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CN111337666B - I-motif重组介导的FRET探针及其原位成像癌细胞表面蛋白质同源二聚化的应用 - Google Patents

I-motif重组介导的FRET探针及其原位成像癌细胞表面蛋白质同源二聚化的应用 Download PDF

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CN111337666B
CN111337666B CN202010096115.0A CN202010096115A CN111337666B CN 111337666 B CN111337666 B CN 111337666B CN 202010096115 A CN202010096115 A CN 202010096115A CN 111337666 B CN111337666 B CN 111337666B
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阚爱玲
张楠
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Shandong University
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Abstract

本发明涉及i‑motif重组介导的FRET探针及其原位成像癌细胞表面蛋白质同源二聚化的应用。该策略中，将目标蛋白的适体、i‑motif形成序列的一半(Half‑i)和FRET供受体对整合为探针。该探针通过适体结合绑定在目标蛋白上。发生同源二聚化的蛋白带领两个探针相互靠近，使得两个相同的Half‑i序列能够在酸性的肿瘤细胞外环境中重组为i‑motif，进而引发FRET效应。此设计中的FRET发生模式与蛋白同源二聚化模式的匹配度更高。该策略实现了对肿瘤活细胞表面的间充质上皮转化(Met)受体同源二聚化的准确、动态的原位成像，在生物医学研究中具有巨大潜力。

Description

I-motif重组介导的FRET探针及其原位成像癌细胞表面蛋白 质同源二聚化的应用
技术领域
本发明属于蛋白质同源二聚化的可视化监测领域，具体涉及一种i-motif重组介导的荧光共振能量转移(FRET)策略用于原位成像活的癌细胞表面蛋白质的同源二聚化。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
膜蛋白通过蛋白-蛋白相互作用执行大部分基本的生物学功能。特别是，研究发现膜蛋白的同源二聚化是许多信号通路中的初始步骤，在生理调节和癌症进展中都至关重要。例如，间充质上皮转化(Met)受体，是一种广泛表达的跨膜蛋白，在机体内平衡和癌症转移中起着重要的作用。Met介导的信号转导通路的激活是典型的同源二聚化模型。在其配体(肝细胞生长因子，HGF)的刺激下，无活性的Met单体转化为有活性的同源二聚体，进而引起随后的Met受体磷酸化和下游信号级联反应。揭示这些蛋白单体和同源二聚体的表达水平、空间分布和动态响应等信息，将非常有助于信号转导网络的研究。
由于能够灵敏、可逆地响应距离变化，FRET技术被广泛应用于开发蛋白质同源二聚化的可视化策略。这些策略的一般原理是通过特定的识别元件将FRET荧光对绑定到目标蛋白上，从而将不可视的蛋白质行为转换为可视的荧光变化。这些方法的确帮助人们更加直观地理解了蛋白质同源二聚化的行为特点，促进了对其作用机制的研究。但是，发明人发现：要想准确监测细胞膜蛋白同源二聚化的细微变化，目前的FRET方法准确度还不够。具体而言，蛋白同源二聚体是由两分子相同的蛋白质形成的，因此供体和受体将搭载相同的识别元件随机结合至目标蛋白单体。这种随机结合会产生供体和受体的三种组合：二分之一的“供体-受体”、四分之一的“供体-供体”和四分之一的“受体-受体”组合。在这三种组合中，只有“供体-受体”组合能够产生预期的FRET信号以指示蛋白的同源二聚化。其他两种组合虽然占据同源二聚化的蛋白却不产生指示蛋白二聚体的FRET信号。FRET信号和蛋白同源二聚化之间的这种不匹配导致仅一半的同源二聚化蛋白可以通过这些方法被检测到，信号损失严重。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种i-motif重组介导的FRET策略用于原位成像活的癌细胞表面蛋白质的同源二聚化。此设计中的FRET发生模式与蛋白质同源二聚化模式的匹配度更高。该策略实现了对活的癌细胞表面的间充质上皮转化(Met)受体同源二聚化的准确、动态的原位成像，在生物医学研究中具有巨大潜力。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供了一种i-motif重组介导的FRET探针，包括：执行链Half-i@Apt和预阻滞链Blocker；
所述执行链Half-i@Apt包含Half-i序列、Linker序列、目标蛋白的适体序列、与Linker以及Half-i的部分序列互补的Linker*，并将Cy5和Cy3分别标记在Half-i和Linker*的5'末端用作FRET的受体和供体；
整个Linker、部分Half-i以及部分的蛋白适体序列被Blocker链预先封锁；
所述Half-i为由i-motif的形成序列分裂获得的完全对称的两部分。
该探针基于i-motif重组介导的FRET策略，将目标蛋白的适体、i-motif形成序列的一半(Half-i)和FRET供受体对整合为探针。该探针通过适体结合绑定在目标蛋白上。发生同源二聚化的蛋白带领两个探针相互靠近，使得两个相同的Half-i序列能够在酸性的癌细胞外环境中重组为i-motif，进而引发FRET效应。
需要说明的是，本发明是针对癌细胞膜上蛋白质的同源二聚化，并且该技术的实现也必须依赖于癌细胞外特有的酸性微环境。
本发明的第二个方面，提供了基于i-motif重组介导的FRET策略的核酸探针制备方法，包括：
将Half-i@Apt链和Blocker链的浓储液混合，加热至90～95℃维持4～5分钟后缓慢冷却至室温，然后在3～5℃环境下避光放置8小时以上，使两条链充分杂交。
该探针表现出令人满意的稳定性、特异性以及实时成像能力，可以用于原位成像活的癌细胞表面蛋白的同源二聚化。
本发明的第三个方面，提供了任一上述的探针在活的癌细胞表面蛋白同源二聚化原位成像中的应用。
该策略实现了对活的癌细胞表面的Met受体同源二聚化的准确、动态原位成像。由于各种膜蛋白的适体均能够通过体外筛选获得，因此该策略可以通过简单地更换识别序列来扩展到对其他目标蛋白同源二聚化的监测。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提出了一种i-motif重组介导的FRET策略，用于原位成像活的癌细胞表面蛋白的同源二聚化。该探针表现出令人满意的稳定性、特异性以及实时成像能力。重要的是，该策略中用于指示蛋白同源二聚体的FRET信号是通过两个完全相同的Half-i在距离邻近时重组为i-motif而诱导产生的，这与同源二聚化的模式高度匹配，从而使该策略对同源二聚化事件的成像保真度更高。利用该策略，我们实现了对活的癌细胞表面的Met受体同源二聚化的准确、动态原位成像。由于各种膜蛋白的适体能够通过体外筛选获得，因此该策略可以通过简单地更换识别序列来扩展到对其他目标蛋白同源二聚化的监测。鉴于膜蛋白同源二聚化参与多种信号通路并在癌症的发生和发展中起着重要的作用，该策略将为相关的信号网络和病理研究提供强有力的工具。
(2)本发明的操作方法简单快速、准确度高，具有普适性，实用性强。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中i-motif重组介导的FRET策略用于原位成像活的癌细胞表面蛋白同源二聚化的原理示意图。
图2是实施例1中(A)pH 7.4和pH 6.5缓冲液中Half-i-linker和Intact-i-linker的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(泳道M：20bp DNAMarker；泳道1：Half-i-linker；泳道2：Intact-i-linker)。(B)pH 7.4和pH 6.5缓冲液中Half-i的圆二色光谱。(C)pH 7.4和pH6.5缓冲液中Half-i的紫外吸收光谱。
图3是实施例1中pH 6.5的PBS中，Half-i在287nm处的椭圆率随时间的变化(以Half-i在pH 7.4的PBS中的椭圆率作为零点)。
图4是实施例1中pH 6.5缓冲液中Half-i在287nm处的椭圆率随温度的变化。
图5是实施例1中(A)用不同浓度的探针处理的HepG2和LNCaP细胞的细胞存活率。(B)用探针处理的HepG2细胞中Met和p-Met表达的western blotting分析。
图6是实施例1中(A)用Q-probe处理的HepG2细胞的CLSM图像随时间的变化(比例尺为25μm)。(B)CLSM图像的平均荧光强度。
图7是实施例1中(A)LNCaP和HepG2细胞中Met受体的western blotting分析。(B)探针对LNCaP和HepG2细胞的CLSM成像(比例尺为25μm)。
图8是实施例1中(A)用不同浓度的HGF处理的HepG2细胞中Met单体和二聚体的CLSM图像(比例尺为25μm)。(B)用不同浓度的HGF处理的HepG2细胞中Met(单体Met)和p-Met(二聚Met)的Western blotting分析。(C)流式细胞术分析探针对不同条件处理的HepG2细胞的检测(Control:不加HGF和探针；ⅰ:无HGF；ⅱ:10ng/ml HGF；ⅲ:50ng/ml HGF；ⅳ:100ng/ml HGF)。
图9是实施例1中(A)不同处理条件下探针对HepG2细胞的CLSM成像(比例尺为25μm)。(B)不同处理条件下HepG2细胞中的Met(单体Met)和p-Met(同源二聚化Met)的westernblot分析。(C)流式细胞术分析探针对不同条件处理的HepG2细胞的检测(Control:不加HGF和探针；ⅰ:无HGF；ⅱ:100ng/ml HGF；ⅲ:100ng/ml HGF加2μg/ml anti-HGF抗体)。
图10是实施例1中探针和对照探针对HGF处理过的HepG2细胞的CLSM成像。
图11是实施例1中(A)HGF刺激的HepG2细胞中荧光随时间的变化。(B)未经HGF刺激的HepG2细胞中荧光随时间的变化。比例尺为25μm。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对现有FRET技术中，FRET信号和蛋白同源二聚化事件 之间存在不匹配，导致信号损失严重的问题。本发明提出一种i-motif重组介导的FRET探针，包括：执行链Half-i@Apt和预阻滞链Blocker；
所述执行链Half-i@Apt包含Half-i序列、Linker序列、目标蛋白的适体序列、与Linker以及Half-i的部分序列互补的Linker*，并将Cy5和Cy3分别标记在Half-i和Linker*的5'末端用作FRET的受体和供体；
整个Linker、部分Half-i以及部分的蛋白适体序列被Blocker链预先封锁；
所述Half-i为由i-motif的形成序列分裂获得的完全对称的两部分。
本发明建立了一种能够将蛋白质同源二聚化行为转换为高度匹配的光信号的方法，实现了蛋白质同源二聚化的准确可视化。
在一些实施例中，所述执行链Half-i@Apt的序列为Cy5-TCCCCCCTCCCCCCATTGATGATCTATTTTTTTTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTTTTTTTT-Cy3-TAGATCATCAATGTGG(SEQIDNo.1)。本文中，利用i-motif的结构对称和酸响应变构性能，我们提出了一种i-motif重组介导的FRET策略，用于原位成像活的癌细胞表面的蛋白同源二聚化(图1)。该探针由执行链(Half-i@Apt)和预阻滞链(Blocker)构成。在Half-i@Apt中，首先将i-motif的形成序列(C6TC6TC6TC6)分裂为完全对称的两部分(C6TC6)，称为Half-i。将Half-i依序与Linker链、目标蛋白的适体、与Linker以及Half-i的部分序列互补的Linker*链相整合。将Cy5和Cy3分别标记在Half-i和Linker*的5'末端用作FRET的受体和供体。整个Linker、部分Half-i以及部分的蛋白适体被Blocker链预先封锁，以防止Half-i在游离状态下重组为i-motif，同时也能够在供体(Cy3)和受体(Cy5)之间保持一定距离以防止他们发生FRET效应。这里以Met受体为模型解释探针的成像过程：适体与Met受体的结合解除了适体链和Blocker链之间的杂交，从而导致Blocker链与其他部分的组装也变得不稳定，最终使Blocker链与其互补的所有序列解离。被释放的Linker和部分的Half-i与Linker*形成双链体，以继续保持Cy3和Cy5之间的距离使不能发生FRET。当Met单体受到其配体(HGF)的刺激后就被激活形成同源二聚体。这些同源二聚化的单体带领两个探针相互靠近，使其中的两个Half-i序列相互靠近而能够在酸性的癌细胞外微环境中重组为双分子的i-motif四链体，进而使FRET的供受体对间距达到产生FRET效应的有效距离。最终，Cy5被点亮而Cy3被减弱分别代表Met同源二聚体和单体的水平，这样，单体和同源二聚体可以通过两种不同的荧光得到很好的区分。更重要的是，该设计中蛋白同源二聚体的信号是由两个相同探针的紧密靠近诱导产生的，这与蛋白同源二聚化的模式高度匹配，从而能够实现对活的癌细胞表面上蛋白同源二聚化准确、动态的原位成像，如图1所示。
在一些实施例中，所述预阻滞链Blocker的序列为AACCCACCCACCCCGACCGAGCTACCATCCAAAAAAAATAGATTATCAATGGGG(SEQIDNo.2)。以防止Half-i在游离状态下重组为i-motif，同时也能够在供体(Cy3)和受体(Cy5)之间保持一定距离以防止他们发生FRET效应。
本发明还提供了基于i-motif重组介导的FRET策略的核酸探针制备方法，包括：
将Half-i@Apt链和Blocker链的浓储液混合，加热至90～95℃维持4～5分钟后缓慢冷却至室温，然后在3～5℃环境下避光放置8小时以上，使两条链充分杂交。
本发明的探针制备方法可以采用本领域的常规制备方法，以提高制备效率和探针的稳定性。
在一些实施例中，Half-i@Apt链和Blocker链的浓储液的混合比例为1∶1～1.5。
在一些实施例中，所述浓储液的溶剂为TE缓冲液，以有效地溶解DNA粉末。
本发明还提供了任一上述的探针在活的癌细胞表面蛋白质的同源二聚化原位成像中的应用。
在一些实施例中，包括：
用不同浓度的HGF处理HepG2细胞，以诱导Met受体发生不同水平的同源二聚化；
细胞与HGF孵育25～35分钟后，除去培养基并清洗细胞，然后加入探针，避光孵育10～17分钟；然后，将细胞用PBS洗涤2-3次以进行CLSM成像；以成像目标蛋白不同水平的同源二聚化。
为了获得探针与细胞作用的最佳时间，设计了淬灭探针Q-probe，以Cy3的荧光恢复指示探针与目标蛋白的结合。因此，在一些实施例中，所述避光孵育时间为10～17分钟，以使探针与细胞能够高效的结合。
在一些实施例中，共聚焦扫描成像参数如下：用525nm激光以10％的强度激发，使用HyD检测器以200％的gain值为在550nm至600nm范围内收集Cy3的发射荧光，使用PMT检测器以700的gain值在650nm到700nm波长范围内收集Cy5的荧光，使相同浓度的Cy3和FRET激发的Cy5呈现相同的强度，便于比较图像荧光强度。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：
1.实验部分
1.1材料和试剂
所有DNA寡核苷酸均由生工生物工程股份有限公司(中国上海)合成和纯化。DNA序列和修饰列于表1中。用于细胞培养的DMEM培养基、RPMI 1640、胎牛血清(FBS)、青霉素链霉素(PS，100U/ml)、胰蛋白酶和磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)均购自BiologicalIndustries(以色列)。重组人肝细胞生长因子(HGF，#100-39)购自PeproTech(美国)。抗-HGF抗体[ab83760]购自Abcam(UK)。RIPA裂解缓冲液(P0013D)、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(P1050)购自碧云天生物技术有限公司(中国上海)。β-Actin的一抗(AB0035)购自AbwaysTechnology(中国上海)。Met(#8198)和phospho-Met(Tyr1234/1235，#3077)的一抗购自Cell Signaling Technology(USA)。二抗Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP购自AbwaysTechnology(中国上海)。LumiQ通用型发光底物溶液购自圣尔生物(中国上海)。蛋白质样品上样缓冲液(5×)和多色预染蛋白质标记物购自雅酶生物科技有限公司(中国上海)。所有水溶液均使用超纯水(18.25MΩ·cm)制备。
表1.该工作中所使用的寡核苷酸序列和修饰
Figure BDA0002385408470000101
Figure BDA0002385408470000111
[a]Half-i@Apt中，下划线部分表示Met受体的适体序列，双下划线部分表示Half-i序列，虚下划线部分表示Linker，波浪线部分表示Linker*，带星号(*)的碱基表示Half-i@Apt和Blocker链之间地错配碱基，带有井号(#)的碱基表示Half-i@Apt和Linker*之间的错配。
[b]在PAGE实验中使用的Half-i-linker和Intact-i-linker序列。
[c]在优化探针与细胞孵育时间时，用于构建Q-probe的序列。
[d]使用Arbitrary strand构建对照探针。
[e]Cy3-Aptamer和Cy5-complementary strand用于确定CLSM成像中的仪器参数。
1.2仪器
用于DNA分析的非变性聚丙烯酰胺凝胶通过GelDocTM XR+成像系统(美国Bio-RADLaboratories Inc.)进行成像。用于蛋白质印迹分析的SDS-聚丙烯酰胺凝胶通过AmershamImager 600成像系统(美国GE Healthcare)进行成像。紫外-可见吸收光谱通过U-2910分光光度计(日立，日本)测定。圆二色光谱由Chirascan V100圆二色光谱仪(AppliedPhotophysics，UK)测定。细胞毒性实验通过SPARK酶标仪(Tecan Austria GmbH，奥地利)测定吸光度。通过NovoCyte3130流式细胞仪(ACEA Biosciences Inc.，UAS)进行流式细胞术测定。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)成像通过Leica TCS SP8 STED共焦显微镜(德国Leica)进行，选择63x物镜。
1.3细胞和细胞培养
所有细胞系均在37℃，5％CO2的潮湿培养箱中培养。人肝癌细胞系(HepG2)用含有10％FBS和1％PS的DMEM培养基培养。人前列腺腺癌细胞系(LNCaP)用含有10％FBS的RPMI1640培养。
1.4探针的制备
首先用TE缓冲液(10mM Tris，1mM Na2EDTA，pH 8.0)溶解DNA粉末，获得DNA浓储液。通过将Half-i@Apt链和Blocker链的浓储液以1∶1的比例混合，加热至95℃维持5分钟后缓慢冷却至室温，然后在4℃环境下避光放置12小时以使两条链充分杂交。使用不同pH值的PBS缓冲液(10mM NaH2PO4、10mM Na2HPO4、130mM NaCl、4.6mM KCl、5.0mM MgCl2)将探针浓储液稀释至适当浓度用于后续实验。
1.5i-motif在溶液中的pH响应性重组研究。
采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)、紫外-可见(UV-vis)光谱和圆二色(CD)光谱用于验证在pH 6.5的环境下(对应于癌细胞外微环境的酸度)，Half-i重组为i-motif的能力。
Native PAGE分析。Half-i-linker的序列用于PAGE分析，含有两倍的Half-i序列的Intact-i-linker序列用作对照。使用pH 7.4和pH 6.5的PBS将Half-i-linker和Intact-i-linker的浓储液(100μM)稀释至2μM并孵育30分钟。用pH 7.4PBS稀释的样品用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶在pH 7.4的TAE缓冲液(40mMTris，2mM Na2EDTA，20mM CH3COOH)中以15℃恒温、30mA的恒流分离1小时。以pH 6.5PBS稀释的样品用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶在pH 6.5的TAE缓冲液(40mM Tris，2mM Na2EDTA，20mM CH3COOH)中以15℃恒温、30mA的恒流分离1.5小时。电泳结束后凝胶在用1x SYBR Gold避光染色40分钟，然后通过成像系统成像。
紫外-可见光谱。将Half-i的浓储液(200μM)分别用pH 7.4和pH 6.5的PBS稀释至8μM，用于紫外-可见(UV-vis)光谱测量。在室温下记录220nm至320nm范围内的光谱。
CD光谱。分别用pH 7.4和pH 6.5的PBS将Half-i的浓储液(200μM)稀释至15μM，用以进行CD测量。在室温下记录220nm至320nm范围内的光谱。
1.6i-motif重组的动力学研究
为了分析Half-i重组为双分子i-motif的动力学，我们将Half-i的浓储液(200μM)现场添加到pH 6.5的PBS中，并迅速混合至15μM的浓度。在25℃温度下，测定287nm处的椭圆率，每隔90秒测定一次。以pH 7.4的PBS中Half-i的椭圆率作为变化起点。
1.7重组i-motif的热稳定性
以pH 6.5的PBS配制浓度为15μM的Half-i溶液，通过配备有温控水浴的CD光谱仪以1℃/min的速率逐渐升高温度，测定Half-i溶液在不同温度下287nm处的椭圆率。绘制椭圆率与温度的关系曲线，将能够使50％的重组i-motif结构解离的温度作为Tm值。缓冲液的背景光谱从样品测定数据中扣除。
1.8探针的细胞毒性
通过MTT实验评估探针的细胞毒性。将HepG2和LNCaP细胞分别以每孔5000细胞的浓度铺在96孔板中培养24小时使细胞贴壁，用含有不同浓度探针(0nM，10nM，50nM，100nM，250nM，500nM)的培养基替换原培养基。细胞与探针在37℃下共孵育24小时后，向每个孔中添加10μl MTT(5mg/ml)，然后将细胞在37℃下孵育4个小时。然后除去培养基并向每孔加入150μl DMSO溶解其中的甲瓒结晶，震荡4～5分钟后，测量490nm处的吸光度以计算细胞活性。不经探针处理的细胞作为对照组。每个探针浓度设置6个重复孔。
1.9Western blot实验
细胞在6孔板中培养至75％～85％的融合度，对细胞施加不同的处理以进行不同的研究。处理后，将细胞用温的生理盐水洗涤3次以除去培养基，然后于冰上用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液中裂解15分钟。用细胞刮刀从孔板上刮下细胞，然后在4℃下以12000rpm离心分离的细胞15分钟，并收集上清液。向上清液中添加蛋白质样品上样缓冲液，并在100℃下加热5分钟使蛋白质变性。用8％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，每个泳道上样30μg总蛋白质提取物。电泳结束后将蛋白质转移到PVDF膜(MilliporeImmobilon-P，0.45μm)上，转膜结束后用TBST(10mM Tris，150mM NaCl，0.05％(v/v)Tween-20，pH 7.2-7.5)溶解的5％的脱脂奶粉封闭非特异性结合位点。然后用TBST清洗PVDF膜3次。Met、p-Met和β-Actin的一抗与PVDF膜上的蛋白质于4℃孵育过夜。用TBST洗涤3次后，将膜与二抗于室温温震摇孵育2小时。用TBST洗涤3次后，通过ECL成像PVDF膜。通过ImageJ软件对图像的灰度进行分析。
1.10探针对目标蛋白的表达和同源二聚化的干扰
为确保探针能够反映目标蛋白的天然状态，我们评估了探针对Met受体的表达和同源二聚化的干扰。六孔板中的HepG2细胞生长至80％融合度。为研究探针对Met受体表达是否造成干扰，将pH 6.5的PBS溶解的浓度为100nM的探针1ml施加于未经HGF处理的细胞，孵育15分钟；为了研究探针对Met受体同源二聚化是否造成干扰，首先加1ml浓度为100ng/ml的HGF与细胞共孵育30分钟，然后将pH 6.5的PBS溶解的浓度为100n M的探针1ml施加于细胞并孵育15分钟。处理结束后，裂解细胞并提取总蛋白用于Western blotting分析。
1.11孵育时间的优化
探针与细胞孵育时间过长可能导致探针被降解或被内吞进入细胞，孵育时间过短可能导致探针与目标蛋白结合不充分，两种情况都不利于成像的准确性。为了探索探针与细胞的最佳孵育时间，我们将与我们设计了一条标记有荧光淬灭基团BHQ2并且与Half-i@Apt链部分互补的序列Q-blocker，将其与Half-i@Apt链互补杂交淬灭Cy3荧光，构建了一个荧光淬灭的探针(Q-probe)。在共聚焦显微镜下找到清晰的细胞成像焦平面后，向细胞施加100μl 100nM的Q-probe，探针与目标蛋白的结合会移除blocker链和BHQ2，从而恢复Cy3的荧光，以Cy3荧光的恢复情况指示探针与目标蛋白的结合情况。实验过程中以525nm的激光激发荧光，接收550-600nm范围内的发射荧光。
1.12共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)成像
为了能够更加直接地对成像获得的荧光强度进行对比，我们首先调整显微镜的成像参数以使Cy3和FRET激活的Cy5在相同浓度时显示相同的强度。将HepG2细胞铺在共聚焦培养皿中，培养24小时使贴壁。将Cy3标记的适体(Cy3-Aptamer)和Cy3/Cy5对标记的适体(由Cy3-Aptamer和Cy5-complementary strand组装而成)以1：1的比例添加到细胞中，避光孵育15分钟。然后将细胞用pH 6.5PBS轻柔洗涤2-3次以除去过量的探针并通过共聚焦激光扫描显微镜成像。以525nm的激光激发荧光，调整Cy3和Cy5通道的gain值，以使Cy3和Cy5显示相同在强度。最终确定共聚焦扫描成像参数如下：用525nm激光以10％的强度激发，使用HyD检测器以200％的gain值为在550nm至600nm范围内收集Cy3的发射荧光，使用PMT检测器以700的gain值在650nm到700nm波长范围内收集Cy5的荧光。除特别说明外，所有用于CLSM成像的处理均以100μl的体积进行。CLSM图像的强度通过显微镜系统配备的定量工具进行分析。
1.12.1成像目标蛋白不同水平的同源二聚化。用不同浓度的HGF(0ng/ml，10ng/ml，50ng/ml和100ng/ml)处理HepG2细胞，以诱导Met受体发生不同水平的同源二聚化。细胞与HGF孵育30分钟后，除去培养基并清洗细胞，然后加入100nM探针(以pH 6.5PBS溶解)，避光孵育15分钟。然后，将细胞用pH 6.5的PBS洗涤2-3次以进行CLSM成像。
2.12.2抑制剂实验。进行抑制剂实验以进一步验证探针的特异性和准确性。首先将100ng/ml HGF与2ug/ml的Anti-HGF抗体孵育1小时以占据HGF的结合位点，然后再将HGF应用于HepG2细胞孵育30分钟。然后移除培养基并洗涤细胞，加入100nM探针(以pH 6.5的PBS溶解)，避光孵育15分钟。将细胞用pH 6.5的PBS洗涤2-3次以进行CLSM成像。
1.12.3对照探针测定。为了探索探针的成像机理，我们用一段不具有酸响应能力的任意序列替换探针中的Half-i序列构建了一种对照探针。向HepG2细胞加入含100ng/mlHGF的培养基孵育30分钟。将浓度为100nM的探针和对照探针(以pH 6.5PBS溶解)分别添加到细胞中，避光孵育15分钟。将细胞用pH 6.5的PBS洗涤2-3次以进行CLSM成像。
1.12.4对蛋白同源二聚化的实时成像。首先将HepG2细胞与100nM探针在pH6.5的PBS中避光孵育15分钟。用pH 6.5的PBS洗涤细胞以移除多余的探针。在共聚焦激光扫描显微镜下确定好清晰的焦平面后，向细胞中加入100μl浓度为的100ng/ml的HGF，并立即用xyt扫描模式以1分钟1次的时间间隔拍摄荧光图像。
1.13探针对目标蛋白的特异性考察
以表达目标蛋白的HepG2细胞为阳性细胞，不表达目标蛋白的LNCaP细胞为阴性细胞，对照考察探针对目标蛋白的特异性。将HepG2细胞和LNCaP细胞分别于共聚焦小皿中培养贴壁24小时。分别向两种细胞施加探针，孵育15分钟后，用PBS清洗2-3次，进行CLSM成像。实验过程中以525nm的激光激发，接收550-600nm范围内Cy3的发射荧光。
1.14流式细胞术
细胞在六孔板中培养至75％～85％融合度，施加以不同处理用于不同的实验。处理结束后，向细胞施加100nM的探针(以pH 6.5的PBS溶解)，避光孵育15分钟，用pH 6.5的PBS清洗2-3遍，用细胞刮子将细胞刮下进行流式细胞术分析。对于不同水平的蛋白同源二聚化分析，向细胞分别施加含有0,10,50,100ng/ml的HGF的培养基孵育30分钟。对于抑制剂实验，先将100ng/ml HGF与2ug/ml的抑制剂共孵育1小时再施加于细胞孵育30分钟。
2.结果与讨论
2.1溶液中i-motif的pH响应性重组研究
因为Half-i能否在pH 6.5(与癌细胞外微环境的酸度相符[9])的环境下重组为分子间i-motif是本方案设计能否可行的关键之一。我们通过聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)、紫外可见吸收(UV-vis)光谱和圆二色光(CD)谱考察了Half-i的酸响应重组能力。如图2A中PAGE结果显示，在pH 7.4条件下，Half-i-linker仅在较低位置呈现单一的条带，而没有形成与对照的Intact-i-linker分子量相近的条带；而在pH 6.5条件下，Half-i-linker形成了较亮的与Intact-i-linker分子量相近的条带和非常弱的与pH 7.4缓冲液中位置相同的条带，说明Half-i-linker能够在pH 6.5的环境中以较高的效率形成双分子结构[8b]。Uv-vis光谱(图2B)显示，pH 6.5条件下在Half-i溶液在295nm(i-motif四链体结构的特征吸收处)的吸光度比pH 7.4条件下的明显增大，表明在pH 6.5条件下Half-i形成i-motif结构；CD光谱(图2C)显示，在pH 7.4缓冲液中，Half-i的负峰和正峰分别出现在232nm和277nm，而在pH 6.5缓冲液中，负峰和正峰分别红移至265nm和287nm，并且其数值也明显增大，与i-motif的光谱特征相符，这表示形成了i-motif结构。以上所有结果都显示Half-i在pH 6.5环境下能够形成分子间i-motif四链体结构，初步证实我们提出的设计具有可行性。
2.2i-motif重组的动力学
通过圆二色光谱测定Half-i重组为i-motif的重组动力学，以Half-i在287nm处的椭圆率指示形成的i-motif的量。如图3所示，前90秒内椭圆率迅速增大，90-180秒上升速度显著下降，180-630秒内有及其微弱的增加，630秒后趋于平稳。该变化模式表明，Half-is能够在90秒内迅速重组为i-motif，至630秒重组完全。
2.3重组i-motif的热稳定性
通过CD光谱仪测定pH 6.5缓冲液中的Half-i在287nm处的椭圆率随温度的变化来评估重组的i-motif的热稳定性，以温度为横坐标，以椭圆率为纵坐标，所有的点用Boltzmann函数拟合。如图4所示，由Half-i重组获得的i-motif的Tm值为46摄氏度。这表明重组i-motifs可以在室温或37℃环境下稳定存在，支持该探针用于活细胞成像。
2.4探针对细胞天然状态的干扰
为了使成像结果能够揭示目标蛋白在天然状态下的单体及同源二聚体水平，我们期望探针不会干扰细胞的天然状态。首先进行了探针的细胞毒性考察，如图5A所示，MTT测定结果显示用不同浓度的探针处理过的细胞的存活率都在85％以上，表明该探针对细胞没有明显的细胞毒性，为活细胞成像奠定了基础。然后我们评估了该探针对目标蛋白的表达和同源二聚化的干扰。将HepG2细胞与探针共孵育一定的时间后，通过western blot分析细胞中目标Met受体的单体和同源二聚体。结果如图5B,在Met单体和同源二聚体表达上，用探针处理的细胞与未经探针处理的细胞(图8B)呈现一致的趋势。证实该探针对细胞活度以及对目标蛋白的表达和同源二聚化几乎没有干扰，因此从该探针获得的图像能够可靠地揭示目标蛋白同源二聚化的自然水平。
2.5探针与细胞孵育时间的优化
为了获得探针与细胞作用的最佳时间，设计了淬灭探针Q-probe，以Cy3的荧光恢复指示探针与目标蛋白的结合。如图6所示，在探针加入细胞后7.5分钟内，Cy3荧光迅速增强，表明探针与目标蛋白快速结合，这是因为探针和暴露的蛋白浓度均很高；7.5到17.5分钟，Cy3荧光强度继续增大，但是增大的速度明显下降，这是由于随着探针与目标蛋白的结合，二者的浓度逐渐降低造成的。17.5分钟后，荧光强度开始下降，可能因为荧光受到激光照射发生一定程度的漂白或者被复杂的细胞环境影响。考虑到成像操作和Half-i重组为i-motif所需的时间，最终选择针与细胞孵育的时间为15分钟。
2.6探针的特异性
通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)成像评估了探针对目标分子的特异性。从图7B中可以看出，经过探针处理后，不表达Mer受体的LNCaP细胞几乎不显示荧光，表明探针不与非目标分子结合。对于表达Met受体的HepG2细胞，图像显示明显的Cy3荧光，表明探针与细胞膜上的Met受体结合。结果表明该探针能够排除非目标分子对成像结果的干扰，对目标分子具有良好的特异性，有潜力应用于对特定目标蛋白同源二聚化的成像。
2.7探针对不同水平的同源二聚化的成像
以不同浓度的HGF处理HepG2细胞以诱导目标蛋白发生不同水平的同源二聚化，然后进行CLSM成像、Western blot分析和流式细胞术分析。如图8A所示，在不添加HGF时，细胞膜上显示出很亮的代表Met单体的Cy3荧光，代表Met同源二聚体的Cy5荧光强度几乎为零，添加10ng/ml HGF处理时现象与无HGF处理的相似，Cy3荧光强度仍然很高，Cy5强度微弱，表示这两种条件下，目标蛋白以单体形式为主存在，同源二聚体水平很低；50ng/ml和100ng/ml的HGF处理时，细胞膜表面出现明显的Cy5荧光，同时Cy3荧光强度有所下降，表明目标蛋白同源二聚体增多，以单体形式存在的减少。共聚焦荧光成像结果与western blot(图8B)相一致，流式细胞术结果(图8C)也显示该探针能够灵敏响应蛋白不同水平的同源二聚化，说明该探针能够对蛋白同源二聚化以高的灵敏度和准确度进行原位成像。
2.8抑制剂实验
为了进一步验证探针的特异性和准确性，我们进行了抑制剂实验，CLSM成像结果如图9A所示。仅HGF刺激的细胞同时呈现Cy3和Cy5荧光，表示单体和同源二聚体Met受体同时存在。经过抑制剂处理的细胞显示高强度的Cy3荧光，而Cy5荧光非常弱，代表较高水平的蛋白单体和低水平的二聚体，这是因为与抑制剂共孵育过的HGF不能诱导Met受体发生同源二聚化。CLSM图像的结果与western blotting(图9B)和流式细胞术(图9C)检测趋势相符，表明该探针对目标蛋白的同源二聚化具有很好的特异性和准确性。
2.9对照探针实验
为了进一步探究探针成像目标蛋白同源二聚化的机制，我们将探针中的Half-i替换为没有酸响应性质的一段任意序列作为对照探针。对HGF刺激的HepG2细胞进行CLSM成像考察。如图10所示，用我们设计的探针成像的细胞同时显示出明显的代表蛋白单体的Cy3荧光和代表同源二聚体的Cy5荧光。对照探针成像的细胞仅显示较强的Cy3荧光信号，Cy5信号非常弱。这一结果说明之所以能够对蛋白的同源二聚化进行准确的成像是因为Half-i的酸响应重组变构，Half-i是探针成像蛋白同源二聚化的关键部分。
2.10探针的即时成像能力
用CLSM在xyt扫描模式下考察探针的实时成像能力。如图11A所示，加入HGF刺激的细胞中，刚加入HGF时探针呈现出较强的Cy3荧光，而Cy5荧光几乎为零；5分钟时出现微弱的Cy5荧光；5到15分钟Cy5荧光逐渐增强，Cy3荧光强度有轻微减弱；15到30分钟两种荧光强度基本维持稳定。不加HGF刺激的细胞中(图11B)，Cy3的荧光在30分钟内稳定维持在较高的强度；Cy5荧光始终处于非常微弱的强度。证明该探针能够以高的准确度对蛋白同源二聚化进行实时成像。这将有助于探针用于对蛋白相互作用的快速检测。
3.结论
我们提出了一种i-motif重组介导的荧光共振能量转移策略，用于原位成像活的癌细胞表面蛋白的同源二聚化。该探针表现出令人满意的稳定性、特异性以及实时成像能力。重要的是，该策略中用于指示蛋白同源二聚体的FRET信号是通过两个完全相同的Half-i在距离邻近时重组为i-motif而产生的，这与同源二聚化的模式高度匹配，从而使该策略对同源二聚化事件的成像保真度更高。利用该策略，我们实现了对活的癌细胞表面的Met受体同源二聚化的准确、动态原位成像。由于各种膜蛋白的适体均能够通过体外筛选获得，因此该策略可以通过简单地更换识别序列来扩展到对其他目标蛋白同源二聚化的监测。鉴于膜蛋白同源二聚化参与多种信号通路并在癌症的发生和发展中起着重要的作用，该策略将为相关信号网络和病理研究提供强有力的工具。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> I-motif重组介导的FRET探针及其原位成像癌细胞表面蛋白质同源二聚化的应用
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcccccctcc ccccattgat gatctatttt ttttggatgg tagctcggtc ggggtgggtg 60
ggttggcaag tctttttttt tagatcatca atgtgg 96
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacccaccca ccccgaccga gctaccatcc aaaaaaaata gattatcaat gggg 54
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcccccctcc ccccattgat gatcta 26
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attgatgatc tacccccctc cccccttccc ccctcccccc attgatgatc ta 52
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaaaaaaaga cttgccaacc cacccacccc ga 32
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tagcagatag caga 14
<210> 7
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tggatggtag ctcggtcggg gtgggtgggt tggcaagtct ttttttttga gatcatccat 60
ggcttacg 68
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgtaagccat ggatgatctc 20

Claims (9)

1.一种用于原位成像癌细胞膜上蛋白质的同源二聚化的i-motif重组介导的FRET探针，其特征在于：包括执行链 Half-i @ Apt和预阻滞链 Blocker；所述执行链 Half-i @Apt 包含 Half-i序列、Linker序列、目标蛋白的适体序列、与 Linker 以及Half-i 的部分序列互补的 Linker*，并将 Cy5和 Cy3分别标记在 Half-i 和 Linker*的 5'末端用作FRET的受体和供体；整个 Linker、部分 Half-i 以及部分的蛋白适体序列被 Blocker链预先封锁； 所述 Half-i为由 i-motif的形成序列分裂获得的完全对称的两部分；所述执行链 Half-i @ Apt 的序列 SEQIDNo.1 为
Cy5-TCCCCCCTCCCCCCATTGATGATCTATTTTTTTTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTTTTTTTT-Cy3-TAGATCATCAATGTGG。
2.如权利要求 1 所述的用于原位成像癌细胞膜上蛋白质的同源二聚化的 i-motif重组介导的 FRET 探针，其特征在于，所述预阻滞链 Blocker的序列 SEQIDNo.2 为
AACCCACCCACCCCGACCGAGCTACCATCCAAAAAAAATAGATTATCAATG
GGG。
3.如权利要求 1 所述的用于原位成像癌细胞膜上蛋白质的同源二聚化的 i-motif重组介导的 FRET 探针，其特征在于，制备方法如下：
将Half-i@Apt链和 Blocker链的浓储液混合，加热至 90~95℃维持 4~5 分钟后缓慢冷却至室温，然后在 3~5℃环境下避光放置 8 小时以上，使两条链充分杂交，即得。
4.如权利要求 3所述的用于原位成像癌细胞膜上蛋白质的同源二聚化的 i-motif重组介导的 FRET 探针，其特征在于，Half-i@Apt链和 Blocker 链的浓储液的混合比例为 1∶1~1.5。
5.如权利要求 3 所述的用于原位成像癌细胞膜上蛋白质的同源二聚化的 i-motif重组介导的 FRET探针，其特征在于，所述浓储液的溶剂为 TE 缓冲液。
6.权利要求 1或2所述的探针在癌细胞表面蛋白质同源二聚化原位成像中的应用。
7.如权利要求 6 所述的应用，其特征在于，包括：用不同浓度的 HGF 处理 HepG2 细胞，以诱导 Met 受体发生不同水平的同源二聚化；细胞与 HGF 孵育 25~35分钟后，除去培养基并清洗细胞，然后加入探针，避光孵育 10~17 分钟；然后，将细胞用 PBS 洗涤 2-3次以进行 CLSM 成像。
8.如权利要求 7 所述的应用，其特征在于，所述避光孵育时间为 15~16 分钟。
9.如权利要求 7 所述的应用，其特征在于，共聚焦扫描成像参数如下：用525nm激光以10％的强度激发，使用 HyD检测器以 200％的 gain 值为在 550 nm至 600 nm 范围内收集Cy3 的发射荧光，使用 PMT 检测器以 700的gain 值在 650 nm 到 700 nm波长范围内收集 Cy5 的荧光。
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