CN111304369A

CN111304369A - 新型冠状病毒双重检测试剂盒

Info

Publication number: CN111304369A
Application number: CN202010278540.1A
Authority: CN
Inventors: 蒋析文; 范建; 彭海龙; 彭荣俞
Original assignee: Daan Gene Co Ltd of Sun Yat Sen University
Current assignee: Daan Gene Co Ltd of Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-02-06
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2040-04-10
Also published as: EP3882364A1; US11649511B2; CN111304369B; CN115279925B; US20210404023A1; CN115279925A; EP3882364B1; EP3882364A4; WO2021155638A1

Abstract

本发明提供了新型冠状病毒双重检测试剂盒，具体的地，本发明公开了一种多重检测新型冠状病毒2019‑nCoV核酸的试剂盒及方法，能够同时检测新型冠状病毒2019‑nCoV的2个核酸靶标，具有极高的灵敏度和特异性，并且显著提高了病毒鉴定的准确性。

Description

新型冠状病毒双重检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术和分子诊断领域，具体地说，本发明涉及用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合及试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒（2019 novel corona virus, 2019-n CoV，SARS-CoV-2）属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆型或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。S蛋白是病毒的主要蛋白之一，其编码基因用于病毒分型通过S-蛋白与人的 ACE2相互作用的分子机制来感染人的呼吸道上皮细胞，人感染了该冠状病毒后常见体征为发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。感染严重者可导致肺炎、严重畸形呼吸综合征、肾衰竭，更有甚者可导致死亡。这种新型冠状病毒对人类具有有很强的感染力，所引起的肺部感染被命名为“新型冠状病毒肺炎”(COVID-19)。

目前，感染新型冠状病毒主要的确诊方法为CT肺部影像学，但是，对爆发的疫情来说却在以下缺陷：

一、CT很容易造成交叉感染，除非采用完全封闭的单独器具，而且要时刻进行消毒，这对大部分的疫区来说，装备跟人力都跟不上消耗；

二、CT阳性也存在误诊可能，若是普通流感的患者，CT影像也有磨玻璃影；

三、CT仪器昂贵，偏僻不发达的疫区无法配套相关仪器。

而荧光PCR法在检测上可以弥补这些不足。实时荧光PCR技术是在核酸反应管中加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光PCR技术是一种灵敏度、特异性和精密度更高的核酸检测技术，其检测结果准确，重复性高，能反应病原体变化，同时避免了传统PCR需后处理的问题，降低了污染的可能性。

基于此，开发一套灵敏度高、特异性强、重复性好的产品用于新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测显得非常必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒双重检测试剂盒，以便能够高效率、高特异性、低成本的对新型冠状病毒2019-nCoV感染患者进行检测。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的引物对集，所述引物对集包括：

第一引物对组，所述第一引物对组包括：

如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对集还包括：

第二引物对组，所述第二引物对组包括：

如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对集还包括：

内标引物对组，所述内标引物对组包括：

如SEQ ID NO.7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.8所示的反向引物。

本发明的第二方面，提供了一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的探针组，所述探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的第二探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的内控探针。

在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团。

在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。

本发明的第三方面，提供了一种用于多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO.1-6所示的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中还包含SEQ ID NO.7-9所示的多核苷酸序列。

在另一优选例中，使用 PCR用缓冲液（Buffer）配制所述引物探针混合液。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含PCR酶系，所述PCR酶系包括热启动酶、和逆转录酶C-MMLV；优选地还包括RNA酶抑制剂。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性质控品。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性质控品。

本发明的第四方面，提供了一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的方法，所述方法包括步骤：

（1）提供待检测对象的核酸样本；

（2）制备PCR反应体系并进行PCR检测：

其中，所述PCR反应体系包括：步骤（1）提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针组。

在另一优选例中，所述核酸样本可来自咽拭子样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、痰液样本、或环境样本。

在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。

在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。

在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括PCR酶系。

本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1：ORF1ab基因检测限；

图2：N基因检测限；

图3：内标测试结果；

图4：ORF1ab基因和N基因特异性测试结果；

图5：ORF1ab基因和N基因特异性检测内标测试结果；

图6：ORF1ab基因精密度检测结果；

图7：N基因精密度检测结果；

图8：ORF1ab基因准确性检测结果；

图9：N基因准确性检测结果；

图10：ORF1ab基因干扰性检测结果；

图11：N基因干扰性检测结果；

图12：临床样本检测结果；

图13：ORF1ab基因对照引物对检测结果；

图14：ORF1ab基因对照引物对检测结果。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的试剂盒及方法，能够同时检测新型冠状病毒2019-nCoV的2个核酸靶标，可通过不同靶标之间相互验证，防止出现假阳性，对可能因突变而引起的漏检进行确认，显著提高了病毒鉴定的准确性。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101 和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

多重PCR

多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

影响多重PCR反应的因素有很多，比如：

（1）反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。

（2）引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。

（3）最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。

（4）引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。

虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。

按照新型冠状病毒的诊疗指南，新型冠状病毒核酸检测是确诊的金标准。本发明开发了一种同时检测新型冠状病毒的ORF1ab基因和N基因的检测试剂盒，本试剂盒同时包括内源性内标检测系统，用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程的监控，可减少假阴性结果的出现。本试剂盒为双重荧光检测试剂盒，具有敏度高、特异性强、重复性好等特点。

本发明提供一种特异性检测样品中ORF1ab基因和N基因组合和包含该组合的试剂盒，其中用于检测ORF1ab基因的引物序列为：

SEQ ID NO.1：TCAAAGTAGCCACTGTACAGTC和SEQ ID NO.2: TTAGCTAAGAGAATGTCAT，

对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.3: AGTGCACATCAGTAGTCTTACTCTCAG；

用于检测N基因的引物序列为：

SEQ ID NO.4：TCTTACAACCAGAACTCA和SEQ ID NO.5:AGGTAAGAACAAGTCCTGAG，

对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.6： TAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTAC。

本发明各病原体的探针标记不限于列出的同一波长的单个标记，包括不同标记的不同组合形式的多重检测试剂。

在一个实施例中，所述试剂盒还包括内标质控及扩增引物和检测探针；内标质控扩增引物序列分别为：

SEQ ID NO.7: AGTATTGGAGCACCGTGCG和SEQ ID NO.8: GTGGCGGACTCGCCAGTTCT，

对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.9： ATCGTACCTAGGACTCTAGCGCG。

内标既可监测样本采集，也可监测样本提取过程，防止样本核酸提取失败导致假阴性。

在本发明的一个优选地实施方式中，内标片段的核酸序列如下：

AGTATTGGAGCACCGTGCGGTCAACGTAAGGGAGCAGAGGCGGCAGTCAAATAACTTCCTCAAGGAACAACACGTACCTAGGACTCTAGCGCGGACTAGAACTGGCGAGTCCGCCAC（SEQ ID NO.:14）

在其中一个实施例中，所述试剂盒包括含ORF1ab基因片段和/或N基因片段的阳性对照，以及阴性对照（灭菌生理盐水）。

在本发明的一个优选地实施方式中，阳性对照中ORF1ab基因片段的核酸序列如下：

TCAAAGTAGCCACTGTACAGTCTAAAATGTCAGATGTAAAGTGCACATCAGTAGTCTTACTCTCAGTTTTGCAACAACTCAGAGTAGAATCATCATCTAAATTGTGGGCTCAATGTGTCCAGTTACACAATGACATTCTCTTAGCTAA（SEQ ID NO.:15）。

在本发明的一个优选地实施方式中，阳性对照中N基因片段的核酸序列如下：

TCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCGGACTCGCCAGTCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTCTAGGACTCTATTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCT（SEQID NO.:16）。

在其中一个实施例中，所述试剂盒包括含有ORF1ab基因和N基因和内标基因引物、探针，dNTPs（dATP:dCTP:dGTP:dTTP=1:1:1:1）及PCR缓冲液的PCR反应液和含有热启动Hot.Taq酶和C-MMLV酶的PCR酶系，其中引物和探针的浓度为0.1-1μM，dNTPs浓度为0.2-0.4mM，MgCl₂浓度为2-5mM,C-MMLV酶为1-3U，热启动Hot.taq为2.5-10U。

本发明还提供了一种ORF1ab基因和N基因双重检试剂盒的使用方法，包括如下步骤：提取待测样本(提取试剂采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（粤穗械备20170583号），得到核酸样本（阳性质控和阴性质控同步参与提取）；取5μL加入到上述PCR反应液（17μL）和酶系混合物(3μL)中，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择VIC、FAM、和Cy5,PCR扩增程序如下；

50℃，15min，95℃，15min；1个循环

94℃，15sec，55℃，45sec（搜集荧光）；45个循环。

PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体DNA的阴、阳性，检测结果可用于新型冠状病毒感染的辅助诊断以及药物疗效的观察，为研究提供可靠的依据。

本发明中新型冠状病毒2019-nCoV的基因序列参见GISAID：BetaCov/Wuhan/WH01/2019| EPI_ISL_406798；关于其N、ORF1ab和E基因的寡核苷酸序列信息可参考文献（Roujian Lu, Xiang Zhao, Juan Li,et.al, Genomic characterisation andepidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins andreceptor binding. Lancet. 2020 Jan 30）。

本试剂盒组成详见表1和表2，可同时检测新型冠状病毒2019-nCoV的2个靶标基因，可通过不同靶标之间相互验证，防止出现假阳性，对可能因突变而引起的漏检进行确认，显著提高了病毒鉴定的准确性。

表1 试剂盒组成

组成	主要组分
		PCR反应液	特异性引物和荧光探针（SEQ ID NO.:1-9）、dNTPs、PCR缓冲液
PCR酶系	热启动Hot.Taq酶、逆转录酶C-MMLV
		阳性质控品	含ORF1ab基因片段假病毒、含N基因片段的假病毒、含内标片段的假病毒
阴性质控品	含内标片段的假病毒

试剂盒所需引物、探针序列如表2：

表2 引物、探针及序列号

引物探针名称	引物/探针序列	SEQ ID NO.
			ORF1ab-F1	TCAAAGTAGCCACTGTACAGTC	1
ORF1ab-R1	TTAGCTAAGAGAATGTCAT	2
			ORF1ab-P	5’VIC-AGTGCACATCAGTAGTCTTACTCTCAG BHQ1-3’	3
N-F1	TCTTACAACCAGAACTCA	4
			N-R1	AGGTAAGAACAAGTCCTGAG	5
N-P	5’FAM-TAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTAC BHQ1-3’	6
			内标-F1	AGTATTGGAGCACCGTGCG	7
内标-R1	GTGGCGGACTCGCCAGTTCT	8
			内标-P	5’Cy5- ATCGTACCTAGGACTCTAGCGCG- BHQ2-3’	9

优选地，所述荧光基团选自下组：FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5。

优选地，所述淬灭基因选自下组：MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3。

本发明的引物设计中，对特异性引物及探针经大量试验筛选，并对其进行组合、优化、验证，最终优选出组合后不会互相干扰、扩增效率高、特异性好的多重检测最优引探组合。

本发明所述试剂盒用于判定检测有效标准为：

每次检测均同时检测阴性质控品、阳性质控品，当检测结果的阳性质控品为阳性，且阴性质控品为阴性时，表明实验结果有效。

本发明所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

（1）提取检测样本中的总核酸，获得核酸样本。

（2）将所述核酸样本与PCR反应液、PCR酶系混合，制得PCR反应体系。

（3）实时荧光PCR反应，程序如下：

第一阶段：50 ℃ 2-15 min，95 ℃ 10-15 min，1个循环；

第二阶段：94 ℃ 10-15 s，55-60 ℃ 45 s，45个循环。

PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体核酸的阴、阳性给出检测结果。

本发明的有益效果在于：

目前的检测试剂多为单靶标检测试剂，针对新型冠状病毒2019-nCoV的2个靶标同时进行检测，可通过不同靶标之间相互验证，防止出现假阳性，显著提高了病毒鉴定的准确度和特异性。同时体系中含有内源性内标质控体系，可全程监控取样、样本保存、核酸提取以及PCR扩增整个过程，防止假阴性的出现。

本发明适用于对新型冠状病毒2019-nCoV核酸的检测，为病毒鉴定和防控提供可靠的依据，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在疫情防控过程中，使用本发明的检测方法对环境中的病毒核酸进行检测，这些病毒核酸信息可以作为公众健康管理之需。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook. J等著《分子克隆实验室指南》（黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1 ORF1ab基因和N基因双重检试剂盒检测限测试

将以已定值的ORF1ab基因和N基因假病毒做为初始样本分别稀释至浓度为10⁵copies/ml，依次稀释至10⁴、10³ 、500、250、100 copies/ml，各浓度样本中分别加入终浓度为10⁴copies/ml的含内标扩增片段的质粒菌作为待检样本，测试双重检测试剂的灵敏度。

检测结果参考图1-3：

图1：ORF1ab基因检测限；

图2：N基因检测限；

图3：内标测试结果。

检测结果表明，对不同浓度的ORF1ab基因和N基因的阳性质控品进行检测，可检测出的最低浓度为 250 copies/ml。

实施例2 ORF1ab基因和N基因双重检试剂盒特异性测试

以生理盐水、SARS病毒、鼻病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、冠状病毒OC43、呼吸道合胞病毒、人类冠状病毒NL63 型、人类冠状病毒HKU1型作为特异性参考品，测试ORF1ab基因和N基因双重检试剂盒的特异性。

检测结果参考图4-5：

图4：ORF1ab基因和N基因特异性测试结果；

图5：ORF1ab基因和N基因特异性检测内标测试结果。

检测结果表明，检测特异性参考品（生理盐水、SARS病毒、鼻病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、冠状病毒OC43、呼吸道合胞病毒、人类冠状病毒NL63型、人类冠状病毒HKU1型），检测结果均为阴性，内标质控均为阳性。

实施例3 ORF1ab基因和N基因双重检试剂盒精密度测试

分别将ORF1ab基因和N基因假病毒稀释至10⁵和10³copies/ml作为精密度参考品，各重复10次，计算各浓度精密度参考品的变异系数。

检测结果参考图6-7：

图6：ORF1ab基因精密度检测结果

图7：N基因精密度检测结果

经测试ORF1ab基因假病毒高浓度和低浓度精密度参考品的变异系数分别为0.55%和0.65%；N基因高浓度和低浓度精密度参考品的变异系数分别为0.44%和0.96%；两种基因假病毒不同浓度的精密度参考品的变异系数均小于5%。

实施例4 ORF1ab基因和N基因双重检试剂盒准确性测试

分别制备5份不同浓度的ORF1ab基因和N基因假病毒作为阳性参考品，经提取后以ORF1ab基因和N基双重检试剂盒测试验证试剂盒的准确性。

检测结果参考图8-9：

图8：ORF1ab基因准确性检测结果；

图9：N基因准确性检测结果。

结果表明各病原体对应阳性参考品结果均为阳性，且与其它病原体无交叉反应。

实施例5 ORF1ab基因和N基因双重检试剂盒干扰物质测试

分别向10³copies/ml的ORF1ab基因和N基因假病毒中加入5%含量的全血，5%的粘液、大观霉素（100mg/L）、青霉素（0.5mg/ml）、四环素（5mg/L）、氧氟沙星（3.06mg/L）、阿奇霉素（0.45mg/L）作为干扰物质测试样本，以不含干扰物质的样本作为对照，测试干扰物质对引物探针扩增的影响。

检测结果参考图10-11：

图10：ORF1ab基因干扰性检测结果

图11：N基因干扰性检测结果

结果表明，在待测样本中加入5%全血、5%的粘液、大观霉素（100mg/L）、青霉素（0.5mg/ml）、四环素（5mg/L）、氧氟沙星（3.06mg/L）、阿奇霉素（0.45mg/L）的样本对检测结果无明显干扰，不影响结果判读。

实施例6 临床样本检测

检测样本核酸的提取：

（1）临床待测样本核酸模板提取

采集22例疑似咽拭子临床样本，提取待测样本(提取试剂采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（粤穗械备20170583号），得到核酸样本（阳性质控和阴性质控同步参与提取）；取5μL加入到上述PCR反应液（17μL）和酶系混合物(3μL)中，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择VIC、FAM、和Cy5,PCR扩增程序如下；

50℃，15min，95℃，15min；1个循环

94℃，15sec，55℃，45sec（搜集荧光）；45个循环。

PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体DNA的阴、阳性。

在所检测的22例疑似临床样本中，共检出17例新型冠状病毒2019-nCoV核酸阳性临床样本。典型检测结果如图12所示。

测序验证结果表明本发明检测体系检测准确率达到了100%，进一步证明了本发明体系检测的临床检测准确性。

对比例1

本发明人在研究过程中，针对新型冠状病毒2019-nCoV目标核酸序列筛选了数十组PCR引物和探针，经过大量测试，最终获得了灵敏度和特异性能够满足临床检测需求，且能够进行多重检测的引物、探针组合。

针对新型冠状病毒2019-nCoV的N、ORF1ab基因检测靶标，本发明人经过了大量的筛选、组合。例如针对ORF1ab基因，设计的部分典型引物序列如下：

ORF1ab基因对照上游引物ORF1ab-F2：CTAAAATGTCAGATGTAAAG（SEQ ID NO.10）

ORF1ab基因对照下游引物ORF1ab-R2：TGTAACTGGACACATTGAGC（SEQ ID NO.11）

ORF1ab基因对照上游引物ORF1ab-F3：TTGTATCAAAGTAGCCAC（SEQ ID NO.12）

ORF1ab基因对照下游引物ORF1ab-R3：ATTGAGCCCACAATTTAG（SEQ ID NO.13）

具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上实施例，进行PCR检测测试。

使用ORF1ab-F2和ORF1ab-R2的检测结果如图13所示，检测结果表明该引物对特异性较差。使用ORF1ab-F3和ORF1ab-R3的检测结果表明该引物对在单一检测体系中对ORF1ab基因靶核酸的特异性和灵敏度较佳，但是在多重检测体系中ORF1ab基因靶低浓度核酸扩增收到明显抑制，单重和多重体系检测结果如图14所示。表明对照引物对ORF1ab-F3和ORF1ab-R3无法应用于多重检测体系中。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中山大学达安基因股份有限公司

<120> 新型冠状病毒双重检测试剂盒

<130> 000057

<150> CN202010078064.9

<151> 2020-02-06

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

tcaaagtagc cactgtacag tc 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

ttagctaaga gaatgtcat 19

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

agtgcacatc agtagtctta ctctcag 27

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

tcttacaacc agaactca 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

aggtaagaac aagtcctgag 20

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

taattctttc acacgtggtg tttattac 28

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

agtattggag caccgtgcg 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

gtggcggact cgccagttct 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

atcgtaccta ggactctagc gcg 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

ctaaaatgtc agatgtaaag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

tgtaactgga cacattgagc 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

ttgtatcaaa gtagccac 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 13

attgagccca caatttag 18

<210> 14

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 14

agtattggag caccgtgcgg tcaacgtaag ggagcagagg cggcagtcaa ataacttcct 60

caaggaacaa cacgtaccta ggactctagc gcggactaga actggcgagt ccgccac 117

<210> 15

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 15

tcaaagtagc cactgtacag tctaaaatgt cagatgtaaa gtgcacatca gtagtcttac 60

tctcagtttt gcaacaactc agagtagaat catcatctaa attgtgggct caatgtgtcc 120

agttacacaa tgacattctc ttagctaa 148

<210> 16

<211> 144

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 16

tcttacaacc agaactcaat taccccggac tcgccagtct gcatacacta attctttcac 60

acgtggtgtt tattaccctg acaaagttct aggactctat tcagatcctc agttttacat 120

tcaactcagg acttgttctt acct 144

Claims

1.一种用于检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：

第一引物对组，所述第一引物对组包括：

2.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：

第二引物对组，所述第二引物对组包括：

3.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：

内标引物对组，所述内标引物对组包括：

4.一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的探针组，其特征在于，所述探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针；

核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的第二探针；和

核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的内控探针。

5.一种用于多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对集；和

权利要求4所述的探针组。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO.1-9所示的多核苷酸序列。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含PCR酶系，所述PCR酶系包括热启动酶、和逆转录酶C-MMLV。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性质控品；和/或

所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性质控品。

9.一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

（1）提供待检测对象的核酸样本；

（2）制备PCR反应体系并进行PCR检测：

其中，所述PCR反应体系包括：步骤（1）提供的所述核酸样本、权利要求1所述的引物对集、和权利要求4所述的探针组。

10.权利要求1所述的引物对集、和/或权利要求4所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸。