CN111303262A

CN111303262A - 一种植物耐热性和根发育相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111303262A
Application number: CN202010293716.0A
Authority: CN
Inventors: 朱生伟; 曹务强; 李彬; 毛玉伟; 罗小敏
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2020-04-15
Filing date: 2020-04-15
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2040-04-15
Also published as: CN111303262B

Abstract

本发明公开了一种植物耐热性和根发育相关蛋白及其编码基因与应用，该蛋白为蛋白质GhBRK7，蛋白质GhBRK7的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。实验证明，提高野生型拟南芥中蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性，得到转基因拟南芥；与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的耐热性提高和根发育增强。抑制陆地棉TM‑1中蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性，得到陆地棉TM‑1沉默株；与陆地棉TM‑1相比，陆地棉TM‑1沉默株的耐热性降低；耐热性降低表现为株高降低、叶片黄化、叶片中H₂O₂的含量增加和死亡细胞数量增加。由此可见，蛋白质GhBRK7可以调控植物的耐热性和根发育。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种植物耐热性和根发育相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物耐热性和根发育相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

随着工业化进程的推进和人类活动的加剧，全球变暖趋势日益加重。我国极端高温天气近年来频繁发生，区域平均气温呈上升趋势，而西北地区较南方增温速率更加明显，特别是西北新疆棉区的高温(≥35℃)逆境发生频繁。棉花是世界性的重要纤维作物，同时也是一种重要的油料与生物能源作物，在国民经济和社会发展中占有重要地位。频繁发生的高温(≥35℃)逆境导致棉花蕾铃脱落严重、成铃发育畸形，造成棉花减产、纤维品质下降。高温时间持续越长，脱落率就越高，成为影响棉花产量及品质形成的重要环境影响因子之一。另外，高温还会引起花粉败育、生活力下降，导致杂交授粉困难，成铃率低，严重影响杂交棉种子生产。因此研究棉花耐热相关基因并增强棉花的耐热性，对提高棉花产量和品质具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提高植物耐热性和促进根发育。

本发明首先保护蛋白质GhBRK7的应用，可为D1)或D2)：

D1)调控植物耐热性和/或根发育；

D2)培育耐热性和/或根发育改变的转基因植物。

本发明还保护编码蛋白质GhBRK7的核酸分子的应用，可为D1)或D2)：

D1)调控植物耐热性和/或根发育；

D2)培育耐热性和/或根发育改变的转基因植物。

上述任一所述的应用中，所述调控植物耐热性可为提高植物耐热性或降低植物耐热性。

上述任一所述的应用中，所述调控植物根发育可为促进植物根发育或抑制植物根发育。

上述任一所述的应用中，所述培育耐热性改变的转基因植物可为培育耐热性提高的转基因植物或培育耐热性降低的转基因植物。

上述任一所述的应用中，所述培育根发育改变的转基因植物可为培育根发育增强的转基因植物或培育根发育降低的转基因植物。

上述任一所述的应用中，所述植物可为如下c1)至c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)棉花；c4)棉花品种陆地棉TM-1；c5)十字花科植物；c6)拟南芥；c7)野生型拟南芥Columbia-0亚型。

本发明还保护一种培育转基因植物甲的方法，包括如下步骤：提高出发植物中蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性，得到转基因植物甲；与出发植物相比，转基因植物甲的耐热性提高和/或根发育增强。

上述方法中，所述“提高出发植物中蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高出发植物中蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述“提高出发植物中蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性”可通过向出发植物中导入编码蛋白质GhBRK7的核酸分子实现。

上述方法中，所述“向出发植物中导入编码蛋白质GhBRK7的核酸分子”可通过向出发植物中导入重组载体甲实现；所述重组载体甲可为向表达载体插入编码蛋白质GhBRK7的核酸分子，得到的重组质粒。所述重组载体甲具体可为实施例提及的重组质粒35S::GhBRK7-GFP。

所述重组质粒35S::GhBRK7-GFP的制备方法如下：

(1)将SEQ ID NO：1自5’末端起第1至1464位所示的双链DNA分子和pENTR/SD/D-TOPO载体连接，得到中间载体；

(2)将中间载体和载体pMDC83进行LR重组反应，得到重组质粒35S::GhBRK7-GFP。

所述转基因植物甲具体可为实施例提及的GhBRK7-OE 1-8、GhBRK7-OE 5-6和GhBRK7-OE 5-8中的至少一株。

在本发明的一个实施例中，所述出发植物具体可为c1)、c2)、c5)、c6)和c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c5)十字花科植物；c6)拟南芥；c7)生态型拟南芥Columbia-0亚型。

本发明还保护一种培育转基因植物乙的方法，可包括如下步骤：抑制出发植物中蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性，得到转基因植物乙；与出发植物相比，转基因植物乙的耐热性降低和/或根发育降低。

上述方法中，所述“抑制出发植物中蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性”可通过基因定点编辑、RNA干扰、同源重组、基因敲除等本领域熟知的方法，达到抑制蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性的目的。

上述方法中，所述“抑制出发植物中蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性”可通过向出发植物中导入抑制蛋白质GhBRK7表达的物质实现。所述抑制蛋白质GhBRK7表达的物质可为抑制编码蛋白质GhBRK7的核酸分子的表达的物质。所述“抑制编码蛋白质GhBRK7的核酸分子的表达的物质”可通过向出发植物中导入重组质粒PTRV2-GhBRK7和载体PTRV1实现。所述重组质粒PTVR2-GhBRK7具体为向载体PTRV2的限制性内切酶PstⅠ的识别序列间插入SEQID NO：1自5'末端起第159至492位所示的DNA分子。

所述转基因植物乙具体可为实施例提及的陆地棉TM-1沉默株T2、T3、T5和T6中的至少一株。

在本发明的一个实施例中，所述出发植物具体可为c1)-c4)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)棉花；c4)棉花品种陆地棉TM-1。

本发明还保护植物育种方法甲或植物育种方法乙。

所述植物育种方法甲可包括如下步骤：增加植物中蛋白质GhBRK7的含量和/或活性，从而提高耐热性和/或增强根发育。

所述植物育种方法乙可包括如下步骤：降低植物中蛋白质GhBRK7的含量和/或活性，从而降低耐热性和/或降低根发育。

上述任一所述植物可为如下c1)至c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)棉花；c4)棉花品种陆地棉TM-1；c5)十字花科植物；c6)拟南芥；c7)野生型拟南芥Columbia-0亚型。

上述任一所述促进植物根发育或增强根发育具体表现为主根长度、侧根长度、侧根数目、根毛密度和根毛长度中的至少一种的增加。

上述任一所述耐热性降低具体表现为株高降低、H₂O₂的含量增加和死亡细胞数量增加中的至少一种。所述H₂O₂的含量可为植物叶片中的H₂O₂的含量。所述死亡细胞可为植物叶片中的死亡细胞。

上述任一所述耐热可为耐37℃-44℃(如37℃-40℃、40℃-42℃、42℃-44℃、37℃、40℃、42℃或44℃)的高温。

上述任一所述蛋白质GhBRK7可为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO：2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的来源于棉花且与植物耐热性和/或根发育相关的蛋白质；

a4)与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性，来源于棉花且与植物耐热性和/或根发育相关的蛋白质。

其中，SEQ ID NO：2由488个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO：2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO：1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述任一所述编码蛋白质GhBRK7的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码蛋白质GhBRK7的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码蛋白质GhBRK7的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO：1由1467个核苷酸组成，SEQ ID NO：1的核苷酸编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质GhBRK7的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质GhBRK7的核苷酸序列80％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质GhBRK7，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质GhBRK7的核苷酸序列具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

实验证明，向野生型拟南芥中导入重组质粒35S::GhBRK7-GFP，得到转基因拟南芥；与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的耐热性提高和根发育增强；耐热性提高表现为存活率提高和热激相关基因(如HSFA2基因、HSFA7a基因、DREB2A基因、HSP70基因、HSP90基因、HSP101基因)的相对表达水平提高。向陆地棉TM-1中导入重组质粒PTVR2-GhBRK7和载体PTRV1，得到陆地棉TM-1沉默株；与陆地棉TM-1相比，陆地棉TM-1沉默株的耐热性降低；耐热性降低表现为株高降低、叶片黄化、叶片中H₂O₂的含量增加和死亡细胞数量增加。由此可见，蛋白质GhBRK7可以调控植物的耐热性和根发育。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为转GhBRK7基因拟南芥的耐热性鉴定和实时定量PCR检测GhBRK7基因的相对表达水平。

图2为实时定量PCR检测转GhBRK7基因拟南芥中HSFA2基因、HSFA7a基因、DREB2A基因、HSP70基因、HSP90基因和HSP101基因的相对表达水平。

图3为T₃代纯合转GhBRK7基因拟南芥株系的主根长度、侧根长度、侧根数目、根毛密度和根毛长度的统计结果。

图4为陆地棉TM-1沉默株的表型鉴定和耐热性鉴定。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，进行实时定量PCR时，检测GhBRK7基因的引物为5’-ACCTATCTGCATGTTGTTGGAG-3’和5’-CATCTGGAGTGTTTCAATTGAG-3’。

陆地棉TM-1记载于如下文献中：Tronlinder NL et al，1989，Plant Cell Rep8:133-136.，公众可以从中国科学院植物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。在下文中，陆地棉TM-1简称为TM-1。

根癌农杆菌GV3101记载于如下文献中：郑银英，崔百明，常明进，彭明.转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究.西北植物学报.2009年29卷1期.75-79.，公众可以从中国科学院植物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。

野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)记载于如下文献中：Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.A geneticlink between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsisthaliana.Nature Genetics.2004，36:167-171，公众可以从中国科学院植物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。在下文中，拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)简称野生型拟南芥。

载体PTRV1和载体PTRV2均记载于如下文献中：Dong Y，Burch-Smith TM，Liu Y，Mamillapalli P，Dinesh-Kumar SP.A ligation-independent cloning tobacco rattlevirus vector for high-throughput virus-induced gene silencing identifiesroles for NbMADS4-1 and-2in floral development.Plant physiol.2007年145期.1161-1170.，公众可以从中国科学院植物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。

pENTR/SD/D-TOPO载体为Invitrogen公司的产品。

载体pMDC83为Invitrogen公司的产品，公众可以从中国科学院植物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。

Phusion酶为赛默飞公司的产品。5×Phusion Buffer为Phusion酶中的组件。

实施例1、蛋白质GhBRK7的编码基因(即GhBRK7基因)的克隆

1、采用Trizo1法提取生长至14天的陆地棉TM-1幼苗的叶片的总RNA，然后利用反转录酶AMV反转录出第一链cDNA，得到陆地棉TM-1的cDNA。

2、以步骤1获得的陆地棉TM-1的cDNA为模板，采用Forward Primer：5’-ATGGGGTGTGGGTGTTCAA-3’和Reverse Primer：5’-AGAAGTTGCATTCTTTTTATTTTCGA-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到约1464bp的双链DNA分子。

反应体系为50μL，由2μL模板(含1μg陆地棉TM-1的cDNA)、1μL Phusion酶、2.5μLForward Primer水溶液(浓度为10μM)、2.5μL Reverse Primer水溶液(浓度为10μM)、10μL5×Phusion Buffer、10μL dNTP mixture(dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度均为10mmol)和22μL ddH₂0组成。

反应条件为：98℃3min；98℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；20℃5min；4℃保存。

将步骤2得到的双链DNA分子进行测序。测序结果表明，步骤2得到的双链DNA分子(即GhBRK7基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO：1自5’末端起第1至1464位所示。

实施例2、转GhBRK7基因拟南芥的获得及鉴定

一、重组质粒35S::GhBRK7-GFP和GV3101/35S::GhBRK7-GFP的获得

1、将实施例1中步骤2获得的双链DNA分子和pENTR/SD/D-TOPO载体连接，得到中间载体。

2、完成步骤1后，将中间载体和载体pMDC83进行LR重组反应，得到重组质粒35S::GhBRK7-GFP。

重组质粒35S::GhBRK7-GFP表达SEQ ID NO：2所示的蛋白质GhBRK7。

3、将重组质粒35S::GhBRK7-GFP导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/35S::GhBRK7-GFP。

二、转GhBRK7基因拟南芥的获得

1、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中：Clough，S.J.，and Bent，A.F..Floraldip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735-743.)，将步骤一中3获得的GV3101/35S::GhBRK7-GFP转至野生型拟南芥中，获得T₁代转GhBRK7基因拟南芥种子。

2、将步骤1获得的T₁代转GhBRK7基因拟南芥种子播种于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T₁代转GhBRK7基因阳性苗，T₁代转GhBRK7基因阳性苗收到的种子即为T₂代转GhBRK7基因拟南芥种子。

3、将步骤2筛选出的不同株系的T₂代转GhBRK7基因拟南芥种子播种于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为GhBRK7基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T₃代转GhBRK7基因拟南芥种子。

4、将步骤3筛选出的T₃代转GhBRK7基因拟南芥种子再次播种于含有30mg/L的潮霉素的1/2MS培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T₃代纯合转GhBRK7基因拟南芥。

将其中3个T₃代纯合转GhBRK7基因拟南芥株系分别命名为GhBRK7-OE 1-8(简称1-8)、GhBRK7-OE 5-6(简称5-6)和GhBRK7-OE 5-8(简称5-8)，并进行后续实验。

三、实时定量PCR检测T₃代纯合转GhBRK7基因拟南芥(即转GhBRK7基因拟南芥)中GhBRK7基因的相对表达水平

待测拟南芥种子为1-8的T₃代种子、5-6的T₃代种子、5-8的T₃代种子或野生型拟南芥种子。

1、取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于1/2MS固体培养基上，4℃春化2天。

2、完成步骤1后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)7天，得到待测拟南芥幼苗。

3、完成步骤2后，将所述待测拟南芥幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。

4、完成步骤3后，采用Trizo1法提取待测样本的总RNA，然后利用反转录酶AMV反转录出第一链cDNA，得到待测样本的cDNA。

5、完成步骤4后，以待测样本的cDNA作为模板，实时定量PCR检测GhBRK7基因的相对表达水平。

将野生型拟南芥幼苗中GhBRK7基因的表达水平作为1，获得3个T₃代纯合转GhBRK7基因拟南芥株系(1-8、5-6和5-8)中GhBRK7基因的相对表达水平。结果表明，与野生型拟南芥相比，T₃代纯合转GhBRK7基因拟南芥株系(1-8、5-6和5-8)中GhBRK7基因的相对表达水平均显著提高。

四、转GhBRK7基因拟南芥的耐热性鉴定

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

3、完成步骤2后，取30株所述待测拟南芥幼苗，先42℃黑暗处理2.5h，再22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)7天(目的为恢复)。

4、完成步骤3后，观察拟南芥的表型并统计存活率。

部分存活率统计结果见图1中左图(Col为野生型拟南芥)。结果表明，高温(42℃)处理后，与野生型拟南芥相比，3个T₃代纯合转GhBRK7基因拟南芥株系(1-8、5-6和5-8)的存活率均显著提高。

5、进行步骤3时，将42℃处理前的待测拟南芥幼苗和42℃处理30min的待测拟南芥幼苗放入液氮保存，得到相应的待测样本。

6、完成步骤5后，采用Trizo1法提取待测样本的总RNA，然后利用反转录酶AMV反转录出第一链cDNA，得到待测样本的cDNA。

7、完成步骤6后，以待测样本的cDNA为模板，实时定量PCR检测GhBRK7基因的相对表达水平。

将野生型拟南芥幼苗中GhBRK7基因的表达水平作为1，获得3个T₃代纯合转GhBRK7基因拟南芥株系(1-8、5-6和5-8)中GhBRK7基因的相对表达水平。部分结果见图1中右图(Col为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相比，T₃代纯合转GhBRK7基因拟南芥株系(1-8、5-6和5-8)中GhBRK7基因的相对表达水平均显著提高。

8、以待测样本的cDNA为模板，实时定量PCR检测热激相关基因(HSFA2基因、HSFA7a基因、DREB2A基因、HSP70基因、HSP90基因或HSP101基因)的相对表达水平。HSFA2基因、HSFA7a基因和DREB2A基因均编码不同的热激转录因子，HSP70基因、HSP90基因和HSP101基因均编码不同的热激蛋白。

检测HSFA2基因的引物为5’-GGAAGCAGCGTTGGATGTGA-3’和5’-TAGATCTTGGCTGTCCCAATCCA-3’。

检测HSFA7a基因的引物为5’-TGCATTCTTTCTCCACGATTCTCC-3’和5’-CAAATTCCCATCTCTCTGCTTCT-3’。

检测DREB2A基因的引物为5’-GCGTCTGAGGTTACGAGTAC-3’和5’-CATGAACACAACCAGGAGTCTCA-3’。

检测HSP70基因的引物为5’-CCTACCAACACCGTCTTCGA-3’和5’-CTTCTCACCTGGACCGGAAA-3’。

检测HSP90基因的引物为5’-GGTATTGGCATGACCAAAGCAGAT-3’和5’-ATGCTTACATCAGCTCCAGCTTGA-3’。

检测HSP101基因的引物为5’-CAGAGAGTTATGACCCGGTGTA-3’和5’-ATCGATTTCCTCACGCACAACCA-3’。

将野生型拟南芥幼苗中GhBRK7基因的表达水平作为1，获得3个T₃代纯合转GhBRK7基因拟南芥株系(1-8、5-6和5-8)中热激相关基因的相对表达水平。部分结果见图2(Col为野生型拟南芥)。结果表明，对拟南芥进行高温处理2.5h后，与野生型拟南芥相比，T₃代纯合转GhBRK7基因拟南芥株系中热激相关基因的相对表达水平均显著提高。

上述结果表明，在野生型拟南芥中过表达GhBRK7基因可以提高拟南芥的耐热性；耐热性提高表现为存活率提高和热激相关基因的相对表达水平提高。

五、转GhBRK7基因拟南芥的根发育鉴定

实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：

2、完成步骤1后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)3天，得到待测拟南芥幼苗。

3、完成步骤2后，将生长基本一致的待测拟南芥幼苗转移至1/2MS固体培养基(每个培养皿转移5株幼苗)，竖直培养4天，统计主根长度、侧根数目、侧根长度、根毛密度和根毛长度。

统计主根长度和侧根长度的方法为：竖直培养前，用记号笔标记待测拟南芥幼苗根尖的位置；竖直培养后，再次用记号笔标记待测拟南芥幼苗根尖的位置；测量两个位置之间的距离，即获得相应根的长度。

统计根毛密度和根毛长度的方法为：完成步骤3后，将幼苗置于体视镜载物台上，统计距根尖第二和第三毫米处根上的根毛数量(获得根毛密度)，拍照，之后利用Image J软件测量根毛长度。

统计结果见图3(Col为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥相比，3个T₃代纯合转GhBRK7基因拟南芥株系(1-8、5-6和5-8)的主根长度、侧根长度、侧根数目、根毛密度和根毛长度均显著增加。

上述结果表明，在野生型拟南芥中过表达GhBRK7基因可以促进根发育，促进根发育表现为主根长度、侧根长度、侧根数目、根毛密度和根毛长度的增加。

实施例3、陆地棉TM-1沉默株的获得及鉴定

侵染溶液：含10mM MES、10mM MgCl₂和200mM乙酰丁香酮的水溶液。

一、重组质粒PTVR2-GhBRK7的构建和重组农杆菌的获得

2、以步骤1获得的陆地棉TM-1的cDNA为模板，采用引物F：5’-CGACGACAAGACCCTATCTGGATTTGCCATGGAGA-3’和引物R：5’-GAGGAGAAGAGCCCTAAGATGCAAAGCAACCCTTAAT-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应体系为50μL，由2μL模板(含1μg陆地棉TM-1的cDNA)、1μL Phusion酶、2.5μL引物F水溶液(浓度为10μM)、2.5μL引物R水溶液(浓度为10μM)、10μL5×Phusion Buffer、10μLdNTP mixture(dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度均为10mmol)和22μL ddH₂0组成。

反应条件为：98℃3min；98℃30s，60℃30s，72℃40s，35个循环；72℃10min；20℃5min；4℃保存。

3、完成步骤2后，取所述PCR扩增产物，回收约362bp的DNA片段。将该DNA片段置于含有dATP的T₄DNA合成酶缓冲液中，22℃处理30min，然后70℃放置20min，得到片段甲。

4、将载体PTRV2用限制性内切酶PstⅠ酶切8h，回收酶切产物。将该酶切产物置于含有dTTP的T₄DNA合成酶缓冲液中，22℃处理30min，然后70℃放置20min，得到载体骨架。

5、将片段甲和载体骨架混合，65℃连接2min，得到重组质粒PTVR2-GhBRK7。

将重组质粒PTVR2-GhBRK7进行测序。根据测序结果，重组质粒PTVR2-GhBRK7为向载体PTRV2的限制性内切酶PstⅠ的识别序列间插入SEQ ID NO：1自5'末端起第159至492位所示的DNA分子。

将重组质粒PTVR2-GhBRK7导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/PTVR2-GhBRK7。

将载体PTRV1导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/PTRV1。

二、陆地棉TM-1沉默株的获得

1、取GV3101/PTVR2-GhBRK7的单菌落，接种至4mL含100mg/L利福平(Rif)和50g/L卡那霉素(Kan)的YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养24h，得到培养菌液1。

2、完成步骤1后，取培养菌液1，按体积比为1：100接种至含100mg/L利福平(Rif)和50g/L卡那霉素(Kan)的YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养6h，得到0D_600nm为0.5左右的培养菌液2。

3、完成步骤2后，取培养菌液2，5000rpm离心5min，收集沉淀；之后用50mL侵染溶液重悬沉淀，得到侵染液甲。

4、将步骤1至3中的GV3101/PTVR2-GhBRK7替换为GV3101/PTRV1，其它步骤均不变，得到侵染液乙。

5、将步骤3得到的侵染液甲和步骤4得到的侵染液乙混合(体积比为1:1)，得到侵染工作液；用该侵染工作液侵染生长至10天的陆地棉TM-1幼苗的子叶，得到10株陆地棉TM-1拟沉默株，依次将其命名为T1～T10。

6、完成步骤5两周后，采用Trizo1法分别提取10株陆地棉TM-1拟沉默株和生长至24天的陆地棉TM-1幼苗的总RNA，然后利用反转录酶AMV反转录出第一链cDNA。分别以cDNA为模板，实时定量PCR检测GhBRK7基因的表达水平。

实验结果表明，与陆地棉TM-1幼苗相比，T2、T3、T5和T6中GhBRK7基因的表达水平均显著降低。因此，T2、T3、T5和T6均为陆地棉TM-1沉默株。以T2、T3、T5和T6为研究材料进行后续的实验，在下文统一命名为VIGS-GhBRK7。

按照上述步骤，将GV3101/PTVR2-GhBRK7替换为GV3101/PTRV2(将载体PTRV2导入根癌农杆菌GV3101得到的重组农杆菌)，其它步骤均不变，得到转空载体沉默株。转空载体沉默株和陆地棉TM-1中GhBRK7基因的相对表达水平无显著差异。

三、实时定量PCR检测陆地棉TM-1沉默株中GhBRK7基因及其同源基因的相对表达水平

1、取生长至8周的待测棉花植株(VIGS-GhBRK7、转空载体沉默株或陆地棉TM-1)的叶片，放入液氮保存，得到相应的待测样本。

2、完成步骤1后，采用Trizo1法提取待测样本的总RNA，然后利用反转录酶AMV反转录出第一链cDNA，得到待测样本的cDNA。

3、完成步骤2后，以待测样本的cDNA为模板，实时定量PCR检测目的基因(GhBRK7基因、GhBRK2基因、GhBRK3基因、GhBRK12基因或GhBRK15基因)的相对表达水平。

检测GhBRK2基因的引物为5’-AACCTCAACGACTCCTCCGA-3’和5’-GAGCTTTTTCTCCATGCTCCG-3’。

检测GhBRK3基因的引物为5’-GACGAAACAATCCAGCTTGATG-3’和5’-GCTAGTGATGACAGCACATTGACC-3’。

检测GhBRK12基因的引物为5’-CGGATAACGAAAGTGTTAAGATCAC-3’和5’-TTCTTCACTGAAATTGTTGGTCACA-3’。

检测GhBRK15基因的引物为5’-TTACGCTGTGTGGACCCAA-3’和5’-CTTGTGGGACCGCATGTTT-3’。

将陆地棉TM-1中目的基因的表达水平作为1，获得VIGS-GhBRK7和转空载体沉默株中目的基因的相对表达水平。部分结果见图4中A(CK为陆地棉TM-1)。结果表明，与陆地棉TM-1相比，VIGS-GhBRK7中GhBRK7基因的表达水平显著下降，VIGS-GhBRK7中GhBRK7基因的4个同源基因(分别为GhBRK2基因、GhBRK3基因、GhBRK12基因和GhBRK15基因)的表达水平有的下降、有的增加。转空载体沉默株和陆地棉TM-1中目的基因的表达水平无显著差异。

四、陆地棉TM-1沉默株的表型鉴定和耐热性鉴定

实验重复三次取平均值，每个重复的步骤如下：

1、取生长至8周的20株待测棉花植株(VIGS-GhBRK7、转空载体沉默株或陆地棉TM-1)，42℃(高温)光暗交替培养(14h光照培养/10h暗培养)16天。

2、完成步骤1后，观察表型并统计存活率。

部分待测棉花植株的表型见图4中B(CK为陆地棉TM-1)。部分待测棉花植株的存活率统计结果见图4中C(CK为陆地棉TM-1)。

结果表明，高温(42℃)处理16天后，与陆地棉TM-1相比，VIGS-GhBRK7的株高显著降低、叶片黄化，存活率显著降低。陆地棉TM-1和转空载体沉默株的表型(如株高)和存活率无显著差异。

3、进行步骤1期间，采用DAB染色的方法检测42℃处理前和42℃处理24h时待测棉花植株的叶片中H₂O₂的含量。

部分待测棉花植株的检测结果见图4中D(CK为陆地棉TM-1)。结果表明，42℃处理24h时，与陆地棉TM-1相比，VIGS-GhBRK7的叶片中H₂O₂的含量显著增加；陆地棉TM-1和转空载体沉默株的叶片中H₂O₂的含量无显著差异。

4、进行步骤1期间，采用台盼蓝染色的方法检测42℃处理前和42℃处理48h时待测棉花植株的叶片中细胞的死亡情况。

部分待测棉花植株的检测结果见图4中E(CK为陆地棉TM-1)。结果表明，42℃处理48h时，与陆地棉TM-1相比，VIGS-GhBRK7的叶片中死亡细胞的数量显著增加；陆地棉TM-1和转空载体沉默株的叶片中死亡细胞的数量无显著差异。

5、完成步骤1后，取所述待测棉花植株，25℃光暗交替培养(14h光照培养/10h暗培养)20天(目的为恢复)。

6、完成步骤5后，观察表型并统计存活率。

部分待测棉花植株的存活率统计结果见图4中F(CK为陆地棉TM-1)。

结果表明，25℃恢复培养20天后，与陆地棉TM-1相比，VIGS-GhBRK7的株高显著降低，存活率显著降低。陆地棉TM-1和转空载体沉默株的表型(如株高)和存活率无显著差异。

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 一种植物耐热性和根发育相关蛋白及其编码基因与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1467

<212> DNA

<213> 陆地棉Gossypium hirsutum

<400> 1

atggggtgtg ggtgttcaaa cctatctgca tgttgttgga gtttggatca gaatggatca 60

attcctgaag ctgataatgt tgaaaatgaa gacaagggtg aagttgatga tttgcctgca 120

ttccgtgaat actcaattga aacactccag atggctacat ctggatttgc catggagaat 180

atagtttcag aacatggtga gaaggctcct aatgtagttt acaagggcaa gttggaaaat 240

caaaggcgta ttgctgttaa acgttttaat aggtctgcat ggccagatgc ccgacaattc 300

ttggaagaag caaaagctgt tggtcagctc cgaaatcaca ggttggcaaa cttacttggt 360

tgttgctgtg aaggtgatga gaggttactt gtcgcagaat ttatgactaa tgatacactg 420

gcaaaacact tattccattg ggaagcacaa ccaatgaaat gggcaatgcg attaagggtt 480

gctttgcatc ttgcagaagc tctagagtac tgcaccagca aaggacgtgc cctatatcat 540

gacctaaatg catatagaat tgttttcgat gatgagggca accctagact ttcatgcttt 600

ggactaatga agaacagtag agatggaaaa agttacagca caaacttggc atttactcct 660

ccagagtatt tgaggacagg aagagtaaca ccagaaagtg taatttatag ttttggcacc 720

cttctacttg atcttctcag tggaaaacat attcctccaa gtcacgctct ggaccttata 780

cgtgacagga acattcagat gctgacagat tcttgtttgg aagggcaatt ttcaaatgat 840

gatggcactg agttagtgcg tctagcatca cgatgtttac aatatgagcc ccgtgagcgt 900

ccaaatccaa agtcattggt tactgcatta attcctcttc agagggacac tgaggttcct 960

tctcatgaat taatgggcat acttcatgga actgatgctg ttcctttgtc accacttggg 1020

gaagcctgct taagaatgga tttgactgcc attcatgatg tcctagaaaa gcttggatat 1080

aaagatgatg agggtgctgc tactgagctt tccttccaga tgtggacaaa ccagatgcag 1140

gaaacactga catcaaagaa aaagggtgat gttgctttta ggcataagga ttttagagct 1200

gctcttgaat gctataccca gttcattgat gttggaaccg tggtttcccc aacggtttat 1260

gctcggcgta gtttgtctta cctcatgagc aacatgcctc aagaagccct caatgatgca 1320

gtgcaagcac aagtaatatc tcctatttgg catattgcat cctacttgca agcgtctgct 1380

ctacttgctc taggaaagga ggatgaggca caagctgctc ttagggaggc tactgagctc 1440

gaaaataaaa agaatgcaac ttcttga 1467

<210> 2

<211> 488

<212> PRT

<213> 陆地棉Gossypium hirsutum

<400> 2

Met Gly Cys Gly Cys Ser Asn Leu Ser Ala Cys Cys Trp Ser Leu Asp

1 5 10 15

Gln Asn Gly Ser Ile Pro Glu Ala Asp Asn Val Glu Asn Glu Asp Lys

20 25 30

Gly Glu Val Asp Asp Leu Pro Ala Phe Arg Glu Tyr Ser Ile Glu Thr

35 40 45

Leu Gln Met Ala Thr Ser Gly Phe Ala Met Glu Asn Ile Val Ser Glu

50 55 60

His Gly Glu Lys Ala Pro Asn Val Val Tyr Lys Gly Lys Leu Glu Asn

65 70 75 80

Gln Arg Arg Ile Ala Val Lys Arg Phe Asn Arg Ser Ala Trp Pro Asp

85 90 95

Ala Arg Gln Phe Leu Glu Glu Ala Lys Ala Val Gly Gln Leu Arg Asn

100 105 110

His Arg Leu Ala Asn Leu Leu Gly Cys Cys Cys Glu Gly Asp Glu Arg

115 120 125

Leu Leu Val Ala Glu Phe Met Thr Asn Asp Thr Leu Ala Lys His Leu

130 135 140

Phe His Trp Glu Ala Gln Pro Met Lys Trp Ala Met Arg Leu Arg Val

145 150 155 160

Ala Leu His Leu Ala Glu Ala Leu Glu Tyr Cys Thr Ser Lys Gly Arg

165 170 175

Ala Leu Tyr His Asp Leu Asn Ala Tyr Arg Ile Val Phe Asp Asp Glu

180 185 190

Gly Asn Pro Arg Leu Ser Cys Phe Gly Leu Met Lys Asn Ser Arg Asp

195 200 205

Gly Lys Ser Tyr Ser Thr Asn Leu Ala Phe Thr Pro Pro Glu Tyr Leu

210 215 220

Arg Thr Gly Arg Val Thr Pro Glu Ser Val Ile Tyr Ser Phe Gly Thr

225 230 235 240

Leu Leu Leu Asp Leu Leu Ser Gly Lys His Ile Pro Pro Ser His Ala

245 250 255

Leu Asp Leu Ile Arg Asp Arg Asn Ile Gln Met Leu Thr Asp Ser Cys

260 265 270

Leu Glu Gly Gln Phe Ser Asn Asp Asp Gly Thr Glu Leu Val Arg Leu

275 280 285

Ala Ser Arg Cys Leu Gln Tyr Glu Pro Arg Glu Arg Pro Asn Pro Lys

290 295 300

Ser Leu Val Thr Ala Leu Ile Pro Leu Gln Arg Asp Thr Glu Val Pro

305 310 315 320

Ser His Glu Leu Met Gly Ile Leu His Gly Thr Asp Ala Val Pro Leu

325 330 335

Ser Pro Leu Gly Glu Ala Cys Leu Arg Met Asp Leu Thr Ala Ile His

340 345 350

Asp Val Leu Glu Lys Leu Gly Tyr Lys Asp Asp Glu Gly Ala Ala Thr

355 360 365

Glu Leu Ser Phe Gln Met Trp Thr Asn Gln Met Gln Glu Thr Leu Thr

370 375 380

Ser Lys Lys Lys Gly Asp Val Ala Phe Arg His Lys Asp Phe Arg Ala

385 390 395 400

Ala Leu Glu Cys Tyr Thr Gln Phe Ile Asp Val Gly Thr Val Val Ser

405 410 415

Pro Thr Val Tyr Ala Arg Arg Ser Leu Ser Tyr Leu Met Ser Asn Met

420 425 430

Pro Gln Glu Ala Leu Asn Asp Ala Val Gln Ala Gln Val Ile Ser Pro

435 440 445

Ile Trp His Ile Ala Ser Tyr Leu Gln Ala Ser Ala Leu Leu Ala Leu

450 455 460

Gly Lys Glu Asp Glu Ala Gln Ala Ala Leu Arg Glu Ala Thr Glu Leu

465 470 475 480

Glu Asn Lys Lys Asn Ala Thr Ser

485

Claims

1.蛋白质GhBRK7的应用，为D1)或D2)：

D1)调控植物耐热性和/或根发育；

D2)培育耐热性和/或根发育改变的转基因植物；

所述蛋白质GhBRK7为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

2.编码权利要求1中所述蛋白质GhBRK7的核酸分子的应用，为D1)或D2)：

D1)调控植物耐热性和/或根发育；

D2)培育耐热性和/或根发育改变的转基因植物。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述调控植物耐热性为提高植物耐热性或降低植物耐热性；

所述调控植物根发育为促进植物根发育或抑制植物根发育；

所述培育耐热性改变的转基因植物为培育耐热性提高的转基因植物或培育耐热性降低的转基因植物；

所述培育根发育改变的转基因植物为培育根发育增强的转基因植物或培育根发育降低的转基因植物。

4.一种培育转基因植物甲的方法，包括如下步骤：提高出发植物中权利要求1中所述蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性，得到转基因植物甲；与出发植物相比，转基因植物甲的耐热性提高和/或根发育增强。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述“提高出发植物中所述蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性”通过向出发植物中导入编码所述蛋白质GhBRK7的核酸分子实现。

6.一种培育转基因植物乙的方法，包括如下步骤：抑制出发植物中权利要求1中所述蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性，得到转基因植物乙；与出发植物相比，转基因植物乙的耐热性降低和/或根发育降低。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述“抑制出发植物中所述蛋白质GhBRK7的表达量和/或活性”通过向出发植物中导入抑制所述蛋白质GhBRK7表达的物质实现。

8.植物育种方法甲或植物育种方法乙；

所述植物育种方法甲包括如下步骤：增加植物中权利要求1中所述蛋白质GhBRK7的含量和/或活性，从而提高耐热性和/或增强根发育；

所述植物育种方法乙包括如下步骤：降低植物中权利要求1中所述蛋白质GhBRK7的含量和/或活性，从而降低耐热性和/或降低根发育。

9.如权利要求3所述的应用或权利要求4至8任一所述的方法，其特征在于：

所述促进植物根发育或增强根发育表现为主根长度、侧根长度、侧根数目、根毛密度和根毛长度中的至少一种的增加；

所述耐热性降低表现为株高降低、H₂O₂的含量增加和死亡细胞数量增加中的至少一种。

10.如权利要求1、2、3或9所述的应用、或、权利要求4至9任一所述的方法，其特征在于：所述植物为如下c1)至c7)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)棉花；c4)棉花品种陆地棉TM-1；c5)十字花科植物；c6)拟南芥；c7)野生型拟南芥Columbia-0亚型。