CN111356701A - 抗α-突触核蛋白抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及优先识别α‑突触核蛋白聚集体的抗α‑突触核蛋白抗体，以及使用抗α‑突触核蛋白抗体检测、诊断和/或治疗或预防由α‑突触核蛋白聚集体的累积引起的各种疾病或其相关疾病症状的用途。
Description
技术领域
本发明涉及抗α-突触核蛋白的抗体及其用途。
背景技术
α-突触核蛋白(α-突触核蛋白，α-syn)主要在神经元的突触前末端表达，在正常情况下是天然未折叠的单体。α-突触核蛋白有助于调节作为控制随意或非随意运动的神经递质的多巴胺的释放。特别地，α-突触核蛋白的功能对于增加的突触活性和衰老是重要的，并且是神经退变的重要因素。
然而，在病理状态下，α-突触核蛋白通过与液滴、磷脂双层或脂质膜的结合和相互作用而经历结构变化，以形成折叠的或折叠的α-螺旋二级结构，从而分散含量。形成包括二聚物、寡聚物和/或纤维形式的分子的聚集体。
已知这些α-突触核蛋白聚集体诱导对细胞的毒性，并且是发现于帕金森病(PD)、帕金森病痴呆症(PDD)、多系统萎缩症(PD MSA)、路易体痴呆(DLB)和各种疾病的神经元中的路易体的异常蛋白聚集体主要成分。还已知α-突触核蛋白的翻译后修饰(例如磷酸化或泛素化)也与α-突触核蛋白的聚集和神经毒性有关。已知α-突触核蛋白在动物实验和细胞实验中杀死多巴胺神经元并引起炎症反应，并在实验动物中引起类似于帕金森病的运动症状。此外，已知α-突触核蛋白聚集与一组称为α-突触核蛋白病的神经退行性疾病的病因有关，包括帕金森病、帕金森病痴呆、路易体痴呆、多系统萎缩症和许多其他神经轴突疾病。
此外，帕金森病患者的脑脊液和血浆样品中发现了α-突触核蛋白的低聚体和单体形式，这表明小分子量的α-突触核蛋白聚集体可以穿透细胞膜并进入细胞外空间。还显示折叠的α-突触核蛋白可以通过胞吐作用从细胞释放，然后如朊病毒蛋白那样通过细胞间转移从脑的一个区域转移到另一区域。
因此，α-突触核蛋白是开发α-突触核蛋白病(例如帕金森病)的治疗剂的靶标。主要的开发策略包括抑制聚集体形成、基因沉默和去除聚集体。在前一种情况下，包括的表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、3-(1,3-苯并二恶唑-5-基)-5-(3-溴苯基)-1H-吡唑(anle138b)、CLR0120和脯氨酰寡肽酶抑制剂KYP-20479。
由于低分子量化合物的靶标特异性结合能力低且半衰期短，因此低分子量化合物应以高剂量施用。与低分子量化合物相比，抗体具有靶标特异性和长半衰期。但是，为了增加疾病的治疗潜力，需要优先以高亲和力结合聚集体的抗体。因此，为了治疗与α-突触核蛋白聚集体的异常积累有关的疾病，需要开发能够优先结合α-突触核蛋白，特别是α-突触核蛋白聚集体的抗体。
发明内容
技术问题
在本说明书中，提供了能够特异性结合α-突触核蛋白，特别是α-突触核蛋白聚集体的抗体或其抗原结合片段。针对α-突触核蛋白的抗体或其抗原结合片段可以特异性地识别并结合至α-突触核蛋白，尤其结合至α-突触核蛋白的C末端区域。
本发明的实施方式提供了特异性结合至突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体并降低受试者神经系统中的α-突触核蛋白水平的抗体。更具体地，本发明的抗体或其抗原结合片段对α-突触核蛋白聚集体，特别是淀粉样原纤维、初原纤维和寡聚物，或尤其对淀粉样初原纤维具有高结合亲和力，但是对α-突触核蛋白单体具有低结合亲和力。
本发明的抗体或其抗原结合片段至少具有选自由以下组成的组中的特性：(i)特异性结合至α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体，(ii)降低受试者神经系统中的α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的水平，(iii)减少或抑制神经细胞之间的α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的细胞间传递，以及(vi)改善神经细胞对α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的吞噬摄取。优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段可以具有(i)至(iv)的所有特性。
本发明的实施方式涉及用于预防、减轻、改善或治疗突触核蛋白病的组合物，所述组合物包含能够特异性结合至α-突触核蛋白，尤其α-突触核蛋白聚集体的抗体或其抗原结合片段。
本发明的实施方式涉及预防、减轻、改善或治疗突触核蛋白病的方法，所述方法包括以下步骤：向有需要的受试者施用能够特异性结合至α-突触核蛋白，特别是α-突触核蛋白聚集体的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段的施用量可以是降低受试者的神经系统中，更具体地神经系统中的神经细胞的胞外区域中的α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体的水平的有效量。
本发明的实施方式涉及降低受试者的神经系统中，更具体地神经系统中的神经细胞的胞外区域中的α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体的水平的方法，或降低神经系统中的神经细胞的胞外区域中的α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体的水平的用途，所述方法或用途包含能够特异性结合至α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体的抗体或其抗原结合片段。
本发明的实施方式涉及减少或抑制受试者的神经系统中，尤其是神经细胞之间的α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的细胞间传递的方法，或减少或抑制神经系统中的神经细胞之间的α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的细胞间传递的用途，所述方法或用途包含能够特异性结合至α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体的抗体或其抗原结合片段。
本发明的实施方式涉及增加神经系统中小胶质细胞对α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的吞噬摄取的方法，或增加神经系统中小胶质细胞对α-突触核蛋白或α-突触核蛋白的吞噬摄取的用途，所述方法或用途包含能够特异性结合至α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体的抗体或其抗原结合片段。
技术方案
在下文中，将更详细地描述本发明。
本发明提供了能够特异性结合至α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体的抗体或其抗原结合片段。抗α-突触核蛋白的抗体或其抗原结合片段可以特异性识别并结合至α-突触核蛋白，而不结合至β-突触核蛋白或γ-突触核蛋白，以及特异性识别并结合至α-突触核蛋白聚集体，而不结合至淀粉样β聚集体和tau聚集体。
在本文中，术语“抗原”或“免疫原”是指例如可以被抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫功能性抗原结合片段)结合的分子或分子的一部分，并且可以由于与动物中抗原的结合特性而用于抗体的生产。抗原可以包括一个或多个可以与不同抗体或其片段相互作用的表位。在根据本发明的一种实施方式中，抗原可以是α-突触核蛋白蛋白或α-突触核蛋白蛋白聚集体。具体地，α-突触核蛋白的蛋白聚集体可以是淀粉样原纤维、初原纤维和寡聚物，尤其是淀粉样原纤维。根据本发明的能够特异性结合至α-突触核蛋白或其聚集体的抗体或其抗原结合片段可以尤其特异性结合至α-突触核蛋白的C末端区域。识别N末端的α-突触核蛋白抗体无法识别统称为α-突触核蛋白相关疾病的属于突触核蛋白病的其它疾病(例如多系统萎缩症)的聚集体。相反，识别C末端区域的α-突触核蛋白抗体在识别其他各种突触核蛋白病和帕金森病的聚集体方面具有优势。
在本文中，术语“中和”是指当结合蛋白特异性结合至抗原时，抑制或降低抗原的生物学活性。在一种实施方式中，中和蛋白或中和抗体可以结合至抗原(α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体)，并因此使受试者的神经系统中的神经细胞的胞外区域中的抗原水平降低至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或防止胞外区域中抗原水平增加。
在本文中，“α-突触核蛋白”是天然的α-突触核蛋白(NCBI ID:NP_000336)，由SNCA基因编码的140个氨基酸组成，并且包括加工的各种形式以及未加工的全长蛋白质。另外，α-突触核蛋白包括α-突触核蛋白的天然存在的变体，例如突变体、剪接变体或等位基因变体。变体是外显子3和外显子5缺失的126和112残基蛋白质形式(CAG3339.1)，以及140残基蛋白质。还已知SNCA基因的特定多态性或错义突变与帕金森病的发生有关，并且这样的变体也包括在α-突触核蛋白中。包括与α-突触核蛋白同源的β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白。在一种实施方式中，根据本发明的抗体特异性识别α-突触核蛋白。α-突触核蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:225。
在本文中，“α-突触核蛋白聚集体”由于α-突触核蛋白的构象变化而形成，并且包括寡聚物、初原纤维、原纤维和/或包括选自这些结构中的至少一种的结构或聚集体。
可以被本文提供的抗体识别的α-突触核蛋白可以选自人α-突触核蛋白、猴α-突触核蛋白(例如恒河猴α-突触核蛋白)、小鼠α-突触核蛋白、大鼠α突触核蛋白等的哺乳动物α突触核蛋白。例如，人α-突触核蛋白可以是α-突触核蛋白(NCBI ID:NP_000336)，但不限于此。除非本文另有说明，否则α-突触核蛋白可以指人α-突触核蛋白，并且本文提供的抗体或抗原结合片段不仅具有对人α-突触核蛋白的特异性结合特性，而且还具有对猴子(例如恒河猴)α-突触核蛋白、大鼠α-突触核蛋白和/或小鼠α-突触核蛋白的特异性结合特性。
抗体或其抗原结合片段可以结合至α-突触核蛋白的C末端区域，特别是包括以下的C末端区域：包括人α-突触核蛋白的SEQ ID NO:126中的第110至120个残基或第111至122个残基的至少11或12个连续氨基酸组成的肽。已经证实本发明的抗体或抗原结合片段可以识别抗原识别区域并以高结合亲和力结合至α-突触核蛋白聚集体。
在本文中，“亲和力”或“亲和度”是抗体或其抗原结合片段与抗原之间的相互作用的强度，并且可以通过抗原的性质(例如抗原的大小、形状和/或电荷)以及抗体或抗原结合片段的CDR序列和/或理化性质(亲水/疏水性质、静电性质等)来确定。确定亲和力的方法是本领域已知的，并且通常表示为解离常数(KD)，但不限于此。
在本文中，“特异性结合至α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体”是指与其他抗原相比，对α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的结合亲和力相对较高，并且如Octet分析或SPR分析所测量的，对α-突触核蛋白聚集体，具体是淀粉样原纤维、初原纤维和寡聚体，特别是淀粉样原纤维的亲和力可以为0.1×10-10M至2×10-10M或0.05×10-10M至0.3×10-9M，但不限于此。
根据本发明的实施方式的人源化α-突触核蛋白抗体包括轻链和重链，例如Hu11F11_(ver.1)、Hu11F11(ver.2)和Hu11F11_ABL2-4，并且与嵌合α-突触核蛋白抗体相比，表现出促进吞噬细胞摄取的高活性。与嵌合α-突触核蛋白抗体相比，Hu11F11(ver.1)、Hu11F11(ver.2)、Hu11F11(ver.3)、Hu11F11(ver.4)和ABL2-4显示出高的抑制原纤维与神经细胞膜结合的活性。与嵌合α-突触核蛋白抗体相比，Hu11F11(ver.2)、Hu11F11(ver.4)和ABL2-4具有高的抑制由过表达α-突触核蛋白的细胞分泌的α-突触核蛋白向其他神经细胞传播的活性，并显示出对α-突触核蛋白聚集体的结合亲和力，例如，其在基于细胞的测定中具有与嵌合α-突触核蛋白抗体相似或更好的活性。
根据本发明的α-突触核蛋白抗体可以抑制从受试者的神经系统中的神经细胞分泌出的α-突触核蛋白聚集体转移到胞外空间中的其他正常细胞并感染神经细胞(抑制聚集体的细胞间传递)的功能，并具有促进小胶质细胞对胞外空间中的α-突触核蛋白聚集体的吞噬作用的能力。α-突触核蛋白聚集体像朊病毒一样从一个细胞传播到另一细胞，并且α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体遍布整个脑，导致正常细胞中的突触核蛋白病。因此，α-突触核蛋白聚集体对脑神经元有毒性，众所周知会导致脑神经元死亡(神经退变)和神经炎症。因此，随着α-突触核蛋白聚集体扩散到脑的各个部分，脑细胞死亡和神经炎症反应增加，并导致脑细胞死亡的发生以及产生的伴随突触核蛋白病(例如帕金森病)的进展而发现的行为和认知障碍。
因此，本发明的α-突触核蛋白抗体可以通过抑制α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体在神经细胞之间的传播来防止α-突触核蛋白聚集体向脑的各个区域扩散的现象，以及通过减少或清除受试者神经系统的神经细胞的胞外区域中的α-突触核蛋白聚集体本身以及促进小胶质细胞的吞噬作用来减少作为突触核蛋白病的重要原因的α-突触核蛋白聚集体的水平，从而导致脑神经细胞死亡和神经炎症反应减少，并有望进一步改善、减轻或预防突触核蛋白病(例如帕金森病)的症状和进展。
另外，根据本发明的α-突触核蛋白抗体具有执行以下两种功能的优异活性：(i)抑制神经细胞之间的α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的传递(参见本文公开的基于细胞的测定的结果)，以及(ii)通过促进小胶质细胞的吞噬作用降低脑神经系统中α-突触核蛋白聚集体的水平。特别地，由于目前已经在临床试验中或在科学论文中出版的α-突触核蛋白抗体具有两种活性(i)和(ii)之一，这表明本发明的α-突触核蛋白抗体与已知的α-突触核蛋白抗体相比在突触核蛋白病的优越的预防或治疗方面具有优势。因此，根据本发明的α-突触核蛋白抗体在病因学上具有减少和消除α-突触核蛋白聚集体以及抑制α-突触核蛋白聚集体的作用的更优异的功效，因此对于突触核蛋白病或与之相关的症状性疾病(例如认知障碍疾病)更有效。
对α-突触核蛋白聚集体具有高亲和力的根据本发明的抗体或抗原结合片段可以减少α-突触核蛋白聚集体的形成，从而降低脑中聚集体的浓度。另外，对α-突触核蛋白聚集体具有高亲和力的根据本发明的抗体或抗原结合片段可以减少中枢神经系统外部的α-突触核蛋白聚集体的形成，并最终改变以BBB(血脑屏障)为界的α-突触核蛋白形式之间的平衡，从而带来降低中枢神经系统内部α-突触核蛋白聚集体浓度的作用。
这在临床实践中具有很大的优势，因为即使通过较方便的途径施用(例如皮下注射)，也可以充分获得功效，但不限于此。此外，由于对α-突触核蛋白聚集体具有高亲和力的根据本发明的抗体或抗原结合片段可以抑制和/或减少α-突触核蛋白聚集体的形成、积累和/或细胞间传递，因此可以降低脑中α-突触核蛋白聚集体的浓度。另外，对α-突触核蛋白聚集体具有高亲和力的根据本发明的抗体或抗原结合片段可以减少中枢神经系统外部的α-突触核蛋白聚集体的形成，因此，改变以BBB为界的α-突触核蛋白形式之间的平衡。它可以带来降低中枢神经系统内部α-突触核蛋白聚集体的浓度的作用。另外，根据本申请的抗体或抗原结合片段可通过除去单体来抑制聚集体的形成，或消除单体和聚集体两者，但不限于该理论。
特异性结合至α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的本发明的抗体或其抗原结合片段可以不是天然存在的产物(它可以是非天然存在的产物，例如通过化学合成或重组方法)。重组技术是本领域熟知的。
在本文中，“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白，或可以与完整抗体竞争结合靶抗原的抗原结合片段。例如，它包括嵌合的、人源化的、完整的人或双重特异性抗体或其抗原结合片段。抗体本身就是一种抗原结合蛋白。通常，完整抗体包含至少2个全长重链和2个全长轻链，但是在某些情况下，抗体可以仅包含重链。
抗体或其抗原结合片段可以仅来源自一种来源，也可以是嵌合抗体。嵌合抗体包含来源自两种不同抗体的部分，并且在下文更详细地描述。抗体或其抗原结合片段可以通过杂交瘤、重组DNA技术或完整抗体的酶促或化学切割来产生。除非本文另有说明，否则抗体的术语包括含有2条全长重链和2条全长轻链的抗体，以及它们的衍生物、变体、片段和突变体，其实例如下所述。
在一种实施方式中，该抗体包括单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、抗体模拟物(或合成抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体，抗体融合体(或抗体缀合物)及其片段，本文公开的各种类型的抗体不限于此。在一种实施方式中，本文公开的抗体的片段可以是Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链片段(scFv)、双抗体或通过间隔区连接重链可变区和轻链可变区而制备的单链的单链抗体分子。
在本文中，“轻链”包括全长轻链及其片段，该片段具有可变区序列以充分提供与抗原或表位的结合特异性。全长轻链包含可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域存在于轻链多肽的N末端。轻链的种类包括κ链和λ链。
在本文中，“重链”包括全长重链及其片段，该片段具有可变区序列以充分提供与抗原或表位的结合特异性。全长重链包含可变区结构域VH和3种恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域存在于重链多肽的N末端，CH结构域存在于羧基末端，而CH3的位置最接近C末端。重链包括IgG(包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)以及IgM和IgE的同种型。
在本文中，“抗原结合片段”是指抗体的对抗原具有特异性结合亲和力的部分，或包括该部分的多肽。例如，抗原结合片段可以是抗体的包括通过与抗原(例如表位)相互作用而赋予抗体对抗原的特异性和/或亲和力的氨基酸残基的部分，或包括该部分的多肽。该抗原结合片段通常包含一个或多个“互补决定区(CDR)”，以及另外一个或多个“框架(FR)”区。CDR是有助于抗体与抗原结合的特异性和亲和力的氨基酸序列，而框架区是有助于维持这些CDR的适当构象并促进抗原结合区与抗原之间结合的氨基酸序列。
如本文所用，抗体或免疫球蛋白的链(重链或轻链)的“抗原结合片段”包括抗体的与全长链相比缺少一些氨基酸但可特异性结合至抗原的部分。在可以特异性结合至靶抗原或可以与其他抗体或抗原结合片段竞争结合至特异性表位的方面，该片段可以被认为具有生物学活性。一方面，该片段包含存在于全长轻链或重链中的至少一个CDR，并且在一些实施方式中，该片段包含重链和/或轻链的单链或其部分。该生物活性片段可以通过重组DNA技术产生，或者可以例如通过酶促或化学方法切割完整的抗体来产生。具有免疫功能的免疫球蛋白片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体和单链抗抗体(例如scFv、scFv-Fc等)，但不限于此，并且可以来源自任何哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔子，但不限于此。抗体的功能性部分，例如本文所述的一个或多个CDR，可以通过共价键与二级蛋白质或小分子化合物连接，并用作针对特定靶标的靶标治疗剂。
在本文中，“Fab片段”由一条轻链和仅包含可变区和CH1的一条重链组成。Fab分子的重链不能与其他重链形成二硫键。
在本文中，“Fc”区域包含两个重链片段，所述重链片段包含抗体的CH2和CH3结构域。这两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及CH3结构域的疏水相互作用相互结合。
在本文中，“Fab'片段”除了Fab片段之外还包含重链的CH1和CH2结构域之间的区域，并且可以由两个Fab'片段的两个重链之间的二硫键形成。
在本文中，“F(ab')2片段”包含两条轻链以及两条重链，所述重链包含可变区、CH1和CH1与CH2结构域之间的恒定区的一部分，如上所述，在两条重链之间形成了链间二硫键。因此，F(ab')2片段由两个Fab'片段组成，并且两个Fab'片段通过它们之间形成的二硫键彼此结合。
在本文中，“Fv区”是抗体的片段，该片段包含重链和轻链的每个可变区，但不包含恒定区。
在本文中，“单链抗体”是通过经柔性接头连接重链可变区和轻链可变区而形成的抗原结合区的单条多肽链。例如，单链抗体可以是选自由重链可变区和轻链可变区以单链形式连接的scFv，以及重链可变区、轻链可变区和Fc以单链形式连接的scFv-Fc等组成的组中的至少一种。单链抗体可以参考例如美国专利第5,260,203号。
在此，“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”具有两个抗原结合位点。该二价抗体中所包含的两个抗原结合位点可以具有相同的抗原特异性，或者可以分别是结合至不同抗原的双重特异性抗体。在本文中，“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”靶向两个或更多个抗原或表位。
在本文中，“双特异性”或“双重特异性”抗原结合蛋白或抗体是具有两个不同抗原结合位点的杂种抗原结合蛋白或抗体。这样的双特异性抗体是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，并且可以通过各种已知方法来产生，例如杂交瘤融合或Fab'片段融合。
在本文中，“双特异性”、“双重特异性”抗原结合蛋白或抗体是具有两个不同抗原结合位点的杂种抗原结合蛋白或抗体。该双特异性抗体是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，可以通过已知的各种方法来产生，例如，杂交瘤融合或Fab'片段连接等方法。例如，可参考Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.1990,79:315-321；并且可以参考Kostelny等人,J.Immunol.1992,148:1547-1553等。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个抗原结合位点所结合的彼此不同的两个表位可以位于相同或不同的靶蛋白上。在一种实施方式中，本发明的抗体可以是另外包含与用于通过血脑屏障递送抗体的递送载体结合的双特异性抗体的形式。通过血脑屏障递送药物的一种方法包括使用递送系统，例如受体介导的胞吞作用，例如细胞中的葡萄糖转运蛋白、氨基酸转运蛋白、胰岛素受体或转铁蛋白受体。
在本文中，“缀合物”是指本文公开的抗体或其抗原结合片段与其他分子的嵌合分子，所述其他分子特别是下述血脑屏障转运蛋白或治疗剂。在缀合物中，本发明的抗体或其抗原结合片段通过共价键或物理力(例如范德华力或疏水相互作用)、包囊、包埋或其组合方法与其他分子结合。在一种实施方式的缀合物中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以通过肽接头连接。
本发明还包括与本文公开的一种或多种氨基酸序列具有较高序列同一性的一种或多种氨基酸序列。较高序列同一性是指具有变异的序列维持了本发明公开的效果。在一种实施方式中，该序列与所公开的重链可变区具有约90％、95％或99％的序列同一性。在一种实施方式中，该序列与所公开的轻链可变区具有约90％、95％或99％的序列同一性。例如，在变体显示与本发明公开的抗体或抗原结合片段的序列具有90％、95％或99％的序列同一性的情况下，任何序列变异都发生在可变区的框架内而不是CDR。
根据本发明的特异性结合至α-突触核蛋白或其聚集体的抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的互补决定区；以及轻链可变区，包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的互补决定区。
在一种实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含以下CDR序列：
选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)，
选自SEQ ID NO:2至4和SEQ ID NO:7至8的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)，
选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)，
选自SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)，
选自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)，和
选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)。
表1和表2总结了重链CDR1至CDR3的氨基酸序列和轻链CDR1至CDR3的氨基酸序列。
[表1]重链CDR1至CDR3的氨基酸序列
[表2]轻链CDR1至CDR3的氨基酸序列
在一种实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，其包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)、含有选自SEQ ID NO:2至4的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)；和轻链可变区，其包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)、含有SEQ IDNO:11的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)。
另外，在一种实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，其包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)、含有选自SEQ ID NO:7至8的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)和含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)；和轻链可变区，其包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)、含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)。
在其他实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：
位于H-CDR1的N-末端的重链框架(H-FR1)，其包含含有选自SEQ ID NO:16至17和SEQ ID NO:35至40的氨基酸序列的多肽片段，
位于H-CDR1与H-CDR2之间的重链框架(H-FR2)，其包含含有选自SEQ ID NO:18至19和SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列的多肽片段，
位于H-CDR2与H-CDR3之间的重链框架(H-FR3)，其包含含有选自SEQ ID NO:20至31和SEQ ID NO:45至50的氨基酸序列的多肽片段，
位于H-CDR3的C末端的重链框架(H-FR4)，其包含含有选自SEQ ID NO:32至34和SEQ ID NO:51至52的氨基酸序列的多肽片段，
位于L-CDR1的N末端的轻链框架(L-FR1)，其包含含有选自SEQ ID NO:53至58和SEQ ID NO:71至77的氨基酸序列的多肽片段，
位于L-CDR1和L-CDR2之间的轻链框架(L-FR2)，其包含含有选自SEQ ID NO:59至61和SEQ ID NO:78至81的氨基酸序列的多肽片段，
位于L-CDR2和L-CDR3之间的轻链框架(L-FR3)，其包含含有选自SEQ ID NO:62至67和SEQ ID NO:82至88的氨基酸序列的多肽片段，和/或
位于L-CDR3的C末端的轻链框架(L-FR4)，其包含含有选自SEQ ID NO:68至70和SEQ ID NO:89的氨基酸序列的多肽片段。
作为可用作本文的框架的氨基酸序列，重链框架序列在表3和4中例示，而轻链框架序列在表5和6中例示。
[表3]重链框架1至2的氨基酸序列
[表4]重链框架3至4的氨基酸序列
[表5]轻链框架1至2的氨基酸序列
[表6]轻链框架3至4的氨基酸序列
在其他实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，包含含有选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)、含有选自SEQ ID NO:2至4和SEQ ID NO:7至8的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)和含有选自SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)，
其中重链可变区还包含：含有选自SEQ ID NO:16至17和SEQ ID NO:35至40的氨基酸序列的重链框架(H-FR1)、含有选自SEQ ID NO:18至19和SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列的重链框架(H-FR2)、含有选自SEQ ID NO:20至31和SEQ ID NO:45至50的氨基酸序列的重链框架(H-FR3)以及含有选自SEQ ID NO:32至34和SEQ ID NO:51至52的氨基酸序列的重链框架(H-FR4)。更具体地，重链可变区包含：含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链框架(H-FR1)、含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链框架(H-FR2)、含有SEQ ID NO:29至31的氨基酸序列的重链框架(H-FR3)和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链框架(H-FR4)。
另外，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：轻链可变区，包含含有选自SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)、含有选自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)和含有选自SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:15的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)，
其中轻链可变区还包含：含有选自SEQ ID NO:53至58和SEQ ID NO:71至77的氨基酸序列的轻链框架(L-FR1)、含有选自SEQ ID NO:59至61和SEQ ID NO:78至81的氨基酸序列的轻链框架(L-FR2)、含有选自SEQ ID NO:62至67和SEQ ID NO:82至88的氨基酸序列的轻链框架(L-FR3)和含有选自SEQ ID NO:68至70和SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链框架(L-FR4)。更具体地，轻链可变区包含：含有具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的多肽片段的轻链框架(L-FR1)；含有具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的多肽片段的轻链框架(L-FR2)；含有具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的多肽片段的轻链框架(L-FR3)；含有具有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的多肽片段的轻链框架(L-FR4)。
然而，本发明的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段不包含含有由以下组成的抗体的小鼠抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段：由SEQ ID NO:1、2和5的氨基酸序列组成的重链CDR1至CDR3，由SEQ ID NO:10、11和12组成的轻链CDR1至CDR3，由SEQ ID NO:16、18、20和32的氨基酸序列组成的重链框架1至4，以及由SEQ ID NO:53、59、62和68的氨基酸序列组成的轻链框架1至4。此外，本发明的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段不包含含有由以下组成的抗体的小鼠抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段：由SEQ ID NO:6、7和9的氨基酸序列组成的重链CDR1至CDR3，由SEQ ID NO:13、14和15组成的轻链CDR1至CDR3，由SEQ IDNO:35、41、45和51组成的重链框架1至4，以及由SEQ ID NO:71、78、82和89的氨基酸序列组成的轻链框架1至4。作为特定实例，本发明的抗α-突触核蛋白抗体不包含由SEQ ID NO:90的重链可变区(ch11F11-VH)和SEQ ID NO:109的轻链可变区(ch11F11-VL)组成的抗体或由SEQ ID NO:102的重链可变区(ch11F11-VH)和SEQ ID NO:116的轻链可变区(ch11F11-VL)组成的Ch3A9抗体。
根据本发明的实施方式的抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)、含有SEQ ID NO:2至4的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)；轻链可变区，包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)，
其中重链可变区包含：含有选自SEQ ID NO:16至17的氨基酸序列的重链框架(H-FR1)、含有选自SEQ ID NO:18至19的氨基酸序列的重链框架(H-FR2)、含有选自SEQ ID NO:20至31的氨基酸序列的重链框架(H-FR3)和含有选自SEQ ID NO:32至34的氨基酸序列的重链框架(H-FR4)，以及
其中轻链可变区包含：含有选自SEQ ID NO:53至58的氨基酸序列的轻链框架(L-FR1)、含有选自SEQ ID NO:59至61的氨基酸序列的轻链框架(L-FR2)、含有选自SEQ ID NO:62至67的氨基酸序列的轻链框架(L-FR3)和含有选自SEQ ID NO:68至70的氨基酸序列的轻链框架(L-FR4)。
优选地，根据本发明的实施方式的抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，包含含有SEQ ID NO:1、2和5的氨基酸序列的重链CDR1至CDR3；以及轻链可变区，包含含有SEQID NO:10、11和12的氨基酸序列的轻链CDR1至CDR3，其中所述重链可变区包含：含有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的重链框架(H-FR1)、含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链框架(H-FR2)、含有SEQ ID NO:29至31的氨基酸序列的重链框架(H-FR3)和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链框架(H-FR4)；所述轻链可变区包含：含有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链框架(L-FR1)；含有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的轻链框架(L-FR2)；含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链框架(L-FR3)；含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链框架(L-FR4)，
根据本发明的实施方式的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)、含有SEQ ID NO:7至8的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)和含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)；以及轻链可变区，包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)、含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)，
其中重链可变区包含：含有选自SEQ ID NO:35至40的氨基酸序列的重链框架(H-FR1)、含有选自SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列的重链框架(H-FR2)、含有选自SEQ ID NO:45至50的氨基酸序列的重链框架(H-FR3)和含有选自SEQ ID NO:51至53的氨基酸序列的重链框架(H-FR4)，以及
其中轻链可变区包含：含有选自SEQ ID NO:71至77的氨基酸序列的轻链框架1(L-FR1)、含有选自SEQ ID NO:78至81的氨基酸序列的轻链框架(L-FR2)、含有选自SEQ ID NO:82至88的氨基酸序列的轻链框架(L-FR3)和含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的轻链框架(L-FR4)。
在轻链和重链的全长形式中，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸长度的“J”区相连，并且重链还包含约10个或更多个氨基酸长度的“D”区。例如，可以参考基础免疫学，第二版，第7章(Paul,W.编)1989，纽约：Raven出版社。通常，抗体中轻链和重链对的可变区可以形成抗原结合区。
免疫球蛋白链的可变区通常具有相同的整体结构，并包含由三个称为“互补决定区或结构域”或CDR的高变区连接的相对保守的框架区(FR)。来自构成重链/轻链对的每条链的可变区的CDR通常通过框架区对齐，以便形成与靶蛋白(α-突触核蛋白)的特定表位特异性结合的结构。天然存在的轻链可变区和重链可变区的这些元件通常从N末端到C末端按以下顺序包括：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根据1987和1991年,NIH,Bethesda,MD))或Chothia&Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人.,1989,自然(Nature)342:878-883中的公开内容，根据Kabat编号系统(免疫学感兴趣的蛋白质的Kabat序列)，指定与可变区中这些元件中的每个相对应的氨基酸序列的位置。
表7和8中显示了本文公开的各种重链可变区和轻链可变区。这些可变区中的每个可以与重链恒定区和轻链恒定区偶联以形成完整抗体的重链和轻链。另外，获得的重链序列和轻链序列也可以组合以形成完整的抗体结构。例如，根据本发明的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，包含选自SEQ ID NO:90至101或SEQ ID NO:102至108的氨基酸序列；和轻链可变区，包含选自SEQ ID NO:109至115或SEQ ID NO:116至123的氨基酸序列，更具体地，所述抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，包含选自SEQ ID NO:90至101的氨基酸序列；和轻链可变区，包含选自SEQ ID NO:109至115的氨基酸序列，或包含：重链可变区，包含选自SEQ ID NO:102至108的氨基酸序列；和轻链可变区，包含选自SEQ ID NO:116至123的氨基酸序列。
在本发明的特定实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，包含选自SEQ ID NO:98至101的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列(例如Hu11F11_(ver.1)、Hu11F11_(ver.2)、Hu11F11_(ver.3)、和Hu11F11_(ver.4)等)，或可包含：重链可变区，包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列；和轻链可变区，包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列(例如，Hu11F11_(ABL2-4)抗体)。
然而，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段不包含由SEQ ID NO:90的重链可变区和SEQ ID NO:109的轻链可变区组成的抗体，以及由SEQ ID NO:102的重链可变区和SEQID NO:116的轻链可变区组成的抗体。
表7和表8例示了根据一种实施方式的抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[表7]重链可变区
[表8]轻链可变区
另外，表9中描述了示例抗体，其包含根据一种实施方式的抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的组合以及恒定区。
[表9]
为了使本文所述的重链可变区和轻链可变区形成完整抗体的重链和轻链，每个重链可变区和轻链可变区可以与重链恒定区和轻链恒定区结合。如上所述产生的重链和轻链中的每个可以适当地结合以构成重链-轻链的结合，并且重链-轻链的结合可以形成多聚体(例如IgG型抗体的二聚体)，从而构建完整抗体结构。
恒定区可以适当地选自免疫球蛋白(例如人免疫球蛋白)的重链和轻链恒定区。例如，重链恒定区可以是IgG1重链恒定区、IgG3重链恒定区或IgG4重链恒定区，而轻链恒定区可以是κ恒定区或λ恒定区，但不限于此。可以适当地选择其他类型的恒定区或修饰的恒定区，并将其用于抗体稳定性、可制造性、抗原亲和力和/或其他期望的特征，这是本领域技术人员清楚理解的。
在其他实施方式中，表7和8中公开的每个重链可变区和轻链可变区可彼此自由结合以形成各种抗体，以及以单链形式连接以产生单链抗体，例如scFv。
本文描述的抗体可以与本文公开的不同抗体共享特定区域或序列。在一种实施方式中，抗体可以共享另一抗体或其抗原结合片段的恒定区。在另一种实施方式中，抗体可以共享Fc区。
在一种实施方式中，本发明的抗α-突触核蛋白抗体还包括单克隆抗体和多克隆抗体。在另一种实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或来源自动物的抗体。在其他实施方式中，可以重组或化学合成抗α-突触核蛋白抗体。
本文所述的抗体的抗原结合片段或抗体片段可以是选自由scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab'、F(ab')2、微抗体、双抗体、scFv等单链抗体分子组成的组中的至少一种。
在其他实施方式中，本文提供的抗体可以是人源化抗体或人抗体，并且可以是各种同种型(例如，IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE或IgD)，特别是IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型，例如IgG1型或IgG2型。
在另一种实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体可以仅包含上述重链或轻链。在其他实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体仅具有重链可变区或仅具有轻链可变区。
本领域技术人员将理解，当抗体包含本文公开的一个或多个CDR时，公开的CDR中的每个可以彼此独立地选择并组合。因此，可以制备抗体以包含1、2、3、4、5或6个独立选择的CDR。本领域技术人员还将理解，当选择CDR进行组合时，不会重复使用相同种类的CDR，并且例如，通常不产生包含两个CDR-H2区的抗体。
在一种实施方式中，该抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本文公开的抗体包括结合至α-突触核蛋白的单克隆抗体。单克隆抗体可以通过使用本领域已知的任何技术来产生。例如，它可以通过使从免疫的转基因动物中收获的脾细胞永生化来产生。杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体可以使用本领域已知的技术纯化。
在其他实施方式中，抗体可以是动物来源的抗体(例如小鼠抗体等)、嵌合抗体(例如小鼠-人嵌合抗体)、人源化抗体或人抗体。也可以出于各种目的以各种方式修饰抗体。还提供了嵌合抗体和人源化抗体。嵌合抗体是这样的抗体，其中来源自不同抗体的多肽片段共价连接以形成具有免疫功能的轻链、重链或其片段。
在这样的单克隆抗体中，通常构成抗体的非抗原识别部分的特定氨基酸残基被修饰为与对应于人抗体的同种型的对应残基同源。可以用各种已知的方法进行人源化，例如将至少一部分啮齿类动物可变区替换为人抗体的相应区域(美国专利第5,585,089号和第5,693,762号；Jones等人，自然1986，321：522-525；Riechmann等人，自然1988，332：323-27；Verhoeyen等人，科学(Science)1988，239：1534-1536)。
完整的人抗体可以通过免疫转基因动物(通常是小鼠)而产生，该转基因动物可以通过缺乏产生内源性免疫球蛋白而产生人抗体。完整的人抗体也可以来源自噬菌体展示文库。如果使用完整的人抗体，则可以最大程度地减少由对人施用小鼠或小鼠来源的mAb可能引起的免疫原性和过敏性反应。
在一种实施方式中，通过噬菌体展示方法选择本发明的人α-突触核蛋白抗体。通过噬菌体筛选方法选择的α-突触核蛋白特异性的单克隆噬菌体抗体通过使用重组方法转化为完整的IgG形式。获得每种单克隆噬菌体抗体的序列以重组产生抗α-突触核蛋白抗体。将获得的序列中的重链可变区序列与重链恒定区序列连接，并将轻链可变区序列与轻链恒定区序列连接后，用密码子优化方法将氨基酸序列转化为核苷酸序列。将获得的核苷酸序列克隆到用于动物细胞培养的载体中后，用载体转化用于蛋白质生产的宿主细胞(例如CHO细胞)，并进行培养。为了纯化培养基中包含的抗体，使用纯化技术(例如亲和色谱法)分离并纯化重组抗体。
在其他实施方式中，抗体可以具有天然存在的抗体的典型结构或修饰的结构。
具有典型结构的抗体可以具有多聚体结构，该多聚体结构包括包含两条不同多肽链(即重链和轻链)的结构单元。两条不同的多肽链包含一条全长轻链(约25kDa)和一条全长重链(约50至70kDa)。每条链显示出特征性的折叠模式，并且由几个由大约90至110个氨基酸组成的免疫球蛋白结构域组成。这些结构域是由抗体多肽组成的基本单元。每条链的氨基末端部分通常包含称为可变区或V区的部分，该部分是识别抗原的部分。羧基末端部分比氨基末端在进化上更保守，并且它包含称为恒定区或C区的部分。人轻链通常分为κ和λ轻链，它们包含一个可变区和一个恒定区。重链通常分为μ、δ、γ、α或ε链，它们分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE同种型。IgG包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，还有不限于此的许多亚型。重链恒定区通常包括一个或多个显示效应功能的结构域。重链恒定区中结构域的数目根据同种型而变化。IgG重链例如包含三个C区域，分别称为CH1、CH2和CH3。本文公开的抗体可以是这些同种型和亚型中的任一种。在一种实施方式中，本发明的抗体是IgG1、IgG2、IgG2a，IgG2b，IgG3或IgG4亚型。
本文公开的抗体也是本文公开的抗体的变体。例如，抗原的一部分在上文公开的重链或轻链、可变区或CDR序列的一个或多个残基中包含保守氨基酸取代。本领域技术人员将使用已知技术确定本文公开的多肽的合适变体。本领域技术人员将通过靶向被认为不是多肽中活性的重要区域的区域，找到能够改变蛋白质而不破坏活性的区域。
本发明还提供了本文公开的抗体的衍生物。衍生的抗体或其片段可以包含对抗体或其片段提供所需特性(例如在某些用途中增加的半衰期)的任何分子或物质。衍生的抗体可以包含例如可检测的(或标记的)残基(例如放射性、比色、抗原或酶分子)、可检测的珠子(例如磁性或电子致密(例如金)珠子)、或与其他分子(例如生物素或链霉亲和素)结合的分子、治疗性或诊断性残基(例如放射性、细胞毒性或药物活性残基)，或增加抗体对特殊用途的适用性的分子(例如，向受试者(如人受试者)施用，或其他体内或体外用途)。
其他实施方式涉及包含两个融合蛋白的二聚体，其中α-突触核蛋白结合蛋白与抗体的Fc区融合。例如，可以通过如下方法制备二聚体：将编码融合蛋白的融合基因插入合适的表达载体中，在由重组表达载体转化的宿主细胞中表达融合基因，并使表达的融合蛋白与在Fc残基之间形成链间二硫键的抗体分子相似地结合以收集二聚体。
本文使用的术语“Fc多肽”是来源自抗体的Fc区的多肽，并且包括野生型或突变型。还包括包含促进二聚化的铰链区的多肽的切割形式。包含Fc或由其形成的寡聚物的融合蛋白具有容易分离的优点，所述分离通过使用蛋白A或蛋白G柱的亲和色谱进行。
在另一方面，本发明还提供了分离的多核苷酸，其编码根据本发明的抗体或抗原结合片段。在另一方面，本发明提供了包含根据本发明的多核苷酸的表达载体。在另一方面，本发明还提供了用根据本发明的表达载体转化的原核或真核细胞或细胞系。
在另一种实施方式中，本发明还提供了一种产生特异性结合至α-突触核蛋白或其抗原结合片段的分离的抗体的方法，该方法包括在充分表达该抗体或其抗原结合片段的条件下培养本发明的细胞；以及从该细胞系中分离出抗体或其抗原结合片段。
另外，本文公开的抗体或抗原结合片段具有各种有用的应用。例如，该抗体或抗原结合片段可以用于特异性结合分析、基于亲和力的α-突触核蛋白纯化或用于α-突触核蛋白拮抗剂研究的筛选方法等。在一种实施方式中，抗体及其抗原结合片段可用于抑制α-突触核蛋白聚集体形成、去除神经系统中的α-突触核蛋白聚集体、抑制α-突触核蛋白聚集体的细胞间转移以及通过对α-突触核蛋白聚集体的吞噬作用而去除或减少胞外的α-突触核蛋白聚集体。
本发明的抗体及其抗原结合片段可用于检测和/或治疗与α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体有关的各种疾病。例如，该抗体及其抗原结合片段可用于检测、治疗、减轻或改善与α-突触核蛋白聚集体有关的疾病、症状或障碍。另外，根据本发明的抗体可用于诊断与α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体有关的各种疾病或症状，或用于诊断α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体是否存在。
本发明的抗体或其抗原结合片段至少具有选自由以下组成的组中的特性：(i)特异性结合至α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体，(ii)降低受试者神经系统中的α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的水平，(iii)减少或抑制神经细胞之间的α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的细胞间传递，以及(vi)改善神经细胞对α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的吞噬摄取。优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段可以具有(i)至(iv)的所有特性。
本发明的实施方式涉及用于预防、减轻、改善或治疗突触核蛋白病的组合物，所述组合物包含能够特异性结合至α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体的抗体或其抗原结合片段。
本发明的一种实施方式涉及预防、减轻、改善或治疗突触核蛋白病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用能够特异性结合至α-突触核蛋白，特别是α-突触核蛋白聚集体的抗体或其抗原结合片段的步骤。抗体或其抗原结合片段的施用量可以是降低受试者神经系统中，更具体地神经系统中神经细胞的胞外区域中的α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体的水平的有效量。
本发明的实施方式涉及降低受试者神经系统中，更具体地神经系统中的神经细胞的胞外区域中的α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体的水平的方法，或降低神经系统中神经细胞的胞外区域中的α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体的水平的用途，所述方法或用途包含能够特异性结合至α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体的抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供了包含根据本发明的抗体或其抗原结合片段的组合物或试剂盒。该组合物可以作为药物使用或诊断使用提供，并且该药物组合物还可以包含药学上可接受的载体或赋形剂，并且所述诊断组合物还可以包含诊断或检测所需的试剂。
在本文中，术语“血脑屏障”或BBB是由在脑和脊柱及其周围的循环系统之间存在的脑的毛细血管内皮膜中的紧密连接形成的屏障。这种屏障非常坚固，以至于它也限制了约60Da的低分子量分子进入脑。脑的血脑屏障、脊柱的血管脊髓屏障和视网膜的血管视网膜屏障是中枢神经系统中的连续毛细血管屏障，通常称为BBB。
在本发明中，术语“血脑屏障转运蛋白”可以穿过血脑屏障并递送根据本发明的抗体或其抗原结合片段，并且例如包括包含肽和多肽的蛋白质、核酸、抗体或小分子化合物。
在本文中，“治疗剂”是指为了期望的治疗效果而施用至受试者的分子。受试者包括非人哺乳动物(例如灵长类动物)或人。治疗剂的实例包括包含肽和多肽的蛋白质、核酸、抗体或小分子化合物。另一方面，治疗剂可以通过与本发明的抗体结合而用作与α-突触核蛋白聚集体有关的疾病的治疗剂。
尽管突触核蛋白病中α-突触核蛋白的积累诱导神经退变的典型性质的确切机制和突触核蛋白病固有的症状尚不完全清楚，但最近的研究表明，α-突触核蛋白聚集体的异常形成和积累与潜在的突触核蛋白病的发生和退行性进展有关。
根据本发明，术语“α-突触核蛋白病”包括所有以病理性突触核蛋白聚集体为特征的神经退行性疾病。帕金森病、帕金森病痴呆症(PDD)，路易体痴呆症(DLB)、路易体病、路易体痴呆症、帕金森症伴痴呆症、多系统萎缩症(MSA)、多发性神经系统萎缩和I型神经退行性疾病脑铁积聚(I型NBIA)被归类为突触核蛋白病。另外，还发现了在阿尔茨海默病中继发α-突触核蛋白聚集(Kim等人，阿尔茨海默病研究与治疗(Alzheimer's Research&Therapy)2014，6：73)。
突触核蛋白病是多组神经退行性疾病，它们具有共同的病理特性：在神经病方面，可以将特定的病变检测为神经元和少突胶质细胞的选择的群体中的α-突触核蛋白的异常聚集。α-突触核蛋白(以前称为PARK1和PARK4)是一种由140个氨基酸组成的蛋白质，在新皮层、海马体、齿状回、后神经球、纹状体、丘脑和小脑中广泛表达。α-突触核蛋白也在造血细胞中高表达，所述造血细胞包括单核细胞，例如B细胞、T细胞、NK细胞和血小板。在这些细胞中的确切作用尚不清楚，但与巨核细胞(血小板前体)的分化有关。
根据本发明，以高亲和力特异性识别α-突触核蛋白聚集体的α-突触核蛋白抗体可用于诊断或检测这些疾病。此外，特异性识别本发明的α-突触核蛋白聚集体的α-突触核蛋白抗体抑制α-突触核蛋白聚集体的形成，降解α-突触核蛋白聚集体或抑制聚集体的细胞间传递，因此可以有效地用于治疗突触核蛋白病，例如帕金森病。
在本文中，“与α-突触核蛋白聚集体有关的疾病”是被称为突触核蛋白病的一组神经退行性疾病，其中在包括神经元和胶质的损伤中发现α-突触核蛋白聚集体，并且α-突触核蛋白聚集体具有诸如多巴胺系统退变、迁移率变化、认知障碍以及路易体和/或路易神经突形成的特征(Kim等人，阿尔茨海默病研究与治疗2014，6:73；McKeith等人，神经学(Neurology)(1996)47：1113-24)。这些疾病包括帕金森病、帕金森病痴呆症、路易体痴呆症、阿尔茨海默病路易体变异型、阿尔茨海默病和帕金森病合并症、多系统萎缩症和许多其他神经轴索疾病，但不限于此。在一种实施方式中，根据本发明的抗体有效地用于治疗帕金森病。
在本文中，“有效剂量”通常是指足以降低由于疾病特别是与α-syn有关的疾病引起的症状的严重性和/或发生频率，去除由于疾病特别是与α-syn有关的疾病引起的症状和/或疾病发生的根本原因，或预防由于疾病特别是与α-突触核蛋白有关的疾病引起的症状和/或根本原因的发生，和/或改善或纠正由于疾病特别是与α-syn有关的疾病引起的损害的量。在一些实施方式中，有效剂量是治疗有效剂量或预防有效剂量。“治疗有效剂量”是足以治疗疾病特别是与α-syn有关的症状或病症的量，或足以预防、延缓疾病特别是与α-syn相关的症状或病症的量，或扭转疾病的进展的量。“预防有效剂量”是用于预防或延迟疾病的发生或复发以及降低其可能性的量，所述疾病特别是与α-突触核蛋白有关的疾病或该疾病的症状，特别是与α-syn有关的疾病。完全的治疗或预防作用可能是由于多次施用剂量而不是单次施用剂量引起的。因此，可以通过一次或多次施用来递送治疗或预防有效剂量。
在另一方面，本发明提供了本发明的抗体或抗原结合片段或包含它们的组合物在治疗患有突触核蛋白病的受试者的突触核蛋白病中的用途。抗体或抗原结合片段或包含其的组合物在受试者或受试者的脑中抑制α-突触核蛋白聚集体的细胞间传递，降解α-突触核蛋白聚集体，抑制α-突触核蛋白聚集体的形成，或通过小胶质细胞增加对α-突触核蛋白聚集体的吞噬作用。
在本文中，术语“治疗”是指包括减轻或消除疾病或疾病的症状或病症的所有作用，包括降低、缓解、减轻或去除疾病或疾病的症状，从而使患者能够承受疾病的症状或病症，或延迟疾病或疾病的症状或病态的恶化速度。术语“受试者”或“患者”包括人或人类患者。
还提供了药物组合物，该药物组合物包含治疗有效剂量的抗体和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或补充剂。另外，例如，包括通过施用这样的药物组合物治疗癌症患者的方法。术语“患者”包括与α-syn有关的人类患者。一旦配制了药物组合物，就可以将药物组合物以溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体、晶体或脱水或冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。该制剂可以以立即可用的形式或在即将给药前重构的形式(例如冻干)储存。
药物组合物的施用途径可以使用已知的方法，例如经口；通过静脉内、腹膜内、脑内(间质)、心室内、肌内、眼内、动脉内、门脉内或病变内途径注射；持续释放系统或植入装置。在具体的实施方式中，可以通过推注、注射或植入装置连续施用组合物。
该药物组合物或试剂盒可用于治疗突触核蛋白病，例如帕金森病、帕金森病痴呆症、路易体痴呆症、阿尔茨海默病路易体变异型、阿尔茨海默病和帕金森病合并症以及多系统萎缩症。
在另一方面，本发明提供了治疗受试者的突触核蛋白病或调节受试者中的α-突触核蛋白聚集体浓度的方法，包括向需要治疗α-突触核蛋白病和/或调节α-突触核蛋白聚集体浓度的受试者施用本发明的抗体或抗原结合片段或包含它们的组合物。
在一种实施方式中，根据本发明的抗体可以以与转运蛋白连接的形式使用以通过脑血屏障(BBB)。公开了通过脑血屏障递送药物的许多方法。例如，存在通过使用诸如Brad奎宁或HIFU(高强度聚焦超声)的方法来破坏BBB的渗透压的方法。它们还涉及使用细胞递送系统(例如葡萄糖和氨基酸转运、以及胰岛素或转铁蛋白的受体介导的胞吞作用)，或阻断糖蛋白的外排转运蛋白。
在另一种实施方式中，根据本发明的抗体可以与其他治疗剂组合使用以治疗与α-突触核蛋白聚集体有关的疾病。还提供了药物组合物，该药物组合物包含治疗有效剂量的抗体和药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或补充剂。
可接受的制剂材料在使用的容量和浓度上对接受者无毒。在具体的实施方式中，提供了包含治疗有效剂量的人α-突触核蛋白抗体的药物组合物。在具体的实施方式中，可接受的制剂材料优选在使用的容量和浓度上是无毒的。在一种实施方式中，例如，药物组合物可以包含用于组合物的pH，同渗重摩、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、改性、维持或保持吸收或渗透的特定制剂材料。
在具体的实施方式中，本领域技术人员可以根据例如靶向给药途径、递送方法和靶向能力来确定最佳药物组合物(参见上述雷明顿药物科学(REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES))。在具体的实施方式中，该组合物可影响本文公开的抗体的物理状况、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在具体的实施方式中，药物组合物中的主要溶媒或载体可以是水性或非水性的。例如，合适的溶媒或载体可能是补充了用于肠胃外施用的组合物中常见的其他物质的注射用水、生理盐溶液。此外，在具体的实施方式中，可以使用适当的赋形剂(例如蔗糖)将人α-突触核蛋白抗体配制为冻干剂。
药物组合物可以肠胃外递送，并且治疗组合物可以是药学上可接受的溶媒中的人α-突触核蛋白结合蛋白，或者以不包含热原质的肠胃外可接受的水溶液形式提供。
一旦配制了药物组合物，就可以将药物组合物以溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体、晶体或脱水或冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。该制剂可以以立即可用的形式或在即将给药前重构的形式(例如冻干)储存。还提供了用于生产单次剂量施用单位的试剂盒。该试剂盒包括具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性制剂的第二容器。施用频率可能受到所用的人α-突触核蛋白抗体制剂的药代动力学参数的影响。
另外，可能优选离体使用人α-突触核蛋白抗体药物组合物。在这种情况下，可以将从患者取出的细胞、组织或器官暴露于人α-突触核蛋白抗体的药物组合物中，然后将所述细胞、组织或器官植入患者体内。特别地，人α-突触核蛋白抗体可以通过植入使用本文描述的方法进行基因工程化的特定细胞来递送，以表达和分泌多肽。
在另一种实施方式中，本发明提供了检测生物样品中的α-突触核蛋白聚集体的方法，包括提供根据本发明的抗体或其抗原结合片段，并使该抗体或其抗原结合片段与待检测α-突触核蛋白聚集体的生物样品接触。生物学样品包括检测α-突触核蛋白聚集体所需的各种样品，包括例如脑脊髓液、包括血浆的血液或尿液以及细胞、组织或器官。该方法可以在体外或体内进行。在体内成像可以通过使用例如正电子发射断层摄影(PET)、单光子发射断层摄影(SPECT)、近红外(NIR)光学成像或磁共振成像(MRI)来执行。
在另一种实施方式中，本发明提供了在需要诊断突触核蛋白病的受试者中诊断突触核蛋白病的方法，其中该方法包括：使用本发明的任何抗体或抗原结合片段测量/检测受试者中α-突触核蛋白聚集体的浓度或细胞间位置；以及将受试者中测得的α-突触核蛋白聚集体的浓度或细胞间位置与对照样品进行比较，其中与对照样品结果相比相似或有差异代表受试者是否患有α-突触核蛋白病。对照组可以是正常样品或患有α-突触核蛋白病的患者样品。为了检测或诊断用途，通常可以用可检测的标记物质标记抗体。
本文公开的抗体可以有效地用于检测、诊断或监测与α-突触核蛋白有关的疾病或症状。在一种实施方式中，本发明的方法是在需要诊断突触核蛋白病的受试者中诊断突触核蛋白病的方法，其中该方法包括使用根据本发明的抗体和抗原结合片段测量受试者中α-突触核蛋白聚集体的浓度或细胞间位置；以及将受试者中测得的α-突触核蛋白聚集体的浓度或细胞间位置与对照样品的结果进行比较，其中与对照样品结果相比相似或有差异代表受试者是否患有α-突触核蛋白病。
在该方法中，受试者包括没有症状或在出现症状之前的患者。在一种实施方式中，对照组可以是患有包括帕金森病(PD)、路易体痴呆症(DLB)或多系统萎缩症(MSA)的突触核蛋白病的患者，并且在比较步骤中与对照组相似代表了受试者被诊断为突触核蛋白病患者。在另一种实施方式中，当对照组是来自正常受试者的样品时，在比较步骤中与对照组有差异(例如聚集体浓度增加)代表该受试者被诊断为突触核蛋白病患者。在另一种实施方式中，受试者和对照的年龄可以是匹配的。该方法可以在体内或在从受试者分离的生物样品(例如血液、脑脊液(CSF)或尿液样品)中进行。
对于诊断用途，通常可以将抗体用可检测的标记物质标记。合适的标记物质包括放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光物质(例如FITC、若丹明、镧系元素荧光物质)，酶(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基或第二报告分子识别的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二抗结合位点、金属结合结构域、表位标签)，但不限于此。
在另一方面，本发明的抗体可以用于鉴定包括α-突触核蛋白聚集体的组织。在具体的实施方式中，用标记物质标记抗体，并检测与标记抗体的α-突触核蛋白聚集体的结合。在一种实施方式中，在体内检测抗体与α-突触核蛋白聚集体的结合。
在另一方面，本发明公开了对与本文公开的抗体竞争结合α-突触核蛋白聚集体的测试物质的检测或选择。例如，包括在存在或不存在测试物质的情况下检测包含α-突触核蛋白聚集体的溶液中未结合抗体的量的步骤。
游离抗体，即未与α-突触核蛋白聚集体结合的抗体的浓度增加，可能表示测试物质可以与抗体竞争结合α-突触核蛋白。在一种实施方式中，通过标记基团标记抗体。可供选择地，标记测试物质，并通过抗体存在或不存在来监测游离测试物质的量。
除此之外，本文公开的抗体或抗原结合片段具有各种有用的应用。例如，该抗体或抗原结合片段可以用于特异性结合分析、基于亲和力的α-突触核蛋白纯化或用于α-突触核蛋白拮抗剂研究的筛选方法等。
本文公开的抗体可用于检测生物样品中的α-突触核蛋白，特别是α-突触核蛋白聚集体，例如路易体，以及鉴定含有α-突触核蛋白聚集体的细胞或组织。例如，抗α-突触核蛋白抗体可用于诊断，例如检测和/或定量分析生物样品(例如含血清的血液、脑脊液(CSF)或尿液样品、组织或细胞)中的α-突触核蛋白聚集体，并据此诊断α-突触核蛋白病。
发明效果
本文公开的抗体优先以高结合亲和力结合至α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体。根据本发明的具有高亲和力的抗体或其抗原结合片段可以减少α-突触核蛋白聚集体的形成，从而降低脑中聚集体的浓度。另外，根据本发明的对α-突触核蛋白聚集体具有高亲和力的抗体或其抗原结合片段可以减少中枢神经系统外部的α-突触核蛋白聚集体的形成，并改变以血脑屏障为界的α-突触核蛋白形式的平衡状态，从而降低了中枢神经系统内部聚集体的浓度。此外，抗体或其抗原结合片段的优点是由于抗体或其抗原结合片段的高亲和力可以以低剂量施用。由于可以通过例如更简单的皮下注射(但不限于此)获得足够的功效，因此在临床实践中具有很大的优势。
本文公开的抗体可以有效地去除或促进α-突触核蛋白聚集体的降解，并抑制α-突触核蛋白的细胞间传递，因此可以有效地用于治疗与α-突触核蛋白聚集体的积累有关的疾病。
附图说明
图1是斑点印迹结果，示出了在本发明的实施方式中制备的单克隆抗体以聚集形式特异性结合至天然α-突触核蛋白。
图2是针对本发明的实施方式中制备的单克隆抗体的亲和力进行ELISA分析的结果。
图3a是针对本发明的实施方式中制备的单克隆抗体优先结合至α-突触核蛋白聚集体的特异性和亲和力进行BIAcore分析的结果。图3b是示出图3a的结果的表格。
图4a是针对本发明的实施方式中制备的单克隆抗体对α-突触核蛋白聚集体的优先结合特异性的Octet分析的结果。图4b是示出图4a的结果的表格。
图5示出了分析本发明实施方式中制备的单克隆抗体是否抑制细胞间传递的原理(上部)以及实验结果。
图6a是在向小鼠施用抗体之后通过使用p-129α-Syn抗体对小鼠脑组织染色和测量的结果，以测试本发明的实施方式中制备的单克隆抗体是否可以去除过表达人α-突触核蛋白的小鼠模型(TG)中的α-突触核蛋白聚集体。在图中，HP是指海马体，p-129α-syn是指具有磷酸化的第129个残基并且是聚集体的标志物的形式，箭头表示磷酸化的α-突触核蛋白。
图6b是根据与图6a基本相同的实验通过用针对所有α-突触核蛋白的抗体作为标志物进行染色的染色和测量的结果。箭头指示人α-突触核蛋白。抗体9B11、11F4和11F11抑制所有α-突触核蛋白的积累。
图7a是在给小鼠施用抗体后用Iba-1(小胶质细胞增生)抗体作为标志物对小鼠脑组织染色和测量的结果，以测试在本发明实施方式中制备的单克隆抗体是否可以在体内减少小胶质细胞增生的发生，箭头表示活化的小胶质细胞。
图7b是在对小鼠施用抗体后用GFAP(星形胶质细胞增生)抗体作为标志物对小鼠脑组织染色并测量的结果，以测试在本发明的实施方式中制备的单克隆抗体是否可以在体内减轻星形胶质细胞增生，箭头表示活化的星形胶质细胞。
图7c是在给小鼠施用抗体后用IL-1β抗体作为标志物对小鼠脑组织染色并测量的结果，以测试在本发明的实施方式中制备的单克隆抗体是否可以在体内减少炎性细胞因子，箭头表示表达IL-1β的细胞。
图7d是在给小鼠施用抗体后用IL-6抗体作为标记物对小鼠脑组织染色并测量的结果，以测试在本发明的实施方式中制备的单克隆抗体是否可以在体内减少炎性细胞因子，箭头表示表达IL-6的细胞。
图8a和图8b示出了本发明的实施方式中的3A9和11F11的单克隆抗体可以分别特异性地识别人脑组织中的路易体和路易神经突(Lewy neurites)的测量结果。结果表明，本发明的抗体结合至路易体(箭头)和路易神经突(左下部分的线状)。
图9是本发明实施方式的抗体的表位作图结果的示意图，其中本发明的抗体主要结合至C末端区域。
图10a和图10b是分析嵌合抗体和人源化抗体促进小胶质细胞对α-突触核蛋白聚集体的吞噬作用的活性的结果，图10a是11F11人源化抗体，图10b是3A9人源化抗体。
图11是分析嵌合抗体和人源化抗体抑制α-突触核蛋白聚集体与神经细胞表面结合的活性的结果。
图12是分析本发明的嵌合抗体和人源化抗体抑制细胞间传递的功效的结果，其中α-突触核蛋白聚集体从过表达α-突触核蛋白的神经细胞中分泌并转移至正常神经细胞。
图13是在本发明的实施方式中制备的嵌合抗体和11F11人源化抗体的亲和力的ELISA分析结果。
图14是针对本发明的实施方式中制备的嵌合抗体和11F11人源化抗体优先结合至α-突触核蛋白聚集体的特异性和亲和力进行BIAcore分析的结果。
图15a、图15b和图15c是斑点印迹结果，示出了在本发明的实施方式中制备的嵌合抗体特异性结合至α-突触核蛋白，特别是α-突触核蛋白聚集体，但不结合至β-突触核蛋白、γ-突触核蛋白或来源自淀粉样蛋白β1-42或tau的聚集体。
具体实施方式
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明，但是这些仅是示例性的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1：α-突触核蛋白抗体的制备
免疫
将具有全长(140个残基)或C末端21个残基被切割的(119个残基)的α-突触核蛋白单体放入37℃的热混合器中，以1050rpm的转速振荡下聚集14天，然后进行超声处理。将140个残基和119个残基的α-syn原纤维中的每种以1:1(体积:体积)的比例与佐剂混合。
然后，将200μL制备的混合物皮下注射到5至7周龄的BALB/c雌性小鼠中。2周后，进一步皮下注射200μL制备的混合物以进行抗体加强。加强免疫一周后，收集血液，并使用所施用的抗原通过ELISA方法进行免疫滴定。随后，通过仅皮下注射抗原进行第三次加强免疫。
杂交瘤生产
除去免疫小鼠的脾脏，从脾脏中获得脾细胞。将脾细胞悬浮在补充有10％FBS的杂交瘤-SFM培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司)中。为了制备杂交瘤，将脾细胞和鼠骨髓瘤细胞的SP2/0-Ag14在没有血清的杂交瘤-SFM培养基中混合，然后离心除去培养基。然后，将PEG添加到获得的细胞沉淀中，并在37℃下孵育1分钟以诱导细胞融合。
单细胞克隆
融合2周后，使用施用至小鼠的抗原和细胞培养基，通过ELISA法确认与产生抗体的小鼠B细胞的融合。然后，使用杂交瘤进行单细胞克隆以选择16种产生单克隆抗体的杂交瘤。使用全长(140个残基)α-Syn的聚集体作为抗原来获得9B11克隆(IgG1κ)，并使用C末端的21个残基被切割的α-Syn聚集体作为抗原获得3A9和11F11的克隆(分别为IgG2bκ和IgG2bκ)。
抗体纯化
为了纯化抗体，将每种杂交瘤在含有10％FBS的RPMI1640培养基中培养。为了产生抗体，用无血清的SFM培养基代替培养基并培养约4天。分离细胞培养上清液，离心，用0.22μm过滤器过滤，并用用于IgG1型的蛋白G柱和用于其余抗体的蛋白A柱纯化。
可变区序列的确定
可变区和CDR序列通过参考Ahn等人，Mol.Cells 2004,18(2):237-241的公开内容确定。培养杂交瘤并离心以仅分离细胞。通过添加三唑从分离的杂交瘤中分离RNA，并将该RNA作为模板用于合成cDNA。通过测序确认可变区和CDR序列。
实施例2.使用α-突触核蛋白抗体分析抗原结合特异性和结合亲和力
2-1：使用抗α-突触核蛋白抗体的斑点印迹分析
进行斑点印迹实验以分析本发明的抗体是否以天然状态结合单体或聚集体。对于该实验，将50ng或100ngα-syn单体或纤维蛋白(由国立首尔大学的Lee Seung-jae教授制备，Bae等人,J.Neurosci 32:13454,2012)在硝酸纤维素膜上点样。将两倍稀释的单体或原纤维蛋白从膜的右侧向左侧依次上样(12.5、25、50、100ng)。在室温下用5％TBST组合物的脱脂奶粉封闭膜1小时。将实施例1中制备的1mg/ml的α-syn抗体添加到含有1％牛血清白蛋白的TBST中，并在室温下孵育1小时。用TBST洗涤后，使用化学发光底物(NEN)作为底物，并根据制造商的手册对缀合有HRP(辣根过氧化物酶)的二抗进行信号分析。使用LAS-3000发光图像分析系统(FUJIFILM生命科学公司)对结果进行成像。结果示于图1中。
如图1所示，发现与α-突触核蛋白单体相比，本发明的α-突触核蛋白抗体仅优先结合聚集体。特别是9B11、3A9和11F11仅结合至聚合体。274抗体(Bae等人,JNeurosci.2012Sep 26；32(39):13454-13469)用作同时与单体和聚集体结合的比较抗体。
2-2：使用单克隆抗α-突触核蛋白抗体的ELISA分析
进行ELISA分析以定量分析本发明的抗体与抗原的结合亲和力。为此，将实施例1中获得的α-突触核蛋白抗体以1ug/ml的浓度包被在96孔板上，并用α-突触核蛋白原纤维聚集体以10、100、1000和10,000ng/ml进行处理。用PBS洗涤后，处理缀合有HRP的链霉亲和素和与缀合有生物素的二抗，然后与作为底物的TMB反应。测量吸光度，结果示于图2。
如图2所示，发现本发明的抗体优先以高结合亲和力结合至聚集体。ELISA结果表明，优先结合至聚集体的抗体具有0.1×10-9M至2×10-9M的亲和力，而同时结合至单体和聚集体的抗体与这些抗体相比具有约1×10-10M的更高亲和力。本发明的抗体优先以高亲和力结合至α-突触核蛋白聚集体，但是不能获得对单体的亲和力，因为它以比聚集体低的亲和力结合至单体上或不与单体结合。这些结果表明抗体可以有效地去除或抑制引起与α突触核蛋白病因有关的神经退行性疾病例如帕金森病的药物的作用。
2-3.使用抗α-突触核蛋白抗体的BIAcore分析
使用BIAcore分析对实施例1中制备的α-突触核蛋白抗体与单体和聚集抗原的结合进行定量分析。
使用的仪器是T200(GE Healthcare公司，S/N：1565888)。蛋白A用作芯片(GEHealthcare公司，目录号29-1275-56)。将10mM甘氨酸-HCl pH 1.5(GE Healthcare公司，目录号BR-1003-54)作为再生缓冲液。运行缓冲液、分析物稀释液和样品稀释液缓冲液为HBS-EP。将实施例1中制备的α-syn抗体(3A9、9B11和11F11)用1×HBS-EP(GE Healthcare公司，目录号BR-1006-69)稀释，一式两份连续稀释α-突触核蛋白单体(1mg/ml)和原纤维蛋白(3mg/ml)，并以包括0nM的总共6种浓度(0、0.39、1.56、6.25、25、100nM)进行分析。对于捕获，单体的RU为800(理论值)，原纤维的RU为100(理论值)。以60秒的接触时间、30μl/分钟的流速和180秒的稳定时间进行捕获阶段。缔合阶段以120秒的缔合时间和30μl/分钟的流速进行。解离阶段以360秒的解离时间和30μl/分钟的流速进行。再生阶段以240秒(一次)和60秒(二次)的再生时间和30μl/分钟的流速进行两次。使用1:1结合模型进行拟合，评估软件为BIACore T200评估软件(GE Healthcare公司)。结果示于图3a和3b中。
图3a是针对本发明实施例中制备的单克隆抗体优先结合至α-突触核蛋白聚集体的特异性和亲和力进行BIAcore分析的结果。其示出了本发明的抗体以高亲和力结合至聚集体。这些结果表明抗体可以有效地去除或抑制引起与α突触核蛋白病因有关的神经退行性疾病例如帕金森病的药物的作用。图3b是示出图3a的结果的表格。
如图3a和图3b所示，通过上述其他方法，在分析的四种α-突触核蛋白抗体中确认了优先结合至聚集体的3A9、9B11和11F11在BIAcore分析中以约1×10-9M至3×10-9M的高亲和力仅结合至聚集体上。
2-4.使用抗α-突触核蛋白抗体进行Octet分析
使用Octet对实施例1中制备的α-突触核蛋白抗体(3A9、9B11、11F11)与单体和聚集体抗原的结合进行定量分析。
具体地，运行缓冲液为在1000rpm下的1×KB缓冲液(目录号18-1092)或1×PBS缓冲液，固定缓冲液为pH 5的乙酸钠(10mM，目录号18-1068)。α-syn单体为固定化的α-syn抗原，原纤维为固定化的测试抗体。对于单体，目标浓度为20μg/ml，对于原纤维，目标浓度为0.4μg/ml。动力学浓度从50nM的单体和100nM的原纤维依次稀释两次，总共分别给出7个浓度点；单体的缔合时间/解离时间为5分钟/20分钟，原纤维的缔合时间/解离时间为5分钟/25分钟；生物传感器为ARG2，采用1:1拟合模型进行拟合。结果示于图4。图4a是针对本发明的实施方式的α-突触核蛋白抗体优先结合α-Syn聚集体的优先结合特异性进行Octet分析的结果。
如图4a所示，已显示3A9、9B11和11F11几乎不结合至单体(红色虚线框)，但是良好地结合至聚集体(红色虚线框中的上升线图)。这些结果与斑点印迹、Octet和ELISA分析中的结果相似或一致，表明通过上述其他方法确认了在所分析的四种α-突触核蛋白抗体中3A9、9B11和11F11优先结合至聚集体，在Octet分析中仅结合至聚集体。图4b是示出图4a的结果的表格。图4a和图4b显示了优先结合至α-突触核蛋白聚集体，并且与图1的结果一致。发现用作对照组的#274抗体与单体和聚集体均良好结合。
实施例3.抗α-突触核蛋白抗体对α-突触核蛋白聚集体的细胞间转移的抑制作用分析
由于α-突触核蛋白聚集体的细胞间转移被认为是与α-突触核蛋白聚集体相关的疾病的致病原因，因此能够抑制细胞间转移的抗体可以用作治疗剂。为了此目的，如下进行双分子荧光互补(BiFC)分析。BiFC原理示意性地在图5上部示出。
图5示出了分析本发明实施方式中制备的单克隆抗体是否抑制细胞间传递的原理(上部)以及实验结果。在图中，蓝色表示细胞核，绿色表示从一个细胞外部释放的α-突触核蛋白传播到其他细胞内部并与其他α-突触核蛋白相遇而形成聚集体时所产生的信号。
用于BiFC分析的细胞培养
如前所述，培养表达α-突触核蛋白和截半的Venus荧光蛋白(Venus 1-αSyn(V1S)和αSyn-Venus2(SV2))的SH-SY5Y人成神经细胞瘤细胞系(Lee HJ等人,J.Neurosci.2004；24:1888-1896)，在实验之前，在盖玻片上混合180,000个表达V1S和SV2的细胞，并培养3天。每48小时传代培养一次共培养物，以确认α-突触核蛋白的连续细胞间迁移。因为在单独的实验中转移度在传代数为6时最大(数据未显示)，所以使用六次传代的共培养物分析了抗体对细胞间转运的抑制作用。
BiFC实验/抗体处理
在成像前一天，将50μg/ml IgG或测试抗体(3A9、9B11、11F11)添加到共培养物中。每种共培养物中的Venus通道中的信号代表由α-突触核蛋白的聚集产生的聚集体，其被认为是由α-syn从一个细胞迁移到另一细胞而形成的聚集体。这些信号用IN细胞分析仪(INCell Analyzer)自动分析(仪器设置：点大小：0.1至0.4μm，强度：4000至7000)。结果如图5所示。
具体而言，蓝色表示细胞核，绿色表示从一个细胞外部释放而传播到其他细胞内部并与其他α-突触核蛋白相遇而形成聚集体。右侧的图显示了信号强度。在9B11、11F11和3A9处理组中，与阴性对照IgG相比，显示绿色信号的细胞数量减少了。结果表明，本发明的抗体可以有效抑制α-突触核蛋白的细胞间传递。
实施例4.分析抗α-突触核蛋白抗体对α-突触核蛋白聚集体的体内去除作用
为了分析本发明产生的α-突触核蛋白抗体的体内效果，每周3次向过表达人α-突触核蛋白的转基因小鼠(mThy-1人α-突触核蛋白，加州大学圣迭戈分校)腹膜内给药10mg/kg的人α-突触核蛋白或IgG，共3个月。每组使用六只小鼠，并且将非转基因同窝小鼠用作对照组。然后，如下进行灌注。
为了进行脑的病理分析，在最后一次施用完成后，根据人道主义规定将动物用水合氯醛麻醉，然后用0.9％盐水进行心脏灌注。将灌注后的脑的一半(矢状切面)保存在磷酸盐缓冲液(pH 7.4，4℃)中的4％多聚甲醛中，直到随后进行分析为止，另一半立即冷冻保存(-70℃)。
病理分析如下进行。使用振动切片机通过自由漂浮法将固定在低聚甲醛中的脑的半部分切成40μm厚的连续部分。为了研究施用组的脑中α-突触核蛋白的表达水平，将含有皮质、纹状体和海马体的切片与α-突触核蛋白抗体(作为聚集体的标志物的p129α-syn抗体、abcam、ab59264或所有α-突触核蛋白抗体，Cell Signaling Technology公司，#2642)在4℃下孵育过夜。为了研究星形胶质细胞的活性或小胶质细胞的活性，分别用GFAP抗体(胶质纤维酸性蛋白)(AB5804，millipore公司)或Iba1抗体(019-19741，Wako公司)处理切片。为了检查神经炎症的程度，该切片分别用IL-6抗体(NB600-1131，Novus Biologicals公司)或IL-1β抗体(ab9722，abcam公司)处理。与一抗孵育后，用二氨基联苯胺(DAB)处理并检测生物素缀合的山羊抗兔IgG(1:100，Vector Laboratories公司)和亲和素蛋白D-辣根过氧化物酶(1:200，ABC Elite，Vector Laboratories公司)。用明场显微镜观察每个免疫染色的切片以测量光密度。结果在图6a和6b中示出。图6a是在向小鼠施用抗体之后通过使用p-129α-Syn抗体对小鼠脑组织染色和测量的结果，以测试本发明的实施方式中制备的单克隆抗体是否可以去除过表达人α-突触核蛋白的小鼠模型(TG)中的α-突触核蛋白聚集体。在图中，HP是指海马体，p-129α-syn是指具有磷酸化的第129个残基并且是聚集体的标志物的形式，箭头表示磷酸化的α-突触核蛋白。
图6a是使用p-129α-Syn抗体作为检测α-突触核蛋白聚集体的标志物进行分析的结果，表明与仅施用IgG的对照小鼠(在IgG样品中相关的部分表示为箭头)相比，在施用本发明的实施方式中制备的抗体的TG(转基因)小鼠的皮质和海马体的CA1和CA3中，聚集体水平显著降低。这些结果表明，本发明的抗体可以显著去除α-突触核蛋白。WT和IgG是阴性对照，274抗体是结合至单体和聚集体两者的比较组。这些结果表明，本发明的抗体可以有效地抑制α-突触核蛋白聚集体的积累，因此可以有效地用于预防和/或治疗与α-突触核蛋白病因有关的疾病。
图6b是与图6a基本相同的实验的结果，但是它是通过用针对所有α-突触核蛋白的抗体作为标志物染色而获得的。箭头指示人α-突触核蛋白。通过施用抗体有效地去除了TG小鼠中增加的人α-突触核蛋白。这些结果表明，根据本发明的抗体有效地减少了α-突触核蛋白聚集体并且可以有效地用于治疗α-突触核蛋白病，例如帕金森病。9B11、11F4和11F11抗体有效抑制了所有α-突触核蛋白的积累。所有α-突触核蛋白的检测表明，根据本发明的抗体具有清除α-突触核蛋白本身(清除)并抑制细胞间转移(细胞间传递)的能力。另一方面，其还被解释为抑制由单体形成聚集体或去除所有单体。
实施例5：通过抗α-突触核蛋白抗体减少小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生以及减少炎性细胞因子释放的分析
胶质增生是胶质细胞中对由BBB损伤、TGF-β或白介素引起的中枢神经系统损伤作出响应的非特异性反应。代表性实例包括小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生，它们分别使用Iba-1和GFAP蛋白作为标志物。如实施例4中所述，通过向小鼠施用抗体来分析根据本发明的抗体对减少小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生以及减少触发它们的炎性细胞因子释放的作用。结果示于图7a、7b、7c和7d中。
图7a是在给小鼠施用抗体后用Iba-1(小胶质细胞增生)抗体作为标志物对小鼠脑组织染色和测量的结果，以测试在本发明实施方式中制备的单克隆抗体是否可以在体内减少小胶质细胞增生的发生，箭头表示活化的小胶质细胞。证实了在施用3A9、9B11和11F11抗体的小鼠中小胶质细胞的活化显著降低。
图7b是在对小鼠施用抗体后用GFAP(星形胶质细胞增生)抗体作为标志物对小鼠脑组织染色并测量的结果，以测试在本发明的实施方式中制备的单克隆抗体是否可以在体内减轻星形胶质细胞增生，箭头表示活化的星形胶质细胞。证实了3A9、9B11和11F11抗体在显著水平有效地抑制星形胶质增生。
图7c是在给小鼠施用抗体后用IL-1β抗体作为标志物对小鼠脑组织染色并测量的结果，以测试在本发明的实施方式中制备的单克隆抗体是否可以在体内减少炎性细胞因子，箭头表示表达IL-1β的细胞。IL-1β引起炎症，并因此诱导各种神经细胞的死亡和炎症反应。在施用根据本发明的抗体的小鼠脑组织中IL-1β显著降低。
图7d是在给小鼠施用抗体后用IL-6抗体作为标记物对小鼠脑组织染色并测量的结果，以测试在本发明的实施方式中制备的单克隆抗体是否可以在体内减少炎性细胞因子，箭头表示表达IL-6的细胞。施用根据本发明的抗体的小鼠的脑组织中IL-6降低。
如图所示，与对照组相比，发现本发明的抗体减少了小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生，并减少了触发小胶质细胞增生和星形胶质增生的IL-1β和IL-6炎性细胞因子的释放。
实施例6.通过抗α-突触核蛋白抗体检测人脑组织中的路易体
通过使用实施例5中使用的抗体，对从死于帕金森病的患者(悉尼大学Halliday博士)获得的约10微米厚的石蜡包埋脑切片中的路易体和路易神经突进行染色。组织切片用90％甲酸处理3分钟以进行抗原修复，然后通过1％H2O2(50％乙醇基)抑制组织本身的过氧化物酶活性。处理10％的正常马血清以防止组织的非特异性结合。随后，在用磷酸盐缓冲液洗涤后，将相邻的切片用本发明的3A9、11F11和11F11抗体在4℃下过夜处理。用磷酸盐缓冲液洗涤后，将缀合有生物素的抗人IgG抗体在37℃下处理30分钟，然后将亲和素-生物素复合物在室温下反应30分钟(Vectastatin Elite试剂盒；Vector Laboratories)。然后，用含有0.005％H2O2的DAB显色，并用0.5％甲酚紫对切片复染，以区分每个细胞。结果示于图8a和8b中。
图8a和图8b示出了根据本发明的实施方式的3A9和11F11的单克隆抗体可以分别特异性地识别人脑组织中的路易体和路易神经突的测量结果。结果表明，本发明的抗体结合至路易体(箭头)和路易神经突(左下部分的线状)。
如图8a和图8b所示，本发明的抗体显示出有效结合至路易体和路易神经突(箭头所示)。这些结果表明，它能够有效结合至人脑组织中路易体成分的α-突触核蛋白聚集体。这显示了递送至人脑的抗体可以有效且特异性地结合至α-突触核蛋白聚集体。这些结果表明，本发明的抗体实际上可以特异性地结合至人脑组织中的α-突触核蛋白聚集体，并且可以有效地用于预防和/或治疗与α-突触核蛋白病因有关的疾病。
实施例7.抗α-突触核蛋白抗体的表位分析
通过请求PEPSCAN(荷兰)进行肽等位基因分析来进行本发明的3A9和11F11抗体的表位作图。结果在图9中示出。图9是本发明实施方式的抗体的表位作图结果的示意图。
如图9所示，已经证明本发明的大多数抗体结合至C末端区域。识别N末端的α-突触核蛋白抗体无法识别统称为α-突触核蛋白相关疾病的属于突触核蛋白病的其它疾病(例如多系统萎缩症)的聚集体。相反，识别C末端区域的α-突触核蛋白抗体在识别其他各种突触核蛋白病和帕金森病的聚集体方面具有优势。特别地，如上所述，识别110和122个残基之间的区域的抗体已经显示优先结合至聚集体。
实施例8.抗α-突触核蛋白(嵌合)抗体的制备
克隆
通过使用人源化后获得的重链可变区和轻链可变区抗体的核苷酸序列，合成了短核苷酸片段的gblock(m.biotech)，并将其克隆到动物细胞培养载体(pcDNA3.4)中。通过在可变区之前和之后包含约20bp的重叠序列来合成gblock，并且pcDNA3.4载体的除可变区之外的部分通过PCR扩增，并通过Gibson装配法克隆。
转染和表达
使用制备的载体进行maxi-prep(Qiagen公司)以获得大量质粒DNA，然后如下引入细胞中。转染前一天，将ExpiCHOTM(Gibco公司，目录：A29127)细胞的浓度在ExpiCHOTM表达培养基(Gibco公司，目录：A29100-01)中调节至3×106至4×106个活细胞/mL的浓度，并在8％CO2，37℃和120rpm下培养1天。在DNA转染的当天，将生长至7×106至10×106个活细胞/mL并且存活率为95％或更高的细胞通过使用新鲜培养基稀释至6×106个活细胞/mL进行制备。
为了转染亲本细胞，通过使用ExpiFectamineTMCHO转染试剂盒(Gibco公司，目录号：A29129)制备ExpiFectamineTMCHO和质粒DNA复合物。通过分装冷的OptiPROTM 
(Gibco，Cat：12309019)培养基，以适当的浓度制备DNA和ExpiFectamineTMCHO试剂，分别接种，混合并在室温下静置5分钟。将产物接种到亲本细胞中，并在转染后培养。转染后的第二天，将ExpiFectamineTMCHO转染试剂盒中包含的增强剂和饲培剂(feed)接种到转染的细胞中，并在5天后再接种饲培剂，然后在8％CO2，37℃和120rpm下孵育10天，以产生转染的细胞。
为了获得培养液，将培养基转移到离心瓶中进行离心分离，在4℃和6500rpm下离心30分钟，然后用尺寸为0.2μm的过滤器过滤，获得除去悬浮固体的培养基，然后将该培养基用于随后的纯化。
抗体纯化
使用HiTrap MabSelectSure(GE Healthcare公司，11-0034-94)纯化培养物。用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.2，100mM NaCl)平衡后，将回收的培养物上样到柱上。上样完成后，将培养基用50mM柠檬酸钠(pH 5.0)洗涤，然后使用50mM柠檬酸钠(pH 3.4)洗脱。向洗脱液中添加1M Tris-HCl pH 9.0，以中和至pH 6.0。然后，将洗脱液进行缓冲液交换，并用PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)浓缩，并保存在4℃下直至随后使用。当需要进一步纯化时，第二次纯化根据洗脱样品的大小通过使第一纯化产物通过在HiLoad26/600superdex200柱上的1X PBS缓冲液而进行。通过质谱法分析纯化的抗体的氨基酸序列，并确认与小鼠来源的单克隆抗体的可变区一致。
将人IgG1同种型的骨架可变区部分替换为通过上述方法鉴定的3A9、9B11和11F11抗体的可变区，以制备嵌合人IgG1抗体。在获得的嵌合抗体中，尤其地Ch11F11抗体是IgG形式的抗体，并且包含SEQ ID NO:90的重链可变区序列(ch11F11-VH)和SEQ ID NO:109(ch11F11-VL)的轻链可变区序列的组合，而Ch 3A9抗体是IgG形式的抗体，并且包含SEQ IDNO:102(ch11F11-VH)的重链可变区序列和SEQ ID NO:116(ch11F11-VL)的轻链可变区序列的组合。
实施例9：人源化抗体的制备
文库噬菌体的制备
构建将小鼠或人源序列引入每个CDR残基，同时将人框架与嵌合抗体的CDR1、CDR2和CDR3残基结合的微型文库。
将产生的微型文库的感受态细胞接种在含34μg/ml氯霉素(Sigma，C0857)、2％葡萄糖(Sigma，G5400)和5mM MgCl2(Sigma，C0857)的2X YT培养基[17g Tripton(CONDA公司，1612.00)、10g酵母提取物(CONDA公司，1702.00)和5g NaCl(Sigma公司，S7653)]中，在30℃下培养3小时以使得OD600为0.5至0.7。然后，用辅助噬菌体感染细胞，并在含有34μg/ml氯霉素、5mM MgCl2、70μg/ml卡那霉素(Sigma公司，K1876)和1mM IPTG(ELPISBIO公司，IPTG025)的2X YT培养基中在30℃下培养6小时以诱导噬菌体包装。将培养溶液在4℃下以4500rpm离心15分钟。向上清液中添加4％PEG 6000(Fluka公司，81253)和3％NaCl(Sigma公司，S7653)，并在冰上孵育1小时。将产物在4℃下以8000rpm离心20分钟，然后，将沉淀在PBS中悬浮，并在4℃和12,000rpm下再次离心10分钟，以获得包含噬菌体文库的上清液。将获得的上清液保存在4℃直到以后使用。
噬菌体展示淘选
将10μg/ml的重组α-突触核蛋白聚集体添加到免疫试管(maxisorp 444202)中的PBS中，4℃过夜使蛋白质吸附在试管表面上后，将牛血清白蛋白(BSA)以3％的浓度添加到试管中，从而保护未吸附α-突触核蛋白聚集体的表面。排空试管后，将分散在BSA 3％溶液中的1012CFU抗体噬菌体文库放入吸附有α-突触核蛋白单体的免疫试管，并反应1小时(阴性选择)。回收未结合至α-突触核蛋白单体的噬菌体，并在室温下在附着有α-突触核蛋白聚集体的免疫试管中2小时发生结合。然后，将非特异性结合的噬菌体用PBS-T(0.05％Tween20)溶液洗涤5至30次，并使用100mM三乙胺溶液回收剩余的抗原特异性噬菌体抗体。用1MTris缓冲液(pH 7.4)中和回收的噬菌体后，在37℃下感染ER2537大肠杆菌1小时，然后将感染的大肠杆菌在含有羧苄青霉素的2X YT琼脂培养基上涂布在37℃下培养过夜。第二天，将培养的大肠杆菌悬浮在4ml的含有羧苄青霉素的2X YT培养液中，并添加15％甘油，一部分保存在-80℃，其余用于制备用于下次实验的噬菌体。通过总共重复3轮该过程，扩增并浓缩α-突触核蛋白抗原特异性噬菌体库。随着淘选过程的进行，使得使用PBS-T进行洗涤的次数增加，以扩增和浓缩抗原特异性噬菌体。
单克隆筛选
为了从通过淘选获得的噬菌体池中分选出特异性结合至α-突触核蛋白聚集体的单克隆抗体，进行如下实验。
为了从浓缩池中分离出单克隆，在LB-四环素/羧苄青霉素琼脂培养基上涂布噬菌体池并培养后，获得了单菌落。然后，将单克隆接种到96孔深孔培养板中，每孔分别放置400μl 2X YT-四环素/羧苄青霉素培养基并过夜生长，然后将10μl培养液放入添加了390μl 2XYT-四环素/羧苄青霉素培养基的新的96孔深孔培养板中，在37℃下培养4小时。将1mM IPTG添加到培养液中，并在30℃下培养过夜。将过夜培养的培养液离心以得到上清液。
然后，通过使用如下ELISA方法，选择表达结合至α-突触核蛋白聚集体的单克隆可溶性scFv的克隆(Steinberger.Rader and Barbas III.2000.噬菌体展示载体(Phagedisplay vectors).在噬菌体展示实验手册(Phage Display Laboratory Manual)中.第一版.冷泉港出版社.NY.USA.pp.11.9-11.12)。具体地，将实施例1-1中选择的7B7抗体置于96孔板(Nunc-Immuno Plates，美国NUNC公司)上，并在4℃下包被过夜。将3％BSA以200μL的量添加到每个孔中，然后在37℃下封闭2小时。然后，将α-突触核蛋白聚集体和单体以100ng/孔的浓度上样，在37℃下反应2小时，并用300μL PBS-T洗涤五次。将制备的单克隆上清液与3％BSA以1:1(体积:体积)的体积比混合，并将100μL的溶液上样到与聚集体和单体结合的板上，然后在37℃下反应2个小时。将细胞用300μL的PBS-T洗涤五次，并在37℃下与抗HAHRP缀合的抗体一起孵育1小时，然后用PBS-T洗涤五次。添加100μL TMB(四甲基联苯胺，Sigma公司，T0440)后，通过添加50μL1 N H2SO4来终止反应，从而测量450nm处的吸光度。将吸光度为0.5或更大的克隆视为结合的阳性反应，并且排除非特异性结合BSA的克隆。
同时对文库中发现的克隆的CDR残基平行进行硅胶分析，选择了导致与框架结合的严重问题的克隆，或除CDR外的框架部分中不具有T细胞表位、B细胞表位和MHCII表位的克隆。
随后，对于通过以下重链和轻链可变区的组合制备的五种抗体，将人IgG1同种型的人源化抗体可变区替换为骨架可变区部分，以制备五种IgG1骨架人源化抗体。具体地，Hu11F11_(ABL2-4)是IgG型抗体，并且包括SEQ ID NO:92(Hu11F11-VH2)的重链可变区序列和SEQ ID NO:113(Hu11F11-VL4)的轻链可变区序列的组合。Hu11F11_(ver.1)是IgG型抗体，包括SEQ ID NO:98的重链可变区序列(Hu11F11-VH-v1)和SEQ ID NO:115的轻链可变区序列(Hu11F11-VLv3 4c)的组合。Hu11F11_(ver.2)是IgG型抗体，包括SEQ ID NO:99的重链可变区序列(Hu11F11-VH-v2)和SEQ ID NO:115的轻链可变区(Hu11F11-VLv3 4c)的组合。Hu11F11_(ver.3)是IgG型抗体，包括SEQ ID NO:100的重链可变区序列(Hu11F11-VH-v3)和SEQ ID NO:115的轻链可变区序列(Hu11F11-VLv3 4c)。
Hu11F11(ver.4)是SEQ ID NO:101的重链可变区序列(Hu11F11-VH-v4)和SEQ IDNO:115的轻链可变区序列(Hu11F11-VLv3 4c)的组合。
实施例10.人源化抗体的吞噬促进活性的分析
为了测试促进小胶质细胞对胞外α-突触核蛋白聚集体的吞噬作用的功效，对于实施例8中获得的嵌合抗体和实施例9中获得的人源化抗体，hu11F11(ver.1)、hu11F11(ver.2)、hu11F11(ver.3)、hu11F11(ver.4)和ABL2-4，如下对吞噬作用的促进活性进行分析。
具体地，将小鼠小胶质细胞系BV-2与RPMI1640和10％FBS培养，以2×106个细胞/ml的浓度制备，然后将100ul分配在U型底96孔板中。α-突触核蛋白聚集体以及实施例8和9中制备的嵌合11F11或Hu11F11_11F11(ver.1)或Hu11F11_11F11(ver.2)或Hu11F11_11F11(ver.3)或Hu11F11_11F11(ver.4)或Hu11F11_ABL2-4抗体在室温下孵育20分钟，并将它们的混合物添加到96孔板中的细胞系BV-2中，并反应15分钟。在以1200rpm的速度离心5分钟以除去未结合的α-突触核蛋白聚集体和抗体后，将细胞用4％甲醛固定，洗涤3次，并用0.5％triton X-100透化。将识别突触核蛋白的抗体(Santa Cruz)孵育1小时，用含有0.1％Tween20的PBS洗涤3次，然后与抗兔-Alexa-488抗体孵育1小时。然后，洗涤所得物并通过FACScaliber分析。实验结果示于图12a和图12b中，图中示出了嵌合抗体和人源化抗体促进小胶质细胞吞噬α-突触核蛋白聚集体的能力的分析结果。图10a涉及人源化11F11抗体，图10b涉及人源化3A9。
如图10a和图10b所示，与IgG对照组相比，本发明所述的嵌合抗体使对α-突触核蛋白聚集体的摄取增加了约2倍，人源化抗体增加了多达4倍。其中，11F11的人源化抗体变体，即Hu11F11_ABL2-4(Hu11F11-VH2和Hu11F11-VL4的组合)、Hu11F11_(ver.1)(Hu11F11-VH-v1和Hu11F11-VLv3 4c的组合)和Hu11F11_(ver.2)(Hu11F11-VH-v2和Hu11F11-VLv3 4c的组合)，与嵌合11F11抗体相比，在促进BV-2吞噬方面具有优异的活性。Hu11F11_(ver.3)(Hu11F11-VH-v3和Hu11F11-VLv3 4c的组合)和hu11F11_(ver.4)(Hu11F11-VH-v4和Hu11F11-VLv3 4c的组合)显示促进吞噬作用的活性与嵌合11F11抗体相同。
实施例11：原纤维结合测定
进行原纤维结合测定以分析抗体抑制α-突触核蛋白聚集体结合至神经细胞的功效，α-突触核蛋白聚集体结合至神经细胞即α-突触核蛋白聚集体通过细胞间传播而传递至邻近神经细胞的现象的后期。
具体地，将神经元细胞系SH-SY5Y细胞用1uM的α-突触核蛋白聚集体以及嵌合11F11抗体和人源化11F11变体(即Hu11F11_ver1、Hu11F11_ver2、Hu11F11_ver3、Hu11F11_ver4和Hu11F11_ABL2-4)各20nM进行处理10分钟，然后用4％甲醛固定细胞。洗涤后，在非渗透性条件下以1:250处理识别所有形式的α-突触核蛋白的α-突触核蛋白抗体(BD)，洗涤并用共聚焦显微镜成像。在成像之前，通过DAPI处理显示细胞核。
结果，与IgG对照组相比，本申请的抗体有效降低了α-突触核蛋白聚集体的细胞膜结合程度，并且尤其地，相比于11F11嵌合抗体，11F11人源化抗体类似或更有效地降低了结合程度。图11是分析本发明的嵌合抗体和人源化抗体抑制α-突触核蛋白聚集体与神经细胞表面结合的能力的结果。
如图11所示，与IgG对照组相比，本发明的抗体有效地将α-突触核蛋白聚集体的细胞膜结合程度降低了多达23倍，并且尤其地，相比于11F11嵌合抗体，11F11人源化抗体类似或更有效地降低了结合程度。Hhu11F11_(ver.1)(Hu11F11-VH-v1和Hu11F11-VLv3 4c的组合)、hu11F11_(ver.3)(Hu11F11-VH-v3和Hu11F11-VLv3 4c的组合)和hu11F11_(ver.4)(Hu11F11-VH-v4和Hu11F11-VL-v3 4c的组合)显示出比11F11嵌合抗体优越的功效。ABL2-4(Hu11F11-VH2和Hu11F11-VL4的组合)和hu11F11(ver.2)(Hu11F11-VH-v2和Hu11F11-VLv34c)显示出与11F11嵌合抗体相似的降低能力。
实施例12：双室测定
进行双室测定以更直接地分析本发明的人源化抗体抑制α-突触核蛋白聚集体的细胞间传播的功效。将过表达α-突触核蛋白的SH-SY5Y细胞(供体细胞)分别在装有可渗透膜的插入件上铺布，将正常的SH-SY5Y细胞(受体细胞)分别置于12孔板中的盖玻片上，将包括过表达α-突触核蛋白的培养细胞系的插入件覆盖在上面，并孵育过夜。同时，用20nM本发明的抗体处理受体细胞。然后，将受体细胞用4％甲醛固定，洗涤，然后用0.5％TrtonX-100处理以产生渗透性条件。洗涤之后，处理与实施例14中使用的相同的检测抗体和DAPI，并用共聚焦显微镜成像。所分析的图像在图12中示出。
结果，与IgG对照组相比，本发明的人源化抗体有效地降低了α-突触核蛋白聚集体向受体细胞传播的程度，并且尤其地，相比于11F11嵌合抗体，11F11的人源化抗体类似或更有效地降低了α-突触核蛋白聚集体向受体细胞的传播。
图12是分析本发明的嵌合抗体和人源化抗体抑制细胞间传递的功效的结果，其中α-突触核蛋白聚集体从过表达α-突触核蛋白的神经细胞中分泌并转移至正常神经细胞。过表达α-突触核蛋白的SH-SY5Y神经细胞系在顶室铺布，向细胞外分泌α-突触核蛋白，而分泌的α-突触核蛋白则转移到铺布在底部12孔板中的正常SH-SY5Y细胞系。本发明的抗体显著减少了流入底部板的正常SH-SY5Y细胞系中的α-突触核蛋白的量。特别地，与嵌合抗体相比，本发明的人源化抗体中的11F11克隆的人源化抗体显示出进一步增加了流入底部板中的受体细胞中的α-突触核蛋白减少的程度。更具体地说，hu11F11(ver.2)(Hu11F11-VH-v2和Hu11F11-VLv3 4c的组合)和hu11F11(ver.4)(Hu11F11-VH-v4和Hu11F11-VLv3 4c的组合)具有比嵌合抗体优越的抑制活性，Hu11F11(ver.1)(Hu11F11-VH-v1和Hu11F11-VLv3 4c的组合)和hu11F11(ver.3)(Hu11F11-VH-v3和Hu11F11-VLv3 4c的组合)显示出与嵌合抗体相似的抑制能力。
与IgG对照组相比，11F11克隆的人源化抗体有效地将α-突触核蛋白聚集体的传播程度降低了约22倍。特别地，相比于11F11嵌合抗体，11F11的人源化抗体类似或更有效地降低了α-突触核蛋白聚集体向受体细胞的传播。
实施例13.人源化抗体的ELISA分析
按照与实施例2-2基本相同的方法，进行夹心ELISA以定量分析实施例8中获得的嵌合抗体(Ch11F11)和实施例9中获得的人源化抗体(Hu11F11)的结合亲和力。
具体地，将每种抗体按1/10的比例以0.04至400nM的浓度稀释并在96孔板上包被，然后用突触核蛋白原纤维聚集体以2000ng/ml处理每个孔。用1×PBS洗涤后，处理与缀合有HRP的链霉亲和素和缀合有生物素的二抗，然后与作为底物的TMB反应。测量吸光度。结果示于图13中。
如图13所示，证实了根据本发明的人源化抗体，尤其是来源自11F11嵌合抗体的人源化抗体(人源化11F11抗体)显示出与嵌合11F11克隆等效的结合亲和力。人源化抗体，尤其是衍生自11F11克隆的变体，例如hu11F11(ver.1)(包括Hu11F11-VH-v1和Hu11F11-VLv34c的组合)、hu11F11(ver.2)(包括Hu11F11-VH-v1和Hu11F11-VLv3 4c)、hu11F11(ver.3)(包括Hu11F11-VH-v3和Hu11F11-VLv3 4c)和hu11F11(ver.4)(Hu11F11-VH-v4和Hu11F11-VLv3 4c的组合)，显示了与嵌合11F11克隆等效的结合亲和力，它们的EC50值为11.5至15.1nM，类似于11F11嵌合抗体的EC50(为12.5nM)。
实施例14：使用抗α-突触核蛋白抗体的BIAcore分析
根据与实施例2-3基本相同的方法，进行BIAcore分析以定量分析实施例8中获得的嵌合抗体(Ch11F11)和实施例9中获得的人源化抗体(Hu11F11)的结合亲和力。分析结果示于图14和下表中。
[表10]
| 克隆名称 | KD(nM) |
| Ch11F11 | 0.02472 |
| Hu11F11_v2 | 0.0596 |
| Hu11F11_v3 | 0.0316 |
| Hu11F11_v4 | 0.0204 |
结果，本发明的人源化抗体，尤其是克隆11F11的变体，即hu11F11(ver.2)(Hu11F11-VH-v2和Hu11F11-VLv3 4c的组合)、hu11F11(ver.3)(Hu11F11-VH-v3和Hu11F11-VLv3 4c的组合)和hu11F11(ver.4)(Hu11F11-VH-v4和Hu11F11-VLv3 4c的组合)，显示出与嵌合11克隆相似的KD值。至于结合亲和力，人源化克隆显示KD值低至0.02至0.06×10-9M，而嵌合11F11克隆显示KD值低至0.02×10-9M，这表明它们与聚集体具有高的结合亲和力。
实施例15.评估人源化抗体的生产率
通过根据与实施例8基本相同的方法转染和培养以及第一次纯化和第二次纯化，获得了11F11嵌合抗体和11F11的4种人源化抗体变体(Hu11F11(ver.1)、Hu11F11(ver.2)、Hu11F11(ver.3)、Hu11F11(ver.4))，并分析最终纯化的样品中抗体的量和纯度。
用Thermo ScientificTMNanoDropTM分光光度计分析抗体的量。具体地，在通过加样1×PBS调节零点之后，加样一定量的纯化的抗体样品，并在280nm的UV波长下测量。通过用NanoDropTM测量的样品浓度乘以样品的总体积获得总产量，然后将总产量除以总体积得到生产率(收率(g/L))。用HLC-001(Agilent 1200系列)HPLC分析最终纯化的产物的纯度。具体地，通过在TSK凝胶G3000SWXL中使用1×PBS和200mM精氨酸-HCl(pH 6.8)作为流动相，定量分析主峰的比率来获得纯度。生产率分析结果示于表中。
[表11]
结果，11F11嵌合抗体和11F11的人源化抗体变体，例如hu11F11(ver.1)(Hu11F11-VH-v1和Hu11F11-VLv3 4c的组合)、hu11F11(ver.2)(Hu11F11-VH-v2和Hu11F11-VLv3 4c的组合)、hu11F11(ver.3)(Hu11F11-VH-v3和Hu11F11-VLv3 4c的组合)或hu11F11(ver.4)(Hu11F11-VH-v4和Hu11F11-VLv3 4c的组合)具有0.068至0.423g/L的生产率，这通常比通过瞬时转染产生的抗体的收率更高。尤其是，hu11F11(ver.2)(Hu11F11-VH-v2和Hu11F11-VLv3 4c的组合)显示出0.423g/L的生产率，高于11F11嵌合抗体的0.282g/L。
实施例16.通过嵌合抗体评估与α-突触核蛋白的特异性结合
在根据实施例8产生三种嵌合抗体3A9、9B11和11F11之后，将抗体对α-突触核蛋白的结合特异性与作为α-突触核蛋白的同源物的β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白的ELISA分析结果进行比较。
为了进行评估，将人β-突触核蛋白(Uniprot：Q16143)蛋白(CUSABIO公司，目录号：CSB-EP624090HU)和人γ-突触核蛋白(Uniprot：O76070)蛋白(CUSABIO公司，目录号：CSB-EP021915HU)以100ng/ml的浓度在96孔板上包被，洗涤，然后用5％BSA封闭2小时。此时，将结合所有α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白的pan-Syn抗体(santacruz公司，目录：FL-140，sc-10717，兔)用作阳性对照。洗涤后，将按1/10的比例以0.04至400nM的浓度稀释的嵌合抗体(3A9、9B11、11F11)处理2小时，用PBS洗涤，然后用作为检测抗体的HRP结合的山羊抗hFc抗体处理。之后，在与作为底物的TMB反应后，在450nm和650nm处测量吸光度。对于阳性对照，使用HRP结合的山羊抗兔抗体作为检测抗体。
实验结果示于图15a和图15b中。图15a和图15b是ELISA分析结果，显示嵌合抗体(3A9、9B11、11F11)对人β-突触核蛋白和人γ-突触核蛋白的结合亲和力非常低。相反，作为阳性对照的pan-Syn抗体显示出对β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白的高结合亲和力。图15a涉及人β-突触核蛋白，图15b涉及人γ-突触核蛋白。
此外，三种抗体在斑点印迹中与淀粉样蛋白β1-42(Uniprot登录：P05067；CAS编号：107761-42-2)和Tau蛋白(UNIPORT：P10636-8)的聚集体进行反应，然后，分析了抗体与α-突触核蛋白聚集体的特异性结合能力。下面说明这样的分析的原因。淀粉样蛋白β1-42和tau蛋白形成聚集体，这种聚集体被认为是神经退行性疾病，尤其是阿尔茨海默病的重要病因，并且已知该聚集体具有类似α-突触核蛋白聚集体的寡聚体、初原纤维和原纤维的结构。因此，进行斑点印迹分析以研究嵌合抗体3A9、9B11和11F11识别α-突触核蛋白的特定序列，并且不识别来源自α-突触核蛋白、淀粉样蛋白β和tau的聚集体的共同结构。
以与实施例2-3基本相同的方式进行本实施例的斑点印迹法，重组淀粉样β1-42、tau蛋白及其聚集体获得自国立首尔大学的Seung-jae Lee教授(Professor Seung-jaeLee of Seoul National University)。SYN-1、6E10和Tau5是已知分别结合至α-突触核蛋白、淀粉样蛋白β1-42和tau蛋白的抗体。分析结果如图15c所示。
实验结果示于图15c中，表明本发明的嵌合抗体3A9、9B11和11F11仅特异性结合至α-突触核蛋白衍生的聚集体，而不特异性结合至淀粉样蛋白β1-42和tau来源的聚集体。与此相反，6E10和Tau5抗体，已知分别结合淀粉样蛋白β1-42和Tau，在斑点印迹上显示出结合至相应的聚集体。
根据以上结果，嵌合抗体不结合至α-突触核蛋白的同源物和来源自不同蛋白质的聚集体，表示该抗体仅有效地与靶蛋白质结合，因此具有比结合至同源物和来源自不同蛋白质的聚集体的抗体或药物更优异的功效。
Claims (32)
1.一种结合至α-Syn聚集体的抗体或其抗原结合片段，包含：
重链CDR1(H-CDR1)，其包含选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
重链CDR2(H-CDR2)，其包含选自SEQ ID NO:2至4和SEQ ID NO:7至8的氨基酸序列；
重链CDR3(H-CDR3)，其包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9的氨基酸序列；
轻链CDR1(L-CDR1)，其包含选自SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
轻链CDR2(L-CDR2)，其包含选自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14的氨基酸序列；和
轻链CDR3(L-CDR3)，其包含选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)、含有选自SEQ ID NO:2至4的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)；以及
轻链可变区，其包含：含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)、含有SEQID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含：含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)、含有SEQID NO:7至8的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)和含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)；以及
轻链可变区，其包含：含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)、含有SEQID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包含：
位于H-CDR1的N端的重链可变区框架1(H-FR1)，所述重链可变区框架1(H-FR1)包含选自SEQ ID NO:16至17和SEQ ID NO:35至40的氨基酸序列；
位于H-CDR1与H-CDR2之间的重链可变区框架(H-FR2)，所述重链可变区框架(H-FR2)包含选自SEQ ID NO:18至19和SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列；
位于H-CDR2与H-CDR3之间的重链可变区框架(H-FR3)，所述重链可变区框架(H-FR3)包含选自SEQ ID NO:20至31和SEQ ID NO:45至50的氨基酸序列；和
位于H-CDR3 C端的重链可变区框架(H-FR4)，所述重链可变区框架(H-FR4)包含选自SEQ ID NO:32至34和SEQ ID NO:51至52的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述轻链可变区包含：
位于L-CDR1的N末端的轻链可变区框架1(L-FR1)，所述轻链可变区框架1(L-FR1)包含选自SEQ ID NO:53至58和SEQ ID NO:71至77的氨基酸序列；
位于L-CDR1与L-CDR2之间的轻链可变区框架(L-FR2)，所述轻链可变区框架(L-FR2)包含选自SEQ ID NOs 59至61和SEQ ID NO:78至81的氨基酸序列；
位于L-CDR2与L-CDR3之间的轻链可变区框架(L-FR3)，所述轻链可变区框架(L-FR3)包含选自SEQ ID NO:62至67和SEQ ID NO:82至88的氨基酸序列；和
位于L-CDR3的C末端的轻链可变区框架(L-FR4)，所述轻链可变区框架(L-FR4)包含选自SEQ ID NO:68至70和SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
6.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包含：
位于H-CDR1的N末端的重链框架1(H-FR1)，所述重链框架1(H-FR1)包含选自SEQ IDNO：16至的氨基酸序列，
位于H-CDR1与H-CDR2之间的重链框架(H-FR2)，所述重链框架(H-FR2)包含选自SEQ IDNO:18至19的氨基酸序列，
位于H-CDR2与H-CDR3之间的重链框架(H-FR3)，所述重链框架(H-FR3)包含选自SEQ IDNO:20至31的氨基酸序列，和
位于H-CDR3的C末端的重链框架(H-FR4)，所述重链框架(H-FR4)包含选自SEQ ID NO:32至34的氨基酸序列；以及
所述轻链可变区包含：
位于L-CDR1的N末端的轻链框架1(L-FR1)，所述轻链框架1(L-FR1)包含选自SEQ IDNO:53至58的氨基酸序列，
位于L-CDR1与L-CDR2之间的轻链框架(L-FR2)，所述轻链框架(L-FR2)包含选自SEQ IDNO:59至61的氨基酸序列，
位于L-CDR2与L-CDR3之间的轻链框架(L-FR3)，所述轻链框架(L-FR3)包含选自SEQ IDNO:62至67的氨基酸序列，和
位于L-CDR3的C末端的轻链框架(L-FR4)，所述轻链框架(L-FR4)包含选自SEQ ID NO:68至70的氨基酸序列。
7.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包含：
位于H-CDR1的N末端的重链框架1(H-FR1)，所述重链框架1(H-FR1)包含选自SEQ IDNO:35至40的氨基酸序列，
位于H-CDR1与H-CDR2之间的重链框架(H-FR2)，所述重链框架(H-FR2)包含选自SEQ IDNO:41至44的氨基酸序列，
位于H-CDR2与H-CDR3之间的重链框架(H-FR3)，所述重链框架(H-FR3)包含选自SEQ IDNO:45至50，和
位于H-CDR3的C末端的重链框架(H-FR4)，所述重链框架(H-FR4)包含选自SEQ ID NO:51至52的氨基酸序列；以及
所述轻链可变区包含：
位于L-CDR1的N-末端的轻链框架1(L-FR1)，所述轻链框架1(L-FR1)包含选自SEQ IDNO:71至77的氨基酸序列，
位于L-CDR1与L-CDR2之间的轻链框架(L-FR2)，所述轻链框架(L-FR2)包含选自SEQ IDNO:78至81的氨基酸序列，
位于L-CDR2与L-CDR3之间的轻链框架(L-FR3)，所述轻链框架(L-FR3)包含选自SEQ IDNO:82至88的氨基酸序列，和
位于L-CDR3的C-末端的轻链框架(L-FR4)，所述轻链框架(L-FR4)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链可变区包含：选自SEQID NO:90至101或SEQ ID NO:102至108的氨基酸序列；与选自SEQ ID NO:90至101或SEQ IDNO:102至108的氨基酸序列具有至少90％或更高的序列同一性的氨基酸序列；或与选自SEQID NO:90至101或SEQ ID NO:102至108的氨基酸序列具有至少95％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述轻链可变区包含：选自SEQID NO:109至115或SEQ ID NO:116至123的氨基酸序列；与选自SEQ ID NO:109至115或SEQID NO:116至123的氨基酸序列具有至少90％或更高的序列同一性的氨基酸序列；或与选自SEQ ID NO:109至115或SEQ ID NO:116至123的氨基酸序列具有至少95％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含选自SEQ ID NO:90至101的氨基酸序列；和
轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO:109至115的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其包含选自SEQ ID NO:102至108的氨基酸序列；和
轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO:116至123的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:127的重链可变区和SEQ ID NO:128的轻链可变区，
SEQ ID NO:129的重链可变区和SEQ ID NO:130的轻链可变区，
SEQ ID NO:131的重链可变区和SEQ ID NO:132的轻链可变区，
SEQ ID NO:133的重链可变区和SEQ ID NO:134的轻链可变区，
SEQ ID NO:135的重链可变区和SEQ ID NO:136的轻链可变区，或
SEQ ID NO:137的重链可变区和SEQ ID NO:138的轻链可变区。
13.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段被分离并结合至α-突触核蛋白聚集体，其中，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab')片段、双抗体或scFV。
14.根据权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段被分离并结合至α-突触核蛋白聚集体，其中，所述单克隆抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段被分离并结合至α-突触核蛋白聚集体，其中，所述抗体或其抗原结合片段抑制α-突触核蛋白聚集体的细胞间传递；降解α-突触核蛋白聚集体；或抑制α-突触核蛋白聚集体的形成。
16.一种分离的多核苷酸，编码根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
17.一种表达载体，包含根据权利要求16所述的多核苷酸。
18.一种细胞，用根据权利要求17所述的表达载体转染。
19.一种组合物，包含根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述组合物用于治疗α-突触核蛋白病，并且还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中，所述α-突触核蛋白病包括：帕金森病(PD)、帕金森病痴呆症(PDD)、路易体痴呆症(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、阿尔茨海默病和帕金森病合并症或多系统萎缩症(MSA)。
22.一种在体内或体外检测生物样品中α-突触核蛋白聚集体的方法，包括提供根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及使待检测α-突触核蛋白聚集体的生物样品与所述抗体或其抗原结合片段接触。
23.一种治疗受试者的α-突触核蛋白病或调节受试者的α-突触核蛋白聚集体浓度的方法，包括以下步骤：向需要治疗α-突触核蛋白病和/或调节α-突触核蛋白聚集体浓度的受试者施用药学上有效量的根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述α-突触核蛋白病包括：帕金森病(PD)、帕金森病痴呆症(PDD)、路易体痴呆症(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、阿尔茨海默病和帕金森病合并症或多系统萎缩症(MSA)。
25.一种诊断受试者的α-突触核蛋白病的方法，其中，所述方法包括：
通过使用根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，测量受试者中α-突触核蛋白聚集体的浓度和/或细胞间位置；和
将受试者中测得的α-突触核蛋白聚集体的浓度和/或细胞间位置与对照样品的α-突触核蛋白聚集体的浓度和/或细胞间位置进行比较，其中与对照样品结果相比相似或有差异代表受试者患有α-突触核蛋白病。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，所述α-突触核蛋白病包括：帕金森病(PD)、帕金森病痴呆症(PDD)、路易体痴呆症(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、阿尔茨海默病和帕金森病合并症或多系统萎缩症(MSA)。
27.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物用于治疗受试者的α-突触核蛋白病的用途，其中，所述抗体或其抗原结合片段抑制α-突触核蛋白聚集体的细胞间传递；降解α-突触核蛋白聚集体；或抑制受试者脑中的α-突触核蛋白聚集的形成。
28.根据权利要求26所述的用途，其中，所述α-突触核蛋白病包括：帕金森病(PD)、帕金森病痴呆症(PDD)、路易体痴呆症(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、阿尔茨海默病和帕金森病合并症或多系统萎缩症(MSA)。
29.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物用于调节脑细胞中α-突触核蛋白聚集体的浓度的用途，其中，所述抗体或抗原结合片段或包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物抑制α-突触核蛋白聚集体的细胞间传递；降解α-突触核蛋白聚集体；或抑制受试者脑中的α-突触核蛋白聚集的形成。
30.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，通过抑制α-突触核蛋白聚集体的细胞间传递，降解α-突触核蛋白聚集体或抑制α-突触核蛋白聚集体的形成而用于调节脑细胞中的α-突触核蛋白聚集体的浓度。
31.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，用于治疗α-突触核蛋白病。
32.根据权利要求30所述的根据1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述α-突触核蛋白病包括：帕金森病(PD)、帕金森病痴呆症(PDD)、路易体痴呆症(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、阿尔茨海默病和帕金森病合并症或多系统萎缩症(MSA)。
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