CN111356698B - 用于低氧成像、映射和治疗的标记物、缀合物、组合物和方法 - Google Patents

Abstract

用于低氧成像、映射和治疗的标记物、缀合物、组合物和方法。包含生物还原活化的(BA)臂、接头臂和映射点击的化合物，其中BA包含一种或多种取代的或未取代的2/4/5‑取代的硝基咪唑、或取代的苯并三嗪‑1，4‑二氧化物、或取代的1，2，3/1，2，4‑三唑、或取代的1，4‑苯并醌、或两个同或杂BA部分的组合。所述化合物在其分布于细胞或组织中后发生原位点击反应，以与报告基团相连，所述报告基团可以与用于PET/SPECT的金属放射活性的或非放射活性的‑或放射性的卤素或用于荧光/光学报告基团的染料不螯合或螯合，从而完成低氧成像。

Description

用于低氧成像、映射和治疗的标记物、缀合物、组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年9月19日提交的美国专利申请U.S.62/560,478的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开总体上涉及用于低氧成像、映射和治疗的标记物、缀合物、组合物和方法。

背景技术

实体瘤常表现出快速生长和异常的脉管系统，导致氧(O₂)消耗(低氧)和营养供应不足^1-8。低氧改变细胞代谢，这可以触发转录反应，诱导遗传改变^9-13，并激活转化的、自我更新的多能癌症干细胞(CSC)的形成。低氧促进侵袭、转移^14,15、肿瘤进展和复发^13,16-18。低氧性实体瘤对放疗和(由于药物递送受损⁶)化疗更具抗性^14,15,19-21。因此，肿瘤低氧对治疗干预构成了巨大挑战，并导致局部控制不佳和整体存活率低下^22,23。

发明内容

在一个方面，提供了式(I)的化合物或其任何前药、药学上可接受的盐、代谢物、多晶型物、溶剂化物、水合物、立体异构体、放射性同位素或互变异构体

其中BA包含一种或多种取代或未取代的2/4/5-取代的硝基咪唑，或取代的苯并三嗪-1,4-二氧化物，或取代的1,2,3/1,2,4-三唑，或取代的1,4-苯并醌，或两个同或杂BA部分的组合，

其中BA可以进一步被大环配体取代，所述大环配体可以连接到报告部分——荧光生物素化染料、或者非放射性或放射性卤素(例如F、I等)、或配位金属原子(例如Ga-68、Tc-99m等)，

其中，接头臂包含C_1-22烷烃、烯烃、炔烃、脂环族或芳香族接头，其具有或不具有如在具有上述取代的醚、胺、酯、酸、酰胺、5和6元糖(包括单糖和二糖)环中的杂原子。

其中，映射点击包含用于点击化学的取代或未取代的–N₃-、CN、SCN、取代炔烃中的一种，其可进一步包含报告部分，

其中可点击的实体还可包含大环配体，其可以与用于PET/SPECT的金属放射活性的或非放射活性的或放射性的卤素或用于荧光/光学报告的染料不螯合或螯合。

在一个方面，描述了式(II)的化合物或其任何前药、药学上可接受的盐、代谢物、多晶型物、溶剂化物、水合物、立体异构体、放射性同位素或互变异构体，

其中，为生物还原活化的部分/核，例如硝基咪唑、苯并三嗪-1,4-二氧化物(例如，替拉扎明)及其类似物、取代的1,2,4-三唑、取代的四氢异喹啉、取代的苯并醌(例如，AQ4N)和生物还原活化的核的其它实施例

其中R₁是未取代的，或被一个或多个–OH基团取代的脂环族、杂环族或开链部分，其中一个或多个–OH基团被烷基、芳烷基醚、酯、胺或硫醇取代，剩余的游离–OH基团被

–N₃/-CN-SCN/-炔烃/取代的炔烃/取代的烷烃/烯烃/炔烃/烷氧基/烷氧基烷基/烷氧基烯基和烷氧基炔基链取代，

其中–N₃/-CN-SCN-炔/取代的炔基可与报告部分缀合，所述报告部分具有包含荧光染料或放射性卤素的部分，

其中n＝(C₁-C₂₂),

其中BA可以进一步被大环取代的或未取代的配体取代，

其中大环配体可以被放射性卤素取代或与金属配体配位用于报告。

在一个实施例中，含有生物还原活化分子的糖(所有构型)可进一步在2’-和/或3’-位被醚或酯部分所取代，以及在具有或不具有接头的糖的2’-或5’-OH处被叠氮基/炔基/卤素/假卤素(F/I/OTosyl/ONosyl/OTriflyl/OMesyl)取代。

在一个实施例中，连接至BA部分的无环或环状取代基进一步被R₁取代，

其中R₁＝未取代的或被一个或多个-OH基团取代的脂环族、杂环族或开链部分，其中一个或多个-OH基团被烷基、芳烷基醚、酯、胺或硫醇取代；剩余的游离-OH基团被-N₃/-CN/-SCN/-炔/取代的炔/取代的烷/烯烃/炔烃/烷氧基/烷氧基烷基/烷氧基烯基和烷氧基炔基链取代。

在一个实施例中，生物还原活化的分子包括硝基咪唑取代的、同或杂取代的无环或环状产物(例如叠氮基-AZA(ACN)、叠氮基-MISO(AMI)、含叠氮基的喹诺酮、三唑、四唑等)，和所有相关前体；在基于苯并三嗪-1，4-二氧化物的分子中，实施例包括基于替拉扎明(TPZ)的无环或环状化合物，例如(C2/C4/C6葡萄糖取代的-TPZ)，以及合成相应的卤代(F、Cl、Br、I、At)衍生物的所有相关前体。

在一个实施例中，所述是

在一个实施例中，所述苯并三嗪类是

其中R₂是N₃、SCN、CN、炔烃(取代的或未取代的)和叠氮烯基/CN/SCN，

其中n₁是1-22，

其中n₂是1-22，

其中n₃是1-22。

在一个方面，描述了式(III)的化合物或其任何前药、药学上可接受的盐、代谢物、多晶型物、溶剂化物、水合物、立体异构体、放射性同位素或互变异构体，

Y-L-BA(III)

其中，BA为生物还原活化的部分/核，例如硝基咪唑、苯并三嗪-1,4-二氧化物(例如，替拉扎明)及其类似物、取代的1,2,4-三唑、取代的四氢异喹啉、取代的苯并醌(例如被R₁取代的AQ4N)或任何其他生物还原活化的部分

其中R₁是C1-α/β-取代的阿拉伯呋喃糖/戊糖/己糖(例如葡萄糖、二糖等)其中糖环中除了一个以外的其它–OH基团是未取代的，或者是被烷基、芳烷基醚、酯、胺或硫醇取代的，剩余的游离–OH基团被取代或未被取代的叠氮化物或炔烃替换，

其中R₁是R₂取代的烷烃/烯烃/炔烃/烷氧基/烷氧基烷基/烷氧基烯基和烷氧基炔基链(C₁-C₂₂)，R₂是叠氮化物、炔烃或生物素化炔烃，

其中Y是含有叠氮化物或炔烃取代的配体(例如，DOTA或NOTA中的四齿配体)，所述配体通过或不通过接头“L”连接生物还原药物BA；配体可以在与BA偶联之前或之后与金属配位，

其中L是具有至多C₂₂链的环状或非环状接头。

在一方面，描述了一种放射性标记化合物，其包含所述化合物，其中所述放射性标记方法是手动方法或自动方法。

在一方面，描述了一种药物，其包含所述化合物或所述放射性标记化合物，以及一种或多种惰性载体和/或稀释剂。

在一方面，描述了所述化合物、所述放射性标记化合物或所述药物组合物在受试者中作为诊断剂的用途。

在一方面，描述了所述化合物、所述放射性标记化合物或所述药物组合物，其在受试者中作为治疗剂。

在一方面，描述了所述化合物、所述放射性标记化合物或所述药物组合物，其在受试者中作为诊断和治疗剂。

在一方面，描述了所述化合物、所述放射性标记化合物或所述药物组合物，其在受试者中作为显像剂。

在一方面，描述了所述化合物、所述放射性标记化合物或所述药物组合物，其在受试者中作为放射性致敏剂。

在一方面，描述了所述化合物、所述放射性标记化合物或所述药物组合物，其在受试者中作为化学致敏剂。

在一方面，描述了所述化合物、所述放射性标记化合物或所述药物组合物，用于分子放射性疗法(MRT)(也称为全身放射性同位素疗法(SRT)和内放射性疗法(ERT))、化学致敏疗法、放射性致敏疗法、俄歇疗法或低氧成像中。

在一个实施例中，其中(a)所述成像是荧光的、光学的、MRI、放射性PET和SPECT、例如使用F-18、I-124、Ga-68的PET成像、使用例如I-131和I-123的SPECT、使用荧光染料的光学成像；治疗用途包括化疗(如I-127、F-19和其他非放射性化合物)；俄歇疗法(I-125)、光动力疗法(PDT)、放射性致敏和分子放射性疗法[MRT；I-131、Lu-177、Re-186，但不限于这些同位素)(b)治疗诊断用途(PET和SPECT成像、MRI、荧光的、光学的、PDT、放射性致敏、MRT)。

在一实施例中，其中所述受试者是人或任何活体模型

在一方面，描述了一种检测细胞中低氧的方法，其包括：向受试者施用所述化合物或所述的药物组合物；和b)检测受试者的低氧细胞中残留放射性元素的存在。

附图说明

现在将参照附图仅以示例的方式描述本公开的实施方案。

图1描述了固相萃取前(图A)和固相萃取后(图B)放射性¹⁷⁷Lu标记的DOTA-TPZ的色谱图，作为使用SPE方法纯化IV类放射性化合物的实施例。

图2描述了IV类放射性化合物的稳定性，以放射性¹⁷⁷U标记的DOTA-TPZ作为示例。

图3A-D描述了在FaDu细胞中ACN的低氧选择性致敏

图4A-D描述了在用DMSO(A)或不同浓度(1μM、10μM或100μM)的ACN(B-D)处理的固定的FaDu细胞上的叠氮基-AZA(ACN)-ACN点击化学的逆氧依赖性截留(inverse oxygendependent entrapment)，表明荧光信号仅存在于缺氧细胞中。信号在低氧样品中最集中，并且100μMACN处理的样品显示出最显著的差异。Hoechst核染色以蓝色示出，并且点击化学反应以绿色示出。比例尺为20μm。

图5：ACN和吡莫尼唑(Pimonidazole)的低氧选择性摄取之间的比较——用ACN和吡莫尼唑(每种化合物100μM)两者处理的FaDu细胞进行的免疫荧光研究表明，ACN和吡莫尼唑在缺氧氧细胞中都可以被检测到。低氧样品显示ACN更高的核染色，而吡莫尼唑信号大部分集中在细胞质中。Hoechst核染色显示为蓝色，点击化学反应显示为绿色，吡莫尼唑免疫染色显示为红色。比例尺为20μm。

图6：再氧合(re-oxygenation)后低氧细胞中叠氮基AZA(ACN)的滞留情况-当细胞在低氧6小时后进行再氧合时，在ACN处理的FaDu细胞中的ACN点击化学信号随时间降低(B)；直至再氧合后6小时都可以检测到点击信号，并且在再氧合18小时后，该信号最终几乎消失在背景中。常氧对照组显示最低的背景(A)。Hoechst核染色显示为蓝色，并且点击化学反应显示为绿色。比例尺为20μm。

图7：点击化学定义了肿瘤的低氧区域-ACN:吡莫尼唑1:1注射动物的7微米系列肿瘤切片说明，点击化学反应定义了低氧区域并与已知的低氧标记吡莫尼唑共定位。DAPI以蓝色显示，点击化学反应以绿色显示。红色在(A)中代表脉管系统，在(B)和(C)中代表吡莫尼唑免疫染色。比例尺为1mm。

图8：在对照(A)和放射(B)(10Gy)治疗的带有FaDu肿瘤的小鼠中通过ACN映射评估缺氧区域-同一动物的左侧(DMSO对照)和右侧(单剂量10Gy放射)肿瘤的7微米系列切片表明，辐射可以缩小肿瘤，但不会影响肿瘤的低氧。DAPI以蓝色显示，点击化学反应以绿色显示，红色表示脉管系统。比例尺为1mm。

图9：在携带FaDu肿瘤的小鼠中，单独使用IAZA(A)和IAZA+辐射(B)(10Gy)治疗后，通过ACN映射评估缺氧区域-同一动物的左侧(单独IAZA)和右侧(IAZA+单剂量10Gy放射)肿瘤的七微米系列切片显示，辐射和IAZA的组合可缩小肿瘤并减少缺氧。DAPI以蓝色显示，点击化学反应以绿色显示，红色表示脉管系统。比例尺代表1毫米。红色-CD34；绿色-点击，蓝色-DAPI。

图10A&B示出了A-TPZ在FaDu细胞中的低氧选择性毒性。

图11A-D示出了A-TPZ点击化学显示剂量依赖的低氧选择性映射潜力。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

如本文所用，单独或组合使用的术语“烃”是指包含碳和氢的直链、支链或环状有机部分，例如烷基、烯烃、炔烃和芳基，它们各自可以任选被取代。在一些实施例中，烃可以例如包括约1至约60个碳、约1至约40个碳、约1至约30个碳、约1至约20个碳、约1至约10个碳、约1至约9个碳、约1至约8个碳、约1至约6个碳、约1至约4个碳或约1至约3个碳。在一些实施方案中，烃包括10个碳、9个碳、8个碳、7个碳、6个碳、5个碳、4个碳、3个碳、2个碳或1个碳。

如本文所用，术语“烷基”指直链或支链烃。烷基可以是直链的、支链的、环状的或其组合，并且可以包含例如1至60个碳原子。烷基的例子包括但不限于乙基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基异构体(例如正丁基、异丁基、叔丁基等)、环丁基异构体(例如环丁基、甲基环丙基等)、戊基异构体、环戊烷异构体、己基异构体、环己烷异构体等。

如本文所用，术语“直链烷基”是指碳和氢原子的链(例如乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷等)。直链烷基可以用名称-(CH₂)_qCH₃表示，其中q是例如0-59。名称“C_1-12烷基”或类似名称是指具有1至12个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、丙基异构体(例如正丙基、异丙基等)、丁基异构体、环丁基异构体(例如环丁基、甲基环丙基等)、戊基异构体、环戊基异构体、己基异构体、环己基异构体、庚基异构体、环庚基异构体、辛基异构体、环辛基异构体、壬基异构体、环壬基异构体、癸基异构体、环癸基异构体等。类似的名称是指具有不同范围的碳原子数的烷基。

如本文所用，术语“支链烷基”是指没有双键或三键的碳原子和氢原子的链，其在链中含有叉链、支链和/或分链。“分支”是指碳链的分叉，而“取代”是指部分中存在非碳/非氢原子。

如本文所用，术语“环烷基”是指完全饱和的单环或多环烃环体系。当由两个或多个环组成时，这些环可以以融合、桥接或螺环连接的方式连接在一起。环烷基可以是未取代的、取代的、分支的和/或非分支的。典型的环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。如果被取代，则除非另外说明，否则取代基可以是烷基或选自以上关于烷基的取代所指示的那些。除非另有说明(例如，取代的环烷基，杂环基，环烷氧基，卤代环烷基，环烷基胺，硫代环烷基等)，否则烷基仅包含碳和氢原子。

如本文所用，术语“杂烷基”指烷基，其中一个或多个碳原子独立地被一个或多个杂原子(例如，氧、硫、氮、磷、硅或其组合)取代。含有非碳取代的烷基可以是直链烷基、支链烷基、环烷基(例如环杂烷基)或其组合。非碳可以在末端位置(例如，2-己醇)或整合到烷基内(例如，乙醚)。

单独或组合使用的术语“烷氧基”是指-O-烷基基团。

单独或组合使用的术语“烯基”是指具有至少2个碳原子的直链或支链烃，其含有至少一个碳-碳双键。

术语“卤代烷基”是指其中一个或多个氢被相同或不同的卤素取代的烷基。

单独或组合使用的术语“炔基”是指具有至少2个碳原子的直链或支链烃，其含有至少一个碳-碳三键。

术语“烷氧基烷基”是指式-R’-R”的部分，其中R’是亚烷基，R”是烷氧基。

单独或组合使用的术语“芳基”是指最多60个碳原子的芳族碳环部分，它可以是单个环(单环)或稠合在一起的多个环(例如双环或三环稠合环体系)。

术语“亚烷基”是指优选具有1-6个，更优选1-3个碳原子的直链或支链二价脂族烃基。

如本文所用的术语“胺”或“氨基”由式NA1A2A3表示，其中A1、A2和A3可以独立地是氢或如本文所述的任选取代的烷基、环烷基、烯基、环烯基、炔基、环炔基、芳基或杂芳基。在具体实施方案中，胺指NH₂、NH(烷基)、NH(芳基)、N(烷基)₂、N(烷基)(芳基)和N(芳基)₂中的任何一种。

如本文所用，术语“取代的”是指所指的基团(例如，烷基、芳基等)包含取代基。如本文所用的术语“任选取代的”是指所指的基团(例如烷基、环烷基等)可以或可以不被一个或多个另外的基团取代。

术语“溶剂化物”是指通常通过溶剂化反应与溶剂结合的化合物形式。这种物理结合可能包括氢键。常规溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、二乙醚等。合适的溶剂化物包括药学上可接受的溶剂化物，还包括化学计量的溶剂化物和非化学计量的溶剂化物。在某些情况下，溶剂化物能够被分离，例如，当一种或多种溶剂分子被结合到结晶固体的晶格中时。“溶剂化物”包括溶液相和可分离的溶剂化物。代表性的溶剂化物包括水合物、乙醇盐和甲醇盐。

术语“水合物”是指与水结合的化合物。通常，化合物的水合物中所含水分子的数量与水合物中化合物分子的数量成一定比例。因此，化合物的水合物可以由例如通式R.xH₂O表示，其中R是化合物，并且其中x是大于0的数。给定的化合物可以形成一种以上的水合物，包括例如一水合物(x为1)、低水合物(x为大于0且小于1的数，例如半水合物(R.0.5H₂O))和多水合物(x为大于1的数，例如二水合物(R.2H₂O)和六水合物(R.6H₂O))。

术语“互变异构体”是指特定化合物结构的可互换形式，并且氢原子和电子的位移变化的化合物。因此，通过电子和一个原子(通常是氢)的运动，两个结构可能处于平衡状态。例如，烯醇和酮是互变异构体，因为它们通过酸或碱处理而迅速相互转化。互变异构的另一个例子是同样通过酸或碱处理形成的苯硝基甲烷的aci-和nitro-式。互变异构形式可能与目标化合物的最佳化学反应性和生物活性的获得有关。

还应当理解，具有相同分子式但其原子的键合性质或顺序或原子在空间的排列不同的化合物被称为“异构体”。空间原子排列不同的异构体称为“立体异构体”。

彼此不为镜像的立体异构体被称为“非对映体”，而彼此为非重叠镜像的那些被称为“对映体”。当化合物具有不对称中心，例如它键合到四个不同基团时，可能存在一对对映异构体。对映体可通过其不对称中心的绝对构型来表征并且通过Cahn和Prelog的R-和S-序列法则来描述，或者通过分子旋转偏振光平面的方式来描述，并被指定为右旋或左旋(即分别为(+)或(-)异构体)。手性化合物可以以单独的对映体或以其混合物存在。含有等比例对映体的化合物被称为“外消旋化合物”。

术语“多晶型”是指以特定晶体堆积排列的化合物(或其盐、水合物或溶剂化物)的晶体形式。所有的多晶型都有相同的元素组成。不同的晶体形式通常具有不同的X射线衍射图、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光学和电学性质、稳定性和溶解性。重结晶溶剂、结晶速率、储存温度和其他因素可能导致一种晶型占主导地位。化合物的各种多晶型可以通过在不同条件下结晶来制备。

术语“前药”是指这样的化合物(包括本文所述的化合物的衍生物)，所述化合物具有可裂解基团，并且通过溶剂化或在生理条件下变为在体内具有药物活性的本文所述的化合物。

如本文所用，“衍生物”是指具有与化合物相同或相似的核心结构但具有至少一个结构差异(包括取代、缺失和/或添加一个或多个原子或官能团)的任何化合物。术语“衍生物”并不意味着该衍生物是由作为起始材料或中间体的母体化合物合成的，尽管情况可能如此。

术语“代谢物”包括一旦施用给受试者，即可在体内转化成如本文所述的化合物的任何化合物。

术语“受试者”可以指动物，并且可以包括例如家养动物(例如猫、狗等)、牲畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验动物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)、哺乳动物、非人哺乳动物、灵长类动物、非人灵长类动物、啮齿动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类和任何其他动物。在一个特定的实施例中，所述受试者是人。

术语“施用”是指将本发明化合物或其药物组合物以植入、吸收、摄入、注射、吸入或其他方式引入受试者体内或受试者身上。

术语“治疗”是指逆转、减轻、延迟本文所述的“病理状况”(例如，疾病、病症或病况，或其一种或多种病征或症状)的发生或抑制其进展，例如真菌或原生动物感染。在一些实施方案中，可以在一种或多种病征或症状已经发展或已经观察到之后进行治疗。在其他实施方案中，可以在没有疾病或病况的病征或症状的情况下进行治疗。例如，可以在症状发作之前对易感个体进行治疗(例如，根据症状史和/或根据暴露于病原体的情况)。在症状消失后，也可以继续治疗，例如，延迟或防止复发。

术语“病况”、“疾病”和“病症”可互换使用。

本文所述的化合物或组合物的“治疗有效量”是在病况的治疗中足以提供治疗益处的量或足以延迟或最小化与病况相关的一种或多种症状的量。化合物或组合物的治疗有效量意味着治疗药剂单独或与其他疗法组合时在病况的治疗中提供治疗益处的量。术语“治疗有效量”可以包括改善整体治疗、减少或避免病况的症状或病因、或增强另一种治疗剂的治疗效果的量。

本文描述的化合物或组合物的“预防有效量”是足以预防病况或与病况相关的一个或多个症状或预防其复发的量。化合物的预防有效量意味着单独或与其他药剂组合的治疗剂在病况的预防中提供预防益处的量。术语“预防有效量”可以包括改善总体预防或增强另一种预防剂的预防效果的量。

如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载体的组合，使得该组合物适用于体内、体外或离体的诊断或治疗用途。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指任何标准的药用载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(例如，油/水或水/油乳剂)和各种类型的湿润剂。该组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。例如载体、稳定剂和佐剂。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的任何药学上可接受的盐(例如酸或碱)，当给药于受试者时，其能够提供本发明的化合物或其活性代谢物或残基。如本领域技术人员所知，本发明化合物的“盐”可以衍生自无机或有机酸和碱。酸的例子包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其它酸，如草酸，虽然本身不是药学上可接受的，但可用于制备盐，所述盐可用作获得本发明化合物及其药学上可接受的酸加成盐的中间体。

术语“样品”或“生物样品”是指包括组织样品(例如组织的组织切片和针活检)；细胞样品(例如，通过显微切割获得的细胞学涂片或细胞样品)；完整生物体的样品；或细胞部分、片段或细胞器(例如通过裂解细胞并通过离心或其他方式分离其组分而获得的)的任何样品。生物样品的其他例子包括血液、血清、尿液、精液、粪便、脑脊液、组织液、粘液、泪液、汗液、脓液、活检组织(例如，通过外科活检或针活检获得的)、乳头抽吸物、乳汁、阴道液、唾液、拭子(例如口腔拭子)，或任何来自第一生物样品的含有生物分子的材料。生物样品还包括那些转基因的生物样品，如转基因卵母细胞、精子细胞、胚泡、胚胎、胎儿、供体细胞或细胞核。

本文所用的术语“放射性致敏剂”是指一种化合物或组合物，当其以治疗有效量被施用于受试者时，可增加细胞对电离辐射的敏感性和/或促进对可用电离辐射治疗的疾病的治疗。

在一些实施例中，放射性疗法的非限制性实施例包括外照射放射疗法(EBRT或XRT)、远距离放射疗法、近距离放射疗法、密封源放射疗法、全身放射性同位素疗法(RIT；也称为SRT)、非密封源放射疗法、术中放射疗法(IORT)、靶向术中放射疗法(TARGIT)、强度调制放射疗法(IMRT)、体积调制电弧疗法(VMAT)、粒子疗法和俄歇疗法。

本文所用的术语“化学致敏剂”是指一种化合物或组合物，当其以治疗有效量被施用于受试者时，可增加细胞对化疗的敏感性和/或促进可用化学疗法治疗的疾病的治疗。

本文所用的术语“荧光染料”是指在特定激发波长下吸收光能并在不同波长下发射光能的部分。

在一个实施例中，如本文所用的术语“放射性化学物质”是指包含共价连接的放射性同位素、无机放射性离子溶液或放射性气体的有机、无机或有机金属化合物，特别包括对患者施用的(例如，通过吸入、摄入或静脉注射)用于组织成像目的的放射性分子成像探针，其在本领域中也被称为放射性药物、放射性示踪剂或放射性配体。

术语“放射性同位素”或“放射性元素”是指表现出放射性衰变(即，发射正电子)的同位素和包含放射性同位素的放射性标记剂。

同位素或元素在本领域中也被称为放射性同位素或放射性核素。

放射性同位素在本文中使用元素名称或符号及其质量数的各种常用组合来命名(例如，¹⁸F、F-18或氟-18)。放射性同位素的非限制性实施例包括I-124、F-18氟化物、C-11、I-123、I-124、I-127、I-131、Br-76、Cu-64、Tc-99m、Y-90、Ga-67、Cr-51、Ir-192、Mo-99、Sm-153和Tl-201。放射性同位素的其它实施例包括：As-72、As-74、Br-75、Co-55、Cu-61、Cu-67、Ga-68、Ge-68、I-125、I-131、In-111、Μn-52、Pb-203和Ru-97。

如本文所用，术语“治疗诊断”是指特定疗法和诊断的组合。

如本文所用，结合测得量，术语“约”是指本领域技术人员进行测量并采取与测量目的和所用测量设备的精度相当的谨慎程度所期望的被测量的量的正常变化。除非另有说明，否则“约”指的是所提供值的+/-10％的变化。

总的来说，本文描述了如方案(I)所示的新的生物还原活化产品的开发

它们的合成方法、组合物及其在肿瘤(肿瘤疾病)和其它显示低氧的病理生理学疾病(例如糖尿病、中风、心肌梗塞、脑震荡和炎性病况)中的治疗和诊断(治疗诊断)成像和映射细胞/组织低氧中的应用。

在一些实施例中，本文开发的分子是与金属螯合物配位或不配位的基于替拉扎明(TPZ)和基于硝基咪唑核苷的叠氮化物和炔属衍生物及其大环类似物。当这些分子与“报告”实体“点击”时，促进了癌性肿瘤区域中分子和细胞低氧的细胞和分子映射。所述分子还揭示低氧程度、在低氧条件下表达并与生物还原药物缀合的蛋白质的鉴定、以及治疗前后患病细胞内生物还原药物的积累程度，以及在低氧条件下表达的与所述分子结合的蛋白质的鉴定。

在一种情况下，当这些化合物(方案2)在低氧细胞中被还原时，通过点击化学原位结合生物素炔，这可以方便地通过非侵入性荧光或光学成像来成像。点击试剂包括生物素炔、生物素叠氮化物、链霉亲和素、任何适当衍生的荧光或光学“报告分子”、放射性的、磁共振敏感的或任何其它可报告的探针化学物或配位金属。在低氧细胞中，我们的分子选择性地与细胞质大分子、细胞核、核仁和线粒体内容物进行不可逆共价结合，展示了一种高度创新和商业上可行的技术，当进行点击化学时，可在体外以及体内在临床前和可能的医学成像中对细胞、细胞核、核仁内的低氧进行映射和成像。该技术快速、简单，且不似基于吡莫尼唑的免疫组织化学(IHC)染色那样涉及任何二级抗体。

在另一种情况下，这些化合物可以通过化学反应被放射性或非放射性金属(过渡或非过渡)标记，其可以通过医学成像技术在体内被检测，例如通过将这些分子与钆配位的磁共振成像(MRI)，使用镓-68的正电子发射断层扫描(PET)成像，和例如使用锝-99m的单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像。一旦被生物还原地活化，这些分子还赋予低氧选择性化疗性质、当与由光源活化的元素或化合物结合时的光动力疗法(PDT)、超声活化疗法(例如由声源活化)、放射疗法以及与常规放射疗法结合的放射致敏疗法。因此，在此提出的本发明提供了一种“单分子”方法，用于对低氧肿瘤进行有效的多模态非侵入性治疗。所述分子还可用于对其他几种表现出生理性低氧的疾病(包括糖尿病、炎性关节炎、厌氧菌感染、中风、脑外伤和移植排斥)进行成像，以及潜在的治疗。

在方案2中描述的化合物的一般结构包括生物还原活化(BA)部分衍生的无环分子，例如2/4/5-硝基咪唑(如在F-MISO中)，或被环状部分所取代，或被糖取代的部分(如在FAZA[取代或未取代]和IAZA[取代或未取代]中的戊糖，以及所有构型中的己糖、二糖和三糖；例如葡萄糖、半乳糖、果糖、其他取代部分)。根据本发明要求保护的其它BA臂的例子包括取代或未取代的苯并-1，2，4-三嗪-1，4-二氧化物(例如，取代的替拉扎明)；取代的苯并醌(例如在AQ4N中)，取代的三唑(如在HX4中)，它们的前体，和它们的衍生物。

方案2.本申请所述的化合物和取代基的通式1

含有上述生物还原活化分子的糖(所有构型)可进一步在2’和/或3’位被醚或酯部分所取代，并且在具有或不具有接头的糖的2’-或5’-OH被叠氮基/炔基/卤素/假卤素(F/I/OTosyl/ONosyl/OTriflyl/OMesyl)取代(方案2)；

连接到BA部分的无环或环状取代基进一步被R1取代，其中R1＝未取代的，或被一个或多个-OH基团取代的脂环、杂环或开链部分，其中一个或多个-OH基团被烷基、芳烷基醚、酯、胺或硫醇取代。剩余的游离-OH基团被-N₃/-CN/-SCN/-炔/取代的炔/取代的烷/烯烃/炔烃/烷氧基/烷氧基烷基/烷氧基烯基和烷氧基炔基链取代。

生物还原活化分子的例子包括硝基咪唑取代的、同或杂取代的无环或环状产物(例如叠氮基-AZA (ACN)、叠氮基-MISO(AMI)、含叠氮基的喹诺酮、三唑、四唑等)，和所有相关前体；在基于苯并三嗪-1，4-二氧化物的分子中，例子包括基于替拉扎明(TPZ)的无环或环状化合物，例如(C2/C4/C6葡萄糖取代的-TPZ)，以及合成相应卤代(F、Cl、Br、I、At)衍生物的所有相关前体。然而，所述生物还原活化分子并不限于这些类别。

方案3中描述了生物还原活化核的类别的非限制性实施例。

方案3.其中R₂是N₃、SCN、CN、炔烃(取代的或未取代的)、叠氮烯基/CN/SCN；n₁、n₂或n₃＝1-22

下面提供了通式1(方案3)所涵盖的合成的BA药物的类别的实施方案。

类别1:叠氮基或炔取代的α/β-AZA

在该类别下合成的化合物的实施例包括5’-叠氮基-阿拉伯呋喃糖基-2-硝基咪唑(ACN，化合物1)及其2’3’-2-O-新戊酰基类似物(化合物2)

方案4.作为该类别的代表的ACN(1)及其二新戊酰基类似物的合成方案

5’-叠氮基-1-α-D-(5’-叠氮基呋喃-2-硝基咪唑(ACN)的合成

ACN通过两种方法合成。

在一种方法(方案4中所示)中，将叠氮化钠(NaN₃，0.91g，10Eq，14.0mmol)和四正丁基溴化铵(TBAB，0.27g，0.6Eq，0.8mmol)加入到IAZA在DMF的溶液中，并在75℃下搅拌15小时。反应进程通过TLC监控。向反应混合物中加入水，并用乙酸乙酯(3×20mL)萃取粗产物。所有收集的有机层经Na₂SO₄干燥，并减压蒸发至干燥。使用二氯甲烷和甲醇以8∶2的比例作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱纯化获得的粗产物，得到浅黄色产物(70％)。

或者，将AZA-甲苯磺酸酯(0.028g，0.07mmol，1eq)和叠氮化钠(0.0455g，0.70mmol)溶解在DMSO(5mL)中，并加热至50℃过夜(16h)。将反应混合物冷却至22-25℃后，加入水(10mL)以淬灭反应，产物在乙酸乙酯(3×10mL)中萃取。合并的有机萃取物用无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发，得到13mg(0.048mmol，69％收率)ACN。¹H NMR(498MHz,CD₃OD)δ7.66(dd,J＝1.3,0.5Hz,1H,咪唑H-5),7.13(d,J＝1.3Hz,1H,咪唑H-4),6.46(d,J＝1.4Hz,1H,H-1’),4.60–4.51(m,1H,H-2’),4.29(dd,J＝2.0,1.5Hz,1H,H-3’),4.07(t,J＝2.3Hz,1H,H-4’),3.64(dd,J＝12.9Hz,7.4Hz,1H,H-5’),3.48(dd,J＝12.9,7.4Hz,1H,H-5’),ppm；¹³CNMR(101MHz,CD₃OD)δ144.00(咪唑C-2),127.98(硝基咪唑C-4),125.04(硝基咪唑C-5),96.76(C-1’),89.69(C-2’),83.50(C-3’),78.33(C-4’),53.57(C-5’)ppm；HR-MS(ESI):m/z:293.0599[M+Na]+。

类别II：叠氮基或炔基取代的苯并-1，2，4-三嗪-1，4-二氧化物

子类别II.1.

在该类别下合成的化合物的实施例包括3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙基)氨基-1，2，4-苯并三嗪1，4-二氧化物(AEEA-TPZ；3，其中Nu＝-N₃)和相关衍生物，其中X＝-CN、SCN、炔-取代的或未取代的，但不限于这些部分(方案1)。化合物3的表征数据如下。

方案5.化合物3的合成方案

3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙基)氨基-1，2，4-苯并三嗪-1，4-二氧化物(ATZ；3)的合成

将8(100mg，0.24mmol)和NaN₃(46.4mg，0.71mmol)在DMF(2mL)中的溶液在100℃加热1小时。用冷H₂O(20mL)使溶液淬灭，并在CH₂Cl₂(2x 20mL)中萃取。减压浓缩有机层，粗残余物用色谱法纯化(10:1EtOAc–CH₃OH,v/v)得到ATZ,3(59.6mg,86％)为红色固体；¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δH)8.33–8.22(m,2H,Ar),7.84(ddd,J＝8.6,7.0,1.3Hz,1H,Ar),7.48(ddd,J＝8.7,7.0,1.2Hz,1H,Ar),3.81(q,J＝5.3Hz,2H,CH2),3.73(t,J＝4.8Hz,2H,CH2),3.70–3.64(m,2H,CH2),3.40–3.33(m,2H,CH2)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃,δC)149.77,138.29,135.74,130.52,127.27,121.59,117.42,70.09,69.24,50.60,41.21.

子类别II.2.在该子类别下合成的化合物的例子包括在C6位置通过接头缀合至1,2,4-苯并三嗪1,4-二氧化物(或如方案3中所述的其它生物还原部分)的各种糖和相关衍生物，所述接头被取代至“映射”或“治疗”臂(G6-A-TPZ；方案6方案，其中Nu＝-N3)，其中X＝-CN、-SCN、炔-取代的或未取代的，但不限于这些部分(方案3)。化合物17(G6-A-TPZ)的表征数据如下。

试剂和条件:(a)(TfO)₂O,DIEA,DCM,–40℃,30min,(b)22,5h；H₂O,经过两个步骤82％；(c)BrCH₂COOtertBu,DIEA,DCM,过夜,67％；(d)TsCl,DCM,DMAP,Et₃N,1h,83％；(e)Pd/C,H₂,DCM/MeOH,过夜；(f)Ac₂O,吡啶,2h,经过两个步骤87％；(g)NaN₃ DMF,80℃,1h；(h)TFA-DCM(1:1),2h,经过两个步骤79％；(i)23,EDC,HOBt,DCM,DIEA,4h,84％；(j)CH₃ONa,DCM/MeOH,30min；(k)酸性树脂处理,经过两个步骤71％。

方案6.作为子类别II.2的代表的化合物17的合成方案。

化合物17的合成

化合物17：使用合成试剂和条件进行多步骤合成以71％的产率获得化合物17。HRMS(ESI)用于(M+Na)⁺C₂₃ H₃₅ N₉ Na O₈:计算值588.2501.检测值：588.2495.HRMS(ESI)计算值(M+H)⁺C₂₃ H₃₆ N₉ O₈:566.2681.检测值：566.2673.

子类别II.3.在该子类别下合成的化合物的实施例包括在C6位置通过接头缀合至1，2，4-苯并三嗪1，4-二氧化物(或如方案3中所述的其它生物还原部分)的各种糖和相关衍生物，所述接头被取代至“映射”或“治疗”臂(G2-A-TPZ；方案7方案)，其中X＝-CN、-SCN、炔-取代的或未取代的，但不限于这些部分(方案3)。化合物19(G2-A-TPZ)的表征数据如下。

试剂和条件:(a)Tf₂O,DIEA,DCM,–40℃,30min；(b)22,5h；H₂O,82％；(c)BrCH₂COOtertBu,DIEA,DCM,过夜,67％；(d)TsCl,DCM,DMAP,TEA,1h,74％；(e)Pd/C,H₂,DCM/MeOH,过夜；(f)Ac₂O,吡啶,2h,经过两个步骤73％；(g)NaN₃ DMF,60℃,1h；(h)TFA-DCM(1:1),2h,经过两个步骤85％；(i)23,EDC.HCl,HOBt,DCM,DIEA,4h,64％；(j)CH₃ONa,DCM/MeOH,30min,68％。

方案7.作为子类别II.3的代表的化合物19(G2-A-TPZ)的合成方案。

化合物19：使用图7所述的合成试剂和条件进行多步合成，以68％的产率获得该化合物。HRMS(ESI)用于(M+Na)⁺C₂₅ H₃₉ N₉ Na O₈:计算值632.2763。检测值：632.2757.HRMS(ESI)计算值(M+H)⁺C₂₅ H₄₀ N₉ O₈:610.2944.检测值：610.2936。

在一个实施例中，下面提供了在该类别下合成的(放射性)药物的通式。

方案8.化合物及其取代基的通式2

要求保护的化合物的实施例包括与硝基咪唑核苷和苯并三嗪-1,4-二氧化物缀合的DOTA类化合物作为代表。

类别III：大环配体-缀合的-生物还原活化药物

作为该类别药物的实施例，叠氮基-AZA与炔基化的DOTA大分子的偶联如下图所示。

试剂和条件:(i)叠氮化物-炔烃偶联；(ii)2当量NaOH,THF,2h,用1M HCl酸化(iii)金属配位的例子为GaCl₃,0.1M乙酸钠缓冲液(pH～5.0),100℃,1h.

方案9.通式2化合物的合成路线；以炔基化的DOTA大分子和叠氮基-AZA大分子(12)的偶联为例

实施例1：通过炔基化的DOTA大分子和叠氮基-AZA分子的偶联合成5’-脱氧-5’-([4-{2，2’，2”-(10-(2-(丁-3-炔-1-基氨基)-2-氧代乙基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三基)三乙酸}-1，2，3，-三唑)-AZA(DOTA-三唑-AZA；化合物8)。

向搅拌的在叔丁醇中的2,2’,2”-(10-(2-(丁-3-炔-1-基氨基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸(0.016g，0.03mmol，1.2eq)和(3S，4R)-2-(叠氮甲基)-5-(2-硝基-1H-咪唑-1-基)四氢呋喃-3,4-二醇和1(叠氮基-AZA，0.010g,0.03mmol,1eq)的混合溶液中加入硫酸铜(CuSO₄ 5H₂O,0.002g,0.01mmol,0.5eq)和抗坏血酸钠(0.008g,0.04mmol,1.1eq)的水溶液，并在室温(22℃)下搅拌5小时。通过薄层色谱法监测反应进程。粗产物通过硅胶柱色谱纯化，使用8∶2比例的DCM和甲醇作为洗脱剂，以获得浅黄色固体形式的所需化合物8(产率:34％)。本文提供的各种光谱分析证实了纯化产物的同一性。¹H NMR(400MHz,D₂O)δ7.59(s 1H),7.17(s,2H),6.29(s,1H),4.51-4.49(t,J＝7.19Hz,1H),4.75-4.73(t,J＝7.19Hz,1H),3.96-3.94(m,2H),3.72-3.69(m,2H)3.43-3.41(t,J＝6.92Hz,2H),3.30(s,8H),2.09-2.05(m,2H),2.46-2.41(m,18H)；¹³C NMR(100MHz,D₂O)δ177.41,170.74,154.67,130.76,129.92,129.25,122.90,92.07,89.21,77.04,72.94,60.50,59.51,55.94,55.52,54.67,39.63,29.04,28.73；HRMS(ESI⁺),(M+H)⁺计算值C₂₉H₄₆N₁₁O₁₂,740.3327；检测值,740.3315。

类别IV-放射性药物及其组合物

基于放射性配体的放射性药物的通式4。该类放射性药物的实施例包括其中分子与成像或放射治疗金属(例如^99mTc、Ga-68、Lu-177、Re-186等，但不限于这些金属)螯合。

方案10.通式4-属于类别IV的化合物的示意图和放射性标记方法

该类别化合物的选定代表如下所述。

DOTA-TPZ衍生物的^natGaIII复合物。将1mmol/0.5mL(pH 3.0)DOTA-TPZ衍生物的水溶液和Ga(NO₃)₃在5-mL小瓶中混合，并在95℃下在水浴中加热10分钟。通过质谱法确认GaIII复合物的形成。^natGa-DOTA-TPZ:HR-质谱(ESI+),(M)⁺计算值C₂₅H₃₄GaN₈O₉,659.1705；检测值,659.1701。

DOTA-TPZ衍生物的^natLuIII复合物。将1mmol/0.5mL(pH 3.0)DOTA-TPZ衍生物的水溶液和LuCl₃在5-mL小瓶中混合，并在95℃下在水浴中加热15分钟。通过质谱法确认LuIII复合物的形成。natLu-DOTA-TPZ:HR-质谱(ESI+),(M)⁺

¹⁷⁷Lu-DOTA-TPZ的放射性合成被描述为要求保护的化合物的代表性实施例。

¹⁷⁷Lu标记的DOTA-TPZ的合成。将¹⁷⁷Lu加入到合成的(100nmol)配体和0.2ml 1M的乙酸钠缓冲液(pH～5.0)的混合物中，并在铝加热块中在95℃下加热15分钟(图11)。标记完成后，将放射性标记的混合物通过氧化铝N-小柱(alumina N-light cartridge)(用10mL水预洗)，并用1mL盐水洗涤柱。收集标记产物，并通过ITLC-SG/0.1M Na₂CO₃缓冲液分析放射性化学纯度(图1)。游离的¹⁷⁷Lu+保留在原点，而标记的产物随溶剂前沿移动。

方案11.¹⁷⁷Lu标记的DOTA-TPZ分子的放射性合成

图中描绘了纯化前(A)和纯化后(B)的¹⁷⁷Lu-DOTA-TPZ的放射性色谱图

纯化前(左)和纯化后(右)的¹⁷⁷Lu标记的DOTA-TPZ的稳定性评价

¹⁷⁷Lu-DOTA-TPZ的稳定性:对¹⁷⁷Lu-DOTA-TPZ的评价表明，该产物在正常储存条件下(22℃；见图2)可保持>95％的纯度，并在多至24h的时间内保持稳定，从而证明其对所提出的治疗用途的适用性。

图2描述了¹⁷⁷Lu-DOTA-TPZ在制备的培养基中、在人血清和牛血清白蛋白中的稳定性研究。

¹⁷⁷Lu-DOTA-TPZ分配系数的测定:向Na₂HPO₄缓冲液(0.1M，pH 7.4，3g)加入辛醇(3g)，然后加入¹⁷⁷Lu-DOTA-TPZ(74kBq/2μL)，剧烈混合，离心(3000rpm，5min)。使用γ-闪烁计数器测量辛醇部分(0.5g)和0.1M Na₂HPO₄缓冲液部分(0.5g)中的放射性，并计算log P值(表1)。

¹⁷⁷Lu-DOTA-TPZ的血清蛋白结合的测定:用¹⁷⁷Lu-DOTA-TPZ进行人血清蛋白结合测定。通过将1.0mL 1％牛血清白蛋白装入0.1M二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)中来预处理PD-10柱，并用10mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗脱。将¹⁷⁷Lu-DOTA-TPZ(0.37MBq/50μL)与人血清(0.5mL)混合，并在37℃下孵育10min和60min。将每种混合物(0.074MBq/100μL)装载到预处理的PD-10柱上，并用PBS洗脱；在5-mL试管中每份样品收集30个级分(级分大小＝0.5mL)。使用γ-闪烁计数器测量每个级分的放射性，并以cpm(每分钟计数)表示。为了验证每个级分中蛋白质的存在，将来自每个试管的等分试样(2μL)点在滤纸上并用考马斯蓝染色。使用级分活性曲线计算¹⁷⁷Lu-DOTA-TPZ与蛋白质的结合百分比。与分配系数(logP)、蛋白质结合百分比、放射性化学物质产率和比活性相关数据总结在下表1中。

表1.放射性标记的¹⁷⁷Lu-DOPA-TPZ^a的分配系数、蛋白质结合、放射性化学物质产率和比活性

^a该值表示平均值±SD(n＝4)。

MRT、化学致敏疗法、放射性致敏疗法、俄歇疗法、PDT疗法、声学疗法、低氧成像

(a).分子成像包括荧光、光学、MRI、放射性PET和SPECT、和本发明化合物促进的其他方式(例如使用F-18、I-124、Ga-68的PET成像和例如使用I-131和I-123的SPECT，使用荧光染料的光学成像)；治疗用途包括本申请所述分子的化疗(如I-127、F-19和其他非放射性化合物)；俄歇疗法(I-125)、光动力疗法(PDT)、放射性致敏、声学成像和分子放射性疗法[MRT；I-131、Lu-177、Re-186(但不限于这些同位素)]，以及相关方法；

(b).上述分子的治疗用途(PET和SPECT成像、MRI、荧光、光学、PDT、放射性致敏、MRT)以及相关方法和益处。

生物学研究

已经使用本申请的代表性分子进行了基于体外细胞培养和基于体内载瘤-动物模型的低氧映射研究。与“点击映射”相关的研究和发现如下所述。

细胞培养

人头部和颈部鳞状细胞癌细胞系(FaDu)购自美国标准菌库(American TypeCulture Collection)(ATCC HTB-43)。FaDu细胞培养在添加有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和10％青霉素链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12培养基中。细胞在5％ CO₂的湿润培养箱中37℃培养。

1.ACN的评价

ACN的低氧细胞毒性和放射性致敏潜力评价

用集落形成试验评价ACN的低氧细胞毒性。将FaDu细胞接种在60mm玻璃培养皿(三组重复)上，密度为每板300个细胞。让细胞附着24小时，随后在常氧(20％ O₂)或低氧(1％O₂和<0.1％ O₂)下用新鲜溶解的1μM、10μM和100μMACN处理24小时；100μM DMSO作为媒介物对照。使细胞生长并形成集落14天。将集落用结晶紫染色，计数并绘制为媒介物条件的百分比；误差条表示平均值的标准误差。为了评估ACN的放射致敏潜力，将接种在60mm玻璃皿上的FaDu细胞(三组重复，按每板300至900个细胞的密度)附着24小时，然后在常氧或低氧(<0.1％ O₂)下用100μM的ACN或DMSO处理24小时。然后，对每种O₂条件照射一组板(5Gy)。IR(电离辐射)后1小时，低氧细胞被再次氧合，所有平板的培养基被更换，让细胞生长并形成集落14天。将集落用结晶紫染色，计数并绘制为媒介物(DMSO)对照的百分比；误差条表示平均值的标准误差。为了测试ACN是否影响细胞增殖，将接种在60mm玻璃培养皿上的约80万个FaDu细胞附着24小时，用100μM的ACN或DMSO处理，并在常氧和低氧(<0.1％ O₂)下孵育24小时。然后，对每种O₂条件照射一组板(5Gy)。IR后1小时，细胞被胰蛋白酶消化，计数，并按每孔50，000个细胞的密度接种于24孔板上(三组重复)。细胞在复板后1、3、5和7天进行胰蛋白酶消化，并用Z2 coulter颗粒计数器计数。

ACN原位低氧映射电位的评价：点击化学反应

点击化学反应

点击-IT反应混合物(分子探针)是根据制造商的说明，使用1:5000稀释的2mg/mlAlexafluor 555或594缀合炔烃原料(分子探针)制成的。反应混合物在制备后15分钟内使用。所有的反应都是在室温下黑暗中进行的。

叠氮基AZA (ACN)逆氧依赖性截留的体外验证

用胰酶消化半融合的FaDu细胞，并将大约3-5×10⁵个细胞接种在含有灭菌的18cm×18cm玻璃盖玻片的35mm组织培养板中。让细胞生长过夜，并在常氧(20％氧气)、低氧(1％氧气)或缺氧(0％氧气)下用不同浓度的ACN(1μM,10μM and 100μM)处理6小时。低氧和缺氧是通过室内脱气系统实现的。后处理，所有步骤在室温下进行。用1×PBS洗涤细胞3-5次，在2％多聚甲醛(PFA)中固定20分钟，再用1×PBS洗涤3次。然后将固定的细胞封闭，并用含1％的Triton-100的1X PBS中的1％BSA渗透20分钟，然后与含有Alexafluor 594缀合炔烃的点击混合物孵育30分钟。随后，洗涤细胞并用Hoechst 33342(在PBS中以1：10000稀释，LifeTechnologies)染色5分钟，然后将其固定在载玻片上(Fluoroshield Mounting Medium，abcam)。制备的载玻片保持在4℃直到成像。通过使用Zen 2011软件在Zeiss 710共聚焦显微镜上使用Plan-Apochromat 40X/1.3Oil DIC透镜获得图像。

ACN和吡莫尼唑体外低氧选择性摄取的比较

FaDu细胞在盖玻片上生长(如上所述)，并用100μMACN和100μM吡莫尼唑同时处理。随后将细胞暴露于常氧(20％氧气)、低氧(1％氧气)或缺氧(0％氧气)条件下6小时，并固定在2％PFA中。使用Alexafluor 647标记的二级抗体，如他处所述进行标准吡莫尼唑IHC。如前所述使用Alexafluor 555缀合炔烃进行点击化学，然后用Hoechst进行核染色。如前所述，将盖玻片固定在载玻片上成像。

再氧合后低氧细胞中ACN的保留分布：

在低氧下进行生物还原激活后，硝基咪唑活性物质(硝基自由基阴离子)与细胞亲核体结合以形成药物-蛋白加合物。为了评价这些加合物被代谢的速度，我们在常氧或低氧条件下用100μM的ACN处理FaDu细胞6小时，并将它们暴露于随后的再氧合。在再氧合0小时、1小时、3小时、6小时和18小时之后固定细胞。如前所述对固定细胞进行点击化学。

ACN作为低氧示踪剂的评价

根据CCAC指南使用并护理6周龄雌性BALB/c裸鼠(Charles RiverLaboratories)。我们使用了双侧皮下肿瘤模型，其中左侧肿瘤未经处理(对照)，右侧肿瘤作为“处理”组。我们在右上侧皮下注射6×10⁶Fadu细胞(在0.1ml无菌的0.9％NaCl中)，以形成明显的肿瘤。每天测量肿瘤，直到体积达到10mm3。将小鼠分成4组，并以0.15ml 0.9％的盐水腹腔内注射:1-80mg/Kg ACN，2-80mg/Kg吡莫尼唑(低氧探针)，3-80mg/Kg ACN:吡莫尼唑(比例为1:1)，和4-0.9％盐水对照。注射后2小时处死小鼠，取出肿瘤并在OCT中冷冻。对每个肿瘤取7微米连续切片，干燥并保存在-80℃。

ATZ作为低氧示踪剂的评价

按照与上文对ACN相同的方案对替拉扎明进行评价，但使用60mg/Kg的ATZ代替ACN。注射后2、4和18小时处死动物。

免疫荧光和点击化学

将组织切片空气干燥25分钟，在-20℃丙酮中固定5分钟；空气干燥25分钟，用1％BSA(在PBS中)封闭20分钟。切片在室温下与小血管内皮的初级抗体[1:100兔抗CD34(abcam)]或低氧[1:100兔抗吡莫尼唑低氧探针)孵育2小时，随后在1×PBS中洗涤3次，每次5分钟。将二抗(Alexafluor 647山羊抗兔1:1000分子探针，用1×DAPI对DNA染色)在37℃在室温下于黑暗中孵育30分钟，随后用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。点击-IT反应混合物与切片一起孵育30分钟。用1×PBS洗涤切片5次，持续5分钟，并使用Mowiol 4-88(Calbiochem)固定介质固定。载玻片在4℃下保存直至成像。通过使用Zen 2011软件在Zeiss 710共聚焦显微镜上使用Plan-Apochromat 10X/0.45数值孔径透镜通过平铺扫描获得图像。使用Adobe Photoshop将比例尺添加到图像上。

使用“点击映射”通过IAZA对放射性致敏疗法的体内评价

根据CCAC指南使用并护理6周龄雄性Nu/Nu小鼠(Charles River Laboratories)。FaDu细胞培养在添加有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基/F-12培养基中。我们在两侧皮下注射8X10⁶ FaDu细胞(在0.1ml无菌的0.9％NaCl中)，形成双侧明显的肿瘤。每天测量肿瘤，直到体积达到0.4cm3。用异氟醚麻醉小鼠进行治疗前MRI扫描，包括使用室内9.4特斯拉动物MRI扫描仪静脉注射0.3mmol/Kg的钆对比剂(Bayer)。在MR膛内使用热空气(MR-compatible Small animal Heating System,SA Instruments Inc.)在麻醉下保持体温。在整个扫描过程中，每五分钟监测并记录一次温度和呼吸(Smallanimal Monitoring and Gating System,SA Instruments Inc.)。第二天，给动物腹腔注射400mg/Kg IAZA(20％最大耐受剂量)或5％DMSO(在0.15ml无菌0.9％盐水中)。4到6小时后，每只小鼠用异氟醚麻醉，并置于Small Animal Radiation Research Platform(Xstrahl Life Sciences)。使用SSARP GUI软件对右侧肿瘤进行了CT扫描，并使用MuriSlice软件对其进行了注册和细化。将CT图像加载到MuriPlan软件中，创建并执行处理计划，向每只小鼠的右侧肿瘤提供单剂量的10Gy辐射(RT)。左侧肿瘤作为每只小鼠的未受辐射的内部对照。对动物进行多至16天的监测和肿瘤测量。RT后48小时进行治疗中MRI成像，当未放疗肿瘤(左侧)达到1cm3时进行治疗后MRI成像。治疗后MRI扫描后24小时，向小鼠腹腔内注射含60mg/Kg ACN的0.15ml 0.9％的盐水。注射后2小时处死小鼠，取出肿瘤并在OCT中冷冻。取每个肿瘤的7微米连续切片，干燥并保存在-80℃。

结果

ACN在FaDu细胞中不显示低氧-选择性致敏

在集落形成试验中，ACN(浓度高达100μM)不显示任何低氧选择性细胞毒性(图3A)。当用100μMACN和5Gy IR的组合处理FaDu细胞时，没有观察到低氧放射性致敏(图3B)。在细胞增殖试验中，与空白(分别为DMSO或DMSO+IR)对照相比，单独的ACN处理或与5Gy IR组合的ACN处理在细胞计数方面没有产生显著差异(图3C和3D)。

图3描述了ACN不显示低氧选择性致敏-ACN处理不影响常氧(20％ O₂)或低氧(1％O₂和<0.1％ O₂)FaDu细胞(A)的克隆形成潜能。低氧性FaDu细胞对IR有明显的抵抗作用；然而，当用100μMACN和5Gy IR(B)组合处理FaDu细胞时，没有观察到低氧放射性致敏。ACN单独处理(C)或与5Gy IR(D)的组合处理不改变FaDu细胞增殖。

ACN点击化学对缺氧细胞具有选择性

我们的测试化合物ACN以逆氧依赖性方式被截留在FaDu细胞中，其中在<0.1％ O₂下观察到最高的截留率。氧合良好或常氧的细胞显示很少或几乎没有截留(图4A-D)。ACN的叠氮化物部分和荧光团缀合炔烃之间的点击化学使我们能够使用荧光显微镜来鉴定化合物的低氧选择性截留。ACN还以剂量依赖的方式被截留在低氧细胞中，100μM浓度显示出最明显的差异(图4D)。

在用ACN处理的缺氧细胞中，我们看到类似内质网染色的结构，然而这需要进一步验证。在低剂量处理的细胞中，我们看到了可能是ACN的核仁定位。

图4描述了ACN的逆氧依赖性截留-在用DMSO(A)或不同浓度(1μM,10μM或100μM)的ACN(B-D)处理的固定FaDu细胞上的ACN点击化学表明，荧光信号仅存在于缺氧细胞中。在低氧(<0.1％ O₂)的100μMACN处理的细胞中观察到最高的点击信号。即使在最高的药物浓度下，常氧ACN处理的细胞也显示出最小至没有背景信号。Hoechst核染色显示为蓝色，点击化学反应显示为绿色。比例尺为20μm。

ACN和吡莫尼唑染色指示低氧细胞中可能的共定位：

在缺氧细胞中检测到ACN点击化学和吡莫尼唑免疫荧光染色，在常氧样本中检测到最小信号(图5)。低氧<0.1％ O₂细胞中的ACN显示出较高的核信号，而吡莫尼唑染色主要集中在细胞质中。

图5描述了ACN和吡莫尼唑之间低氧选择性摄取的比较-用ACN和吡莫尼唑(每种化合物100μM)处理的FaDu细胞进行的免疫荧光研究表明，在缺氧细胞中可以检测到ACN和吡莫尼唑。低氧(<0.1％ O₂)样品显示ACN有较高的核染色，而吡莫尼唑信号主要集中在细胞质中。Hoechst核染色显示为蓝色，点击化学反应显示为绿色，吡莫尼唑免疫染色显示为黄色。比例尺为20μm。

低氧细胞中的ACN-蛋白加合物可在常氧暴露后多至24小时被检测到：

在低氧后经受再氧合的FaDu细胞中，ACN-蛋白加合物的荧光信号随时间逐渐减弱(图6B)。在再氧合后多至6小时可以检测到信号，然而在经历18小时再氧合的样品中观察到非常微弱的信号。在它们的常氧对照组中观察到最低的背景(图6A)。

图6描述了再氧合后叠氮基AZA(ACN)在低氧细胞中的保留分布-在经ACN处理的FaDu细胞中，ACN点击化学信号可在再氧合后多至24小时内被检测到(B)。常氧对照组显示最低的背景。Hoechst核染色显示为蓝色，点击化学反应显示为绿色。比例尺为20μm。

ACN作为低氧示踪剂的评价

由点击化学反应限定的肿瘤低氧区域存在坏死的边缘区域，并且独立于脉管系统(图7A)。在FaDu异种移植物中的吡莫尼唑和Hoechst 33342也观察到类似的结果(McCall等人,Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.2012 84:393-399)吡莫尼唑免疫染色和点击化学确实如预期的那样共同定位于邻近坏死区域的低氧区域(图7B)。此外，点击化学提供了单步快速检测低氧的优势。在没有点击化学的情况下，吡莫尼唑免疫染色是相同的，这表明点击化学反应不会干扰免疫染色(图7B和C)。吡莫尼唑和CD34所用的第二抗体对肿瘤周围的组织存在非特异性染色(图7)。这再次说明了点击化学的优势。

总之，我们的化合物(ACN)与目前使用的低氧探针(吡莫尼唑)共定位于FaDu异种移植瘤的低氧区，但血管标记CD34不是。点击化学具有以下优于免疫染色的优点：特异性、快速(仅30分钟)、单步反应和无非特异性染色。

图7描述了点击化学限定的肿瘤的低氧区域-ACN：吡莫尼唑1:1注射动物的7微米系列肿瘤切片说明点击化学反应限定了低氧区域并与已知的低氧标记吡莫尼唑共定位。DAPI以蓝色显示，点击化学反应以绿色显示。红色在(A)中代表脉管系统，而在(B)和(C)中代表吡莫尼唑免疫染色。比例尺为1mm。

作为放射性致敏剂的IAZA的基于ACN的成像研究

放射疗法导致肿瘤缩小，但对肿瘤内的低氧没有明显的影响(图8)。这是预料之中的，因为低氧细胞更耐辐射，并且在该研究的短期内10Gy的单次剂量是有效的。单独使用IAZA对低氧没有影响，因为对照肿瘤和仅用IAZA治疗的肿瘤之间没有差异(图8和9)。据报道，IAZA对人和鼠癌细胞系具有低毒性，并被低氧细胞选择性吸收，这与我们的发现一致(Stypinski等人,Nuclear Medicine Communications 1999 20:559-567)。我们观察到IAZA和放射联合治疗的肿瘤中肿瘤缩小和低氧减少(图9)。尽管肿瘤在IAZA和放射治疗的联合作用下消退，但在同一动物身上对照肿瘤的存在并不允许我们追踪肿瘤以观察消退是否能持续任何时间。

图8描述了在对照(A)和辐射(10Gy)处理的荷FaDu肿瘤小鼠(B)中通过ACN映射对低氧区域的评价-同一动物的左侧(DMSO对照)和右侧(单剂量10Gy辐射)肿瘤的7微米系列切片表明，辐射可以缩小肿瘤，但不会影响肿瘤的低氧。DAPI以蓝色显示，点击化学反应以绿色显示，红色表示脉管系统。比例尺为1mm。

图9描述了在单独IAZA(B)和IAZA+辐射(10Gy)处理的荷FaDu肿瘤小鼠(B)中通过ACN映射对低氧区域的评价-同一动物的左侧(单独IAZA)和右侧(IAZA+单剂量10Gy辐射)肿瘤的七微米系列切片表明辐射和IAZA的组合缩小了肿瘤并减少了低氧。DAPI以蓝色显示，点击化学反应以绿色显示，以及红色表示脉管系统。比例尺为1mm。红色-CD34；绿色-点击，蓝色-DAPI

2.A-TPZ的评价

进行结晶紫染色(CVS)和集落形成试验(CFA)以检测A-TPZ的细胞毒性，并且进行点击化学以确定这些生物还原活化药物的低氧-选择性亚细胞定位。这些方法描述如下。

结晶紫染色(CVS)试验

将FaDu细胞(3000细胞/孔)接种在96孔微量滴定板上，并在37℃和5％ CO₂的条件下孵育过夜以附着于表面。第二天，用递增量的药物(1-100μM)处理细胞，并将平板在常氧(20％O₂)和低氧(0.1％ O₂)条件下孵育72小时。根据实验设置，设置无细胞的培养基(DMEM和低葡萄糖DMEM)作为背景。在所需的孵育期后，吸出培养基，让平板干燥几分钟，然后加入结晶紫溶液20分钟，以便对细胞染色。随后，丢弃染料，用水洗涤平板并让其干燥过夜。向孔中加入甲醇(150μL)并孵育20分钟，以便溶解晶体。使用ELISA板读数器在520nm波长下用分光光度法测量样品的吸光度。从其他吸光度结果中减去背景波长(仅培养基)的吸光度。

集落形成试验

将FaDu细胞(最佳密度范围为300-3000个细胞)接种在60mm的平板上，并在37℃和5％的CO₂条件下孵育过夜以附着于表面。然后用递增量的药物处理细胞，并将平板在常氧(20％O₂)和低氧(0.5％ O₂)条件下孵育24小时。更换培养基，平板再培养14天(37℃，5％CO2)，让集落生长。14天后，集落用结晶紫溶液染色并计数。

选择性亚细胞定位

将FaDu细胞(约50万个)接种在30mm培养皿中的盖玻片上，并在37℃和5％ CO₂的条件下孵育过夜以附着于表面。然后用递增浓度(1-30μM)的药物(在浓度为0.5M的DMSO中重建)处理细胞，并在常氧和低氧(<0.1％ O₂)条件下孵育24小时。处理后，用2％多聚甲醛固定细胞20分钟，然后在1％ BSA和0.1％ Triton-X-100中封闭和渗透20分钟。点击反应是根据制造商的说明，在Alexa 594炔烃存在下，使用Click-iT Cell Reaction Buffer Kit(Thermo Fisher Scientific,no:C10269)进行的。用Hoechst复染细胞核，并用共聚焦显微镜获得图像。

A-TPZ的剂量依赖性低氧选择性细胞毒性

如图10(i)所示，如通过CVS试验所评估的，在低氧水平(0.1％ O₂)下，A-TPZ显示出选择性细胞毒性，并且在常氧组观察到最小毒性。当与母体化合物TPZ相比时，A-TPZ显现出稍低的毒性(数据未显示)。这使得A-TPZ成为一个很好的研究模型，因为叠氮化物的修饰似乎没有显著改变母体化合物的毒性。在集落形成试验以及[图10(ii)]中观察到类似的趋势。

图10描述了A-TPZ的低氧选择性细胞毒性。如结晶紫染色试验(CVS)(A)和集落形成试验(CFA)(B)所示的A-TPZ处理的细胞的细胞毒性。在CVS试验(i)中，将FaDu细胞(3000个细胞/孔)接种在96孔板上并孵育过夜以粘附。然后用递增剂量的A-TPZ处理细胞，并将板暴露于常氧(20％ O₂)和低氧(0.1％ O₂)条件下72小时。将没有细胞的培养基(DMEM)设置为背景。处理后吸出培养基，然后加入结晶紫溶液对细胞染色。使用甲醇溶解晶体，分光光度法测量样品的吸光度。误差条表示平均值的标准误差。在CFA(ii)中，将FaDu细胞(最佳密度范围为300至3000个细胞)接种在60mm平板上，孵育过夜以粘附。第二天，用递增量的A-TPZ处理细胞，并将板暴露于常氧(20％ O₂)和低氧(0.5％ O₂)条件下24小时。更换培养基，并将平板孵育14天(37℃，5％ CO₂)，让集落生长。将集落用结晶紫溶液染色并计数。误差条表示平均值的标准误差。

低氧-选择性亚细胞定位

在A-TPZ和alexa-594炔烃之间进行的点击反应显示A-TPZ在暴露于低氧(<0.1O₂)的细胞中的选择性亚细胞定位[图11]。很明显，该药物显示出更多的细胞骨架染色，主要是核仁和核定位。观察到信号强度是剂量依赖性的[图11-B，C，D]。在常氧药物处理的细胞中没有观察到荧光[图11-A]，这证实了A-TPZ在还原时通过点击化学与炔烃(Alexa-594)结合，特别是原位与低氧细胞结合。由此证实了该化合物的选择性。总的来说，这似乎是监测TPZ摄取的有效方法。

图11显示A-TPZ点击化学显示低氧-选择性映射潜力，其是剂量依赖性的。将FaDu细胞接种在盖玻片上，孵育过夜以粘附。然后在常氧和低氧(<0.1％ O2)条件下用递增剂量的A-TPZ处理细胞24小时。将细胞固定在2％多聚甲醛中，使用Alexa 594炔烃在室温下进行点击化学反应30分钟。用Hoechst复染细胞核，用共聚焦显微镜获得图像。

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试剂盒

通过以试剂盒的形式提供用于本发明方法的化合物和/或组合物，可以方便地实施本发明的方法。这种试剂盒优选包含化合物和/或组合物。

如本文所用，术语“给受试者施用所述化合物的说明书”及其语法等价物包括使用试剂盒中所含的组合物治疗以病毒感染为特征的病况的说明书(例如，为主治医师提供了将患者特定特征与治疗过程相关联的剂量、施用途径、决策树)。本发明的化合物(例如，如以上结构和本文其它地方所示)可以包装成试剂盒，其可以包括给受试者施用所述化合物的说明书。

应当理解，下面的实施例仅仅用于说明的目的。因此，它们无论如何都不应当限制本发明的范围。

本文所描述的实施方案仅仅旨在作为实施例。本领域技术人员可对具体实施方案进行改变、修改和变化。权利要求的范围不应局限于本文所列具体实施方案，而应以符合本说明书整体的方式加以解读。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都表示本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且通过引用并入本文，如同每个单独的出版物专利或专利申请都被具体地和单独地表明通过引用并入一样。

如此描述本发明，显而易见的是，本发明可以以多种方式变化。这种变化不应被视为偏离本发明的精神和范围，并且对于本领域技术人员来说显而易见的所有这种修改都旨在包括在以下权利要求的范围内。

Claims (8)

1.下式的化合物或其任何药学上可接受的盐、立体异构体、放射性同位素或互变异构体，

其中R是H并且Nu是-N₃。

2.下式的化合物

3.一种放射性标记的化合物，其包含权利要求1-2中任一项所述的化合物，其中所述放射性标记方法是手动方法或自动方法。

4.一种药物组合物，其包含权利要求1-2中任一项所述的化合物或权利要求3所述的放射性标记的化合物和一种或多种惰性载体和/或稀释剂。

5.如权利要求1-2中任一项所述的化合物、权利要求3所述的放射性标记的化合物或权利要求4所述的药物组合物在制备用于受试者的成像剂中的用途。

6.如权利要求1-2中任一项所述的化合物、权利要求3所述的放射性标记的化合物或权利要求4所述的药物组合物在制备用于受试者的放射性致敏剂中的用途。

7.如权利要求1-2中任一项所述的化合物、权利要求3所述的放射性标记的化合物或权利要求4所述的药物组合物在制备用于受试者的化学致敏剂中的用途。

8.权利要求5-7中任一项所述的用途，其中所述受试者是人。