CN111356466A

CN111356466A - 腺病毒及其用途

Info

Publication number: CN111356466A
Application number: CN201880070184.5A
Authority: CN
Inventors: T·G·乌伊尔; S·罗伊; S·卡恩; J·H·H·V·屈斯泰
Original assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2017-10-31
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2038-10-30
Also published as: EA202091104A1; JP2021500911A; MX2020004492A; US20200323977A1; AU2018359492A1; BR112020007698A2; KR20200083510A; AU2018359492B2; IL274220A; US11872281B2; CA3079210A1; WO2019086450A1; EP3703722A1; JP7438943B2; EP3703722B1; CN111356466B; SG11202003200VA

Abstract

本文提供了腺病毒核酸序列和包含所述核酸序列的腺病毒载体。所提供的腺病毒载体可用于在受试者中诱导保护性免疫应答。

Description

腺病毒及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术。更具体地说，涉及腺病毒载体诸如复制缺陷型腺病毒载体在宿主中递送抗原并引发免疫应答的领域和用途。

背景技术

重组腺病毒载体广泛应用于基因治疗应用和疫苗。基于AdV-5载体的疫苗已显示出在多种动物模型中引发强有力的和保护性的免疫应答(参见例如WO 2001/02607；WO2002/22080；Shiver等人,Nature[自然]415:331(2002)；Letvin等人,Ann.Rev.Immunol.[免疫学年鉴]20:73(2002)；Shiver和Emini,Ann.Rev.Med.[医学年鉴]55:355(2004))。然而，基于重组AdV-5载体的疫苗的效用将可能受到人群中AdV-5特异性中和抗体(NAb)的高血清阳性率的限制。在小鼠、恒河猴和人的研究中，抗AdV-5免疫的存在已经显示出基本上抑制了基于AdV-5的疫苗的免疫原性。

一种在先前已被最常见的人腺病毒(例如AdV-5)感染或治疗的个体中规避预先存在的免疫性的有前景的策略涉及开发来自腺病毒血清型的重组载体，这些腺病毒血清型未遇到这种预先存在的免疫性。一种这样的策略是基于使用非人猿猴腺病毒，因为这些腺病毒通常不感染人并且在人样品中表现出低血清阳性率。非人猿猴腺病毒可应用于人类用途，因为已表明这些病毒可在体外感染人细胞(WO 2003/000283、WO 2004/037189)。

因此，本领域需要可大量生产的、在宿主中不会遇到预先存在的免疫、但仍具有免疫原性并能够诱导针对由插入载体中的异源核酸编码的抗原的强烈免疫应答的替代性腺病毒载体。

发明内容

本文提供了分离的核酸序列。这些分离的核酸序列编码与SEQ ID NO:1的氨基酸6-375具有至少98％的同一性的纤维多肽。在某些实施例中，该纤维多肽包含选自BB21纤维多肽(SEQ ID NO:1)、BB21纤维变体多肽(SEQ ID NO:58)或BB24纤维多肽(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。在某些实施例中，该分离的核酸序列进一步包含编码六邻体多肽的六邻体核酸序列，该六邻体多肽包含具有选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的六邻体高变区。在某些实施例中，该六邻体多肽包含选自BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

还提供了编码六邻体多肽的分离的核酸序列，该六邻体多肽包括具有选自SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。在某些实施例中，该六邻体多肽包含选自BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

本发明的实施例还包括由本发明的纤维核酸序列和六邻体核酸序列编码的分离的纤维多肽和六邻体多肽。

在某些实施例中，本文提供了分离的核酸，这些分离的核酸包含编码本文披露的六邻体多肽中的至少一种的六邻体核酸序列，以及编码本文披露的纤维多肽中的至少一种的核酸序列。在某些实施例中，本文提供了包含本文所述的分离的核酸的载体。在一个实施例中，该载体是病毒载体。在另一个实施例中，该载体是表达载体。在一个优选的实施例中，该载体是腺病毒载体。更优选地，该载体进一步包含转基因。

还提供了包含本文所述的载体的重组细胞。这样的细胞可以用于重组蛋白生产、重组蛋白表达，或载体或病毒颗粒的生产。还提供了生产载体的方法。这些方法包括(a)使本文披露的重组细胞在用于生产载体的条件下生长；以及(b)从该重组细胞中分离该载体。

在某些实施例中，提供了包含本文披露的载体的免疫原性组合物。还提供了在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，这些方法包括向该受试者施用本文披露的免疫原性组合物。

进一步提供了腺病毒载体，这些腺病毒载体包含(a)至少一个转基因插入位点；以及(b)编码纤维多肽的核酸序列，其中该纤维多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸6-375具有至少98％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，该纤维多肽包含选自BB21纤维多肽(SEQID NO:1)、BB21纤维变体多肽(SEQ ID NO:58)或BB24纤维多肽(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。在某些实施例中，腺病毒载体进一步包含编码六邻体多肽的六邻体核酸序列，该六邻体多肽包括具有选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。在某些实施例中，该六邻体多肽包含选自BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

进一步提供了腺病毒载体，这些腺病毒载体包含(a)至少一个转基因插入位点；以及(b)编码六邻体多肽的核酸序列，其中该六邻体多肽包括具有选自SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。在某些实施例中，该六邻体多肽包含选自BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

在某些实施例中，本文提供的腺病毒载体是复制缺陷型腺病毒载体(rAd)。在一个实施例中，腺病毒载体可以包含E1缺失。在某些实施例中，本文提供的腺病毒载体可进一步包含E3缺失。腺病毒载体可以是包含来自一种或多种猿猴腺病毒(SAdV)诸如黑猩猩腺病毒(例如ChAd3)、大猩猩腺病毒或恒河猴腺病毒(例如，rhAd51、rhAd52或rhAd53)的腺病毒核酸序列的猿猴腺病毒载体。腺病毒载体可以是包含来自一种或多种人腺病毒(例如，hAdV-4、hAdV-5、hAdV-26、hAdV-35)的腺病毒序列的人腺病毒载体。优选地，腺病毒载体是包含一个或多个人腺病毒核酸序列的嵌合腺病毒载体。人腺病毒核酸序列可以例如来自人腺病毒-4(hAdV-4)、人腺病毒-5(hAdV-5)、人腺病毒-26(hAdV-26)或人腺病毒-35(hAdV-35)。腺病毒载体可以例如包含人腺病毒-5(hAdV-5)E4 orf6和orf6/7。

在某些实施例中，转基因插入位点与反向末端重复序列(ITR)相邻。在某些实施例中，转基因在一个或多个转基因插入位点插入，这些转基因插入位点选自由E1缺失处或附近的转基因插入位点、E3缺失处或附近的转基因插入位点和邻近ITR的转基因插入位点(例如在E4区与右ITR(RITR)之间)组成的组。

在某些实施例中，本文提供的腺病毒载体包含选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55组成的组的核酸序列。

还提供了包含本文所述的腺病毒载体和药学上可接受的载剂的免疫原性组合物或疫苗。进一步提供了用于在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法。这些方法包括向该受试者施用本文披露的疫苗。进一步提供了生产疫苗的方法。这些方法包括将本文披露的腺病毒载体与药学上可接受的载剂组合。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前述发明内容以及本申请的优选实施例的以下详细描述。然而，应当理解，本申请不限于附图中所示的精确实施例。

图1显示由BB21.FLuc和BB24.FLuc诱导的细胞免疫应答。图1A显示实验设置，该设置也用于图2和图3所示的实验。图1B显示由Ad26.FLuc、BB21.FLuc和BB24.FLuc诱导的针对载体编码的抗原(即，Fluc，萤火虫萤光素酶)的细胞免疫应答的图，如通过干扰素γ(IFN-γ)ELISPOT分析所测定的。y轴显示每10⁶个脾细胞的点形成单位(SFU)的数量，虚线表示培养基刺激的95％百分位数。

图2显示由Ad4Ptr13-BB21.FLuc和Ad4.FLuc诱导的细胞免疫应答。该图显示由Ad26.FLuc、Ad4Ptr13-BB21.FLuc和Ad4.Fluc诱导的针对载体编码的抗原(即，Fluc)的细胞免疫应答，如通过IFN-γELISPOT分析所测定的。

图3显示由Ad4Ptr01-BB24.FLuc诱导的细胞免疫应答。该图显示由Ad26.FLuc和Ad4Ptr01-BB24.FLuc诱导的针对载体编码的抗原(即，Fluc)的细胞免疫应答，如通过IFN-γELISPOT分析所测定的。

图4显示由BB21.RSVF-2A-GLuc诱导的细胞和体液免疫应答。图4A显示实验设置，该设置也用于图5和图6所示的实验。图4B显示在用Ad26.RSVF-2A-GLuc以及用BB21.RSVF-2A-GLuc以三种不同的浓度(10⁸、10⁹和10¹⁰vp)或用Ad26.FLuc和BB21.FLuc以10¹⁰vp免疫后八周时进行的呼吸道合胞病毒中和试验(VNA)的结果。该图描绘以终点滴度(log₂)计算的针对呼吸道合胞病毒株A2(RSV A2)的VNA滴度。图4C显示由Ad26.RSVF-2A-GLuc和BB21.RSVF-2A-GLuc诱导的针对载体编码的抗原RSV F的细胞免疫应答，如通过IFN-γELISPOT分析所测定的。图4D显示由免疫后8周时免疫小鼠血清中的Ad26.RSVF-2A-GLuc和BB21.RSVF-2A-GLuc诱导的RSV F特异性IgG结合抗体滴度的图。该图描绘以终点滴度(log₁₀)计算的IgG ELISA滴度。

图5显示由BB24.RSVF-2A-GLuc诱导的细胞和体液免疫应答。图5A显示在用Ad26.RSVF-2A-GLuc、BB24.RSVF-2A-GLuc和Ad48.RSVF-2A-GLuc以三种不同的浓度(10⁸、10⁹和10¹⁰vp)或用Ad26.FLuc、BB24.FLuc和Ad48.FLuc以10¹⁰vp免疫后八周时进行的呼吸道合胞病毒中和试验(VNA)的结果。该图描绘以终点滴度(log₂)计算的针对RSV A2的VNA滴度。图5B显示由Ad26.RSVF-2A-GLuc、BB24.RSVF-2A-GLuc和Ad48.RSVF-2A-GLuc诱导的针对载体编码的抗原RSV F的细胞免疫应答，如通过IFN-γELISPOT分析所测定的。图5C显示由免疫后8周免疫小鼠血清中的Ad26.RSVF-2A-GLuc、BB24.RSVF-2A-GLuc和Ad48.RSVF-2A-GLuc诱导的RSV F特异性IgG结合抗体滴度的图。该图描绘以终点滴度(log₁₀)计算的IgG ELISA滴度。

图6显示由Ad4Ptr01-BB24.RSVF-2A-GLuc和Ad4Ptr13-BB21.RSVF-2A-GLuc诱导的细胞和体液免疫应答。图6A显示在用Ad26.RSVF-2A-GLuc、Ad4Ptr01-BB24.RSVF-2A-GLuc和Ad4Ptr13-BB21.RSVF-2A-GLuc以三种不同的浓度(10⁸、10⁹和10¹⁰vp)或用Ad26.FLuc、Ad4Ptr01-BB24.FLuc和Ad4Ptr13-BB21.FLuc以10¹⁰vp免疫后八周时进行的呼吸道合胞病毒中和试验(VNA)的结果。该图描绘以终点滴度(log₂)计算的针对RSV A2的VNA滴度。图6B显示由Ad26.RSVF-2A-GLuc、Ad4Ptr01-BB24.RSVF-2A-GLuc和Ad4Ptr13-BB21.RSVF-2A-GLuc诱导的针对载体编码的抗原RSV F的细胞免疫应答，如通过IFN-γELISPOT分析所测定的。图6C显示由免疫后8周免疫小鼠血清中的Ad26.RSVF-2A-GLuc、Ad4Ptr01-BB24.RSVF-2A-GLuc和Ad4Ptr13-BB21.RSVF-2A-GLuc诱导的RSV F特异性IgG结合抗体滴度的图。该图描绘以终点滴度(log₁₀)计算的IgG ELISA滴度。

图7显示在用腺病毒载体Ad4、Ad5、Ad26、Ad35、Ad49、BB21、BB24、Ad4Ptr13-BB21和Ad4Ptr01-BB24免疫的小鼠中诱导的同源和异源腺病毒中和滴度。

图8显示Ad5、Ad26、BB21、BB24、Ad4Ptr13-BB21和Ad4Ptr01-BB24在200个来自年龄为18-55岁、生活在美国(US)和欧盟(EU)的成人的人类群组血清样品中的血清阳性率。将这些血清中针对每种载体测得的中和滴度分成四个类别(<16(阴性)、16至300、300至1,000、1000至4000和>4000)，如在所示的图表中表示的。

图9显示质粒pBB21.dE1.dE3(SEQ ID NO:13)的示意图。

图10显示质粒pBB21.dE1.dE3.5IXP(SEQ ID NO:14)的示意图。

图11显示质粒pBB24.dE1.dE3(SEQ ID NO:15)的示意图。

图12显示质粒pBB24.dE1.dE3.5IXP(SEQ ID NO:16)的示意图。

图13显示质粒pAd4.5orf6(SEQ ID NO:18)的示意图。

图14显示质粒pAd4.Ptr01.BB24.5orf6(SEQ ID NO:21)的示意图。

图15显示质粒pAd4.Ptr13.BB21.5orf6(SEQ ID NO:22)的示意图。

图16显示BB21纤维(SEQ ID NO:1)、BB21纤维变体(SEQ ID NO:58)和BB24纤维(SEQ ID NO:2)的比对。

图17显示新型载体BB21.Fluc和BB24.Fluc在生产细胞系sPER.C6中的生产率。

图18显示新型衣壳嵌合载体Ad4Ptr13-BB21和Ad4Ptr01-BB24在生产细胞系sPER.C6中的生产率。

具体实施方式

本披露至少部分地基于分离和鉴定分入人腺病毒E种的新黑猩猩腺病毒分离株，以及构建和评价包含编码黑猩猩六邻体和纤维多肽的可变区的核酸的疫苗载体。本披露另外至少部分地基于嵌合腺病毒载体的产生，这些嵌合腺病毒载体包含：人腺病毒骨架，以及嵌合六邻体或纤维多肽序列或者黑猩猩六邻体或纤维多肽序列中的至少一种。这些腺病毒载体能够引发免疫应答，而且在人体中具有低血清阳性率。这些腺病毒载体可以被配制成疫苗并用于诱导针对感兴趣的特异性抗原的保护性免疫。

在背景技术和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献各自通过援引以其全文并入本文。包括在本说明书中的对文件、法案、材料、装置、制品等的讨论用于提供本发明的背景的目的。这种讨论不承认任何或所有这些事项形成关于所披露或要求保护的任何发明的现有技术的一部分。

除非另外定义，否则本文所用的所有科学和技术术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，本文所用的某些术语具有说明书中阐述的含义。

必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种”和“该”包括复数指示物。

除非另有说明，否则任何数值，诸如本文所述的浓度或浓度范围，应被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，数值典型地包括列举值±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样地，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。如本文所用，数值范围的使用明确地包括所有可能的子范围，该范围内的所有单个数值，包括值的这些范围内的整数和分数，除非上下文另有明确指示。

除非另外指明，否则在一系列要素前面的术语“至少”应被理解为指该系列中的每一个要素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验便确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等同方案。这些等同方案也旨在包括在本发明中。

如本文所用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或它们的任何其他变化，将被理解为意味着包括所述整数或整数组，而不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放性的。例如，包含元件的清单的组合物、混合物、工艺、方法、物品或设备不一定限制于仅那些元件，而可以包括不是此类组合物、混合物、工艺、方法、物品或设备明确列出的或固有的其他元件。此外，除非明确地说明是相反的，否则“或”是指包括在内的或，而不是指排他性的或。例如，以下项中的任一者满足条件A或B：A是真(或存在)并且B是假(或不存在)，A是假(或不存在)并且B是真(或存在)，以及A和B二者都是真(或存在)。

如本文所用，多个引用的要素之间的连接术语“和/或”应被理解为涵盖单独的和组合的选项两者。例如，当两种要素由和/或连接时，第一选项是指在不具有第二要素的情况下第一要素的应用。第二选项是指在不具有第一要素的情况下第二要素的应用。第三选项是指第一要素和第二要素一起的应用。这些选项中的任一个应被理解为属于该含义之内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。这些选项中的多于一个的同时应用也应被理解为属于该含义之内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

如本文所用，贯穿说明书和权利要求书所用的术语“由……组成”指示包括任何列举的整数或整数组，但不能将另外的整数或整数组添加至指定的方法、结构或组合物。

如本文所用，贯穿说明书和权利要求书所用的术语“基本上由……组成”指示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不实质性改变所指定的方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。

如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选哺乳动物，最优选人，其将或已经通过根据本发明实施例的方法接种。如本文所用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，更优选地是人。

词语“右”、“左”、“下”和“上”表示所参考的附图中的方向。

应当理解的是，当提及优选的发明的组分的规格或特征时，在此使用的术语“约”、“大约”、“总体上”、“基本上”、以及类似术语，指示描述的规格/特征不具有严格的界限或参数，并且并不从其排除功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员将理解的那样。在最低程度上，包括数值参数的此类引用将包括将不改变最低有效位数的变化，使用本领域接受的数学的和产业的原理(例如化整误差、测量误差或其他系统误差、制造公差等)。

在两个或更多个核酸或多肽序列(例如六邻体和纤维多肽以及编码它们的多核苷酸)的上下文中，术语“相同的”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查所测量的。

对于序列比较，典型地，一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机；如果需要，指定子序列坐标；以及指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的类似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实现形式(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，威斯康星遗传学软件包(WisconsinGenetics Software Package),遗传学计算机课题组(Genetics Computer Group),威斯康星州麦迪逊科学大道575号(575Science Dr.,Madison,WI))、或通过目视检查(一般参见Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验室指南],F.M.Ausubel等人编,Current Protocols[实验室指南],格林出版联合公司(Greene PublishingAssociates,Inc.)和约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)的合资公司,(1995年增刊)(Ausubel))来进行。

适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST2.0算法，这些算法描述于Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，这些序列对匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻近字分值阈值(Altschul等人，同上)。这些初始的邻近字命中将作为种子，以用于启动搜索以发现包含它们的更长的HSP。然后，只要累积比对得分可以增加，字命中就沿着每个序列在两个方向上延伸。

对于核苷酸序列，累积得分使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)来计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当存在以下情况时，停止字命中在每个方向上的扩展：累积比对得分从其最大获得值下降数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用11的字长(W)、10的期望值(E)、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用3的字长(W)、10的期望值(E)和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915(1989))。

除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。

两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一个核酸编码的多肽与由第二个核酸编码的多肽具有免疫交叉反应性，如下所述。因此，例如，如果某多肽和第二多肽仅因保守取代而不同，则两种肽通常基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交，如下所述。

如本文所用，术语“保护性免疫”或“保护性免疫应答”是指该接种疫苗的受试者能够控制对其进行了疫苗接种的致病因子的感染。致病因子可以是例如抗原基因产物或抗原蛋白，或其片段。通常，已经出现了“保护性免疫应答”的受试者仅出现轻度至中度临床症状或根本没有症状。通常，对某种因子具有“保护性免疫应答”或“保护性免疫”的受试者不会由于所述因子的感染而死亡。

术语“佐剂”定义为一种或多种引起免疫系统刺激的物质。在此上下文中，使用佐剂来增强对本发明的腺病毒载体的免疫应答。

如本文所用，术语“抗原基因产物或其片段”或“抗原蛋白”可包括细菌、病毒、寄生虫、或真菌蛋白、或其片段。优选地，抗原性蛋白或抗原性基因产物能够在宿主中产生保护性免疫应答，例如诱导针对疾病或感染(例如细菌、病毒、寄生虫或真菌疾病或感染)的免疫应答，和/或在受试者中产生针对疾病或感染的免疫(即，接种疫苗)，其保护受试者抵抗疾病或感染。

腺病毒载体

暴露于某些腺病毒已经导致针对某些腺病毒血清型的免疫应答，这可以影响腺病毒载体的功效。因为人腺病毒感染在人类中是常见的，所以在人群中抗人腺病毒的中和抗体的流行率高。预计个体中存在这种中和抗体会降低基于人腺病毒骨架的基因转移载体的功效。一种避免功效降低的方法是替换腺病毒衣壳蛋白上的表位，这些表位是中和抗体的靶标。衣壳蛋白上的靶序列可以用来自其他腺病毒的蛋白序列替换，这些腺病毒具有低流行性，并因此而言，针对这些腺病毒的中和抗体在人群中很少。

“衣壳蛋白”是指腺病毒衣壳上的蛋白(例如BB21、BB24、HAdV-4)或其功能片段或衍生物，其参与确定特定腺病毒的血清型和/或向性。衣壳蛋白典型地包括纤维蛋白、五邻体蛋白和/或六邻体蛋白。在某些实施例中，衣壳蛋白是腺病毒的完整或全长衣壳蛋白。在其他实施例中，衣壳蛋白是腺病毒的全长衣壳蛋白的片段或衍生物。在某些实施例中，由本发明的腺病毒载体编码的六邻体、五邻体和纤维具有相同或不同的腺病毒背景(即，BB21六邻体和BB21纤维、BB24六邻体和BB24纤维、PrtoAdV-1六邻体和BB21纤维变体、PtroAdV-13六邻体和BB24纤维等)。

“六邻体多肽”指腺病毒六邻体外壳蛋白、其功能片段和衍生物。

“纤维多肽”指腺病毒纤维蛋白、其功能片段和衍生物。

针对腺病毒的中和抗体的一个靶标是主要外壳蛋白，即六邻体蛋白。用来自人群中罕见的腺病毒的六邻体蛋白或六邻体蛋白内的可变序列，诸如本文所述的那些黑猩猩腺病毒序列，替换六邻体蛋白或六邻体蛋白内的定义血清型并与中和抗体结合的可变序列，可以允许构建对通常在人中发现的抗体的中和不太敏感的腺病毒载体。

针对腺病毒的中和抗体的第二个靶标是纤维蛋白。用来自人群中罕见的腺病毒的纤维蛋白或纤维蛋白内的可变序列，诸如本文所述的那些黑猩猩腺病毒序列，替换纤维蛋白或纤维蛋白内的可变序列，也可以允许构建对通常在人中发现的抗体的中和不太敏感的腺病毒载体。上述纤维替换与六邻体替换的组合可赋予对通常在人中发现的抗体的中和的额外抗性。

本披露提供了编码六邻体多肽和/或纤维多肽的分离的和嵌合的核酸序列，这些六邻体多肽和/或纤维多肽源自分离的人和猿猴腺病毒血清型；以及包含分离的和/或嵌合的核酸序列中的至少一种的腺病毒载体。

“腺病毒载体”指衍生自或包含腺病毒基因组的至少一部分的重组载体。

在优选的实施例中，分离的核酸序列编码与SEQ ID NO:1的氨基酸6-375具有至少98％同一性的纤维多肽。在某些实施例中，分离的核酸序列编码与SEQ ID NO:1的氨基酸6-375具有至少99％同一性的纤维多肽。在某些实施例中，分离的核酸序列编码与SEQ ID NO:1具有至少98％、99％同一性的纤维多肽。纤维多肽可例如包含选自BB21纤维多肽(SEQ IDNO:1)、BB21纤维变体多肽(SEQ ID NO:58)或BB24纤维多肽(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。在某些优选的实施例中，分离的核酸序列进一步包含编码六邻体多肽的核酸序列，该六邻体多肽包括含有选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的含六邻体多肽高变区多肽。六邻体多肽可例如包含选自BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ IDNO:6)的氨基酸序列。

在优选的实施例中，分离的核酸序列编码六邻体多肽，该六邻体多肽包含构成含六邻体多肽高变区多肽的多肽序列，其中，该含六邻体高变区多肽包含选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在某些实施例中，六邻体多肽包含选自BB21六邻体多肽(SEQID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

在优选的实施例中，提供了分离的核酸，其包含编码至少一种本文披露的六邻体多肽的六邻体核酸序列和编码至少一种本文披露的纤维多肽的核酸序列。

在优选的实施例中，提供了载体，优选腺病毒载体，其根据本发明的实施例包含编码六邻体多肽的分离的核酸序列和/或编码纤维多肽的分离的核酸序列中的至少一种。腺病毒载体可以例如包含至少一个转基因插入位点；以及编码六邻体多肽和/或纤维多肽的核酸序列，其中六邻体多肽包括构成本文披露的含六邻体多肽高变区多肽的多肽，并且纤维多肽包括本文所述的纤维多肽。

典型地，本发明的腺病毒载体包含在例如质粒、粘粒或杆状病毒载体上的完整重组腺病毒基因组。本发明的核酸分子可以呈RNA形式或呈通过克隆而获得或以合成方式而产生的DNA形式。DNA可以是双链的或单链的。

普通技术人员将认识到，衍生自多种血清型的元件可以组合在单个腺病毒载体中，例如人或猿猴腺病毒。因此，可以产生组合了来自不同血清型的期望性质的嵌合腺病毒载体。因此，在一些实施例中，本发明的嵌合腺病毒载体可以将不存在预先存在的猿猴六邻体和/或纤维多肽序列免疫性与现有腺病毒载诸如rAd4、rAd5、rAd26或rAd35的高水平抗原递送和呈递能力相结合。

用作疫苗的腺病毒载体的优点包括易于操纵、良好的大规模可制造性以及基于多年的研究、开发、制造和临床试验经验的优异安全记录，这些临床试验使用了许多已报道的腺病毒载体。被用作疫苗的腺病毒载体通常提供对转基因编码的蛋白的良好免疫应答，包括细胞免疫应答。根据本发明的腺病毒载体可以基于任何类型的腺病毒，并且在某些实施例中是人腺病毒，其可以属于任何组或血清型。在优选的实施例中，重组腺病毒基于来自A、B、C、D、E、F或G组的人腺病毒。在其他优选的实施例中，重组腺病毒基于人腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49或50。在其他实施例中，它是可以为任何血清型的猿猴腺病毒，诸如黑猩猩或大猩猩腺病毒。在某些实施例中，重组腺病毒基于黑猩猩腺病毒1、3、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50、67型或SA7P。

在更优选的实施例中，第二组合物的黑猩猩腺病毒载体是ChAdV3。重组黑猩猩腺病毒血清型3(ChAd3或cAd3)是亚群C腺病毒，其性质类似于人腺病毒血清型5(Ad5)的性质。ChAd3在评估丙型肝炎病毒(HCV)候选疫苗的人类研究中已显示出是安全的和免疫原性的(Barnes E等人2012Science translational medicine[科学转化医学]4:115ra1)。据报道，基于ChAd3的疫苗能够诱导与人Ad5载体疫苗相当的免疫应答。参见例如Peruzzi D等人2009 Vaccine[疫苗]27:1293-300和Quinn KM等人2013J Immunol[免疫学杂志]190:2720-35；WO 2005/071093；以及WO 2011/0130627。

腺病毒载体、其构建方法及其繁殖方法是本领域所熟知的，并且描述于例如美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191和6,113,913，以及Thomas Shenk,"Adenoviridae andtheir Replication"[腺病毒及其复制],M.S.Horwitz,"Adenoviruses"[腺病毒],分别第67和68章，见于Virology[病毒学],B.N.Fields等人编，第3版，纽约雷文出版社有限公司(Raven Press,Ltd.,New York)(1996)，以及本文提及的其他参考文献。典型地，腺病毒载体的构建涉及使用标准分子生物学技术，诸如以下文献中所述的那些技术：Sambrook等人,Molecular Cloning,a Laboratory Manual[分子克隆，实验室手册],第2版,纽约冷泉港的冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)(1989)；Watson等人,Recombinant DNA[重组DNA],第2版,Scientific American Books[科学美国人](1992)；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验室指南],纽约威利国际科学出版公司(Wiley Interscience Publishers,NY)(1995)；以及本文提及的其他参考文献。

在某些实施例中，腺病毒载体包含E1缺失和/或E3缺失。E1或E3缺失可以例如包括基因的完全缺失或部分缺失，其使得E1或E3基因产物具有功能缺陷。因此，在某些实施例中，腺病毒是复制缺陷型的，例如因为它在基因组的E1区含有缺失。如技术人员已知的，在缺失来自腺病毒基因组的必需区域的情况下，由这些区域编码的功能必须优选的是由生产细胞反式提供，即，当E1、E2和/或E4区域的部分或全部从腺病毒中缺失时，这些区域必须存在于生产细胞中，例如整合到其基因组中，或呈所谓的辅助腺病毒或辅助质粒形式。这些腺病毒还可以具有在E3区域中的缺失，该缺失对于复制是非必要的，因此不必补充这种缺失。E1、E2、E3和E4区域中的一个或多个也可以通过其他方法失活，诸如通过将感兴趣的转基因(通常与启动子连接)插入待失活的区域。

可以使用的生产细胞(有时在本领域中以及在本文还称为‘包装细胞’或‘补充细胞’)可以是可在其中繁殖所希望的腺病毒的任何生产细胞。例如，在生产细胞中完成重组腺病毒载体的繁殖，这些生产细胞补充腺病毒中的缺陷。此类生产细胞优选地在其基因组中至少具有腺病毒E1序列，并因而能够补充在E1区域中具有缺失的重组腺病毒。可以使用任何补充E1的生产细胞，诸如由E1永生化的人类视网膜细胞，例如911或PER.C6细胞(参见美国专利5,994,128)、E1转化的羊水细胞(参见欧洲专利1230354)、E1转化的A549细胞(参见例如WO 98/39411、美国专利5,891,690)、GH329:HeLa(Gao等人,2000,Hum Gene Ther[人类基因治疗]11:213-19)、293等。在某些实施例中，生产细胞是例如HEK293细胞、或PER.C6细胞、或911细胞、或IT293SF细胞等。在(Kovesdi等人,2010,Viruses[病毒]2:1681-703)中对生产细胞中的腺病毒载体的生产进行了综述。

在某些实施例中，腺病毒载体是包含一个或多个人腺病毒核酸序列的嵌合腺病毒载体。人腺病毒核酸可以选自例如人腺病毒-4(Ad-4)、人腺病毒-5(Ad-5)、人腺病毒-26(Ad-26)或人腺病毒-35(Ad-35)。在某些实施例中，E1缺陷型腺病毒载体包含人Ad5的腺病毒的E4-orf6编码序列。这使得此类腺病毒可在表达Ad5的E1基因的熟知的补充细胞系中繁殖，诸如293细胞或PER.C6细胞(参见例如Fallaux等人,1998,Hum Gene Ther[人类基因治疗]9:1909-17；Havenga等人,2006,J Gen Virol[普通病毒学杂志]87:2135-43；WO 03/104467，它们通过援引以其全文并入本文)。

在某些实施例中，腺病毒载体包含转基因。“转基因”是指异源核酸，它是不天然存在于载体中的核酸，并且根据本发明，转基因可编码在受试者中引发免疫应答的抗原性基因产物或抗原性蛋白。转基因可以例如通过标准分子生物学技术引入载体中。例如，可将转基因克隆到腺病毒载体的缺失的E1或E3区域中，或E4区域与rITR之间的区域中。通常，转基因可操作地连接至表达控制序列。在优选的实施例中，转基因在转基因插入位点被插入。

如果需要，可以对编码根据本发明实施例的六邻体或纤维多肽的核酸序列和/或对转基因进行密码子优化，以确保在治疗的宿主(例如人)中正确表达。密码子优化是广泛应用于本领域的技术。

转基因可以在腺病毒衍生的启动子(例如，主要晚期启动子)的控制下(即，可操作地连接)，或者可以在异源启动子的控制下。合适的异源启动子的实例包括CMV启动子和RSV启动子。优选地，启动子位于表达盒内的感兴趣的异源基因的上游。

在优选的实施例中，腺病毒载体包含选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55组成的组的核酸序列。

免疫原性组合物

免疫原性组合物是用于本发明的包含免疫有效量的纯化的或部分纯化的人或猿猴(例如黑猩猩)腺病毒载体的组合物。所述组合物可以根据本领域熟知的方法被配制成疫苗(也称为“免疫原性组合物”)。此类组合物可以包含佐剂以增强免疫应答。鉴于本披露，可以通过本领域技术人员熟知的技术确定制剂中每种组分的最佳比率。

鉴于本披露，根据本发明的实施例的免疫原性组合物可以使用本领域技术人员已知的方法制备。液体药物组合物通常包含液体载剂，诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇，诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

可用于本发明的免疫原性组合物可以包含佐剂。适于根据本发明共同施用的佐剂应该是在人中潜在安全、耐受良好且有效的佐剂，包括QS-21、Detox-PC、MPL-SE、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、TERamide、PSC97B、Adjumer、PG-026、GSK-I、AS01、AS03、AS04、AS15、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpG ODN、Betafectin、Alum和MF59。

其他可以施用的佐剂包括凝集素、生长因子、细胞因子和淋巴因子，诸如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、粒细胞集落刺激因子(gCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gMCSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、IL-I、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12或其编码核酸。

本发明的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、载剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此类材料应该是无毒的，并且不应该干扰活性成分的功效。载剂或其他材料的确切性质可以取决于施用途径，例如肌内、皮下、经口、静脉内、皮肤、粘膜内(例如，肠)、鼻内或腹膜内途径。

诱导保护性免疫的方法

本发明的另一个一般方面涉及在需要的受试者中诱导免疫应答的方法。这些方法可以例如包括向受试者施用包含本文所述的腺病毒载体和药学上可接受的载剂的疫苗。本文还提供了生产疫苗的方法。这些方法包括将本文所述的腺病毒载体与药学上可接受的载剂组合。

根据本发明的实施例的任何免疫原性组合物(包括但不限于本文所述的那些)均可在本发明方法中用作疫苗。

包含载体的免疫原性组合物/疫苗的施用典型地是肌内或皮下。然而，也可以设想其他施用方式，诸如静脉内、皮肤、皮内、生殖器或鼻。免疫原性组合物的肌内施用可以通过使用针注射腺病毒载体的混悬液来实现。一种替代方案是使用无针注射装置来施用组合物(使用例如Biojector^TM)或含有疫苗的冷冻干燥粉末。

对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在病痛部位的注射，载体将呈肠胃外可接受的水溶液的形式，它是无热原的并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域技术人员完全能够使用例如等渗媒介物诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸盐林格氏注射液来制备适合的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。还可以使用缓释制剂。

典型地，施用将具有预防性目的，以在感染或发展症状之前产生针对感兴趣的抗原(例如，细菌、病毒、寄生虫和/或真菌病原体)的免疫应答。可根据本发明治疗或预防的疾病和病症包括免疫应答可在其中起到保护或治疗作用的那些。在其他实施例中，腺病毒载体可被施用用于暴露后预防。

将含有人或猿猴(例如黑猩猩)腺病毒载体的免疫原性组合物施用给受试者，从而在受试者中产生对感兴趣的抗原的免疫应答。足以诱导可检测的免疫应答的组合物的量被定义为组合物的“免疫有效剂量”或“有效量”。本发明的免疫原性组合物可以诱导体液以及细胞介导的免疫应答。在典型的实施例中，免疫应答是保护性免疫应答。

施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于正治疗的疾病的性质和严重度。治疗处方(例如剂量等的决定)是在全科医生和其他医师、或在兽医环境中是兽医的职责范围内的，并且典型地考虑了待治疗的病症、个体患者的状况、递送部位、施用方法以及医师已知的其他因素。以上提及的这些技术和方案的实例可以在Remington's PharmaceuticalSciences[雷明顿药学大全],第16版，Osol,A.编,1980中找到。

在产生腺病毒载体和任选将此类颗粒配制成组合物后，可以将这些载体施用给个体，特别是人或其他灵长类动物。可以对人或另一种哺乳动物施用，例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、绵羊、山羊、猪、马、牛、驴、猴、狗或猫。向非人哺乳动物的递送不必是为了治疗目的，而是可以用于实验环境，例如研究对腺病毒载体的免疫应答机制。

在一个示例性方案中，腺病毒载体以约100μl至约10ml范围内的体积施用(例如肌内)，该体积的浓度为约10⁴至10¹²个病毒颗粒/ml。优选地，腺病毒载体以0.1-2.0ml范围内的体积施用。例如，腺病毒载体可以100μl、500μl、1ml、2ml施用。更优选地，腺病毒载体以0.5ml的体积施用。任选地，腺病毒载体以10⁷vp/ml、10⁸vp/ml、10⁹vp/ml、10¹⁰vp/ml、5x10¹⁰vp/ml、10¹¹vp/ml或10¹²vp/ml的浓度施用。典型地，在一次施用期间，腺病毒载体以约10⁹至约10¹²个病毒颗粒(vp)的量，更典型地以约10¹⁰至约10¹²个vp的量施用于人受试者。

初始疫苗接种之后可以是从包含编码感兴趣抗原的相同腺病毒载体的疫苗/组合物或包含编码相同感兴趣抗原的不同腺病毒载体的疫苗/组合物的加强或激发。

如果需要，组合物可以存在于试剂盒、包装或分配器中，该试剂盒、包装或分配器可以包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，试剂盒可以包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装。试剂盒、包装或分配器可附有施用说明书。

本发明的组合物可以单独施用或与其他治疗联合施用(同时地或按顺序)，这取决于待治疗的病状。

实施例

本发明还提供了以下非限制性实施例。

实施例1是一种分离的核酸序列，该分离的核酸序列编码纤维多肽，该纤维多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸6-375具有至少98％的同一性。

实施例2是如实施例1所述的分离的核酸序列，其中该纤维多肽包含选自BB21纤维多肽(SEQ ID NO:1)、BB21纤维变体多肽(SEQ ID NO:58)或BB24纤维多肽(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。

实施例3是如实施例1或2所述的分离的核酸，其中该分离的核酸进一步包含编码六邻体多肽的核酸序列，该六邻体多肽包括含六邻体高变区多肽，该含六邻体高变区多肽包含选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

实施例4是如实施例3所述的分离的核酸，其中该六邻体多肽包含选自BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

实施例5是如实施例1或2所述的分离的核酸，其中该分离的核酸进一步包含编码六邻体多肽的核酸序列，该六邻体多肽包含选自Ptr01六邻体多肽(SEQ ID NO:8)或Ptr13六邻体多肽(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。

实施例6是一种分离的核酸序列，该分离的核酸序列编码六邻体多肽，该六邻体多肽包括含有选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。

实施例7是如实施例6所述的分离的核酸序列，其中该六邻体多肽包含选自BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

实施例8是一种载体，该载体包含如实施例1-7中任一项所述的核酸。

实施例9是如实施例8所述的载体，该载体是腺病毒载体，并且进一步包含转基因。

实施例10是一种重组细胞，该重组细胞包含如实施例8或9所述的载体。

实施例11是一种生产载体的方法，该方法包括(a)使如实施例10所述的重组细胞在用于生产该载体的条件下生长；以及(b)从该重组细胞中分离该载体。

实施例12是一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含如实施例8或9所述的载体。

实施例13是一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例12所述的免疫原性组合物。

实施例14是一种腺病毒载体，该腺病毒载体包含(a)至少一个转基因；和(b)编码纤维多肽的核酸序列，其中该纤维多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸6-375具有至少98％同一性的氨基酸序列。

实施例15是如实施例14所述的腺病毒载体，其中该纤维多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸6-375具有至少99％同一性的氨基酸序列。

实施例16是如实施例14或15所述的腺病毒载体，其中该纤维多肽包含与SEQ IDNO:1具有至少98％同一性的氨基酸序列。

实施例17是如实施例14-16中任一项所述的腺病毒载体，其中该纤维多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少99％同一性的氨基酸序列。

实施例18是如实施例14-17中任一项所述的腺病毒载体，其中该纤维多肽包含选自BB21纤维多肽(SEQ ID NO:1)、BB21纤维变体多肽(SEQ ID NO:58)或BB24纤维多肽(SEQID NO:2)的氨基酸序列。

实施例19是如实施例14-18中任一项所述的腺病毒载体，该腺病毒载体进一步包含编码六邻体多肽的核酸序列，该六邻体多肽包括含有选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。

实施例20是如实施例19所述的腺病毒载体，其中该六邻体多肽包含选自BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

实施例21是一种腺病毒载体，该腺病毒载体包含(a)至少一个转基因插入位点；和(b)编码六邻体多肽的核酸序列，其中该六邻体多肽包括含有选自SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。

实施例22是如实施例21所述的腺病毒载体，其中该六邻体多肽包含选自BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

实施例23是如实施例14-22中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体进一步包含E1缺失或灭活的E1。

实施例24是如实施例14-23中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体进一步包含E3缺失或灭活的E3。

实施例25是如实施例14-24中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体是包含一个或多个人腺病毒核酸序列的嵌合腺病毒载体。

实施例26是如实施例25所述的腺病毒载体，其中该人腺病毒核酸序列来自人腺病毒-4(hAdV-4)、人腺病毒-5(hAdV-5)、人腺病毒-26(hAdV-26)或人腺病毒-35(hAdV-35)。

实施例27是如实施例26所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含人腺病毒-5(hAdV-5)E4 orf6。

实施例28是如实施例14-27中任一项所述的腺病毒载体，其中该转基因插入位点与反向末端重复序列(ITR)相邻。

实施例29是如实施例28所述的腺病毒载体，其中将转基因插入一个或多个转基因插入位点，该一个或多个转基因插入位点选自E1缺失处的转基因插入位点、E3缺失处的转基因插入位点和与ITR相邻的转基因插入位点。

实施例30是如实施例14-29中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含选自由SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29组成的组的核酸序列。

实施例31是如实施例14-18和23-29中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含选自SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:55的核酸序列。

实施例32是一种腺病毒载体，该腺病毒载体包含：(a)至少一个转基因；(b)编码六邻体多肽的核酸序列，该六邻体多肽包含选自由BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)、BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)、Ptr01六邻体多肽(SEQ ID NO:8)、Ptr13六邻体多肽(SEQ ID NO:10)组成的组的氨基酸序列；以及(c)编码纤维多肽的核酸序列，该纤维多肽包含选自BB21纤维多肽(SEQ ID NO:1)、BB21纤维变体多肽(SEQ ID NO:58)或BB24纤维多肽(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。

实施例33是如实施例32所述的腺病毒载体，其中该六邻体多肽包含Ptr01六邻体多肽(SEQ ID NO:8)或Ptr13六邻体多肽(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列，并且该纤维多肽包含BB21纤维多肽(SEQ ID NO:1)、BB21纤维变异多肽(SEQ ID NO:58)或BB24纤维多肽(SEQID NO:2)的氨基酸序列。

实施例34是如实施例33所述的腺病毒载体，其中该六邻体多肽包含Ptr01六邻体多肽(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列，并且该纤维多肽包含BB24纤维多肽(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。

实施例35是如实施例33所述的腺病毒载体，其中该六邻体多肽包含Ptr13六邻体多肽(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列，并且该纤维多肽包含BB21纤维变体多肽(SEQ ID NO:58)的氨基酸序列。

实施例36是如实施例32所述的腺病毒载体，其中该六邻体多肽包含BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列，并且该纤维多肽包含BB21纤维多肽(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。

实施例37是如实施例32所述的腺病毒载体，其中该六邻体多肽包含BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列，并且该纤维多肽包含BB24纤维多肽(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。

实施例38是如实施例32-37中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体进一步包含来自人腺病毒-4(HAdV-4)、人腺病毒-5(HAdV-5)、人腺病毒-26(HAdV-26)或人腺病毒-35(HAdV-35)的一个或多个核酸序列。

实施例39是如实施例38所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含来自人腺病毒-4(HAdV-4)的一个或多个核酸序列和人腺病毒-5(HAdV-5)E4 orf6的核酸序列。

实施例40是如实施例39所述的腺病毒载体，该腺病毒载体包含选自由SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:55组成的组的核酸序列。

实施例41是一种疫苗，该疫苗包含如实施例14-40中任一项所述的腺病毒载体和药学上可接受的载剂。

实施例42是一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例41所述的疫苗。

实施例43是一种生产疫苗的方法，该方法包括将如实施例14-40中任一项所述的腺病毒载体与药学上可接受的载剂组合。

实施例44是一种分离的六邻体多肽，该分离的六邻体多肽包括含有选自SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。

实施例45是如实施例44所述的分离的六邻体多肽，其中该六邻体多肽包含选自BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

实施例46是一种分离的六邻体多肽，该分离的六邻体多肽包含选自Ptr01六邻体多肽(SEQ ID NO:8)或Ptr13六邻体多肽(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。

实施例47是一种分离的纤维多肽，其中该纤维多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸6-375具有至少98％的同一性。

实施例48是如实施例47所述的分离的纤维多肽，其中该纤维多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸6-375具有至少99％的同一性。

实施例49是一种分离的纤维多肽，其中该纤维多肽与SEQ ID NO:1具有至少98％的同一性。

实施例50是如实施例49所述的分离的纤维多肽，其中该纤维多肽与SEQ ID NO:1具有至少99％的同一性。

实施例51是如实施例49所述的分离的纤维多肽，其中该纤维多肽包含选自BB21纤维多肽(SEQ ID NO:1)、BB21纤维变体多肽(SEQ ID NO:58)或BB24纤维多肽(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。

实施例52是如实施例41所述的疫苗，用于在有需要的受试者中诱导免疫应答。

实施例53是如实施例41所述的疫苗在制备用于在有需要的受试者中诱导免疫应答的药物中的用途。

实施例54是一种腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含选自由SEQ ID NO:38、SEQID NO:39、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57组成的组的核酸序列。

实施例55是如实施例54所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含SEQ ID NO:38的核酸序列。

实施例56是如实施例54所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含SEQ ID NO:39的核酸序列。

实施例57是如实施例54所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含SEQ ID NO:46的核酸序列。

实施例58是如实施例54所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含SEQ ID NO:47的核酸序列。

实施例59是如实施例54所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含SEQ ID NO:52的核酸序列。

实施例60是如实施例54所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含SEQ ID NO:53的核酸序列。

实施例61是如实施例54所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含SEQ ID NO:56的核酸序列。

实施例62是如实施例54所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含SEQ ID NO:57的核酸序列。

实例

实例1：基于新型腺病毒分离株BB21和BB24的E1和E3缺失型载体的生成

鉴定了两个新型黑猩猩腺病毒分离株BB21(也称为JAd2-WT)和BB24(也称为JAd3-WT)并进行了测序。发现黑猩猩腺病毒分离株在系统发育上属于人腺病毒E种(HAdV-E)这个组。确定BB21和BB24的全基因组核苷酸序列分别为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。确定BB21六邻体和纤维多肽序列分别为SEQ ID NO:5和1。确定BB24六邻体和纤维多肽序列分别为SEQ ID NO:6和2。图15提供了BB21和BB24纤维多肽序列的比对。

用于生成基于BB21和BB24的腺病毒载体的单质粒系统的描述

pBB21.dE1.dE3(SEQ ID NO:13；图9)、pBB21.dE1.dE3.5IXP(SEQ ID NO:14；图10)、pBB24.dE1.dE3(SEQ ID NO:15；图11)和pBB24.dE1.dE3.5IXP(SEQ ID NO:16；图12)是携带基于分离株BB21和BB24的全长、E1和E3缺失型腺病毒载体基因组的质粒。这些质粒中包含的腺病毒载体基因组序列分别在SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQID NO:29中列出。在这些质粒的每一个中，腺病毒载体基因组的侧翼是两个SwaI限制性酶切位点(即一个SwaI位点位于载体基因组的任一端)。这些SwaI位点是为了在病毒拯救之前通过转染合适的E1补充细胞(例如HEK293、911和PER.C6细胞)来促进从质粒骨架上切除腺病毒载体基因组。这些质粒所包含的腺病毒载体基因组进一步携带某些限制性酶切位点，这些限制性酶切位点在E1缺失的位置中、在E3缺失中以及在右反向末端重复序列(RITR)附近被引入。在完整的腺病毒基因组质粒的情况下，将这些限制性酶切位点选择为独特的。它们代表“转基因插入位点”，这些位点允许通过标准分子克隆技术容易地构建携带一个或多个转基因表达盒的腺病毒载体，该一个或多个转基因表达盒插入在所述相应位置中的任一个处或其任何组合中。腺病毒载体设计和质粒构建在以下章节中更详细地描述。

基于BB21和BB24的腺病毒载体基因组设计

基于BB21和BB24的腺病毒载体基因组分别设计为包含E1缺失、E3缺失、不同的转基因插入位点以及天然E4开放阅读框(orf)6和orf6/7被人腺病毒-5(HAdV-5)的开放阅读框替换。使每种腺病毒的E1区域缺失，并用包含AsiSI限制性酶切位点序列的转基因插入位点替换。使每种腺病毒的E3区域缺失，并用包含RsrII限制性酶切位点序列的转基因插入位点替换。通过在每个腺病毒的反向末端重复序列(ITR)附近插入PacI限制性酶切位点序列，产生另一个转基因插入位点。包含E4 orf6和orf6/7编码序列的BB21和BB24序列分别被SEQID NO:30和SEQ ID NO:40替换。这些替换序列包含人腺病毒-5(HAdV-5)的E4 orf6和orf6/7编码序列(GenBank序列AC_000008的碱基对32914-34077)，这些编码序列经修饰以携带一个消除某AseI位点的沉默突变(用于克隆目的)。

设计和构建了两种类型的E1区域缺失。pBB21.dE1.dE3和pBB24.dE1.dE3分别包含的基于BB21和BB24的腺病毒载体基因组携带E1区域缺失，该区域缺失分别对应于SEQ IDNO:11的核苷酸456至3027和SEQ ID NO:12的核苷酸457至3025的移除。相比之下，pBB21.dE1.dE3.5IXP和pBB24.dE1.dE3.5IXP分别包含的基于BB21和BB24的腺病毒载体基因组携带较大的包含E1区域的序列缺失，从而移除了BB21或BB24的所有E1编码序列(即，分别为SEQ ID NO:11的核苷酸456至3418或SEQ ID NO:12的核苷酸457至3420)。后两种腺病毒载体基因组还被设计成携带E1B 55K与pIX编码序列之间的非编码序列段被HAdV-5的非编码序列段替换(即，对应于SEQ ID NO:11的核苷酸3419至3502或SEQ ID NO:12的核苷酸3421至3504的序列被GenBank AC_000008的核苷酸3510-3608(即，被SEQ ID NO:25)替换)。

包含基于BB21的腺病毒载体基因组的单质粒的构建

通过若干基因合成步骤(由新泽西州皮斯卡特维的金斯瑞公司(GenScript；Piscataway,NJ)执行)和标准分子克隆程序构建了pBB21.dE1.dE3(SEQ ID NO:13)。首先，合成含有所需腺病毒载体基因组的右端(即，带有上述E3缺失、部分E4序列替换和与RITR相邻的转基因插入位点)的3576bp DNA片段(SEQ ID NO:31)，并作为EcoRI-AseI限制性片段连接到EcoRI和NdeI消化的pBR322(GenBank登录号J01749.1)中，从而产生BB21中间质粒1。其次，合成含有所需腺病毒载体基因组的左端(即，带有上述E1缺失)的4256bp片段(SEQ IDNO:32)，并作为SnaBI-EcoRI限制性片段连接到ZraI和EcoRI消化的BB21中间质粒1中，从而产生BB21中间质粒2。第三，合成含有中间腺病毒载体基因组片段的4077bp片段(SEQ IDNO:33)，并作为EcoRI-HpaI限制性片段连接到EcoRI和HpaI消化的BB21中间质粒2中，从而产生BB21中间质粒3(SEQ ID NO:34)。第四，将BB21病毒基因组的18815bp AbsI-EcoRI限制性片段(SEQ ID NO:11)连接到AbsI和EcoRI消化的BB21中间质粒3中，从而产生最终质粒pBB21.dE1.dE3(SEQ ID NO:13)。

以与pBB21.dE1.dE3相同的方式构建pBB21.dE1.dE3.5IXP(SEQ ID NO:14)，不同的是，首先修饰上述BB21中间质粒3(SEQ ID NO:34)以包含所需的E1缺失和Ad5 pIX启动子插入。这是通过合成224bp片段(SEQ ID NO:35)完成的，该片段随后作为AsiSI-FseI限制性片段连接到AsiSI和FseI消化的BB21中间质粒3中。

pBB21.FLuc(SEQ ID NO:36)和pBB21.RSVF-2A-GLuc(SEQ ID NO:37)是pBB21.dE1.dE3衍生的质粒，它们各自带有基于BB21的腺病毒载体基因组，该腺病毒载体基因组装备有在E1缺失位置插入的转基因表达盒。这些质粒内携带的腺病毒载体基因组序列分别在SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39中列出。pBB21.FLuc携带萤火虫萤光素酶(FLuc)的转基因表达盒。该盒由巨细胞病毒主要立即早期启动子(即“CMV启动子”)驱动，并含有SV40衍生的聚腺苷酸化信号。pBB21.RSVF-2A-Gluc携带“RSV-F_A2-2A-GLuc”的转基因表达盒(RSVF-2A-GLuc)，它是由呼吸道合胞病毒株A2融合糖蛋白、口蹄疫病毒2A肽和高斯(Gaussia)萤光素酶(GLuc)构成的嵌合蛋白。像FLuc盒一样，该盒也由CMV启动子驱动，并携带SV40聚腺苷酸化信号。另外，该盒在其5’非翻译区中包含含有人载脂蛋白A1基因的内含子2的序列。将Fluc和RSVF-2A-GLuc表达盒各自通过若干标准基因合成和分子克隆步骤构建，然后将它们连接到pBB21.dE1.dE3的独特AsiSI限制性酶切位点中，从而分别生成pBB21.FLuc和pBB21.RSVF-2A-Gluc。

包含基于BB24的腺病毒载体基因组的单质粒的构建

通过若干基因合成步骤(由金斯瑞公司执行)和标准分子克隆程序构建了pBB24.dE1.dE3(SEQ ID NO:15)。首先，合成含有所需腺病毒载体基因组的左右端(即，具有上述E1缺失、E3缺失、部分E4序列替换和与RITR相邻的转基因插入位点)的8144bp DNA片段(SEQ ID NO:41)，并作为MfeI-AseI限制性片段连接到EcoRI和NdeI消化的pBR322(GenBank登录号J01749.1)中，从而产生BB24中间质粒1(SEQ ID NO:42)。其次，将BB24病毒基因组的22482bp的NdeI-EcoRI限制性片段(SEQ ID NO:12)连接到NdeI和EcoRI消化的BB24中间质粒1中，从而产生最终质粒pBB24.dE1.dE3。

以类似方式构建了pBB24.dE1.dE3.5IXP(SEQ ID NO:16)。首先，修饰上述BB24中间质粒1(SEQ ID NO:42)以携带所需的E1缺失和Ad5 pIX启动子插入。这是通过合成2671bp片段(SEQ ID NO:43)完成的，该片段随后作为AsiSI-EcoRI限制性片段连接到AsiSI和EcoRI消化的BB24中间质粒1中。其次，将BB24病毒基因组的19470bp XbaI-EcoRI限制性片段(SEQ ID NO:12)连接到经修饰的质粒(用XbaI和EcoRI消化)中。

pBB24.FLuc(SEQ ID NO:44)和pBB24.RSVF-2A-GLuc(SEQ ID NO:45)是pBB24.dE1.dE3衍生的质粒，它们各自含有基于BB24的腺病毒载体基因组，该腺病毒载体基因组装备有在E1缺失位置插入的转基因表达盒。这些质粒内携带的腺病毒载体基因组序列分别在SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中列出。pBB24.FLuc携带与本文针对pBB21.FLuc所述相同的FLuc表达盒。pBB24.RSVF-2A-GLuc携带与本文针对pBB21.RSVF-2A-GLuc所述相同的RSVF-2A-GLuc表达盒。将这两个盒各自通过若干标准基因合成和分子克隆步骤构建，然后将它们连接到pBB24.dE1.dE3的独特AsiSI限制性酶切位点中，从而分别生成pBB24.FLuc和pBB24.RSVF-2A-GLuc。

基于BB21和BB24的腺病毒载体的生成和生产

通过将相应的腺病毒载体基因组质粒(即，pBB21.FLuc、pBB21.RSVF-2A-GLuc、pBB24.FLluc和pBB24.RSVF-2A-GLuc)转染到补充E1的PER.C6细胞中，生成了分别包含腺病毒载体基因组序列SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47的腺病毒载体BB21.FLuc(也称为JAd2NVT003)、BB21.RSVF-2A-GLuc(也称为JAd2NVT001)、BB24.FLuc(也称为JAd3NVT003)和BB24.RSVF-2A-GLuc(也称为JAd3NVT001)。在转染到PER.C6细胞(这些细胞在补充了10％胎牛血清(FBS)和10mM MgCl₂的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中作为贴壁细胞培养物生长)中之前，用SwaI消化腺病毒载体基因组质粒以从质粒释放相应的腺病毒载体基因组。使用Lipofectamine转染试剂(加利福利亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen；Carlsbad,CA))，根据标准程序进行转染。在收获病毒拯救转染后，通过在PER.C6细胞培养物上的连续几轮感染而进一步扩增病毒。如前所述(Havenga等人,“Novelreplication-incompetent adenoviral B-group vectors:high vector stability andyield in PER.C6 cells,”[新的无复制能力的腺病毒B组载体：在PER.C6细胞中的高载体稳定性和产率]J.Gen.Virol.[普通病毒学杂志]87(8):2135-43(2006))，使用两步氯化铯(CsCl)密度梯度超速离心程序从粗病毒收获物中纯化病毒。病毒颗粒(VP)滴度通过先前描述的基于分光光度法的程序进行测量(Maizel等人,“The polypeptides of adenovirus:I.Evidence for multiple protein components in the virion and a comparison oftypes 2,7A,and 12,”[腺病毒的多肽：I.病毒体中多种蛋白组分的证据以及2、7A和12型的比较]Virology[病毒学],36(1):115-25(1968))。

实例2：基于带有来自猿腺病毒的六邻体和纤维序列的HAdV-4的E1和E3缺失型载体的生成。

为了产生在六邻体或六邻体和纤维序列中进行修饰的、基于人腺病毒4型(HAdV-4)的无复制能力的腺病毒载体，构建了携带完整HAdV-4载体基因组的质粒，该载体基因组带有E1和E3缺失、转基因插入以及六邻体和/或纤维替换，如下所述。将转基因表达盒插入载体的E1缺失中。将质粒转染到E1补充细胞系(诸如HEK 293或PER.C6)中导致挽救了基于HAdV-4的载体，其中衣壳蛋白(六邻体，或六邻体和纤维)已被源自某些猿腺病毒分离株的异源序列替换。腺病毒载体质粒的设计和构建在以下章节中描述。

包含基于HAdV-4的腺病毒载体基因组的单质粒的设计和构建

预先确定了用于载体设计和构建的HAdV-4分离株的完整序列(35990bp)(SEQ IDNO:17)。

使用标准分子生物学和DNA克隆技术产生了携带基于HAdV-4的载体基因组(带有缺失以使得无复制能力，并产生供插入外源转基因盒的空间)的单质粒。简而言之，在金斯瑞公司(GenScript)合成了包含所需的基于HAdV-4的腺病毒载体的左端和右端的DNA片段，并将其克隆到pBR322中。随后，从纯化的野生型HAdV-4基因组DNA(通过限制性酶消化)获得了HAdV-4基因组缺失的中间部分(约19kbp的HindIII-HindIII限制性片段)，然后将其连接至含有左端和右端的基于pBR322的质粒中。这导致生成质粒pAd4.dE1.dE3。该质粒携带侧翼为SwaI位点的E1和E3缺失型基于HAdV-4的腺病毒载体基因组。这些SwaI位点允许通过转染E1补充细胞系(诸如PER.C6或HEK293细胞系)从质粒上切下载体基因组，以挽救腺病毒载体。在E1缺失的位置，质粒携带AsiSI限制性酶切位点所包含的转基因插入位点。PacI位点所包含的另一个转基因插入位点位于右反向末端重复序列附近。

还制备了pAd4.dE1.dE3的E4区域修饰形式，即pAd4.5orf6(SEQ ID NO:18；图13)。在产生pAd4.dE1.dE3以包含天然HAdV-4E4序列的同时，还产生了pAd4.5orf6以包含经修饰的E4区域，其中天然HAdV-4序列的核苷酸33018-34165被替换为包含来自HAdV-5的E4 orf6和orf6/7序列(即，HAdV-5GenBank序列AC_000008(SEQ ID NO:48)的核苷酸32914-34077)。pAd4.5orf6内携带的腺病毒载体基因组序列在SEQ ID NO:49中列出。通过使用标准克隆技术切除pAd4.dE1.dE3的2.9kb PsiI-PacI片段并用携带所述修饰的合成序列(由金斯瑞公司生成)替换，生成了pAd4.5orf6。除了修饰的E4区域以外，质粒pAd4.dE1.dE3和pAd4.5orf6是相同的。pAd4.5orf6的图谱如图12所示。指出了E1和E3缺失，以及编码六邻体和纤维的区域。

在合适的E1补充细胞(如HEK293和PER.C6)中转染相应质粒(即pAd4.dE1.dE3和pAd4.5orf6)时，可以拯救两种基于HAdV-4的载体形式。但是，发现使用来自HAdV-5的含E4orf6的序列可以提高载体产量和生产效率。以前，在基于HAdV-35的载体中进行类似的替换显示出相似的结果(Havenga等人,“Novel replication-incompetent adenoviral B-group vectors:high vector stability and yield in PER.C6 cells[新的无复制能力的腺病毒B组载体：在PER.C6细胞中的高载体稳定性和产率]”J.Gen.Virol.[普通病毒学杂志]87(8):2135-43(2006))。

pAd4.dE1.dE3和pAd4.5orf6各自在腺病毒载体基因组中在E1缺失位置携带一个独特的AsiSI限制性酶切位点，以及在右反向末端重复序列附近携带一个独特的PacI限制性酶切位点。这些位点允许通过标准克隆技术将转基因表达盒插入腺病毒载体基因组的相应位置处。例如，一个或多个这样的盒可以被插入这些位置中的一个或两个处。

pAd4.FLuc和pAd4.RSVF-2A-GLuc是pAd4.5orf6的含转基因表达盒的形式，分别携带编码萤火虫萤光素酶(FLuc)和融合蛋白的转基因盒，该融合蛋白包含呼吸道合胞病毒A2融合糖蛋白、口蹄疫病毒衍生的2A肽和高斯萤光素酶(RSVF-2A-GLuc)。它们通过标准克隆技术将相应的盒插入pAd4.5orf6的AsiSI位点而构建。在基于BB21和BB24的腺病毒载体的情况下，两个转基因盒与实例1中使用的相同。

包含基于HAdV-4的携带六邻体和纤维序列替换的载体的单质粒的设计和构建

构建基于HAdV-4的载体基因组质粒，其中六邻体和纤维编码序列被某些黑猩猩腺病毒分离株的序列替换，这些分离株像HAdV-4一样已经被分配到人腺病毒E种。用作这些构建的六邻体序列供体的腺病毒分离株是PtroAdV-1和PtroAdV-13，其部分六邻体核苷酸序列之前保藏在GenBank中(分别在JN163971和JN163983下)。用于构建的纤维序列来自新的黑猩猩腺病毒分离株BB21和BB24，它们在本文实例1中描述。进行了六邻体和纤维序列替换的两种不同组合(在基于HAdV-4的载体基因组质粒的背景下)：(1)将PtroAdV-1六邻体核苷酸序列与编码BB24纤维(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列组合；以及(2)将PtroAdV-13六邻体核苷酸序列与编码BB21纤维变体(SEQ ID NO:58)的核苷酸序列组合。携带六邻体和纤维序列替换的所述第一组合的所构建的质粒是pAd4.Ptr01.BB24.5orf6(SEQ ID NO:21；图13)、pAd4.Ptr01.BB24.5orf6.Fluc(SEQ ID NO:19)和pAd4.Ptr01.BB24.5orf6.RSVF-2A-Gluc(SEQ ID NO:50)，它们分别带有如SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53所列的腺病毒载体基因组序列。携带六邻体和纤维序列替换的所述第二组合的所构建的质粒是pAd4.Ptr13.BB21.5orf6(SEQ ID NO:22；图14)、pAd4.Ptr13.BB21.5orf6.Fluc(SEQ IDNO:20)和pAd4.Ptr13.BB21.5orf6.RSVF-2A-Gluc(SEQ ID NO:54)，它们分别带有如SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57所列的腺病毒载体基因组序列。

以上六邻体修饰和纤维修饰的腺病毒载体基因组质粒均通过标准基因合成和分子克隆程序构建。合成了包含相应的经修饰的六邻体和纤维序列的序列片段(由金斯瑞公司合成)，然后进行连续的亚克隆步骤，这些步骤一起相当于将这些序列插入pAd4.5orf6(在其中替换相应的含天然HAdV-4六邻体和纤维的序列)。随后将所得的质粒pAd4.Ptr01.BB24.5orf6和pAd4.Ptr13.BB21.5orf6装上Fluc和RSVF-2A-Gluc的上述表达盒，方式是将这些盒克隆到这些质粒的独特AsiSI位点中(导致构建了pAd4.Ptr01.BB24.5orf6.Fluc、pAd4.Ptr01.BB24.5orf6.RSVF-2A-Gluc、pAd4.Ptr13.BB21.5orf6.Fluc和pAd4.Ptr13.BB21.5orf6.RSVF-2A-Gluc)。

本文进行的六邻体序列替换导致了编码嵌合六邻体的序列“Ptr01”(SEQ ID NO:7)和“Ptr13”(SEQ ID NO:9)的构建。这些序列构成HAdV-4六邻体基因，其中编码高变区(HVR)的序列分别被PtroAdV-1和PtroAdV-13的序列替换。由Ptr01和Ptr13编码的嵌合六邻体多肽分别在SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10中列出。

本文中进行的纤维序列替换需要用衍生自纤维供体分离株BB21和BB24的序列替换HAdV-4的编码完整纤维的序列，如本文实例1所述。这些替换核苷酸序列分别编码BB21纤维变体(SEQ ID NO:58)和BB24纤维变体(SEQ ID NO:2)。图16显示了这两种纤维和BB21纤维(SEQ ID NO:1)的多肽比对。

基于HAdV-4的携带六邻体和纤维序列替换的载体的生成和生产

分别通过转染到SwaI消化的腺病毒载体基因组质粒pAd4.Ptr01.BB24.5orf6.FLuc、pAd4.Ptr01.BB24.5orf6.RSVF-2A-GLuc、pAd4.Ptr13.BB21.5orf6.FLuc和pAd4.Ptr13.BB21.5orf6.RSVF-2A-GLuc的E1补充PER.C6细胞中，生成了分别包含腺病毒载体基因组序列SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57的腺病毒载体Ad4Ptr01-BB24.FLuc(也称为Ad4C1NVT003)、Ad4Ptr01-BB24.RSVF-2A-GLuc(也称为Ad4C1NVT001)、Ad4Ptr13-BB21.FLuc(也称为Ad4C2NVT003)和Ad4Ptr13-BB21.RSVF-2A-GLuc(也称为Ad4C2NVT001)。同样，分别从质粒pAd4.FLuc和pAd4.RSVF-2A-GLuc生成了对照腺病毒载体Ad4.FLuc和Ad4.RSVF-2A-GLuc。根据与本文实例1中针对基于BB21和BB24的载体所述相同的标准程序，进行所有转染和随后的载体扩增、纯化和滴定。

评估由于替换HAdV-4六邻体和纤维而导致的抗腺病毒中和滴度的降低

将表达萤火虫萤光素酶的重组腺病毒(具有衣壳蛋白六邻体和纤维替换，按上述方法构建)用于确定用来自猿腺病毒的同源蛋白替换衣壳蛋白六邻体和纤维是否导致了带有抗HAdV-4中和活性的人血清样品的中和降低。

简而言之，将要测试的腺病毒的粗制病毒原液的等量感染单位等分试样与血清样品的连续稀释液一起温育。用于这些试验的起始稀释度是16倍。在温育期之后，将腺病毒等分试样用于感染指示细胞系，诸如A549细胞，其中任何未被血清温育而中和的腺病毒都可能感染指示细胞。然后将病毒转导的细胞温育过夜，以使得可以表达萤火虫萤光素酶转基因。带有抗腺病毒中和活性的任何血清样品的中和滴度是与未用血清温育的腺病毒等分试样相比，在报告细胞中可以实现萤光素酶活性降低90％的最小血清稀释度。

测定了据发现带有Ad4.FLuc中和抗体的22个人类血清样品(所测试的79个样品中)的抗腺病毒中和滴度(表1)。当与相同血清样品分别针对嵌合腺病毒Ad4.Ptr01-BB24.FLuc和Ad4Ptr13-BB21.FLuc的中和滴度进行比较时，很明显，抗腺病毒中和活性由于六邻体和纤维编码序列中的衣壳改变而显著降低。这些结果证实，腺病毒六邻体和纤维蛋白包含抗体介导的腺病毒中和的重要抗原决定簇。它们还表明，通过将载体的六邻体和纤维蛋白用在人群中可能具有低血清阳性率的猿腺病毒的那些蛋白进行交换，可以避免在人体中预先存在的抗基于人腺病毒的载体(在这种情况下是Ad4.FLuc，一种基于HAdV-4的载体)的抗载体体液免疫。

总之，Ad4Ptr01-BB24.FLuc和Ad4Ptr13-BB21.Fluc被证明在血清学上不同于其亲本基于HAdV-4的载体Ad4.Fluc。此外，在一组Ad4.Fluc中和性人血清中，没有发现针对这两种载体的中和活性(就Ad4Ptr01-BB24.FLuc而言)或仅有有限的(就Ad4Ptr13-BB21.Fluc而言)中和活性。

表1：抗Ad4中和抗体阳性的人血清中的抗腺病毒中和滴度

<16表示在16倍的最低稀释度下未观察到中和作用

由新型腺病毒载体诱导的细胞和体液免疫应答

实例3至8描述了为了评估本文产生的四种新型载体即腺病毒载体BB21、BB24、Ad4Ptr13-BB21和Ad4Ptr01-BB24的免疫原性而进行的实验。在这些实验中，评估了新型载体在小鼠中肌内免疫后诱导针对载体编码的(模型)抗原的体液和细胞免疫应答的能力。使用两种不同的抗原测试了载体：萤火虫萤光素酶(FLuc)和RSV-F_A2-2A-GLuc(RSVF-2A-GLuc)。RSVF-2A-GLuc是一种嵌合蛋白，由呼吸道合胞病毒株A2融合糖蛋白、口蹄疫病毒2A肽和高斯萤光素酶(GLuc)组成。将每个载体与基于携带相同的编码抗原的转基因盒的人26型腺病毒(HAdV-26，在本文中也称为Ad26)的基准载体并排比较。使用众所周知的免疫测定法，诸如酶联免疫斑点测定法(ELISPOT)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)以及在RSVF-2A-GLuc抗原的情况下，呼吸道合胞病毒中和测定法(VNA)，测量了针对相应抗原的免疫应答。

实例3：由BB21.FLuc和BB24.FLuc诱导的细胞免疫应答

为了评估新型腺病毒载体BB21和BB24的细胞免疫原性，用Ad26.FLuc(阳性对照)、表达萤火虫萤光素酶的BB21或BB24载体(即BB21.FLuc或BB24.FLuc)或用不编码转基因的腺病毒载体(Ad26空)肌内免疫Balb/C小鼠。测试了两个载体施用剂量：每只小鼠10⁹和10¹⁰个病毒颗粒(vp)。免疫两周后，处死小鼠并分离脾细胞(图1A)。通过离体ELISPOT试验测定了细胞免疫应答，该试验测量用15mer重叠FLuc肽库过夜刺激脾细胞后IFN-γ分泌细胞的相对数量(图1B)。结果表明，在较高剂量免疫(10¹⁰)下，由BB21.Fluc和BB24.Fluc诱导的细胞免疫应答大约与Ad26.Fluc所见的应答一样高。相比之下，在较低剂量免疫(10⁹)下，BB21.Fluc和BB24.Fluc均比Ad26.Fluc产生了更高的应答。总的来说，由本发明的表达FLuc的重组BB21和BB24腺病毒载体诱导的细胞免疫应答清楚地表明了这些载体在小鼠中的强有力的免疫原性。

实例4：由Ad4Ptr13-BB21.FLuc诱导的细胞免疫应答

为了评估新型工程化腺病毒载体Ad4Ptr13-BB21的细胞免疫原性，用各自表达萤火虫萤光素酶(Fluc)的Ad4Ptr13-BB21、Ad26(阳性对照)或Ad4(Ad4Ptr13-BB21的亲本载体)或用不编码转基因的腺病毒载体(Ad26空)肌内免疫Balb/C小鼠。测试了两个载体施用剂量：每只小鼠10⁹和10¹⁰个病毒颗粒(vp)。免疫两周后，根据用于BB21.Fluc和BB24.Fluc的相同实验设置，处死小鼠并分离脾细胞(图1A)。通过离体ELISPOT试验测定了细胞免疫应答，该试验测量用15mer重叠FLuc肽库过夜刺激脾细胞后IFN-γ分泌细胞的相对数量(图2)。结果表明，在较高剂量免疫(10⁹)下，由Ad4Ptr13-BB21.FLuc诱导的细胞免疫应答大约与基准对照载体Ad26.Fluc所见的应答一样高，而在较低剂量免疫(10¹⁰)下，Ad4Ptr13-BB21.FLuc比Ad26.Fluc产生了略高的应答。

总的来说，由表达FLuc的新型工程化Ad4Ptr13-BB21腺病毒载体(包含BB21纤维变体(SEQ ID NO:58))诱导的细胞免疫应答清楚地表明了该载体在小鼠中的强有力的免疫原性

实例5：由Ad4Ptr01-BB24.FLuc诱导的细胞免疫应答

为了评估新型工程化腺病毒载体Ad4Ptr01-BB24.FLuc的细胞免疫原性，用Ad26.FLuc(阳性对照)、表达FLuc的Ad4Ptr01-BB24或用不编码转基因的腺病毒载体(Ad26空)肌内免疫Balb/C小鼠。测试了两个施用剂量：每只小鼠10⁹和10¹⁰个病毒颗粒(vp)。免疫两周后，根据用于BB21.Fluc和BB24.Fluc的相同实验设置，处死小鼠并分离脾细胞(图1A)。通过离体ELISPOT试验测定了细胞免疫应答，该试验测量用15mer重叠FLuc肽库过夜刺激脾细胞后IFN-γ分泌细胞的相对数量(图3)。结果表明，在较高剂量下，Ad4Ptr01-BB24.FLuc清楚地诱导了针对所编码的抗原的细胞免疫应答，其读数接近但略低于阳性对照载体Ad26.Fluc所见的读数。

总的来说，由表达FLuc的新型工程化Ad4Ptr01-BB24腺病毒载体(包含BB24纤维(SEQ ID NO:2))诱导的细胞免疫应答清楚地表明了该载体在小鼠中的免疫原性。

实例6：由BB21.RSVF-2A-GLuc诱导的细胞和体液免疫应答

使用RSV-F_A2-2A-GLuc(RSVF-2A-GLuc)作为载体编码的(模型)疫苗抗原，进一步评估了新型腺病毒载体BB21的免疫原性。用Ad26.RSVF-2A-GLuc(阳性对照)或BB21.RSVF-2A-GLuc(均以每只小鼠10⁸、10⁹和10¹⁰个病毒颗粒)或者用Ad26.FLuc或BB21.FLuc(均以每只小鼠10¹⁰个病毒颗粒)肌内免疫Balb/C小鼠。在第八周处死小鼠并收集血样和脾细胞(图4A)。如下所述评估不同的免疫参数。

为了评估BB21.RSVF-2A-Gluc引发呼吸道合胞病毒中和抗体的能力，进行了病毒中和试验。图4B描绘了免疫后八周时收集的血清样品所测得的呼吸道合胞病毒株A2(RSVA2)VNA滴度。每个点代表一只小鼠，条代表组平均值，虚线对应于定量下限(LLOQ＝6,88；线性样品的平均终点滴度)。结果表明，用BB21.RSVF-2A-Gluc以10¹⁰vp剂量免疫所产生的RSVA2中和滴度与编码相同抗原的基准Ad26载体所见的中和滴度在相同的范围内。

通过RSV-F_A2特异性ELISPOT试验评估了针对载体编码的抗原的细胞免疫诱导。为此，在免疫后八周时，分离来自免疫小鼠的脾细胞，用跨越RSV-F_A2蛋白的15mer重叠肽刺激过夜，通过离体ELISPOT试验测定细胞免疫应答，该试验测量IFN-γ分泌细胞的相对数量。数据显示由BB21.RSVF-2A-GLuc引发的抗原特异性细胞免疫应答是剂量依赖性的，并且根据剂量，在大小上与基准载体Ad26.RSVF-2A-GLuc诱导的免疫应答相似(图4C)。正如预期的那样，从用编码萤火虫萤光素酶的腺病毒载体免疫的小鼠的脾细胞中没有测量到RSV-F_A2特异性应答。

通过ELISA评估了表达RSVF-2A-GLuc的载体引发RSV-F_A2特异性IgG抗体的能力。在抗RSV F_A2 IgG抗体ELISA中测试了从用表达RSVF-2A-GLuc或萤火虫萤光素酶的Ad26或BB21载体免疫的小鼠免疫后8周时收集的血清。具体而言，此ELISA检测能够结合重组稳定的融合前RSV-F_A2蛋白(前RSV-F)的IgG抗体。结果表明，BB21.RSVF-2A-GLuc以剂量依赖性方式引发了与Ad26.RSVF-2A-GLuc所诱导的相似的前RSV-F特异性IgG抗体滴度(图4D)。相比之下，正如预期的那样，在用编码萤火虫萤光素酶的载体免疫的小鼠的血清中未检测到RSV-F_A2特异性抗体滴度。

总体而言，数据显示，BB21载体诱导了针对所编码的抗原的强有力的细胞和体液免疫应答，其大小与基于HAdV-26的基准载体所诱导的相似。这些免疫应答清楚地表明了BB21载体在小鼠中的强有力的免疫原性。

实例7：由BB24.RSVF-2A-GLuc诱导的细胞和体液免疫应答

使用RSV-F_A2-2A-GLuc(RSVF-2A-GLuc)作为载体编码的(模型)疫苗抗原，进一步评估了新型腺病毒载体BB24的免疫原性。用Ad26.RSVF-2A-GLuc(阳性对照)、BB24.RSVF-2A-GLuc或Ad48.RSVF-2A-GLuc(分别以每只小鼠10⁸、10⁹和10¹⁰个病毒颗粒)或者用Ad26.FLuc、BB24.Fluc或Ad48.FLuc(分别以每只小鼠10¹⁰个病毒颗粒)肌内免疫Balb/C小鼠。根据与用于BB21.RSVF-2A-GLuc相同的实验设置(图4A)，在免疫后八周处死小鼠，收集血液和脾细胞。如下所述评估不同的免疫参数。

为了评估BB24.RSVF-2A-Gluc引发呼吸道合胞病毒中和抗体的能力，进行了病毒中和试验。图5A描绘了免疫后八周时收集的血清样品所测得的呼吸道合胞病毒株A2(RSVA2)VNA滴度。每个点代表一只小鼠，条代表组平均值，虚线对应于定量下限(LLOQ＝6,88；线性样品的平均终点滴度)。三种载体所见的结果相似：10⁹和10¹⁰vp剂量免疫中的一些或全部观察到中和滴度，而在10⁸vp剂量下没有或几乎没有检测到任何中和滴度。通过RSV-F_A2特异性ELISPOT试验评估了针对载体编码的抗原的细胞免疫诱导。为此，在免疫后八周时，分离来自免疫小鼠的脾细胞，用跨越RSV-F_A2蛋白的15mer重叠肽刺激过夜，通过离体ELISPOT试验测定细胞免疫应答，该试验测量IFN-γ分泌细胞的相对数量。数据显示由BB24.RSVF-2A-GLuc引发的抗原特异性细胞免疫应答是剂量依赖性的，并且根据剂量，至少在大小上与对比载体Ad26.RSVF-2A-GLuc和Ad48.RSVF-2A-GLuc诱导的免疫应答相似(图5B)。正如预期的那样，从用编码萤火虫萤光素酶的腺病毒载体免疫的小鼠的脾细胞中没有测量到RSV-F_A2特异性应答。

通过ELISA评估了表达RSVF-2A-GLuc的载体引发RSV-F_A2特异性IgG抗体的能力。在抗RSV F_A2 IgG抗体ELISA中测试了从用表达RSVF-2A-GLuc或萤火虫萤光素酶的Ad26、Ad48或BB24载体进行免疫的小鼠免疫后8周时收集的血清。具体而言，此ELISA检测能够结合重组稳定的融合前RSV-F_A2蛋白(前RSV-F)的IgG抗体。结果表明，BB24.RSVF-2A-GLuc以剂量依赖性方式引发了与Ad26.RSVF-2A-GLuc和Ad48.RSVF-2A-GLuc所诱导的相似的前RSV-F特异性IgG抗体滴度(图5C)。相比之下，正如预期的那样，在用编码萤火虫萤光素酶的载体免疫的小鼠的血清中未检测到RSV-F_A2特异性滴度。

总体而言，数据显示，BB24载体诱导了针对所编码的抗原的强有力的细胞和体液免疫应答，其大小与基于HAdV-26的基准载体所诱导的相似。这些免疫应答清楚地表明了BB24载体在小鼠中的强有力的免疫原性。

实例8：由Ad4Ptr01-BB24.RSVF-2A-GLuc和Ad4Ptr13-BB21.RSVF-2A-GLuc诱导的细胞和体液免疫应答

使用RSV-F_A2-2A-GLuc(RSVF-2A-GLuc)作为载体编码的(模型)疫苗抗原，进一步评估了新型工程化腺病毒载体Ad4Ptr01-BB24和Ad4Ptr13-BB21的相应免疫原性。用Ad26.RSVF-2A-GLuc(阳性对照)、Ad4Ptr01-BB24.RSVF-2A-GLuc或Ad4Ptr13-BB21.RSVF-2A-GLuc(分别以每只小鼠10⁸、10⁹和10¹⁰个病毒颗粒)或者用Ad26.FLuc、Ad4Ptr01-BB24.FLuc或Ad4Ptr13-BB21.FLuc(分别以每只小鼠10¹⁰个病毒颗粒)肌内免疫Balb/C小鼠。根据与用于BB21.RSVF-2A-GLuc相同的实验设置(图4A)，在免疫后八周时收集血样和脾细胞。如下所述评估不同的免疫参数。

为了评估Ad4Ptr01-BB24.RSVF-2A-GLuc和Ad4Ptr13-BB21.RSVF-2A-GLuc引发呼吸道合胞病毒中和抗体的能力，进行了病毒中和试验。图6A描绘了免疫后八周时收集的血清样品所测得的呼吸道合胞病毒株A2(RSV A2)VNA滴度。每个点代表一只小鼠，条代表组平均值，虚线对应于定量下限(LLOQ＝6,88；线性样品的平均终点滴度)。结果表明，用Ad4Ptr01-BB24.RSVF-2A-GLuc和Ad4Ptr13-BB21.RSVF-2A-GLuc以10¹⁰vp剂量免疫均产生了RSV A2中和滴度。

通过RSV-F_A2特异性ELISPOT试验评估了针对载体编码的抗原的细胞免疫诱导。为此，在免疫后八周时，分离来自免疫小鼠的脾细胞，用跨越RSV-F_2A蛋白的15mer重叠肽刺激过夜，通过离体ELISPOT试验测定细胞免疫应答，该试验测量IFN-γ分泌细胞的相对数量。数据显示，Ad4Ptr13-BB21.RSVF-2A-Gluc和Ad4Ptr01-BB24.RSVF-2A-GLuc均能够引发剂量依赖性抗原特异性细胞免疫应答(图6B)。正如预期的那样，从用编码萤火虫萤光素酶的腺病毒免疫的小鼠的脾细胞中没有测量到RSV-F_A2特异性应答。

通过ELISA评估了表达RSVF-2A-GLuc的载体引发RSV-F_A2特异性IgG抗体的能力。在抗RSV F_A2 IgG抗体ELISA中测试了从用表达RSVF-2A-GLuc或萤火虫萤光素酶的Ad26(阳性对照)、Ad4Ptr13-BB21或Ad4Ptr01-BB24载体免疫的小鼠免疫后8周时收集的血清。具体而言，此ELISA检测能够结合重组稳定的融合前RSV-F_A2蛋白(前RSV-F)的IgG抗体。结果表明，Ad4Ptr13-BB21.RSVF-2A-Gluc和Ad4Ptr01-BB24均能够以剂量依赖性方式引发前RSV-F特异性IgG抗体滴度(图6C)。正如预期的那样，在仅用编码萤火虫萤光素酶的载体免疫的小鼠的血清中未检测到RSV-F_A2特异性滴度。

总体而言，数据显示表达RSVF-2A-GLuc的新型工程化腺病毒载体Ad4Ptr13-BB21和Ad4Ptr01-BB24(它们分别包含BB21纤维变体(SEQ ID NO:58)和BB24纤维(SEQ ID NO:2))能够诱导针对所编码的抗原的明显的细胞和体液免疫应答。这些免疫应答清楚地表明Ad4Ptr13-BB21和Ad4Ptr01-BB24在小鼠中具有良好的免疫原性。

实例9：对新型和现有腺病毒载体之间的血清交叉中和的评估

由于它们作为新腺病毒疫苗载体的潜在用途，本文产生的新型腺病毒载体优选地在血清学上不同于目前已经开发作为疫苗载体(诸如基于人腺病毒血清型HAdV-5和HAdV-35的载体)的现有腺病毒载体。因此，在新型腺病毒载体BB21、BB24、Ad4Ptr13-BB21和Ad4Ptr01-BB24以及基于HAdV-4、HAdV-5、HAdV-26、HAdV-35和HAdV49的几种现有载体之间进行了交叉中和测试。为此，在腺病毒中和试验中，针对每种不同的载体测试小鼠抗血清，每种抗血清针对这些腺病毒载体之一而产生。在将Balb/C小鼠用每只小鼠10¹⁰个载体颗粒免疫后两周或八周时，从这些小鼠收集用于该试验的小鼠抗血清。如先前所述(Spangers等人2003.J.Clin.Microbiol.[临床微生物学杂志]41:5046-5052)进行腺病毒中和试验。简而言之，从1:16稀释开始，将血清进行2倍系列稀释，然后与表达萤火虫萤光素酶(FLuc)的腺病毒载体预混合，然后与A549细胞温育过夜(以每个细胞500个病毒颗粒的感染复数)。感染后24小时测得的被感染细胞裂解物中的萤光素酶活性水平代表载体感染效率。针对给定载体的中和滴度定义为能够使载体感染效率降低90％的最高血清稀释度。中和滴度可任意分为以下几类：<16(无中和)、16至200、200至2,000和>2,000。

结果表明，在所测试的载体之间没有或只有极低水平的交叉中和(图7)。所观察到的唯一的轻微交叉中和在载体BB21与Ad4Ptr13-BB21之间。对于这些载体观察到的相互交叉中和滴度明显低于对于这些相同载体所获得的相应的同源中和滴度。重要的是，新型载体(即BB21、BB24、Ad4Ptr13-BB21和Ad4Ptr01-BB24)均未显示出与测试组中所含的人腺病毒载体即Ad26、Ad35、Ad49、Ad5和Ad4的交叉中和。因此，新的腺病毒载体BB21、BB24、Ad4Ptr13-BB21和Ad4Ptr01-BB24各自都可以潜在地与一种或多种这些或其他不同的腺病毒载体联合用于顺序免疫，例如在异源初免-加强疫苗接种方案的情况下，或者，另选地或除此之外，在一系列针对不同疾病或抗原的两个或更多个连续疫苗接种方案的情况下。

实例10：新型腺病毒载体在人群中的血清阳性率

对于它们作为有效疫苗载体的潜在用途而言重要的是，本文所述的新型腺病毒载体不受疫苗目标群体中高水平的预先存在的抗载体体液免疫的妨碍。因此，在200个来自成年人的人群血清样品中分别评价了载体BB21、BB24、Ad4Ptr13-BB21和Ad4Ptr01-BB24的血清阳性率，这些成年人年龄为18-55岁，生活在美国(US)和欧盟(EU)。通过进行如实例9中所开展的且如先前所述的(Sprangers等人2003.J.Clin.Microbiol.[临床微生物学杂志]41:5046-5052)标准腺病毒中和试验，测试了每种载体被人血清样品中和的情况。简而言之，从1:16稀释开始，将血清进行2倍系列稀释，然后与表达萤火虫萤光素酶(FLuc)的腺病毒载体预混合，然后与A549细胞温育过夜(以每个细胞500个病毒颗粒的感染复数)。感染后24小时测得的被感染细胞裂解物中的萤光素酶活性水平代表载体感染效率。针对给定载体的中和滴度定义为能够使载体感染效率降低90％的最高血清稀释度。中和滴度可任意分为以下几类：<16(无中和)、16至300、300至1000、1000至4000和>4000。

结果表明，所有四种新型腺病毒载体(即BB21、BB24、Ad4Ptr13-BB21、Ad4Ptr01-BB24)在所研究的人类受试者中的血清阳性率都比对照Ad5载体低得多(图8)。此外，载体BB21、Ad4Ptr13-BB21和Ad4Ptr01-BB24还显示出比基准Ad26载体低的血清阳性率。此外，针对新型载体所见的阳性中和滴度通常相当低，大部分不高于300。相比之下，大多数针对Ad26和Ad5发现的阳性中和滴度高于300。

总体而言，上述数据表明，可以认为在所评估的疫苗目标群体中，针对载体BB21、BB24、Ad4Ptr13-BB21和Ad4Ptr01-BB24的预先存在的体液抗载体免疫是较低的，这表明这些载体在这些群体中具有作为有效疫苗载体的潜力。

实例11：在悬浮PER.C6细胞中的腺病毒载体生产率

用于临床试验及其他方面的腺病毒载体需要在可扩展的无血清腺病毒生产平台中容易地生产至高滴度。悬浮-适应的

细胞(本文也称为悬浮PER.C6细胞或sPER.C6)代表了这样的平台，因为它们已经显示出支持在生物反应器中大规模生产腺病毒载体，获得大量高滴度的临床级载体制备物，例如基于HAdV-26或HAdV-35的E1缺失型载体的制备物(EP 2536829 B1、EP 2350268 B1)。

作为关于本文所述的新型载体是否适合基于sPER.C6细胞的生产工艺的初步评估，对在摇瓶中培养的sPER.C6细胞进行了小规模载体生产率实验。这些生产率实验使用实例1和2中所述的新型载体的Fluc编码形式进行。基于HAdV-26的载体Ad26.Fluc用作基准对照。将以1×10⁶个细胞/ml的密度接种在摇瓶中的总体积为10ml的补充了4mM L-谷氨酰胺(龙沙集团(Lonza))的

培养基(可从龙沙集团获得)中的悬浮PER.C6细胞培养物用不同的载体以不同的病毒颗粒(VP)-细胞比感染，然后温育4天。用于感染的不同VP-细胞比是70、150和900。每天采集被感染的细胞培养物的样品，并通过基于定量PCR(qPCR)的方案测定这些样品中的VP滴度，该方案采用对CMV启动子(其存在于所有测试的载体中)特异的引物和探针。该方案需要在qPCR之前对测试样品进行DNA酶处理，以除去任何游离的载体DNA(即未包装到病毒颗粒中的载体基因组)。

新型载体BB21.FLuc和BB24.Fluc所获得的生产率结果示于图17，而新嵌合载体Ad4Ptr01-BB24.FLuc和Ad4Ptr13-BB21.FLuc及其亲本载体Ad4.Fluc所见的结果示于图18。在所测试的所有VP-细胞感染比和收获时间点下，BB21.FLuc和BB24.Fluc均显示出比基准对照载体Ad26.Fluc更高的VP滴度。同样，两个嵌合载体Ad4Ptr01-BB24.FLuc和Ad4Ptr13-BB21.FLuc显示出良好的生产率，产生的VP滴度高于或似乎等于Ad26.Fluc所获得的VP滴度(取决于所用的VP-细胞感染比)。另外，这两种嵌合载体与亲本、非衣壳修饰的载体Ad4.Fluc相比，显示出未受损的生产率。

上述结果证明每种新型载体在基于sPER.C6的无血清悬浮细胞培养模型上的良好生产率。

总之，如上所述，对由本发明的新型重组腺病毒载体诱导的体液和细胞免疫应答进行的研究清楚地表明这些载体在小鼠中的强有力的免疫原性。此外，这些载体被证明不诱导针对某些现有腺病毒疫苗载体候选物(例如Ad26和Ad35)的交叉中和抗体应答，反之亦然；也不诱导或诱导非常低的针对彼此的交叉中和抗体应答。此外，这些新载体在人类中显示出低血清阳性率。最后，这些新载体可以容易地以高产率产生。低血清阳性率、强有力的免疫原性和可生产性的组合表明本发明的新型腺病毒载体可用作针对多种病原体的新型疫苗载体候选物，并且可另外用于基因疗法和/或诊断。

本领域技术人员将理解，在不偏离本发明的广泛发明构思的情况下，可以对上述实施例进行改变。因此，应当理解，本发明不限于所披露的特定实施例，而是旨在涵盖由本说明书限定的本发明的精神和范围内的修改。

Claims

1.一种分离的核酸序列，该分离的核酸序列编码纤维多肽，该纤维多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸6-375具有至少98％的同一性。

2.如权利要求2所述的分离的核酸序列，其中该纤维多肽包含选自BB21纤维多肽(SEQID NO:1)、BB21纤维变体多肽(SEQ ID NO:58)或BB24纤维多肽(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的分离的核酸序列，其中该分离的核酸进一步包含编码六邻体多肽的核酸序列，该六邻体多肽包括含有选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。

4.如权利要求3所述的分离的核酸序列，其中该六邻体多肽包含选自BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

5.一种分离的核酸序列，该分离的核酸序列编码六邻体多肽，该六邻体多肽包括含有选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。

6.如权利要求5所述的分离的核酸序列，其中该六邻体多肽包含选自BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

7.一种载体，该载体包含如权利要求1-6中任一项所述的核酸。

8.如权利要求7所述的载体，该载体为腺病毒载体，并且进一步包含转基因。

9.一种重组细胞，该重组细胞包含如权利要求7或8所述的载体。

10.一种生产载体的方法，该方法包括：

(a)使如权利要求9所述的重组细胞在用于生产该载体的条件下生长；

(b)从该重组细胞中分离该载体。

11.一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含如权利要求8所述的载体。

12.一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求11所述的免疫原性组合物。

13.一种腺病毒载体，该腺病毒载体包含：

(a)至少一种转基因；以及

(b)编码纤维多肽的核酸序列，其中该纤维多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸6-375具有至少98％同一性的氨基酸序列。

14.如权利要求13所述的腺病毒载体，其中该纤维多肽包含选自BB21纤维多肽(SEQ IDNO:1)、BB21纤维变体多肽(SEQ ID NO:58)或BB24纤维多肽(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。

15.如权利要求13或14所述的腺病毒载体，该腺病毒载体进一步包含编码六邻体多肽的核酸序列，该六邻体多肽包括含有选自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的含六邻体高变区多肽。

16.如权利要求15所述的腺病毒载体，其中该六邻体多肽包含选自BB21六邻体多肽(SEQ ID NO:5)或BB24六邻体多肽(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列。

17.如权利要求13-16中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体进一步包含E1缺失。

18.如权利要求13-17中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体进一步包含E3缺失。

19.如权利要求13-18中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体是包含一个或多个人腺病毒核酸序列的嵌合腺病毒载体。

20.如权利要求19所述的腺病毒载体，其中所述人腺病毒核酸序列来自人腺病毒-4、人腺病毒-5、人腺病毒-26或人腺病毒-35。

21.如权利要求20所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含人腺病毒-5(hAdV-5)E4orf6。

22.如权利要求13-21中任一项所述的腺病毒载体，其中该转基因位于E1缺失位点、E3缺失位点或与右反向末端重复序列(rITR)相邻。

23.如权利要求13-22中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含选自由SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29组成的组的核酸序列。

24.如权利要求13-14和17-23中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含选自SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:55的核酸序列。

25.一种疫苗，该疫苗包含如权利要求13-24中任一项所述的腺病毒载体和药学上可接受的载剂。

26.一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求25所述的疫苗。

27.一种生产疫苗的方法，该方法包括将如权利要求13-24中任一项所述的腺病毒载体与药学上可接受的载剂组合。