。

如图15所示，在体外试验中，MH71和MH243的培养滤液(无细胞)以1/10的稀释度阻止大麦病原体丁香假单胞菌BRIP47231和BRIP34869的细菌生长。MH71和MH243滤液以1/10的稀释度强烈抑制丁香假单胞菌BRIP34869的细菌生长。

在体外试验中，当以1/10稀释时，由分离株MH71产生并假定分泌到培养滤液(无细胞)培养基中的代谢物抑制了至多达58％的稻属病原体水稻黄单胞菌水稻致病变种((DAR61714)，至多达59％的大麦病原体丁香假单胞菌(BRIP47231)，和至多达71％的丁香假单胞菌(BRIP34869)的生长(图14和图15)。

在体外试验中，当以1/10稀释时，由分离株MH243产生并假定分泌到培养滤液(无细胞)培养基中的代谢物抑制了至多达60％的大麦病原体丁香假单胞菌(BRIP47231)，和至多达83％的丁香假单胞菌(BRIP34869)的生长(图15)。

本领域技术人员将理解，本文描述的发明除了具体描述的那些之外还可以进行变化和修改。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还单独地或共同地包括在本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或更多个的任何和所有组合。

Claims (5)

1.一种治疗或预防由真菌或细菌病原体引起的植物感染或由所述病原体引起的感染所导致的植物疾病或与由所述病原体引起的感染相关的植物疾病的方法，所述方法包括向植物、植物部分或植物周围施用保藏号为V17/004100的链霉菌(Streptomyces)分离株MH71和/或保藏号为V17/004101的链霉菌分离株MH243，其中当链霉菌分离株MH71施用于所述植物，植物部分或植物周围时，所述病原体选自十字花科小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)、芸苔生链格孢菌(Alternaria brassicicola)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、半透明黄单胞菌(Xanthomonastranslucens)和水稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)，并且其中当链霉菌分离株MH243施用于所述植物，植物部分或植物周围时，所述病原体选自十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、芸苔生链格孢菌(Alternaria brassicicola)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物为农作物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物为油料种子植物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是草或谷类。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述植物选自加拿大油菜、小麦、大豆、水稻、向日葵、油菜籽、棉花、花生、蓖麻、大麦、玉米、燕麦、黑麦、高粱、葡萄和粟。

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