CN111334507A

CN111334507A - 绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体

Info

Publication number: CN111334507A
Application number: CN201911345087.5A
Authority: CN
Inventors: 王利红; 张伟
Original assignee: Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College
Current assignee: Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2039-12-24
Also published as: CN111334507B

Abstract

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及绵羊Lrh‑1短发夹RNA及其干扰载体。本发明根据绵羊Lrh‑1基因的cDNA序列及设计原则筛选出靶序列，根据靶序列设计有短发夹RNA结构的单链寡核苷酸，经变性退火为双链寡核苷酸插入融合有绿色荧光的pENTR/U6载体，构建pENTR/U6‑shRNA‑GFP干扰载体。通过转染到湖羊卵巢颗粒细胞中，利用实时荧光定量PCR方法在mRNA水平检测，证实Lrh‑1‑shRNA干扰载体可以有效抑制绵羊体细胞中Lrh‑1基因的表达。

Description

绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体。

背景技术

肝受体同系物-1(Liver receptor homolog-1,Lrh-1)是一种哺乳动物重要的核受体，属于核受体超家族中的NR5A亚家族的第2个成员，也称NR5A2，在动物的心、胃、肺、脑、胆囊、胰腺外分泌部、唾液腺、肠、卵巢、脂肪、膀胱、睾丸、肾上腺、胎盘等多种组织中均有表达。Lrh-1主要是以一种转录调控因子执行其功能，通过在不同时期的不同组织中调控多种蛋白的表达，从而影响这些组织的发育及生理生化功能，并在动物胚胎发育、分化、胆固醇代谢、胆汁酸的动态平衡、类固醇激素生成、乳腺癌的细胞转移和侵袭、组织炎症反应等过程中具有重要作用。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(doublestrand RNA，dsRNA)导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。RNA干扰技术的出现使得以特定的方式特异性沉默靶基因成为可能，并逐渐成为治疗疾病和基因功能研究的高效工具。目前，RNAi技术开辟了生命科学新的研究领域，成为21世纪国际生命科学的研究热点和前沿。

为了反向深入研究绵羊细胞中Lrh-1基因功能，需要对Lrh-1基因进行干扰、沉默、敲减或敲除，但目前尚未见Lrh-1基因的敲除或敲减的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体，该短发夹RNA能够对目的基因Lrh-1产生良好的敲减作用。

本发明提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其正义链5’→3’包括顺序连接的序列A、茎环序列1、序列B；其中，序列A与序列B反向互补；所述序列A如SEQ ID NO:1～3任一项所示。

本发明提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其反义链5’→3’包括顺序连接的序列A、茎环序列2、序列B；所述茎环序列2与茎环序列1反向互补。

本发明提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA中，反义链和正义链中的序列A是一致的，序列B也是一致的。

一些具体实施例中，所述序列A为GCACGGACTTACACCTATTGT(SEQID NO:1)，序列B为ACAATAGGTGTAAGTCCGTGC(SEQ ID NO:10)；

一些具体实施例中，所述序列A为GGAATAAGTTCGGGCCCATGT(SEQID NO:2)，序列B为ACATGGGCCCGAACTTATTCC(SEQ ID NO:11)；

一些具体实施例中，所述序列A为GCACAGGAATTGGTGGCAAAG(SEQ ID NO:3)，序列B为CTTTGCCACCAATTCCTGTGC(SEQ ID NO:12)；

本发明提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA的正义链和反义链的5’端皆连接有接头，所述正义链的接头序列为CACC；所述反义链的接头序列为AAAA。

本发明提供的绵羊Lrh-1短发夹RNA中，所述茎环序列1的核酸序列为CGAA。茎环序列2的核酸序列为TTCG。

一些实施例中，所述绵羊Lrh-1短发夹RNA正义链的核酸序列如SEQ IDNO:4所示，反义链的核酸序列如SEQ ID NO:5所示；

或正义链的核酸序列如SEQ ID NO:6所示，反义链的核酸序列如SEQ IDNO:7所示；

或正义链的核酸序列如SEQ ID NO:8所示，反义链的核酸序列如SEQ IDNO:9所示。

本发明还提供了由本发明所述正义链和反义链退火合成的ds Oligo。

具体的，本发明提供了由SEQ ID NO:4所示正义链和SEQ ID NO:5所示反义链退火形成的ds Oligo。

或由SEQ ID NO:6所示正义链和SEQ ID NO:7所示反义链退火形成的dsOligo。

或由SEQ ID NO:8所示正义链和SEQ ID NO:9所示反义链退火形成的dsOligo。

本发明还提供了绵羊Lrh-1基因的干扰载体，其包括骨架载体和所述的ds Oligo。

在本发明实施例中，所述骨架载体为pENTR/U6-shRNA-GFP。

一些具体实施例中，所述ds Oligo插入骨架载体的位点为BamH I和EcoRI。

本发明还提供了一种敲减绵羊Lrh-1基因的方法，其以本发明所述的干扰载体转染受体。所述转染采用脂质体转染法。所述受体为动物细胞或绵羊的卵巢颗粒细胞。具体为293T细胞或湖羊卵巢颗粒细胞。

本发明还提供了一种Lrh-1基因被敲减的细胞系，其以本发明所述的干扰载体转染细胞构得。

一种敲减绵羊Lrh-1基因的试剂盒，其包括所述的短发夹RNA、所述的ds Oligo或所述的干扰载体。

本发明所述的试剂盒中，还包括转染试剂。

本发明构建了一种Lrh-1短发夹RNA，并构建了Lrh-1基因的干扰载体，具体而言，本发明根据绵羊Lrh-1基因的cDNA序列及设计原则筛选出靶序列，根据靶序列设计有短发夹RNA结构的单链寡核苷酸，经变性退火为双链寡核苷酸插入融合有绿色荧光的pENTR/U6载体，构建pENTR/U6-shRNA-GFP干扰载体。通过转染到湖羊卵巢颗粒细胞中，利用实时荧光定量PCR方法在mRNA水平检测，证实Lrh-1-shRNA干扰载体可以有效抑制绵羊体细胞中Lrh-1基因的表达。这一干扰载体实现了对绵羊体细胞基因组的精确打靶，为深入研究绵羊体细胞中Lrh-1基因与其他基因功能间关系，提供了有效地实验研究技术依据。

本发明具有以下优点及效果中至少一种：

(1)RNA(Lrh-1-shRNA)短发夹干扰载体，可直接用于转染绵羊细胞，特异性抑制Lrh-1基因表达，进行RNAi实验。

(2)RNA(Lrh-1-shRNA)干扰载体融合有GFP标签，可在荧光显微镜下直观监测转染效率。

(3)RNA(Lrh-1-shRNA)干扰载体的构建为绵羊Lrh-1基因功能的深入研究提供了便利。

附图说明

图1示本发明设计的shRNA；

图2示本发明的干扰载体图谱；

图3示细胞转染图片；

图4示GAPDH基因的扩增曲线(a)和溶解曲线(b)；

图5示Lrh-1基因的扩增曲线(a)和溶解曲线(b)。

具体实施方式

本发明提供了绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1Lrh-1高表达载体构建

1.材料：pMD18-T vector、oligo DNA、感受态细胞DH5α、platinumPfxDNAPolymerase、platinumTaqDNAPolymerase High Fidelity、快切限制性内切酶：BamH I和EcoR I、T4 DNA连接酶。

2.方法

1)、对所需合成的根据GenBank中绵羊Lrh-1基因序列(JN662490.1)进行分析，检查基因内部有无特别复杂二级结构和重复序列连接。

2)、根据基因序列分析的结果，分别进行单链oligo的设计及合成。

3)、利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因序列。

4)、将合成好的序列装入pMD18-T载体并转化至感受态细胞DH5α。

5)、测序验证重组克隆中插入序列是否与要求相一致。

6)、通过重叠PCR将基因序列中突变点修复。

7)、将构建好的pMD18T-Lrh-1用BamH I和EcoR I酶切回收约1.5kb片段。酶切体系如表1：

表1酶切体系

质粒pMD18T-Lrh-1(150ng/μl)	10μl
		BamH I	1μl
EcoR I	1μl
		10×Q.cut Buffer	5μl
ddH<sub>2</sub>O	33μl

8)、将pcDNA3.1(+)用BamH I和EcoR I酶切回收。酶切体系如表2：

表2酶切体系

pcDNA3.1(+)(约150ng/μl)	6μl
		BamH I	1μl
EcoR I	1μl
		10×Q.cut Buffer	5μl
ddH<sub>2</sub>O	37μl

9)、将酶切好的载体pcDNA3.1(+)和片段Lrh-1用T4 DNA连接酶连接，然后转化感受态细胞DH5α，挑取若干克隆，小量抽提制备质粒，测序验证。

连接体系如表3：

表3连接体系

10×Ligation buffer	1μl
		酶切DNA片段	3.0μl
酶切载体	1.0μl
		T4 DNA Ligase(10U/μl)	0.5μl
ddH<sub>2</sub>O	4.5μl

实施例2干扰载体构建

1.材料：shRNA oligos、线性化载体：pENTR/U6-shRNA-GFP、10×退火反应buffer、T4 DNA Ligase、感受态细胞DH5α

2.方法：

1)、根据GenBank中绵羊Lrh-1基因序列(JN662490.1)设计短发夹3条shRNAoligos(图1)。

2)、Oligo正义链中间的CGAA序列和反义链中间的TTCG序列为短发夹RNA茎环结构。正义链模板的5’端CACC和反义链模板的5’端AAAA，为和穿梭质粒连接时的接头设计。

3)、将合成的oligos，退火反应合成双链，体系如下：

表4退火体系

Top strand DNA oligo(200μM)	5μl
		Bottomstrand DNA oligo(200μM)	5μl
10×Oligo Annealing Buffer	2μl
		DNase/RNase-Free Water	8μl
Total volume	20μl

4)、95℃反应4min后，室温放置5～10min；

5)、用去离子水将上述反应产物稀释100倍，使双链oligo混合物终浓度为500nM；

6)、用Oligo Annealing Buffer将500nM ds oligo混合物稀释成终浓度为10nM。

7)、连接载体和ds Oligo，体系如下：

表5连接体系

8)、16℃连接2h后转化到感受态细胞DH5α；

9)、载体(图谱如图2)说明：(1)原核抗性：kan(2)真核筛选抗性：Zeocin(3)表达GFP荧光蛋白(4)ds oligo插入在BamH I和EcoR I酶切位点处。(5)含有图1中No.1组所示dsoligo的质粒载体为SR51、含有图1中No.2组所示ds oligo的质粒载体为SR362、含有图1中No.3组所示ds oligo的质粒载体为SR1159。

10)、测序验证干扰载体是否正确。

实施例3干扰载体敲减效果评价

1.材料：高表达质粒：pcDNA3.1(+)-Lrh-1、shRNA干扰质粒：SR51、SR362、SR1159和阴性对照、293T细胞、DMEM高糖培养基、胎牛血清FBS、转染试剂：lipofectamine 2000、去内毒素大抽试剂盒、反转录试剂盒、SYBR qPCR Mix

2.方法

1)、大抽抽提制备需要转染的缩影质粒(参照去内毒素大抽试剂盒说明书操作)。

2)、培养293T细胞，铺6孔板，使第二天细胞密度达到90％左右。

3)、转染：用lipofectamine2000共转染高表达质粒和干扰质粒，分组如下：

表6转染分组

分组	高表达质粒Lrh-1	干扰载体	Lipofectamine2000
				SR51组	1μg Lrh-1	3μg SR51	10μl
SR362组	1μg Lrh-1	3μg SR362	10μl
				SR1159组	1μg Lrh-1	3μg SR1159	10μl
NC组	1μg Lrh-1	3μg SR-NC	10μl
				空白组	0	0	0

4)、48h后收集细胞，抽提RNA，反转录至cDNA，qPCR检测目的基因Lrh-1表达水平。(反转录和qPCR的详细步骤参照试剂盒步骤)

表7 qPCR所用引物信息

引物名称	序列(5’>3’)
		Lrh-F	CTCAAGGTGGATGACCAAATGA(SEQ ID NO:13)
Lrh-R	TTGCCCAGTAACCAGGAAGAT(SEQ ID NO:14)
		GAPDH-F	AGAAGGCTGGGGCTCATTTG(SEQ ID NO:15)
GAPDH-R	AGGGGGCCATCCACAGTCTTC(SEQ ID NO:16)

3.结果

(1)细胞转染图片如图3

(2)qPCR筛选结果：GAPDH基因的扩增曲线和溶解曲线如图4、Lrh-1基因的扩增曲线和溶解曲线如图5

(3)qPCR数据及计算结果如表8：

表8qPCR数据及计算结果

样品名称	2<sup>-ΔΔct</sup>	干扰效率
			SR51组	0.641967223	35.80％
SR362组	2.110930312	无
			SR1159组	0.234590083	76.54％
NC组	1	0

从上表可看出，SR51和SR1159均对目的基因Lrh-1有一定敲减作用，其中敲减效率最佳的为SR1159，为76.54％，故可选择该干扰质粒用于下游实验。

实施例4干扰载体在绵羊体细胞中敲减效果验证

4.1绵羊(湖羊)卵巢颗粒细胞采集

准备37～38℃的生理盐水，其中加入庆大霉素，青链霉素，放入保温瓶中备用。采取新鲜、完整的湖羊卵巢置于保温瓶中，于3h之内送到实验室。

4.2卵巢颗粒细胞采集及培养

1)、在超净工作台中，用生理盐水冲洗卵巢5-8遍，去除血污及杂质，剥离卵巢系膜。用10mL注射器中先吸取1mL含有1％血清的DPBS溶液，随后抽吸直径2～5mm的健康卵泡的卵泡液。

2)、500×g室温离心5min，弃上清，沉淀用PBS冲洗2次。

3)、弃上清，沉淀加入500μL0.3％透明质酸酶消化2min，用移液器吹打使颗粒细胞分散。

4)、500×g室温离心3min，弃上清，沉淀用PBS冲洗2次。

5)、500×g室温离心3min，弃上清，用预暖的10mL细胞培养液于T75细胞培养瓶中重悬细胞，37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。

4.3干扰载体Lrh-1-shRNA转染颗粒细胞

选用转染效果相对最佳的质粒SR1159进行湖羊颗粒细胞转染，实验操作方法同实施例3，实验设三次重复，分别记为Lrh-1敲除1、Lrh-1敲除2、Lrh-1敲除3。

4.4颗粒细胞中Lrh-1mRNA表达检测

以步骤4.3制备获得的Lrh-1敲除1～3细胞为待测样品，每组细胞重复检测。以GAPDH为control进行检测。Control细胞设置三组，每组重复检测三次。

4.4.1颗粒细胞中RNA提取

按

Plus RNA Purification Kit(Invitrogen货号：12183-555)试剂盒要求操作，然后贮存在-80℃备用。

4.4.2逆转录实验

(1)试剂：SuperScript^TM III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR

(Invitrogen货号：11752-050)

(2)仪器：恒温金属浴(国产)

(3)操作步骤

表9：1st-Strand cDNA Synthesis反应体系及条件

4.4.3Real-Time PCR检测

(1)试剂：Power

Green PCRMaster Mix(Roche货号：4913914001)

(2)仪器：Quantstudio多重实时荧光定量PCR仪(美国life technologies公司)

(3)实验过程

①荧光定量PCR引物设计和合成

采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8软件进行定量PCR引物设计，然后进行合成，引物序列如下：

表10：Real-Time PCR Primers and Conditions

②Real-Time PCR扩增体系和反应条件

表11：定量PCR反应体系及条件

③Real-Time PCR基因表达差异统计分析

每个样品重复三次，各个基因的相对表达水平以2(Ct^内参基因-Ct^目的基因)进行统计分析。

4.4.4Lrh-1定量结果

表12定量结果

实验结果表明，构建的Lrh-1-shRNA干扰载体，可以有效地敲减湖羊体细胞中Lrh-1基因的表达。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏农牧科技职业学院

<120> 绵羊Lrh-1短发夹RNA及其干扰载体

<130> MP1934713

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcacggactt acacctattg t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaataagtt cgggcccatg t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcacaggaat tggtggcaaa g 21

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caccgcacgg acttacacct attgtcgaaa caataggtgt aagtccgtgc 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaagcacgg acttacacct attgtttcga caataggtgt aagtccgtgc 50

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caccggaata agttcgggcc catgtcgaaa catgggcccg aacttattcc 50

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaaggaata agttcgggcc catgtttcga catgggcccg aacttattcc 50

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caccgcacag gaattggtgg caaagcgaac tttgccacca attcctgtgc 50

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaaagcacag gaattggtgg caaagttcgc tttgccacca attcctgtgc 50

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acaataggtg taagtccgtg c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acatgggccc gaacttattc c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctttgccacc aattcctgtg c 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctcaaggtgg atgaccaaat ga 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttgcccagta accaggaaga t 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agaaggctgg ggctcatttg 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agggggccat ccacagtctt c 21

Claims

1.绵羊Lrh-1短发夹RNA，其正义链5’→3’包括顺序连接的序列A、茎环序列1、序列B；其中，序列A与序列B反向互补；所述序列A如SEQ ID NO:1～3任一项所示。

2.根据权利要求1所述的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其特征在于，其反义链5’→3’包括顺序连接的序列A、茎环序列2、序列B；所述茎环序列2与茎环序列1反向互补。

3.根据权利要求1或2所述的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其特征在于，所述正义链和反义链的5’端皆连接有接头，所述正义链的接头序列为CACC；所述反义链的接头序列为AAAA。

4.根据权利要求1～3任一项所述的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其特征在于，所述茎环序列1的核酸序列为CGAA。

5.根据权利要求1～4任一项所述的绵羊Lrh-1短发夹RNA，其特征在于，

正义链的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，反义链的核酸序列如SEQ ID NO:5所示；

或正义链的核酸序列如SEQ ID NO:6所示，反义链的核酸序列如SEQ ID NO:7所示；

或正义链的核酸序列如SEQ ID NO:8所示，反义链的核酸序列如SEQ ID NO:9所示。

6.由权利要求1～5任一项所述的短发夹RNA中，正义链和反义链退火合成的ds Oligo。

7.绵羊Lrh-1基因的干扰载体，其特征在于，包括骨架载体和权利要求6所述的dsOligo。

8.根据权利要求7所述的干扰载体，其特征在于，所述骨架载体为pENTR/U6-shRNA-GFP。

9.一种敲减绵羊Lrh-1基因的方法，其特征在于，以权利要求7或8所述的干扰载体转染受体。

10.一种敲减绵羊Lrh-1基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的短发夹RNA、权利要求6所述的ds Oligo或权利要求7或8所述的干扰载体。