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CN111334068A - 一种基于SNAP-tag技术的自闪烁超分辨荧光染料及其合成和应用 - Google Patents

一种基于SNAP-tag技术的自闪烁超分辨荧光染料及其合成和应用 Download PDF

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CN111334068A CN201811550693.6A CN201811550693A CN111334068A CN 111334068 A CN111334068 A CN 111334068A CN 201811550693 A CN201811550693 A CN 201811550693A CN 111334068 A CN111334068 A CN 111334068A
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Abstract

本发明提供了一种基于SNAP‑tag技术的自闪烁超分辨荧光染料及其合成和应用，该荧光染料的结构(1)所示，通过引入氮杂环丁烷抑制硅罗丹明的分子内旋转，从而具有高光稳定性、高量子产率等特点。而且由于染料分子内螺化的热力学平衡，该荧光染料可以不断闪烁，进而应用于超分辨荧光成像。此外，该探针能够在活细胞内对融合有SNAP‑tag标签的多种目标蛋白进行特异性标记，实现活细胞内目标蛋白的示踪。本项目发明的SNAP‑tag自闪烁超分辨荧光染料在蛋白标记、蛋白与蛋白的相互作用，以及超分辨荧光成像等领域具有广泛应用。

Description

一种基于SNAP-tag技术的自闪烁超分辨荧光染料及其合成和 应用
技术领域
本发明属荧光染料技术领域，具体涉及一种基于SNAP-tag技术的自闪烁超分辨荧光染料及其合成和应用。
背景技术
蛋白标签技术结合了蛋白的遗传编码特性以及小分子的优良光物理特性，其在研究蛋白的功能、蛋白与蛋白的相互作用中具有广泛的应用。荧光显微成像技术作为原位、无损追踪这类动态生命活动的主要工具，其分辨率长期无法突破衍射极限的限制。而近些年来超分辨成像技术将荧光显微成像的分辨率提升至20nm，为蛋白的相关研究带来了新的机遇。研究工作者可以从更精细的结构中提取蛋白与蛋白相互作用、蛋白分布等信息。
当前，单分子定位显微镜在对荧光标记的生物分子进行超分辨率图像构建时，通常需要进行强激光照射以及添加硫醇等添加剂来诱导荧光团的开关。但是，强激光照射会导致严重的细胞损伤，加入的硫醇也会对细胞结构产生很大的影响，这些条件限制了超分辨技术潜在应用。自闪烁荧光染料由于分子内螺环的热力学平衡，其在基态没有颜色和荧光，即可通过分子内开关不断闪烁。因此，在近生理条件下，能够在不需要大功率激光照射或任何添加剂下即可自发闪烁的荧光团对于活细胞超分辨成像是极其重要的。
发明内容
本发明提供一种基于SNAP-tag技术的自闪烁超分辨荧光染料及其合成和应用，一种高亮度的SNAP-tag的自闪烁荧光染料，该染料能够特异性识别SNAP-tag蛋白并进行超分辨成像。
一种高亮度的用SNAP-tag的自闪烁荧光染料，该荧光染料具有如下结构：
Figure BDA0001910561010000021
本发明提供一种高亮度的用SNAP-tag的自闪烁荧光染料，该染料具有高光稳定性、高量子产率，荧光量子产率达到0.8(在水中)。
发明提供一种高亮度的用于SNAP-tag蛋白的自闪烁荧光染料，该染料具有自闪烁功能，可以减少dSTORM的应用的激光能量(40W/cm2)。
一种高亮度的用SNAP-tag的自闪烁荧光染料的合成方法，该荧光染料合成路线，如下：
Figure BDA0001910561010000022
具体合成步骤如下：
(1)中间体1的合成：
将3-甲基-4-溴苯甲酸,N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，偶氮二异丁氰(AIBN)溶于四氯化碳(CCl4)中，加热回流40-80h；反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300目硅胶柱以体积比20:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化得到白色目标物1；
(2)中间体2的合成：
将中间体1溶于10％碳酸钠溶液中，在70℃搅拌1-4h。反应结束后加入稀盐酸，待沉淀析出后，过滤，干燥；经200-300目硅胶柱以体积比20:1的二氯甲烷和甲醇为展开剂分离纯化得到白色目标物2；
(3)中间体3的合成：
将中间体2，叔丁醇，无水硫酸镁，浓硫酸溶于二氯甲烷中，室温搅拌24-72h天。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300目硅胶柱以体积比100:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化得到无色油状目标物3；
(4)中间体4的合成：
将碘化亚铜，磷酸三钾，加入到两口瓶中，再分别加入正丁醇，乙二醇，1-溴-3-碘苯，杂氮环丁烷。反复抽真空通氮气三次；在100℃下搅拌18-48h；反应完成后冷却到室温，加入饱和氯化铵溶液，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经200-300目硅胶柱以体积比2:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化获得无色油状中间体4；
(5)中间体5的合成
将中间体4加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，加入四氢呋喃冷却至-78℃；之后加入正丁基锂(2.4M)，反应15-20min,再加入二氯二甲基硅烷；反应逐渐恢复到室温；反应完成后加入饱和氯化铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物200-300目经硅胶柱；以体积比70:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化获得中间体5；
(6)中间体6的合成：
将中间体5、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应1-4h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300硅胶柱以体积比30:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化得到白色目标物6；
(7)中间体7的合成：
将中间体6加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，加入四氢呋喃冷却至-18℃；之后加入异丁基锂(1.6M)，反应20-30min,再加入二甲氨基甲酰氯；反应逐渐恢复到室温；反应完成后加入饱和氯化铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经200-300目硅胶柱；以二氯甲烷为展开剂分离纯化获得黄色固体中间体7；
(8)中间体8的合成：
将中间体3加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，用注射器加入无水四氢呋喃，冷却至-78℃；之后加异丁基锂，反应30min,再加入中间体7；逐渐恢复到室温搅拌12-24h；反应完成后加入饱和氯化入铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经200-300目硅胶柱；以体积比30:1的二氯甲烷和甲醇为展开剂分离纯化获得蓝色固体中间体8；
(9)中间体9的合成：
将中间体8溶于三氟乙酸(CF3COOH)中，室温下搅拌2-4天。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300目硅胶柱以体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇为展开剂分离纯化得到蓝色固体中间体9；
(10)中间体10的合成：
将中间体9，N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，三乙胺溶于DMF中，室温搅拌1-3h；反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300目硅胶柱以体积比10:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化得到白色粉末中间体10；
(11)探针BG-SiRho的合成：
将中间体10、N,N-二异丙基乙氨，中间体11溶于DMF中，室温搅拌12-16h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300目硅胶柱以体积比10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂分离纯化得到白色粉末探针BG-SiRho；
步骤(1)中：
3-甲基-4-溴苯甲酸与N-溴代琥珀酰亚胺的质量比为1:0.45-1.8；
3-甲基-4-溴苯甲酸与偶氮二异丁氰的质量比为1:0.0078-0.0312；
3-甲基-4-溴苯甲酸与四氯化碳的质量与体积比为1:5-20g/mL。
步骤(2)中：
中间体1与10％碳酸钠溶液的质量与体积比为1:4-16g/mL。
步骤(3)中：
中间体2与叔丁醇的质量比为1:0.7-2.8；
中间体2与无水硫酸镁的质量比为1:0.9-3.6；
中间体2与浓硫酸的质量与体积比1:0.1-0.4；
中间体2与二氯甲烷的质量与体积比为1:13-52g/mL。
步骤(4)中：
1-溴-3-碘苯与碘化亚铜的质量比为1:0.2-2；
1-溴-3-碘苯与磷酸三钾的质量比为1:4-10；
1-溴-3-碘苯与杂氮环丁烷的质量与体积比1:0.2-1；
1-溴-3-碘苯与乙二醇的体积比为1:1-1.5(g：mL)。
步骤(5)中：
中间体4与正丁基锂的质量与体积比为1:1-4g/mL；
中间体4与二氯二甲基硅烷的质量与体积比为1:0.13-0.5g/mL；
中间体4与四氢呋喃的质量与体积比为1:10-20g/mL。
步骤(6)中：
中间体5与N-溴代琥珀酰亚胺的质量比为1:0.56-2.23；
中间体5与N,N-二甲基甲酰胺的质量与体积比为1:7.5-30g/mL。
步骤(7)中：
中间体4与异丁基锂的质量与体积比为1:1.36-5.4(g：mL)；
中间体4与二甲氨基甲酰氯的质量与体积比为1:0.12-0.48g/mL；
中间体4与四氢呋喃的质量与体积比为1:18-70g/mL。
步骤(8)中：
中间体3与异丁基锂的质量与体积比为1:0.85-3.4g/mL；
中间体3与中间体7的质量比为1:0.07-0.30；
中间体3与四氢呋喃的质量与体积比为1:18-72g/mL。
步骤(9)中：
中间体8与三氟乙酸的质量与体积比为1:74-300g/mL。
步骤(10)中：
中间体9与N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯的质量比为1:0.8-3.2；
中间体9与4-二甲氨基吡啶的质量比为1:0.1-0.3；
中间体9与三乙胺的质量与体积比为1:0.6-2.4g/mL；
中间体9与DMF的质量与体积比为1:147-600g/mL。
步骤(11)中：
中间体10与N,N-二异丙基乙氨的质量与体积比为1:1-2；
中间体10与中间体11的质量比为1:0.33-1.2；
中间体10与DMF的质量与体积比为1:250-500g/mL。
本发明一种高亮度的用于SNAP-tag蛋白的自闪烁荧光染料的合成方法，该方法具有操作方便、成本低等优点。
一种高亮度的用于SNAP-tag蛋白标记的自闪烁超分辨荧光染料在细胞、组织及活体内的荧光成像领域的应用。
本发明的染料具有以下特征：
该染料拥有合成原料低价、方法简单等优点。
该染料能够特异性识别SNAP-tag蛋白并进行超分辨成像。
该染料具有高光稳定性、高量子产率，荧光量子产率达到0.8(在水中)。
该染料具有自闪烁功能，可以减少dSTORM的应用的激光能量(40W/cm2)。
附图说明
图1实施例1制备的中间体3的核磁谱图氢谱。
图2实施例1制备的中间体4的核磁谱图氢谱。
图3实施例1制备的中间体5的核磁谱图氢谱。
图4实施例1制备的中间体6的核磁谱图氢谱。
图5实施例1制备的中间体7的核磁谱图氢谱。
图6实施例1制备的中间体8的核磁谱图氢谱。
图7实施例1制备的中间体9的核磁谱图氢谱。
图8实施例1制备的中间体10的核磁谱图氢谱。
图9实施例1制备的染料BG-SiRho的核磁谱图氢谱。
图10实施例1制备的染料BG-SiRho在不同pH下(pH＝2-12)的紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸光度，荧光染料的浓度为5μM。
图11实施例1制备的染料BG-SiRho在不同pH下(pH＝2-12)的荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光染料的浓度为5μM。
图12实施例1制备的染料BG-SiRho对细胞核内转染SNAP-tag蛋白后的超分辨成像。
图13实施例1制备的染料BG-SiRho对细胞内线粒体转染SNAP-tag蛋白后的超分辨成像。
具体实施方式
实施例1
中间体1的合成
Figure BDA0001910561010000091
将3-甲基-4-溴苯甲酸(5.03g，23mmol)、NBS(4.5g，25mmol)，AIBN(76.8mg，0.47mmol)溶于50mL四氯化碳(CCl4)中，加热回流72h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(20:1)为展开剂分离纯化得到白色目标物6g，产率86％。
中间体2的合成
Figure BDA0001910561010000092
将1(6g，20mmol)溶于50mL10％碳酸钠溶液中，在70℃搅拌2h。反应结束后加入稀盐酸，待沉淀析出后，过滤，干燥。经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(20:1)为展开剂分离纯化得到白色目标物3g，产率65％。
中间体3的合成
Figure BDA0001910561010000093
将2(2.3g，10mmol)、叔丁醇(3.2g，44mmol)，无水硫酸镁(4.18g)，浓硫酸(0.47mL)溶于60mL二氯甲烷中，室温搅拌48h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(100:1)为展开剂分离纯化得到无色油状目标物2.75g，产率80％。实施例1制备的中间体3其核磁谱图如图1所示，具体氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.14(d,J＝2.1Hz,1H),7.71(dd,J＝8.3,2.1Hz,1H),7.55(d,J＝8.3Hz,1H),4.50(s,2H),1.59(s,9H),1.32(s,9H).
中间体4的合成
Figure BDA0001910561010000101
将CuI(135mg,0.707mmol),K3PO4(4.5g，21mmol)，加入到50mL的两口瓶中，再分别加入10mL正丁醇，1mL乙二醇，1-溴-3-碘苯(900mg，7mmol)，杂氮环丁烷(600μL，8mmol)。反复抽真空通氮气三次。在100℃下搅拌24h。反应完成后冷却到室温，加入10mL饱和氯化铵溶液，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(2:1)为展开剂分离纯化获得无色油状液体500mg,产率50％。实施例1制备的中间体4其核磁谱图如图2所示，具体氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.03(t,J＝8.0Hz,1H),6.81(dd,J＝7.9,0.7Hz,1H),6.54(t,J＝1.9Hz,1H),6.33(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),3.86(t,J＝7.3Hz,4H),2.37(m,J＝14.5,7.2Hz,2H).
中间体5的合成
Figure BDA0001910561010000102
将4(1.055g，5mmol)加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，冷却至-78℃。之后加入2mL正丁基锂(2.4M)，反应15min,再加入二氯二甲基硅烷(252μL,2.1mmol)。反应逐渐恢复到室温。反应完成后加入饱和氯化铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(70:1)为展开剂分离纯化获得无色油状液体2g,产率80％。实施例1制备的中间体5其核磁谱图如图3所示，具体氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.19(t,J＝7.6Hz,2H),6.89(d,J＝7.2Hz,2H),6.60(d,J＝2.1Hz,2H),6.45(dd,J＝8.0,1.7Hz,2H),3.85(t,J＝7.2Hz,8H),2.39–2.27(m,4H),0.49(s,6H).
中间体6的合成
Figure BDA0001910561010000111
将5(0.322g，1mmol)、NBS(0.36g，2mmol)溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应2h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(30:1)为展开剂分离纯化得到白色目标物0.5g，产率90％。实施例1制备的中间体6其核磁谱图如图4所示，具体氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.30(d,J＝8.5Hz,2H),6.51(d,J＝2.9Hz,2H),6.31(dd,J＝8.5,3.0Hz,2H),3.81(t,J＝7.2Hz,8H),2.38–2.26(m,4H),0.71(s,6H).
中间体7的合成
Figure BDA0001910561010000121
将6(0.42g，0.9mmol)加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，冷却至-18℃。之后加入1.14mL异丁基锂(1.6M)，反应30min,再加入二甲氨基甲酰氯(92μL,1mmol)。反应逐渐恢复到室温。反应完成后加入饱和氯化铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷为展开剂分离纯化获得黄色固体0.3g,产率60％。实施例1制备的中间体7其核磁谱图如图5所示，具体氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.36(d,J＝8.7Hz,2H),6.51(dd,J＝8.7,2.5Hz,2H),6.48(d,J＝2.5Hz,2H),4.02(t,J＝7.3Hz,8H),2.47–2.35(m,4H),0.43(s,6H).
中间体8的合成
Figure BDA0001910561010000122
将3(0.275g，0.8mmol)加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，用注射器加入10mL无水四氢呋喃，冷却至-78℃。之后加入0.47mL异丁基锂(1.6M)，反应30min,再加入7(40mg，0.114mmol)。逐渐恢复到室温搅拌12h。反应完成后加入饱和氯化铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(30:1)为展开剂分离纯化获得蓝色固体34mg,产率50％。实施例1制备的中间体8其核磁谱图如图6所示，具体氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.06(d,J＝1.4Hz,1H),7.94(dd,J＝7.9,1.6Hz,1H),7.14(d,J＝7.9Hz,1H),6.87(d,J＝2.6Hz,2H),6.85(d,J＝9.4Hz,2H),6.25(dd,J＝9.4,2.5Hz,2H),4.28(s,8H),4.09(s,2H),2.54–2.38(m,4H),1.55(s,9H),0.83(s,9H),0.46(d,J＝5.0Hz,6H).
中间体9的合成
Figure BDA0001910561010000131
将8(34mg，0.057mmol)溶于5mL三氟乙酸(CF3COOH)中，室温下搅拌2天。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(10:1)为展开剂分离纯化得到蓝色目标物17mg，产率60％。实施例1制备的中间体9其核磁谱图如图7所示，具体氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(s,1H),7.75(d,J＝7.9Hz,1H),7.01(d,J＝8.6Hz,2H),6.78(d,J＝8.0Hz,1H),6.34(dd,J＝8.7,2.5Hz,2H),5.41(s,2H),3.79(t,J＝7.3Hz,8H),2.28(dt,J＝14.5,7.1Hz,4H),0.56(s,3H),0.44(s,3H).
中间体10的合成
Figure BDA0001910561010000141
将9(17mg，0.034mmol)、N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯(27mg，0.1mmol)，DMAP(5.1mg)，三乙胺(20μL)溶于5mL DMF中，室温搅拌1h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(10:1)为展开剂分离纯化得到白色粉末目标物10m g，产率53％。实施例1制备的中间体10其核磁谱图如图8所示，具体氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.10(s,1H),8.03(d,J＝8.1Hz,1H),7.15(d,J＝8.1Hz,1H),6.88(d,J＝8.6Hz,2H),6.66(d,J＝2.6Hz,2H),6.32(dd,J＝8.6,2.6Hz,2H),5.29(s,2H),3.89(t,J＝7.2Hz,8H),2.91(s,4H),2.41–2.29(m,4H),0.59(s,3H),0.51(s,3H).
染料BG-SiRho的合成
Figure BDA0001910561010000142
将10(10mg，0.018mmol)、N,N-二异丙基乙氨(20μL)，11(6mg，0.02mmol)溶于5mLDMF中，室温搅拌12h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(10:1)为展开剂分离纯化得到白色粉末目标物10mg，产率80％。实施例1制备的染料BG-SiRho其核磁谱图如图9所示，具体氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.83(s,2H),7.66(d,J＝8.0Hz,1H),7.49(d,J＝8.1Hz,2H),7.36(d,J＝8.0Hz,2H),7.00(d,J＝8.7Hz,2H),6.88(d,J＝7.9Hz,1H),6.68(d,J＝2.6Hz,2H),6.40(dd,J＝8.7,2.6Hz,2H),5.53(s,2H),5.39(s,2H),4.57(s,3H),3.85(t,J＝7.2Hz,8H),2.39–2.29(m,4H),0.56(s,3H),0.45(s,3H).
经检测，其结构如上式BG-SiRho所示，其在水中荧光发射波长为660nm左右，吸收波长为650nm左右，且该染料能够实现荧光自开关。
实施例2
中间体1的合成
Figure BDA0001910561010000151
将3-甲基-4-溴苯甲酸(5g，24mmol)、NBS(2.25g，12.5mmol)，AIBN(38mg，0.24mmol)溶于30mL四氯化碳(CCl4)中，加热回流40h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(20:1)为展开剂分离纯化得到白色目标物3g，产率85％。
中间体2的合成
Figure BDA0001910561010000161
将1(6g，20mmol)溶于50mL10％碳酸钠溶液中，在70℃搅拌2h。反应结束后加入稀盐酸，待沉淀析出后，过滤，干燥。经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(20:1)为展开剂分离纯化得到白色目标物1.5g，产率64％。
中间体3的合成
Figure BDA0001910561010000162
将2(2.3g，10mmol)、叔丁醇(1.6g，22mmol)，无水硫酸镁(2g)，浓硫酸(0.25mL)溶于60mL二氯甲烷中，室温搅拌24h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(100:1)为展开剂分离纯化得到无色油状目标物1.4g，产率81％。
中间体4的合成
Figure BDA0001910561010000163
将CuI(70mg,035mmol),K3PO4(2.3g，10mmol)，加入到50mL的两口瓶中，再分别加入5mL正丁醇，0.5mL乙二醇，1-溴-3-碘苯(900mg，7mmol)，杂氮环丁烷(300μL，4mmol)。反复抽真空通氮气三次。在100℃下搅拌18h。反应完成后冷却到室温，加入10mL饱和氯化铵溶液，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(2:1)为展开剂分离纯化获得无色油状液体250mg,产率50％。
中间体5的合成
Figure BDA0001910561010000171
将4(1g，5mmol)加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，冷却至-78℃。之后加入1mL正丁基锂(2.4M)，反应15min,再加入二氯二甲基硅烷(130μL,1.05mmol)。反应逐渐恢复到室温。反应完成后加入饱和氯化铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(70:1)为展开剂分离纯化获得无色油状液体1g,产率81％。
中间体6的合成
Figure BDA0001910561010000172
将5(0.3g，1mmol)、NBS(0.18g，1mmol)溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应1h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(30:1)为展开剂分离纯化得到白色目标物0.6g，产率93％。
中间体7的合成
Figure BDA0001910561010000181
将6(0.42g，0.9mmol)加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，冷却至-18℃。之后加入0.7mL异丁基锂(1.6M)，反应30min,再加入二甲氨基甲酰氯(46μL,0.5mmol)。反应逐渐恢复到室温。反应完成后加入饱和氯化铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷为展开剂分离纯化获得黄色固体0.15g,产率60％。
中间体8的合成
Figure BDA0001910561010000182
将3(0.28g，0.8mmol)加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，用注射器加入10mL无水四氢呋喃，冷却至-78℃。之后加入0.24mL异丁基锂(1.6M)，反应30min,再加入7(20mg，0.6mmol)。逐渐恢复到室温搅拌12h。反应完成后加入饱和氯化铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(30:1)为展开剂分离纯化获得蓝色固体18mg,产率58％。
中间体9的合成
Figure BDA0001910561010000191
将8(34mg，0.06mmol)溶于5mL三氟乙酸(CF3COOH)中，室温下搅拌2天。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(10:1)为展开剂分离纯化得到蓝色目标物9mg，产率62％。
中间体10的合成
Figure BDA0001910561010000192
将9(17mg，0.034mmol)、N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯(14mg，0.05mmol)，DMAP(2.5mg)，三乙胺(10μL)溶于5mL DMF中，室温搅拌1h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(10:1)为展开剂分离纯化得到白色粉末目标物5mg，产率52％。
染料BG-SiRho的合成
Figure BDA0001910561010000201
将10(10mg，0.018mmol)、N,N-二异丙基乙氨(10μL)，11(3mg，0.01mmol)溶于5mLDMF中，室温搅拌12h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(10:1)为展开剂分离纯化得到白色粉末目标物5mg，产率80％。
经检测，其结构如上式BG-SiRho所示，其在水中荧光发射波长为660nm左右，吸收波长为650nm左右，且该染料能够实现荧光自开关。
实施例3
中间体1的合成
Figure BDA0001910561010000202
将3-甲基-4-溴苯甲酸(2.5g，12mmol)、NBS(4.5g，25mmol)，AIBN(76.8mg，0.47mmol)溶于50mL四氯化碳(CCl4)中，加热回流80h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(20:1)为展开剂分离纯化得到白色目标物5g，产率80％。
中间体2的合成
Figure BDA0001910561010000211
将1(3g，10mmol)溶于50mL10％碳酸钠溶液中，在70℃搅拌2h。反应结束后加入稀盐酸，待沉淀析出后，过滤，干燥。经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(20:1)为展开剂分离纯化得到白色目标物2g，产率70％。
中间体3的合成
Figure BDA0001910561010000212
将2(1.2g，5mmol)、叔丁醇(3.2g，44mmol)，无水硫酸镁(4.18g)，浓硫酸(0.47mL)溶于60mL二氯甲烷中，室温搅拌72h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(100:1)为展开剂分离纯化得到无色油状目标物1g，产率70％。
中间体4的合成
Figure BDA0001910561010000213
将CuI(135mg,0.707mmol),K3PO4(4.5g，21mmol)，加入到50mL的两口瓶中，再分别加入10mL正丁醇，1mL乙二醇，1-溴-3-碘苯(450mg，3.5mmol)，杂氮环丁烷(600μL，8mmol)。反复抽真空通氮气三次。在100℃下搅拌48h。反应完成后冷却到室温，加入10mL饱和氯化铵溶液，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(2:1)为展开剂分离纯化获得无色油状液体300mg,产率60％。
中间体5的合成
Figure BDA0001910561010000221
将4(0.5g，2.5mmol)加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，冷却至-78℃。之后加入2mL正丁基锂(2.4M)，反应15min,再加入二氯二甲基硅烷(252μL,2.1mmol)。反应逐渐恢复到室温。反应完成后加入饱和氯化铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(70:1)为展开剂分离纯化获得无色油状液体1g,产率80％。
中间体6的合成
Figure BDA0001910561010000222
将5(0.16g，0.5mmol)、NBS(0.36g，2mmol)溶于5mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应4h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(30:1)为展开剂分离纯化得到白色目标物0.5g，产率90％。
中间体7的合成
Figure BDA0001910561010000231
将6(0.21g，0.45mmol)加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，冷却至-18℃。之后加入1.14mL异丁基锂(1.6M)，反应30min,再加入二甲氨基甲酰氯(92μL,1mmol)。反应逐渐恢复到室温。反应完成后加入饱和氯化铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷为展开剂分离纯化获得黄色固体0.15g,产率60％。
中间体8的合成
Figure BDA0001910561010000232
将3(0.14g，0.4mmol)加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，用注射器加入10mL无水四氢呋喃，冷却至-78℃。之后加入0.47mL异丁基锂(1.6M)，反应30min,再加入7(40mg，0.114mmol)。逐渐恢复到室温搅拌12h。反应完成后加入饱和氯化铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(30:1)为展开剂分离纯化获得蓝色固体34mg,产率50％。
中间体9的合成
Figure BDA0001910561010000241
将8(17mg，0.03mmol)溶于5mL三氟乙酸(CF3COOH)中，室温下搅拌4天。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(10:1)为展开剂分离纯化得到蓝色目标物9mg，产率60％。
中间体10的合成
Figure BDA0001910561010000242
将9(9mg，0.017mmol)、N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯(27mg，0.1mmol)，DMAP(5.1mg)，三乙胺(20μL)溶于5mL DMF中，室温搅拌3h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以石油醚和乙酸乙酯(10:1)为展开剂分离纯化得到白色粉末目标物5mg，产率50％。
染料BG-SiRho的合成
Figure BDA0001910561010000251
将10(5mg，0.009mmol)、N,N-二异丙基乙氨(20μL)，11(6mg，0.02mmol)溶于5mLDMF中，室温搅拌16h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经硅胶柱(200-300目)以二氯甲烷和甲醇(10:1)为展开剂分离纯化得到白色粉末目标物5mg，产率80％。
经检测，其结构如上式BG-SiRho所示。
将BG-SiRho溶解于DMSO溶液中配制2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其紫外吸收，荧光光谱变化及细胞内荧光成像。
BG-SiRho在不同pH下(pH＝2-8)的紫外吸收光谱测试。取400μL BG-SiRho母液溶于80mL水中，通过氢氧化钠溶液及盐酸溶液调节pH，带稳定后取出4mL测试液进行紫外吸收光谱测试。
BG-SiRho终浓度为2μM在不同pH下(pH＝2-8)的紫外吸收如图10所示，光谱有很大的改变，pH越低，其在650纳米处的吸收越强，说明探针在正常生理学条件下(pH＝7.0-7.4)绝大部分保持暗态。
BG-SiRho在不同pH下(pH＝2-8)的荧光发射光谱测试。取400μL BG-SiRho母液溶于80mL水中，通过氢氧化钠溶液及盐酸溶液调节pH，带稳定后取出4mL测试液进行荧光光谱测试。
BG-SiRho终浓度为2μM在不同pH下荧光如图11所示，荧光光谱有很大的改变，在中性及碱性环境下荧光很弱，在酸性条件下荧光增强，说明探针在生理学条件下绝大部分保持非荧光暗态。
实施例4
通过质粒诱导Hela细胞核内表达SNAP-tag蛋白。之后加入BG-SiRho孵育20分钟，进行活细胞超分辨荧光成像实验。
探针BG-SiRho终浓度为1μM的细胞培养液孵育Hela细胞10分钟后荧光成像图如图12所示，BG-SiRho荧光染料对细胞核的SNAP-tag蛋白有很好的标记效果，具有很好地超分辨成像效果，而且成像过程中不需要强的激光淬灭荧光分子。
实施例5
通过质粒诱导Hela细胞线粒体内表达SNAP-tag蛋白。之后加入BG-SiRho孵育20分钟，进行活细胞超分辨荧光成像实验。
探针BG-SiRho终浓度为1μM的细胞培养液孵育Hela细胞10分钟后荧光成像如图8所示，图13中BG-SiRho荧光染料对线粒体的SNAP-tag蛋白有很好的标记效果，具有好地超分辨成像效果。

Claims (14)

1.一种基于SNAP-tag技术的自闪烁超分辨荧光染料，其特征在于该自闪烁荧光染料结构如下：
Figure FDA0001910561000000011
2.一种如权利要求1所述的高亮度的SNAP-tag自闪烁超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于包含步骤如下：
(1)中间体1的合成：
将3-甲基-4-溴苯甲酸,N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，偶氮二异丁氰(AIBN)溶于四氯化碳(CCl4)中，加热回流40-80h；反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300目硅胶柱以体积比20:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化得到白色目标物1；
(2)中间体2的合成：
将中间体1溶于10％碳酸钠溶液中，在70℃搅拌1-4h。反应结束后加入稀盐酸，待沉淀析出后，过滤，干燥；经200-300目硅胶柱以体积比20:1的二氯甲烷和甲醇为展开剂分离纯化得到白色目标物2；
(3)中间体3的合成：
将中间体2，叔丁醇，无水硫酸镁，浓硫酸溶于二氯甲烷中，室温搅拌24-72h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300目硅胶柱以体积比100:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化得到无色油状目标物3；
(4)中间体4的合成：
将碘化亚铜，磷酸三钾，加入到两口瓶中，再分别加入正丁醇，乙二醇，1-溴-3-碘苯，杂氮环丁烷。反复抽真空通氮气三次；在100℃下搅拌18-48h；反应完成后冷却到室温，加入饱和氯化铵溶液，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经200-300目硅胶柱以体积比2:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化获得无色油状中间体4；
(5)中间体5的合成
将中间体4加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，加入四氢呋喃冷却至-78℃；之后加入正丁基锂(2.4M)，反应15-20min,再加入二氯二甲基硅烷；反应逐渐恢复到室温；反应完成后加入饱和氯化铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物200-300目经硅胶柱；以体积比70:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化获得中间体5；
(6)中间体6的合成：
将中间体5、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下反应1-4h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300硅胶柱以体积比30:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化得到白色目标物6；
(7)中间体7的合成：
将中间体6加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，加入四氢呋喃冷却至-18℃；之后加入异丁基锂(1.6M)，反应20-30min,再加入二甲氨基甲酰氯；反应逐渐恢复到室温；反应完成后加入饱和氯化铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经200-300目硅胶柱；以二氯甲烷为展开剂分离纯化获得黄色固体中间体7；
(8)中间体8的合成：
将中间体3加入至25mL史莱克瓶中，反复抽真空通氮气三次，用注射器加入无水四氢呋喃，冷却至-78℃；之后加异丁基锂，反应30min,再加入中间体7；逐渐恢复到室温搅拌12-24h；反应完成后加入饱和氯化入铵淬灭反应，用乙酸乙酯萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸馏，反应产物经200-300目硅胶柱；以体积比30:1的二氯甲烷和甲醇为展开剂分离纯化获得蓝色固体中间体8；
(9)中间体9的合成：
将中间体8溶于三氟乙酸(CF3COOH)中，室温下搅拌2-4天。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300目硅胶柱以体积比为10:1的二氯甲烷和甲醇为展开剂分离纯化得到蓝色固体中间体9；
(10)中间体10的合成：
将中间体9，N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，三乙胺溶于DMF中，室温搅拌1-3h；反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300目硅胶柱以体积比10:1的石油醚和乙酸乙酯为展开剂分离纯化得到白色粉末中间体10；
(11)探针BG-SiRho的合成：
将中间体10、N,N-二异丙基乙氨，中间体11溶于DMF中，室温搅拌12-16h。反应结束后减压蒸馏除去溶剂，经200-300目硅胶柱以体积比10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂分离纯化得到白色粉末探针BG-SiRho。
3.根据权利要求2所述的一种高亮度的SNAP-tag自闪烁超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(1)中：
3-甲基-4-溴苯甲酸与N-溴代琥珀酰亚胺的质量比为1:0.45-1.8；
3-甲基-4-溴苯甲酸与偶氮二异丁氰的质量比为1:0.0078-0.0312；
3-甲基-4-溴苯甲酸与四氯化碳的质量与体积比为1:5-20g/mL。
4.根据权利要求2所述的一种高亮度的SNAP-tag自闪烁超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(2)中：
中间体1与10％碳酸钠溶液的质量与体积比为1:4-16g/mL。
5.根据权利要求2所述的一种高亮度的SNAP-tag自闪烁超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(3)中：
中间体2与叔丁醇的质量比为1:0.7-2.8；
中间体2与无水硫酸镁的质量比为1:0.9-3.6；
中间体2与浓硫酸的质量与体积比1:0.1-0.4；
中间体2与二氯甲烷的质量与体积比为1:13-52g/mL。
6.根据权利要求2所述的一种高亮度的SNAP-tag自闪烁超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(4)中：
1-溴-3-碘苯与碘化亚铜的质量比为1:0.2-2；
1-溴-3-碘苯与磷酸三钾的质量比为1:4-10；
1-溴-3-碘苯与杂氮环丁烷的质量与体积比1:0.2-1；
1-溴-3-碘苯与乙二醇的体积比为1:1-1.5(g：mL)。
7.根据权利要求2所述的一种高亮度的SNAP-tag自闪烁超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(5)中：
中间体4与正丁基锂的质量与体积比为1:1-4g/mL；
中间体4与二氯二甲基硅烷的质量与体积比为1:0.13-0.5g/mL；
中间体4与四氢呋喃的质量与体积比为1:10-20g/mL。
8.根据权利要求2所述的一种高亮度的SNAP-tag自闪烁超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(6)中：
中间体5与N-溴代琥珀酰亚胺的质量比为1:0.56-2.23；
中间体5与N,N-二甲基甲酰胺的质量与体积比为1:7.5-30g/mL。
9.根据权利要求2所述的一种高亮度的SNAP-tag自闪烁超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(7)中：
中间体4与异丁基锂的质量与体积比为1:1.36-5.4(g：mL)；
中间体4与二甲氨基甲酰氯的质量与体积比为1:0.12-0.48g/mL；
中间体4与四氢呋喃的质量与体积比为1:18-70g/mL。
10.根据权利要求2所述的一种高亮度的SNAP-tag自闪烁超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(8)中：
中间体3与异丁基锂的质量与体积比为1:0.85-3.4g/mL；
中间体3与中间体7的质量比为1:0.07-0.30；
中间体3与四氢呋喃的质量与体积比为1:18-72g/mL。
11.根据权利要求2所述的一种高亮度的SNAP-tag自闪烁超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(9)中：
中间体8与三氟乙酸的质量与体积比为1:74-300g/mL。
12.根据权利要求2所述的一种高亮度的SNAP-tag自闪烁超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(10)中：
中间体9与N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯的质量比为1:0.8-3.2；
中间体9与4-二甲氨基吡啶的质量比为1:0.1-0.3；
中间体9与三乙胺的质量与体积比为1:0.6-2.4g/mL；
中间体9与DMF的质量与体积比为1:147-600g/mL。
13.根据权利要求2所述的一种高亮度的SNAP-tag自闪烁超分辨荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(11)中：
中间体10与N,N-二异丙基乙氨的质量与体积比为1:1-2；
中间体10与中间体11的质量比为1:0.33-1.2；
中间体10与DMF的质量与体积比为1:250-500g/mL。
14.一种如权利1所述的一种高亮度的用于SNAP-tag蛋白标记的自闪烁超分辨荧光染料在细胞、组织及活体内的荧光成像领域的应用。
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