CN111349642A

CN111349642A - 基因表达盒及其应用

Info

Publication number: CN111349642A
Application number: CN202010180841.0A
Authority: CN
Inventors: 涂桂洪; 邓惠平
Original assignee: Guangzhou Jinyinyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Jinyinyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-16
Filing date: 2020-03-16
Publication date: 2020-06-30

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种基因表达盒及其应用。该基因表达盒包含：a.缺乏启动子的第一报告基因；以及b.位于a的5’端的片段，其序列中至少包含两个不同的酶切位点。5’端的片段能够形成一个高通量捕获组成型启动子的“鸟笼”结构，若“鸟笼”中插入的片段可使得所述第一报告基因表达，则说明该插入的片段中包含适合于宿主细胞的启动子，由此可进行高通量的启动子筛选。

Description

基因表达盒及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种基因表达盒及其应用。

背景技术

启动子是基因有效表达和基因工程产业化的一个关键元件，它决定一个基因产物的产量高低和生产工艺技术的水平。

利用基因工程技术生产重组蛋白，目前普遍采用以宿主细胞，特别是大肠杆菌(E.coli)为外源基因宿主菌的诱导型表达系统。以下以最常见的宿主细胞——大肠杆菌为例来说明诱导型表达系统的缺陷。该表达系统广泛使用的是以乳糖操纵子(lac operon)的启动子为基础改造而来的各种启动子(包括trc,lac,tac,lacUV5-T7等)。利用大肠杆菌表达系统生产重组蛋白的优点是：大肠杆菌容易培养、发酵周期短、单位时间产量比酵母和哺乳动物细胞高，培养基的成本低。因此目前大多数实现重组蛋白规模化生产的仍然是使用诱导型大肠杆菌表达系统。

但是诱导型表达系统的缺点也非常明显：1，该表达系统需要添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导物。由于IPTG价格昂贵并且有毒，不利于药用重组蛋白的生产，药用重组蛋白明文规定不得使用IPTG；2，大肠杆菌表达外源基因通过诱导剂(IPTG)或物理方法(温敏)进行诱导，诱导时机和诱导强度对于外源基因的表达至关重要，不容易掌握；3，诱导后菌体生长停止，无法进行高密度培养，生物量和外源蛋白的表达量一般不会很高；4，大肠杆菌没有完整的分泌机制，大多数外源基因在诱导高表达时往往形成不溶性的包涵体留在细胞内。这给后续的提取工艺带来了极大的麻烦，变性、复性过程繁琐耗时，并常常会出现错配，重组蛋白的回收率一般不超过30％。

这是诱导型表达系统一直面临的最大技术障碍。建立大肠杆菌组成型分泌表达系统是克服这个技术障碍最有效的方法。田林奇等人(《中国生物工程杂志》，2010,30(3):61～66)把大肠杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因和包括该基因5’-端组成型启动子序列的整个DNA片段克隆在大肠杆菌pBR322质粒上并转化大肠杆菌，实现了S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因的组成型表达。宫长斌(《过程工程学报》，第7卷第3期，2007年6月)将pUC19载体上乳糖操纵子的转录起始部位+5～+17间的几处碱基进行了突变，变为组成型启动子，实现了天冬氨酸转氨酶AspAT的组成型表达。

上述两例均为利用大肠杆菌基因自身的、或人工突变的组成型启动子实现大肠杆菌自身基因的组成型表达。

H.Poo等人(Biotechnol.Lett.24(2002)1185–1189)克隆了地芽孢杆菌(Geobacillus toebii)的D-氨基酸氨基转移酶基因，并鉴定了位于该基因上游5’-端的启动子序列。H.Poo等人利用该异源启动子在大肠杆菌(E.coli)实现了重组人肿瘤坏死因子(rhTNF)的组成型表达。Ki Jun Jeong等(Protein Expression and Purification 36(2004)150–156)利用该异源组成型启动子在大肠杆菌(E.coli)中表达了人瘦素(leptin)基因，不添加任何诱导剂，在流加补料的情况下获得了2.1g/L的瘦素。文献中未见目标蛋白可溶性分泌表达的任何提示，推测应为胞内表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于通过高通量筛选组成型启动子的方法及系统，以简化药用重组蛋白工业化生产工艺过程。

本发明涉及一种基因表达盒，包含：

a.SEQ ID NO:1所示的片段，其为缺乏启动子的四环素抗性基因，且所述四环素抗性基因5’端的片段包含BglII、NdeI以及EcoRI酶切位点；

b.pT7-7质粒上所具有的青霉素抗性基因；且所述青霉素抗性基因能够在非诱导条件下进行表达。

5’端的片段能够形成一个高通量捕获组成型启动子的“鸟笼”结构，若“鸟笼”中插入的片段可在无诱导物的情况下使得所述四环素抗性基因，则说明该插入的片段中包含组成型启动子，若只有青霉素抗性基因表达而四环素基因不表达，则说明所插入的启动子并非组成型启动子。

本发明还涉及一种能够表达报告基因的基因表达盒，其由如上所述的基因表达盒中在BglII与NdeI/EcoRI酶切位点之间插入组成型启动子之后，并在所述组成型启动子之后插入目的基因得到。

根据本发明的再一方面，含有如上所述的基因表达盒，或含有如上所述的能够表达报告基因的基因表达盒的载体及宿主细胞。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的基因表达盒在宿主细胞的组成型启动子筛选中的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中以pBR322质粒DNA为模版并加入(T6/T3；T5/T3；T4/T3)引物进行三轮PCR反应的反应原理示意图；

图2为本发明一个实施例中PCR反应产物T3的电泳图谱；

图3为本发明一个实施例中T3插入T7质粒的结构示意图；虚线为本发明构建“鸟笼”核心结构区域，用于克隆启动子的片段，Tet ^R为报告基因；

图4为本发明一个实施例中酶切鉴定结果表明T3/T7的电泳图谱；

图5为本发明一个实施例中分离得到的Hpro1电泳结果；

图6为本发明一个实施例中将Hpro1插入到T3/T7的结构示意图；

图7为本发明一个实施例中大肠杆菌外膜蛋白A前导肽(ompA)和hEGF基因的表达框架示意图；

图8为本发明一个实施例中HE5/BL21例中培养基上清中hEGF的电泳结果；

图9为本发明一个实施例中HE5/BL21例中培养基菌体残留的hEGF的电泳结果；

图10为本发明一个实施例中HE5/TG1例中hEGF的电泳结果。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及一种基因表达盒，包含：

青霉素抗性基因能够在四环素抗性基因无法表达的前提下进行表达，以方便对宿主细胞的筛选。

在本发明中，宿主细胞指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞优选为原核细胞，更优选为大肠杆菌。

在本发明中，诱导型启动子的诱导条件可以是各种诱导剂(例如IPTG)或物理条件(如温度)。

在一些实施方式中，所述四环素抗性基因的3’端具有至少一个终止子。

在一些实施方式中，所述终止子为rrnBT₁T₂。

在一些实施方式中，所述组成型启动子序列如SEQ ID NO:2所示。

在一些实施方式中，所述目的基因为hEGF，且所述hEGF的上游、所述组成型启动子的下游还具有可用于分泌型表达的信号肽基因。

在一些实施方式中，所述信号肽基因为外膜蛋白基因。

在一些实施方式中，所述外膜蛋白基因为ompA。

在本发明的一个具体的实施例中，利用从土壤宏基因组克隆的一个组成型启动子序列、大肠杆菌外膜蛋白A分泌引导肽(ompA)序列、人表皮生长因子(hEGF)基因和转录终止子(rrnBT1T2)组成表达框架。本发明证实，所克隆的组成型启动子在不添加任何诱导剂的情况下具有很强的表达外源基因的活性，并且在大肠杆菌外膜蛋白A分泌引导肽(ompA)的作用下实现了hEGF的可溶性分泌表达和跨膜转运。按本发明构建的工程菌，在连续流加补料的条件下，菌体密度OD₆₀₀高达100，其表达的人表皮生长因子(hEGF)90％以上分泌到培养基中，残留在菌体中的人表皮生长因子(hEGF)不到10％。发酵液经膜过滤后再用凝胶层析分离纯化，可获得纯度大于99％的人表皮生长因子，收得率为200mg/L发酵液。

本发明还涉及一种载体，其含有如上所述的基因表达盒，或含有如上所述的能够表达报告基因的基因表达盒。

术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。该载体最好来源于病毒。该载体最好含有包装和传递到该细胞所需的基本序列。希望该载体一部分由包膜或未包膜的病毒组成。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。本发明优选大肠杆菌载体；在一些实施方式中，所述载体中不含有除a)以外的BglII、NdeI以及EcoRI酶切位点；在一些实施方式中，所述载体由如上所述的基因表达盒插入到T7质粒的BglII/PstI位点上构建得到。

本发明还涉及一种宿主细胞，其基因组中含有如上所述的基因表达盒，或含有如上所述的能够表达报告基因的基因表达盒。

在一些实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

在一些实施方式中，所述应用包括：

1)将待筛选的核酸两端分别设置BglII与NdeI/EcoRI酶切位点；

2)将步骤1)中序列连接入所述的基因表达盒；

3)将步骤2)中得到的产物在宿主细胞中于非诱导条件下进行表达；

4)若步骤3)中的宿主细胞中所述第一报告基因能够表达，则所述待筛选的核酸序列中包含可用于宿主细胞的组成型启动子。

在一些实施方式中，所述待筛选的核酸为来源于动物、植物、微生物的天然核酸，或人工合成的核酸。

在一些实施方式中，所述动物为哺乳动物，例如人、大鼠、小鼠、兔、猴、猪、马、猫、犬等。

在一些实施方式中，所述动物为昆虫，例如秀丽线虫。

在一些实施方式中，所述动物为鱼，例如斑马鱼。

在一些实施方式中，所述植物为拟南芥。

在一些实施方式中，所述微生物为细菌，例如肠杆菌目细菌。

在一些实施方式中，所述待筛选的核酸长度低于200bp，例如190bp、180bp、170bp、160bp、150bp、130bp、110bp、90bp或更短。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1不带启动子Tet^R报告基因(Reporter)的克隆与改造

1.Tet^R基因的5’-端原序列作如下改动：ATG前的TGT改为CAT，在ATG两侧增加了NdeI和EcoRI切点，原EcoRI切点改为BglII。

四环素抗性基因(Tet^R)5’-端原序列

本发明改造后的序列

PCR引物的设计

T4:5’-ATAGATCTCA TGTTTGACAG CTTATCATCG ATAAGCTTTA ATGCGG-3’

T5:5’-GCTTTAATGC GGTAGTTTAT CACAGTTAAA TTGCTAACGC AG-3’

T6:5’-TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGCATATGGA ATTCAAATCT AACAAT-3’

Tet3:5’-AGTTCTGCAGAAGAATTGATTGGCTC-3’

2.以pBR322质粒DNA为模版并加入(T6/T3；T5/T3；T4/T3)引物进行三轮PCR反应(图1)，每个反应为30个循环，取1μl作下一次PCR反应的模板，最后一轮PCR反应的产物记作T3。

T3的PCR电泳图谱如图2所示。

T3中所包含的不含有启动子的四环素抗性基因的序列如SEQ ID NO:1所示：

3.PCR产物BglII/PstI酶切片段克隆在T7-7质粒BglII/PstI位点上(图3)，T7-7质粒具有青霉素抗性基因，而T3基因片段缺乏启动子不能表达出四环素抗性。用该重组质粒(T3)转化E.coli后获得的转化子表型为:(Amp^R/Tet^S)，对青霉素具有抗性而对四环素敏感。连接转化，转化产物直接涂布在含青霉素(+Ap，20μl/ml)的LB平板上，挑选青霉素抗性、四环素敏感(Amp^R/Tet^S)的菌落制备质粒(T3/T7)。

4.T3/T7分别用(BglII,NdeI,BglII/NdeI)酶切鉴定，并回收BglII/NdeI片段备用。T3/T7酶切鉴定结果如图4所示，酶切鉴定结果表明T3/T7结构正确。实施例2从土壤宏基因组中克隆组成型启动子DNA序列

1.取堆肥10cm深处土壤约1g，加入无菌水5ml，摇散后100℃煮沸10分钟，静置片刻取上清1ml加入2xLB培养基1ml，37℃震荡培养过夜。

2.过夜培养物静置片刻，取上层1ml培养液，6000rpm离心1分钟，弃去上清，加入1ml无菌水洗涤，6000rpm再离心1分钟，弃去上清，沉淀物加入0.2ml无菌水，振荡摇匀后在100℃水浴锅煮沸10分钟，12000rpm离心10分钟，上清用作PCR的模板DNA。

3.PCR反应。反应液组成如下:

10×缓冲液5μl

4×dNTP(0.25mM)5μl

Primer l(50nM)1μl

Primer 2(50nM)1μl

模板DNA 10μl

Taq酶1μl加无菌双蒸馏水至50μl

用于克隆启动子的引物序列，5’-端预设BglII酶切位点，3’-端预设EcoRI酶切位点：

PCR反应30个循环:94℃ 5分钟，94℃ 1分钟，50℃ 0.5分，72℃ 1分钟，72℃ 10分钟，30个循环。

4.PCR产物琼脂糖凝胶电泳纸片法分离纯化

结果如图5所示，纸片回收PCR产物，并用NdeI/BglII酶切、回收酶切片段备用。克隆后的结构如图6所示。

5.上述用BglII…NdeI酶切好的质粒DNA和PCR产物的NdeI/BglII酶切片段按比例混合、T4DNA连接酶连接，连接产物按常规方法转化感受态大肠杆菌。转化后的大肠杆菌置于含有青霉素和四环素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜。过夜培养物连续转接到逐步提高四环素浓度的LB培养基中以富集对高浓度四环素有抗性的菌株。

6.经过连续传代的液体培养物适当稀释后涂布在含有青霉素和四环素的LB琼脂平板上，单菌落分离。出现四环素和青霉素双抗性(Amp^R/Tet^R)的转化子说明克隆的片段具有组成型启动子的活性。把筛选出的具有四环素和青霉素双抗性(Amp^R/Tet^R)的转化子送测序，其中一个转化子(命名为Hpro1)的测序结果(约200bp)如下:

AGTGCAAGCTTGCATGCCTGGAGGTCGACTCTAGAAGATCTGATCTCTCCTTCACAGATTCCCAATCTCTTGTTAAATAACGAAAAAGCATCAATCAAAACGGCGGCATGTCTTTCTATATTCCAGCAATGTTTTATAGGGGACATATTGATGAAGATGGGTATCACCTTAGTAAAAAAAGAATTGCTATAAGCTGCTCTTTTTTGTTCGTGATATACTGATAATAAATTGAATTTTCACACTTCTGGAAAAAGGAGATATCATATGGAATTC(SEQ ID NO:2)

实施例3EGF组成型分泌表达框架的构建

1.根据人表皮生长因子(hEGF)的氨基酸组成，选用大肠杆菌偏爱的密码子电脑设计了人表皮生长因子的基因的DNA序列，分段PCR合成。5’-端预设了酶切位点EcoRI，3’-端预设酶切位点PstI。

人工合成人表皮生长因子基因的DNA序列：

2.含有大肠杆菌分泌引导肽序列(ompA)和hEGF基因的DNA片段的合成。根据GenBank文库记录的大肠杆菌外膜蛋白(ompA)的DNA序列合成了两条引物：

ompA1的3’-端与ompA2的5’-端有12个碱基的重叠，在ompA2的3’-端与hEGF基因的5’-端有9个碱基的重叠。另外合成一段与人表皮生长因子(hEGF)基因3’-端序列互补的引物，并在引物中设计了酶切位点PstI：

3.以人工合成的人表皮生长因子(hEGF)DNA作模板，加入引物ompA1、ompA2和E3进行PCR反应，反应产物记作ompA-hEGF，用限制性内切酶NdeI和PstI酶切，纸片法回收片段。把ompA-hEGF酶切片段连接到T3/T7的NdeI和PstI酶切位点上，替换原来的四环素结构基因，构成含有组成型启动子(Hpro1)、大肠杆菌外膜蛋白A前导肽(ompA)和hEGF基因的表达框架如图7所示。任意外源基因替换四环素结构基因后转化子表型由青霉素抗性、四环素抗性(Amp^R/Tet^R)变为青霉素抗性、四环素敏感(Amp^R/Tet^S)，利用本发明构建的表达框架很容易实现重组蛋白基因的组成型可溶性分泌表达。

4.人表皮生长因子(hEGF)组成型分泌表达试验

本发明构建的含有组成型启动子(Hpro1)、大肠杆菌外膜蛋白A前导肽(ompA)和hEGF基因的表达框架的重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)和E.coli TG1。转化子分别记作HE5/BL21和HE5/TG1，分别在含青霉素的LB培养基中37℃通气培养16小时，离心收集菌体和上清液。菌体和上清液分别作聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果显示，在HE5/BL21例中表达稳定，90％hEGF分泌到培养基上清(图8)，菌体残留的hEGF不到10％(图9)；在HE5/TG1例中hEGF表达不稳定(图10)。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市金因源生物技术有限公司

<120> 基因表达盒及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1275

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

atagatctca tgtttgacag cttatcatcg ataagcttta atgcggtagt ttatcacagt 60

taaattgcta acgcagtcag gcaccgcata tggaattcaa atctacaatg cgccctcggc 120

accgtcaccc tggatgctgt aggcataggc ttggttatgc cggtactgcc gggcctcttg 180

cgggatatcg tccattccga cagcatcgcc agtcactatg gcgtgctgct agcgctatat 240

gcgttgatgc aatttctatg cgcacccgtt ctcggagcac tgtccgaccg ctttggccgc 300

cgcccagtcc tgctcgcttc gctacttgga gccactatcg actacgcgat catggcgacc 360

acacccgtcc tgtggatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca 420

ggtgcggttg ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac 480

ttcgggctca tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga 540

ctgttgggcg ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc 600

aacctactac tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg tcgaccgatg 660

cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc 720

gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgctc 780

tgggtcattt tcggcgagga ccgctttcgc tggagcgcga cgatgatcgg cctgtcgctt 840

gcggtattcg gaatcttgca cgccctcgct caagccttcg tcactggtcc cgccaccaaa 900

cgtttcggcg agaagcaggc cattatcgcc ggcatggcgg ccgacgcgct gggctacgtc 960

ttgctggcgt tcgcgacgcg aggctggatg gccttcccca ttatgattct tctcgcttcc 1020

ggcggcatcg ggatgcccgc gttgcaggcc atgctgtcca ggcaggtaga tgacgaccat 1080

cagggacagc ttcaaggatc gctcgcggct cttaccagcc taacttcgat cactggaccg 1140

ctgatcgtca cggcgattta tgccgcctcg gcgagcacat ggaacgggtt ggcatggatt 1200

gtaggcgccg ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc atggagccgg 1260

gccacctcga cctga 1275

<210> 2

<211> 273

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

agtgcaagct tgcatgcctg gaggtcgact ctagaagatc tgatctctcc ttcacagatt 60

cccaatctct tgttaaataa cgaaaaagca tcaatcaaaa cggcggcatg tctttctata 120

ttccagcaat gttttatagg ggacatattg atgaagatgg gtatcacctt agtaaaaaaa 180

gaattgctat aagctgctct tttttgttcg tgatatactg ataataaatt gaattttcac 240

acttctggaa aaaggagata tcatatggaa ttc 273

<210> 3

<211> 247

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

gaattcatga aaaagacagc tatcgcgatt gcagtggcac tggctggttt cgctaccgta 60

gcgcaggccg ctagaattaa ttccgactct gaatgcccgc tgtctcacga cggttactgc 120

ctacacgatg gtgtttgcat gtatatcgaa gctctggaca aatacgcgtg caactgtgtt 180

gttggttaca tcggtgaacg ttgccagtac cgtgacctga aatggtggga actggttaat 240

actgcag 247

Claims

1.基因表达盒，包含：

2.根据权利要求1所述的基因表达盒，所述四环素抗性基因的3’端具有至少一个终止子。

3.根据权利要求2所述的基因表达盒，所述终止子为rrnBT₁T₂。

4.能够表达报告基因的基因表达盒，其由权利要求1～3任一项所述的基因表达盒中在BglII与NdeI/EcoRI酶切位点之间插入组成型启动子之后，并在所述组成型启动子之后插入目的基因得到。

5.根据权利要求4所述的能够表达报告基因的基因表达盒，所述组成型启动子序列如SEQ ID NO:2所示。

6.根据权利要求5所述的能够表达报告基因的基因表达盒，所述目的基因为hEGF，且所述hEGF的上游、所述组成型启动子的下游还具有可用于分泌型表达的信号肽基因。

7.根据权利要求6所述的能够表达报告基因的基因表达盒，所述信号肽基因为外膜蛋白基因。

8.载体，其含有权利要求1～3任一项所述的基因表达盒，或含有权利要求4～7任一项所述的能够表达报告基因的基因表达盒。

9.宿主细胞，其基因组中含有权利要求1～3任一项所述的基因表达盒，或含有权利要求4～7任一项所述的能够表达报告基因的基因表达盒。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其为大肠杆菌。

11.权利要求1～3任一项所述的基因表达盒在组成型启动子筛选中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，待筛选的核酸来源于动物、植物、微生物的天然核酸，或人工合成的核酸。