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CN111304342A - 一种鉴别布鲁氏菌猪种s2疫苗株与其他种属野毒株的pcr试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种鉴别布鲁氏菌猪种s2疫苗株与其他种属野毒株的pcr试剂盒及其使用方法 Download PDF

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CN111304342A
CN111304342A CN201911340838.4A CN201911340838A CN111304342A CN 111304342 A CN111304342 A CN 111304342A CN 201911340838 A CN201911340838 A CN 201911340838A CN 111304342 A CN111304342 A CN 111304342A
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杨晓雯
田国忠
姜海
赵鸿雁
朴东日
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National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
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National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
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Abstract

一种鉴别布鲁氏菌猪种S2疫苗株与其他种属野毒株的PCR试剂盒及其使用方法，属于检测领域。该试剂盒包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、灭菌双蒸水、野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品组成，其中包括用于鉴定猪种1型菌株的特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2，以及S2疫苗株和野毒株的特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4。该PCR试剂盒实用性强，成本低，耗时短，可重复性好，通过普通PCR扩增后，利用电泳检测扩增条带的大小，能够快速、有效、直观的鉴别样品中布鲁氏菌猪种S2疫苗株和其他种属野毒株，用于解决布鲁氏菌和防控过程中疫苗株和野毒株鉴别诊断的难题。

Description

一种鉴别布鲁氏菌猪种S2疫苗株与其他种属野毒株的PCR试 剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴别布鲁氏菌猪种S2疫苗株与其他种属野毒株的PCR试剂盒及其使用方法
背景技术
布鲁氏菌(Brucella)是一种兼性胞内寄生菌，通过直接接触或摄入感染动物的乳制品感染，且易造成宿主持续性感染，引起全球性人畜共患流行性疾病—布鲁氏菌病。该病主要表现为发热、多汗、乏力、关节疼痛等症状，严重者使患者丧失劳动能力，影响公共卫生安全以及经济发展[1]。基于生化鉴定和宿主偏好性，国际上将布鲁氏菌分为12个种[2-6]。常见感染人的布鲁氏菌主要是羊种(B.melitensis)、牛种(B.abortus)、猪种(B.suis)和犬种(B. canis)。人感染布鲁氏菌若诊疗不及时，容易引起各种并发症，如脊柱炎、心内膜炎、脑炎等[7]。全球人间布鲁氏菌病发病率年平均超过50万例，一些流行国家每百万人口的布鲁氏菌发病率超过100[8]，中东地区每百万人口的布鲁氏菌病发病率均在200以上，叙利亚发病率最高(1603.4)，但据世界卫生组织(WHO)调查表明，实际发病率是报告的10-25倍[9]。我国布鲁氏菌病首次报道于内蒙古[10]，人间布鲁氏菌病疫情于1957-1963年和1969-1971年出现两次流行高峰。随着动物布鲁氏菌病疫苗的使用，上世纪80-90年代人畜布鲁氏菌病发病率显著下降[11]，但自20世纪90年代中期开始，布鲁氏菌病疫情在国内再次肆虐，并从北方扩展到南方[12]，全国32省市自治区均有病例报道[13]。2018年我国人间布鲁氏菌病发病数为39296例，较2017年略有下降(40042例)。现有的研究表明，我国布鲁氏菌病主要分布于内蒙古、新疆等畜牧业发达的省市及自治区，农牧民、兽医、屠宰工等感染和发病率较高。
由于工作的性质，很多兽医、农牧民涉及的是疫苗株布鲁氏菌感染。在中国，广泛使用的布鲁氏菌疫苗株是牛种A19和猪种S2疫苗株。猪种S2疫苗株是中国兽医药品监察所于 1952年从流产猪胎儿体内分离，经过生化鉴定为猪种1型菌株[14]。该疫苗株对牛、羊、猪均能产生良好的免疫，目前布鲁氏菌一类流行地区北方各省份常用S2疫苗株预防布鲁氏菌病。在预防动物布鲁氏菌病过程中，由于S2疫苗株免疫方式为口服，因此，兽医和养殖者存在较高的布鲁氏菌暴露风险，在实际工作中，面临布鲁氏菌野毒株和疫苗株感染鉴别诊断困难。目前国内通常采用竞争ELISA(cELISA)和英光偏振试验(FPT)鉴别S2疫苗株和野毒株感染，但是，对于血清学背景未知的样本而言，单次检测无法确定是否为疫苗株S2 感染；鉴定布鲁氏菌种属的分子生物学方法(AMOS-PCR方法)可以通过片段大小不同分别鉴定到羊种1-3亚型、牛种1、2、4型和猪种1型菌株[15]，无法区分S2疫苗株和野毒株；现有的S2疫苗株和野毒株鉴别诊断的方法需要经过测序，耗时长，成本高。本方法根据S2 疫苗株全基因组序列，比较其基因组与野毒株基因组上的差异序列，结合传统的布鲁氏菌种属分子生物学分型方法，通过多次检测筛选出确实可行的差异序列，用于疫苗株S2和其他种属野毒株的鉴别诊断。本发明涉及仪器常见，成本较低，无需经过测序，目测即可确定是否为疫苗株S2感染，方法可应用于鉴别，切实为我国布鲁氏菌猪种S2疫苗株的鉴别诊断提供技术保障。
参考文献
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发明内容
发明人通过S2疫苗株与其亲本野毒株B.suis 1330全基因组序列比对发现，S2疫苗株在基因BS1330_I1369中存在69bp序列插入 (CGCGCGTCGATTATGATGCCAATTGCCGGAGGGAAGTGCGGGAGGAAACGGGTATC GACCTTGCCGATG)，根据此段插入序列，本发明设计特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4，结合传统分子生物学鉴定布鲁氏菌种属方法可以通过片段大小不同分别鉴定到羊种 1-3亚型、牛种1、2、4型和猪种1型菌株，筛选特异性引物对seq IDNo.1和seq ID No.2，根据两对特异性引物对扩增片段大小，分别鉴别布鲁氏菌猪种S2疫苗株和其他种属野毒株感染。以上是提出本发明的技术依据。
本发明的目的是提供一种能够快速、有效、直观的鉴别样品中布鲁氏菌猪种S2疫苗株和其他种属野毒株，用于解决布鲁氏菌病和防控过程中疫苗株和野毒株鉴别诊断的难题的试剂盒及其使用方法，该试剂盒能够快速、直观的鉴别样品中布鲁氏菌猪种S2疫苗株和其他种属野毒株。本发明涉及仪器常见，成本较低，无需经过测序，目测即可确定是否为疫苗株 S2感染，方法可应用于鉴别。
为实现本发明的目的，采用如下技术方案：
该PCR试剂盒由PCR缓冲液、DNA聚合酶、灭菌双蒸水、野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品组成；所述PCR缓冲液包括鉴定猪种1型菌株的特异性引物对seq ID No.1和seqID No.2，以及S2疫苗株和野毒株的特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4，其核苷酸的碱基序列分别为：
seq ID No.1：5’-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3’
seq ID No.2：5’-GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3’
seq ID No.3：5’-GACCCGTCGCCGATAAGG-3’
seq ID No.4：5’-ACGGCGTTGCCTCATTCA -3’
所述野毒株质控标准品由猪种1型标准菌株Brucella suis 1330调整比浊度为0.5McF (1.5×108菌数/mL)经80℃热灭活60min组成，疫苗株质控标准品由猪种S2疫苗株调整比浊度为0.5McF(1.5×108菌数/mL)经80℃热灭活60min组成；
DNA聚合酶为常规的DNA聚合酶均可。
所述的灭菌双蒸水为试剂盒内阴性质控标准品。
一种采用上述试剂盒鉴别布鲁氏菌猪种S2疫苗株与其他种属野毒株的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的基因组DNA，经核酸浓度检测仪检测浓度高于1ng/μL。所述待测样品包括但不限于血液、血清、奶样、组织样本、气溶胶样本。
(2)以提取的样本基因组DNA为模板，将模板、DNA聚合酶分别加入到含特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2以及特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4的PCR缓冲液中，同时进行野毒株质控标准品、疫苗株S2质控标准品、阴性质控标准品对照，进行PCR 扩增。PCR扩增条件为：94℃5min，94℃30s、55-58℃30s、72℃30s，35个循环，72℃ 10min。
PCR扩增体系，具体包括：5μL 10×PCR Buffer，8μL dNTP Mixture(2.5mM)，2μLseq ID No.1/seq ID No.3(即正向引物)，2μL seq ID No.2/seq ID No.4(即反向引物)，0.5μL DNA 聚合酶，27.5μL灭菌双蒸水，5μL提取的DNA模板。
(3)配置1.5％琼脂糖凝胶，取5-10μL上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测条件为：电压80v，电泳时间1h 10min，电泳结束后观察条带大小。
(4)结果判定：野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品均扩增出片段，阴性质控标准品(即灭菌双蒸水)未扩增出条带，否则试验失败，需重做。
对使用特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2而言，琼脂糖凝胶检测扩增出与野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品大小一致的片段(即285bp片段)则为猪种1型菌株；未扩增出大小一致的片段则为羊种、牛种、犬种、猪种其他亚型或其他感染。
对使用特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4而言，结合特异性引物对seq IDNo.1 和seq ID No.2结果，如果特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2扩增出与野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品大小一致的片段(即285bp片段)且a.特异性引物对seq IDNo.3 和seq ID No.4扩增出与野毒株质控标准品大小一致的片段(即349bp片段)，则为猪种1 型野毒株；b.特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4扩增出与疫苗株S2质控标准品大小一致的片段(即418bp片段)，则为猪种疫苗株S2。如果特异性引物对seq ID No.1和seqID No.2未扩增出与野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品大小一致的片段(即285bp片段) 且a.特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4扩增出与野毒株质控标准品(即349bp)/疫苗株S2质控标准品(即418bp片段)大小一致的单一片段，则为羊种、牛种、犬种或猪种其他亚型野毒株；b.特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4未扩增出与野毒株质控标准品 (即349bp)和疫苗株S2质控标准品(即418bp片段)大小一致的片段，则不属于常见布鲁氏菌种属感染；c.特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4扩增出与野毒株质控标准品(即 349bp)和疫苗株S2质控标准品(即418bp片段)大小一致的两条片段，则为布鲁氏菌菌株混合感染。
本发明所述的鉴别试剂盒及其使用方法，其直接目的是鉴别菌株种类，而非获取疾病诊断结果。
本发明所述特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4特异性极高，结合特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2，通过琼脂糖电泳检测，可有效区分布鲁氏菌猪种S2疫苗株与其他种属野毒株。
本发明用于非疾病的诊断和治疗。
本发明提供一种能够快速、有效、直观的鉴别样品中布鲁氏菌猪种S2疫苗株和其他种属野毒株的PCR试剂盒及其使用方法，用于解决布鲁氏菌病和防控过程中疫苗株和野毒株鉴别诊断的难题，该试剂盒能够快速、直观的鉴别样品中布鲁氏菌猪种S2疫苗株和其他种属野毒株。本发明涉及仪器常见，成本较低，无需经过测序，目测即可确定是否为疫苗株 S2感染，方法可应用于鉴别，完全可以推广应用，有助于推动布鲁氏菌病的诊断、流行病学调查和防控。
附图说明
图1疫苗株S2和野毒株差异片段检测。从左至右的泳道分别为阴性对照、DNAmarker、疫苗株S2、猪种1型野毒株B.suis 1330、羊种、牛种、犬种、猪种2型。
图2疫苗株S2、野毒株与常见布鲁氏菌种属检测结果。从左至右的泳道分别为DNAmarker、野毒株质控标准品、疫苗株质控标准品、羊种、牛种、猪种2型、犬种、猪种1型布鲁氏菌提取的基因组DNA样品。
图3疫苗株S2、野毒株与部分疫苗感染样品检测结果。图3A为引物选择为seq IDNo.1 和seq ID No.2扩增结果，从左至右的泳道分别为DNA marker、疫苗株S2感染的DNA样品1-4、布鲁氏菌检测阴性样品、阴性对照、疫苗株质控标准品。图3B为引物选择为seq IDNo.3和seq ID No.4扩增结果，琼脂糖电泳结果显示，从左至右的泳道分别为阴性对照、DNAmarker、疫苗株质控标准品、野毒株质控标准品、混合疫苗株S2和野毒株感染的样品、疫苗株S2感染的DNA样品4、布鲁氏菌检测阴性样品、疫苗株S2感染的DNA样品3、疫苗株S2感染的DNA样品2、疫苗株S2感染的DNA样品1。
图4疫苗株S2、野毒株与分离株检测结果。从左至右的泳道分别为阴性对照、DNAmarker、疫苗株质控标准品、野毒株质控标准品、布鲁氏菌分离株。
具体实施方式
下述实施例用于进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例均按照常规试验条件与方法进行，或者按照制造厂商所建议的试验条件。
1.试验材料
猪种布鲁氏菌疫苗株S2(B.suis S2)，牛种布鲁氏菌544A(B.abortus 544A)，羊种布鲁氏菌16M(B.melitensis 16M)，犬种布鲁氏菌RM6/66(B.canis RM6/66)，背景清晰疫苗株S2感染样品DNA，上分离、经传统生化鉴定为猪种1型布鲁氏菌分离株等，样品均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所保存。
10×PCR Buffer、dNTP Mixture(2.5mM)，DNA聚合酶均购自宝生物(大连)有限公司，琼脂糖购自擎科新业生物有限公司，
Figure BDA0002332209150000061
Genomic DNA Purification Kit基因组提取试剂盒购自美国Promega公司，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。
2.试验仪器
PCR扩增仪(Thermo公司)、电泳仪(北京市六一仪器厂)、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)
实施例1鉴别布鲁氏菌猪种S2疫苗株与其他种属野毒株PCR试剂盒的使用方法
(1)使用基因组提取试剂盒提取血液、血清、奶样、组织样本、气溶胶样本等样本的基因组DNA，经核酸浓度检测仪检测浓度高于1ng/μL。
(2)以提取的样本基因组DNA为模板，将模板、DNA聚合酶分别加入到含特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2以及特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4的PCR缓冲液中，同时进行野毒株质控标准品、疫苗株S2质控标准品、阴性质控标准品对照，进行PCR 扩增。PCR扩增条件为：94℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环，72℃10 min。
PCR扩增体系为50μL，具体包括：5μL 10×PCR Buffer，8μL dNTP Mixture(2.5mM)，2μL seq ID No.1/seq ID No.3(即正向引物)，2μL seq ID No.2/seq ID No.4(即反向引物)， 0.5μL DNA聚合酶，27.5μL灭菌双蒸水，5μL提取的DNA模板。
(3)配置1.5％琼脂糖凝胶，取5-10μL普通PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测条件为：电压80v，电泳时间1h 10min，电泳结束后观察条带大小。
(4)结果判定：野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品均扩增出片段，阴性质控标准品(即灭菌双蒸水)未扩增出条带。对使用特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2而言，琼脂糖凝胶检测扩增出与野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品大小一致的片段(即285bp 片段)则为猪种1型菌株；未扩增出大小一致的片段则为羊种、牛种、犬种、猪种其他亚型或其他感染。
对使用特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4而言，结合特异性引物对seq IDNo.1 和seq ID No.2结果，如果特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2扩增出与野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品大小一致的片段(即285bp片段)且a.特异性引物对seq IDNo.3 和seq ID No.4扩增出与野毒株质控标准品大小一致的片段(即349bp片段)，则为猪种1 型野毒株；b.特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4扩增出与疫苗株S2质控标准品大小一致的片段(即418bp片段)，则为猪种疫苗株S2。如果特异性引物对seq ID No.1和seqID No.2未扩增出与野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品大小一致的片段(即285bp片段) 且a.特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4扩增出与野毒株质控标准品(即349bp)/疫苗株S2质控标准品(即418bp片段)大小一致的单一片段，则为羊种、牛种、犬种或猪种其他亚型野毒株；b.特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4未扩增出与野毒株质控标准品 (即349bp)和疫苗株S2质控标准品(即418bp片段)大小一致的片段，则不属于常见布鲁氏菌种属感染；c.特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4扩增出与野毒株质控标准品(即 349bp)和疫苗株S2质控标准品(即418bp片段)大小一致的两条片段，则为布鲁氏菌菌株混合感染。
实施例2PCR试剂盒的组装
(1)配制PCR反应液
a.设计两对特异性扩增引物，送交生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体引物序列为：
正向引物seq ID No.1：5’-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3’
反向引物seq ID No.2：5’-GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3’
正向引物seq ID No.3：5’-GACCCGTCGCCGATAAGG-3’
反向引物seq ID No.4：5’-ACGGCGTTGCCTCATTCA-3’
b.PCR缓冲液的配制：
PCR扩增体系为50μL，具体包括：5μL 10×PCR Buffer，8μL dNTP Mixture(2.5mM)， 2μL seq ID No.1/seq ID No.3(即正向引物)(引物稀释后浓度为10μmoL/L)，2μL seq ID No.2/seq ID No.4(即反向引物)，0.5μL DNA聚合酶，27.5μL灭菌双蒸水，5μL提取的DNA 模板。
(2)野毒株质控标准品的制备：
所述野毒株质控标准品由猪种1型标准菌株(B.suis 1330)调整比浊度为0.5McF(1.5×108菌数/mL)经80℃热灭活60min组成。
(3)疫苗株质控标准品的制备：
疫苗株质控标准品由猪种S2疫苗株(B.suis S2)调整比浊度为0.5McF(1.5×108菌数 /mL)经80℃热灭活60min组成；
(4)阴性质控标准品的制备：
阴性质控标准品为灭菌双蒸水，体积为5μL。
实施例3布鲁氏菌疫苗株S2与野毒株特异性扩增引物可行性检测
采用本发明的PCR试剂盒分别对猪种S2疫苗株、猪种1型野毒株、羊种、牛种、犬种、猪种2型菌株提取的基因组DNA进行检测，引物选择为seq ID No.3和seq ID No.4，并设阴性对照。
布鲁氏菌疫苗株S2与野毒株特异性扩增引物可行性检测结果见图1。琼脂糖电泳结果显示，从左至右的泳道分别为阴性对照、DNA marker、疫苗株S2、猪种1型野毒株B.suis1330、羊种、牛种、犬种、猪种2型。阴性对照未扩增出条带，猪种S2扩增出片段大于野毒株扩增片段，羊种、牛种、犬种、猪种2型菌株扩增片段大小与疫苗株S2扩增大小一致。根据与DNAmarker大小比对结果，扩增片段分别为400bp左右及300-400bp之间。
实施例4野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品检测
采用本发明的PCR试剂盒分别对制备的野毒株质控标准品、疫苗株质控标准品进行检测，同时进行羊种、牛种、猪种2型和犬种布鲁氏菌提取的基因组DNA做为对照，引物选择为seq ID No.1和seq ID No.2，并设阴性对照。
野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品检测结果见图2。琼脂糖电泳结果显示，从左至右的泳道分别为DNA marker、野毒株质控标准品、疫苗株质控标准品、羊种、牛种、猪种2型、犬种、猪种1型布鲁氏菌提取的基因组DNA样品。阴性对照未扩增出条带，野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品均扩增出与猪种1型菌株大小相同的片段，根据与DNA marker大小比对结果，扩增片段分别为200-300bp之间。
实施例5背景清晰疫苗株S2感染样品检测
分别对实验室保存的布鲁氏菌阳性且背景清晰均为疫苗株S2感染的DNA样品4份，布鲁氏菌阴性DNA样品1份，混合疫苗株S2和野毒株感染的DNA样品1份，按照PCR 试剂盒进行检测，同时设阴性对照。
背景清晰疫苗株S2感染样品检测结果见图3。图3中A为引物选择为seq ID No.1和seq ID No.2扩增结果，琼脂糖电泳结果显示，从左至右的泳道分别为DNA marker、疫苗株S2 感染的DNA样品1-4、布鲁氏菌检测阴性样品、阴性对照、疫苗株质控标准品。结果显示，阴性对照及布鲁氏菌检测阴性样品未扩增出条带，疫苗株S2感染的DNA样品1-4和疫苗株质控标准品扩增出大小相同的片段。
图3中B为引物选择为seq ID No.3和seq ID No.4扩增结果，琼脂糖电泳结果显示，从左至右的泳道分别为阴性对照、DNA marker、疫苗株质控标准品、野毒株质控标准品、混合疫苗株S2和野毒株感染的样品、疫苗株S2感染的DNA样品4、布鲁氏菌检测阴性样品、疫苗株S2感染的DNA样品3、疫苗株S2感染的DNA样品2、疫苗株S2感染的DNA 样品1。阴性对照未扩增出条带，疫苗株S2感染的DNA样品1-4均扩增出与疫苗株质控标准品大小一致的单一片段，布鲁氏菌检测阴性样品未扩增出片段，混合疫苗株S2和野毒株感染的样品扩增出两条分别与野毒株和疫苗株质控标准品大小一致的片段。
实施例6分离布鲁氏菌株检测
分别对实验室保存且已经鉴定为猪种1型的布鲁氏菌分离株进行疫苗株S2与野毒株鉴别诊断，引物选择为特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4。
布鲁氏菌分离株鉴别诊断结果见图4。琼脂糖电泳结果显示，从左至右的泳道分别为阴性对照、DNA marker、疫苗株质控标准品、野毒株质控标准品、布鲁氏菌分离株。结果显示，阴性对照未扩增出条带，野毒株质控标准品和分离株样品扩增出大小相同的片段。特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2扩增猪种1型序列
Figure BDA0002332209150000101
特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4扩增野毒株序列
Figure BDA0002332209150000102
特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4扩增疫苗株S2序列
Figure BDA0002332209150000103
Figure BDA0002332209150000111
Figure BDA0002332209150000121
。

Claims (8)

1.一种鉴别布鲁氏菌猪种S2疫苗株与其他种属野毒株的PCR试剂盒，其特征在于，包括鉴定猪种1型菌株的特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2，以及S2疫苗株和野毒株的特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4，其核苷酸的碱基序列分别为：
seq ID No.1：5’-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3’
seq ID No.2：5’-GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3’
seq ID No.3：5’-GACCCGTCGCCGATAAGG-3’
seq ID No.4：5’-ACGGCGTTGCCTCATTCA-3’。
2.按照权利要求1所述的一种鉴别布鲁氏菌猪种S2疫苗株与其他种属野毒株的PCR试剂盒，其特征在于，包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、灭菌双蒸水、野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品；所述PCR缓冲液包括鉴定猪种1型菌株的特异性引物对seq ID No.1和seq IDNo.2，以及S2疫苗株和野毒株的特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4；
所述野毒株质控标准品由猪种1型标准菌株Brucella suis 1330调整比浊度为0.5McF(1.5×108菌数/mL)经80℃热灭活60min组成，疫苗株质控标准品由猪种S2疫苗株调整比浊度为0.5McF(1.5×108菌数/mL)经80℃热灭活60min组成。
3.采用权利要求1或2所述的试剂盒鉴别布鲁氏菌猪种S2疫苗株与其他种属野毒株的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的基因组DNA，经核酸浓度检测仪检测浓度高于1ng/μL；
(2)以提取的样本基因组DNA为模板，将模板、DNA聚合酶分别加入到含特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2以及特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4的PCR缓冲液中，同时进行野毒株质控标准品、疫苗株S2质控标准品、阴性质控标准品对照，进行PCR扩增；
(3)配置1.5％琼脂糖凝胶，取5-10μL上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测条件为：电压80v，电泳时间1h 10min，电泳结束后观察条带大小；
(4)结果判定：野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品均扩增出片段，阴性质控标准品即灭菌双蒸水未扩增出条带，否则试验失败，需重做；
对使用特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2而言，琼脂糖凝胶检测扩增出与野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品大小一致的片段则为猪种1型菌株；未扩增出大小一致的片段则为羊种、牛种、犬种、猪种其他亚型或其他感染。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述待测样品选自血液、血清、奶样、组织样本、气溶胶样本。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)PCR扩增条件为：94℃5min，94℃30s、55-58℃30s、72℃30s，35个循环，72℃10min。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)PCR扩增体系，具体包括：5μL 10×PCR Buffer，8μL dNTP Mixture(2.5mM)，2μL seq ID No.1/seq ID No.3即正向引物，2μLseq ID No.2/seq ID No.4即反向引物，0.5μL DNA聚合酶，27.5μL灭菌双蒸水，5μL提取的DNA模板。
7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(4)结果判断时，对使用特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4而言，结合特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2结果，如果特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2扩增出与野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品大小一致的片段即285bp片段，且a.特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4扩增出与野毒株质控标准品大小一致的片段即349bp片段，则为猪种1型野毒株；b.特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4扩增出与疫苗株S2质控标准品大小一致的片段即418bp片段，则为猪种疫苗株S2；
如果特异性引物对seq ID No.1和seq ID No.2未扩增出与野毒株质控标准品和疫苗株质控标准品大小一致的片段即285bp片段且a.特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4扩增出与野毒株质控标准品即349bp/疫苗株S2质控标准品即418bp片段大小一致的单一片段，则为羊种、牛种、犬种或猪种其他亚型野毒株；b.特异性引物对seq ID No.3和seq IDNo.4未扩增出与野毒株质控标准品即349bp和疫苗株S2质控标准品即418bp片段大小一致的片段，则不属于常见布鲁氏菌种属感染；c.特异性引物对seq ID No.3和seq ID No.4扩增出与野毒株质控标准品即349bp和疫苗株S2质控标准品即418bp片段大小一致的两条片段，则为布鲁氏菌菌株混合感染。
8.权利要求1或2所述的试剂盒的应用，用于鉴别布鲁氏菌猪种S2疫苗株与其他种属野毒株。
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