CN111286557B - 一种检测输血性传播病原体的试剂组合、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测病原体的试剂组合在制备用于检测血液制品质量的试剂盒中的应用，所述病原体选自由HAV、HBV、HCV、HEV、TP、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、HBOV、TTV、HCMV、B19、DENV、ZIKV、WNV、巴贝斯虫、克氏锥虫和疟原虫组成病原体组，属于医学检验领域。本发明还公开了相应的用于检测血液制品质量的试剂盒和方法。利用本发明，对病原体的最低检测限为1.0×10³copies/mL，具有较好的特异性、可重复性，为输血性传播病原体筛查评估提供重要技术。

Description

一种检测输血性传播病原体的试剂组合、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于医学检验领域，具体地，涉及一种检测输血性传播病原体的试剂组合、试剂盒及应用。

背景技术

依据《出入境特殊物品卫生检疫管理规定》，入境或出境的特殊物品包括微生物、人体组织、生物制品、血液及其制品等，该类物品在境内生产、分装、运输、使用等过程中，可能携带有病原体，还有些特殊物本身就是病原体，如果未进行有效的卫生检疫控制，出入境特殊物品很可能造成传染病的传播或其他危害公共卫生事件的发生。探讨和研究如何对出入境特殊物品进行科学、有效的卫生检疫显得越来越重要和迫切。目前只有环保微生物进行了特殊物品符合性检测，尚无特殊物品风险因子检测的项目和标准，因此迫切需要加强实验室检测能力建设，增强技术把关的能力与水平。其中，由于血液和血液制品因其在急救治疗和防治疾病中具有良好的效力，在临床上应用广泛，且在出入境特殊物品的占比较大，因此确保血液及血液制品的安全，最大限度地降低经血传播疾病的危险，特别是经血液传播的某些病毒，不仅感染率高且危害非常严重，一直是世界各国关注的重大问题。输血传播疾病是指受血者通过输入含病原体的血液或血液制品，以及任何病原体通过血液途径进入人体而引起的疾病。目前输血传播疾病的严重肆虐，极大危害人类的健康，日益受到全球的注视。用于输血的血液制品的质量和安全性是公众关注的重点。近几十年来，除了主要的最常见的病原体之外，最近影响血液安全的新兴病原体数量也在逐年增加。虽然一些高致病性病原体可能具有低流行率或在季节或在地理上的限制因素，与血液安全性相关性不强。然而，血液制品在输血传播过程中的感染则可能影响高度脆弱的人群，如新生儿、老年人或免疫功能低下者，从而造成致命的后果。

因此，需要建立针对这些输血传播病原体的高灵敏度和高特异性检测方法以评估血液制品质量，避免假阳性的结果而导致过多的感染。

发明内容

本发明的目的是建立一种基于多种荧光PCR阵列的分子诊断检测体系，对引起输血传播疾病的甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus，HAV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus，HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)、戊型肝炎病毒(Hepatitis EVirus，HEV)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum，TP)、人类免疫缺陷病毒I型(HumanImmunodeficiency Virus I，HIV1)、人类免疫缺陷病毒II型(Human ImmunodeficiencyVirus II，HIV2)、人类嗜T细胞病毒I型(Human T lymphotropic virus I，HTLV1)、人类嗜T细胞病毒II型(Human T lymphotropic virus II，HTLV2)、人博卡病毒(Human Bocavirus，HBOV)、输血传播病毒(Torque Teno virus，TTV)、人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)、人类微小病毒B19(Human Parvovirus B19，B19)、登革病毒(Dengue Virus，DENV)、寨卡病毒(Zika Virus， ZIKV)、西尼罗病毒(West Nile River Virus，WNV)、巴贝斯虫(Babesia Spp.， B.microti)、克氏锥虫(T.Cruzi)、疟原虫(Plasmodium spp.)共19种(型)病原微生物进行筛查。

为了完成上述目的，本发明一方面提供检测病原体的试剂组合在制备用于检测血液制品质量的试剂盒中的应用，其中，所述病原体选自HAV、HBV、HCV、HEV、 TP、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、HBOV、TTV、HCMV、B19、DENV、ZIKV、 WNV、巴贝斯虫、克氏锥虫和疟原虫中的至少2种，例如3种、4种、5种、6种、7 种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种。

在本发明的一些实施方案中，所述病原体包括HBV和HCV。在本发明的另一些实施方案中，所述病原体包括HIV1、HIV2和TP。在本发明的又一些实施方案中，所述病原体包括HTLV1、HTLV2和HBOV。在本发明的又一些实施方案中，所述病原体包括TTV、HCMV和B19。在本发明的又一些实施方案中，所述病原体包括DENV、ZIKV和WNV。在本发明的又一些实施方案中，所述病原体包括巴贝斯虫、克氏锥虫和疟原虫。在本发明的又一些实施方案中，所述病原体包括HAV和HEV。

在本发明的一些优选实施方案中，所述病原体包括HAV、HBV、HCV、HEV、 TP、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、HBOV、TTV、HCMV、B19、DENV、ZIKV、 WNV、巴贝斯虫、克氏锥虫和疟原虫，共19种病原体。

本发明的第二方面提供一种检测血液制品质量的试剂盒，包括用于检测病原体的试剂组合，其中，所述病原体选自由HAV、HBV、HCV、HEV、TP、HIV1、HIV2、 HTLV1、HTLV2、HBOV、TTV、HCMV、B19、DENV、ZIKV、WNV、巴贝斯虫、克氏锥虫和疟原虫组成病原体组中的至少2种，例如3种、4种、5种、6种、7种、8 种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种。

在本发明的一些实施方案中，所述病原体包括HBV和HCV。在本发明的另一些实施方案中，所述病原体包括HIV1、HIV2和TP。在本发明的又一些实施方案中，所述病原体包括HTLV1、HTLV2和HBOV。在本发明的又一些实施方案中，所述病原体包括TTV、HCMV和B19。在本发明的又一些实施方案中，所述病原体包括DENV、ZIKV和WNV。在本发明的又一些实施方案中，所述病原体包括巴贝斯虫、克氏锥虫和疟原虫。在本发明的又一些实施方案中，所述病原体包括HAV和HEV。

在本发明的一些优选实施方案中，所述病原体包括HAV、HBV、HCV、HEV、 TP、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、HBOV、TTV、HCMV、B19、DENV、ZIKV、 WNV、巴贝斯虫、克氏锥虫和疟原虫，共19种病原体。

在本发明中，所述试剂组合包括检测所述病原体的引物对和探针。

在本发明的一些实施方案中，检测所述HAV的引物对和探针靶向其多蛋白基因；检测所述HBV的引物对和探针靶向其核心蛋白基因；检测所述HCV的引物对和探针靶向其5'UTR基因；检测所述HEV的引物对和探针靶向其壳体蛋白基因的 ORF2；检测所述HIV1的引物对和探针靶向其gag基因；检测所述HIV2的引物对和探针靶向其gag基因；检测所述TP的引物对和探针靶向其脂蛋白抗原Tp47基因；检测所述HTLV1的引物对和探针靶向其Tax基因；检测所述HTLV2的引物对和探针靶向其Tax基因；检测所述HBOV的引物对和探针靶向其NS1基因；检测所述TTV的引物对和探针靶向其ORF1；检测所述HCMV的引物对和探针靶向其UL84基因；检测所述B19的引物对和探针靶向其NS1基因；检测所述ZIKV的引物对和探针靶向其多蛋白基因；检测所述DENV的引物对和探针靶向其3’UTR基因；检测所述WNV的引物对和探针靶向其NS5基因；检测所述巴贝斯虫的引物对和探针靶向其ITS1基因；检测所述克氏锥虫的引物对和探针靶向其卫星序列；检测所述疟原虫的的引物对和探针靶向其18s rRNA基因。

在本发明的一些具体实施方案中，检测所述HAV的引物对包括具有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQID No.3所示核苷酸序列；检测所述HBV的引物对包括具有SEQ ID No.4 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.6所示核苷酸序列；检测HCV所述的引物对包括具有SEQ ID No.7 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.8所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.9所示核苷酸序列；检测所述HEV的引物对包括具有SEQ ID No.10 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.11所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.12所示核苷酸序列；检测所述HIV1的引物对包括具有SEQ ID No. 13所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.14所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.15所示核苷酸序列；检测所述HIV2的引物对包括具有SEQ ID No. 16所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.17所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.18所示核苷酸序列；检测所述TP的引物对包括具有SEQ IDNo.19 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.20所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.21所示核苷酸序列；检测所述HTLV1的引物对包括具有SEQ ID No. 22所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.23所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ IDNo.24所示核苷酸序列；检测所述HTLV2的引物对包括具有SEQ ID No.25所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.26所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.27所示核苷酸序列；检测所述HBOV的引物对包括具有SEQ ID No.28所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.29所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.30所示核苷酸序列；检测所述TTV的引物对包括具有SEQ ID No.31所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNo.32所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.33所示核苷酸序列；检测所述HCMV的引物对包括具有 SEQ ID No.34所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.35所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.36所示核苷酸序列；检测所述B19的引物对包括具有SEQ ID No.37所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.38所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.39所示核苷酸序列；检测所述ZIKV的引物对包括具有SEQ IDNo.40所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.41所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.42所示核苷酸序列；检测所述DENV的引物对包括具有SEQ ID No.43所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.44所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ IDNo.45所示核苷酸序列；检测所述WNV的引物对包括具有SEQ ID No.46所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No.47所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.48所示核苷酸序列；检测所述巴贝斯虫的引物对包括具有SEQ ID No.49所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No. 50所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.51所示核苷酸序列；检测所述克氏锥虫的引物对包括具有SEQ ID No.52所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQID No.53所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.54所示核苷酸序列；检测所述疟原虫的引物对包括具有SEQ ID No.55所示核苷酸序列的上游引物和具有 SEQ ID No.56所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.57所示核苷酸序列。

在本发明中，所述试剂盒进一步包括缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括靶向内参的引物对和探针。在本发明的一些实施方案中，所述内参为RNP。在本发明的一些具体实施方案中，靶向内参引物对包括具有SEQ ID No.58所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID No. 59所示核苷酸序列的上游引物，探针具有SEQ ID No.60所示核苷酸序列。

本发明的第三方面提供一种检测血液制品质量的方法，包括以下步骤：

(1)获得所述血液制品的核酸样本；

(2)利用本发明第二方面所述的试剂盒对所述核酸样本进行qPCR扩增；

(3)根据qPCR检测结果，判断所述血液制品的质量。

如果对应某病原体的qPCR扩增结果为阳性，表明具血液制品具有所述病原体污染，质量差，不能用于临床。

本发明的有益效果

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

本发明建立了一种基于多种荧光PCR阵列的分子诊断检测体系，能同时有效对引起输血传播疾病的甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、梅毒螺旋体、人类免疫缺陷病毒I型、人类免疫缺陷病毒II型、人类嗜 T细胞病毒I型、人类嗜T细胞病毒II型、人博卡病毒、输血传播病毒、人巨细胞病毒、人类微小病毒B19、登革病毒、寨卡病毒、西尼罗病毒、巴贝斯虫、克氏锥虫、疟原虫共19种(型)病原微生物进行检测筛查，涉及病原种类多、全。

本发明的多重实时荧光PCR方法的性能评价显示，其最低检测限质粒模板浓度为1.0×10³copies/mL，具有较好的特异性、可重复性。

本发明建立的多种荧光PCR阵列方法可用于上述19种(型)输血传播病原体的定性检测，为输血性传播病原体筛查评估提供重要技术。

附图说明

图1示出了HAV、HBV、HCV、HEV重组质粒验证结果。

图2示出了TP、HIV1、HIV2、HTLV1重组质粒验证结果。

图3示出了HTLV2、HBOV、TTV、HCMV重组质粒验证结果。

图4示出了B19、DENV、ZIKV、WNV重组质粒验证结果。

图5示出了巴贝斯虫、克氏锥虫、疟原虫、内标重组质粒验证结果。

图6示出了HAV/HBV、HIV1/HIV2/TP、HTLV1/HTLV2/HBOV和 TTV/HCMV/B19多重荧光PCR扩增结果。

图7示出了DENV/ZIKV/WNV、巴贝斯虫/克氏锥虫/疟原虫、HAV/HEV和阴性对照多重荧光PCR扩增结果。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例

1.材料与方法

1.1标本来源

各种含有输血传播病原靶基因的质粒为采用人工合成方法并克隆到质粒上，包括：HAV、HBV、HCV、HEV、TP、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、 HBOV、TTV、HCMV、B19、DENV、ZIKV、WNV、巴贝斯虫、克氏锥虫和疟原虫。质粒委托安徽通用生物合成提供。

1.2主要试剂及仪器

OneStep RT-PCR试剂(江苏硕世公司)，QIAamp Viral RNA Mini Kit核酸提取试剂(Qiagen)，逆转录酶SuperScript^TMIII Reverse Transcriptase (ThermoFisher)，DNA聚合酶Platinum^TMTaq DNA Polymerase(ThermoFisher)， dNTP Mix(Promega)，ABIQuantStudio7Flex荧光PCR仪(美国ABI)，NanoDrop 2000c分光光度计(ThermoScientific)。

1.3引物及探针设计

根据GenBank中的基因数据，根据引物设计原则，针对19种(型)病原体基因特异性保守区，设计引物和探针，探针的5'端分别标记FAM、VIC、ROX、 CY5荧光基团，3’端标记相应的淬灭基团BHQ1、BHQ2、BHQ3。引物、探针由百力格生物公司合成并标记。引物及探针信息如表1所示：

表1引物及探针信息

1.4多重荧光PCR反应条件优化

对多重荧光PCR体系分别设置从55℃、58℃、60℃作为反应的退火延伸温度，分别完成荧光PCR反应，通过扩增曲线分析退火延伸温度对多重荧光PCR 检测的影响。多重荧光PCR反应体系的引物探针浓度共设计3个浓度梯度进行组合优化，25μL反应体系中分别加入终浓度为100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L、 600nmol/L引物和探针。通过扩增曲线分析引物和探针浓度对多重荧光PCR检测的影响。反应条件：50℃30min；95℃5min；95℃10s，60℃40s，45个循环；在60℃40s阶段收集荧光。

1.5灵敏度试验

对重组质粒进行10倍梯度系列稀释，用优化后的多重荧光PCR反应体系对重组质粒(1×10¹copies/μL)进行检测，每个重组质粒(1×10¹copies/μL)稀释 4份，每份重复检测24次，总检测次数为96次，观察其最低检出限。

1.6特异性试验

在经过Blast程序及Bioedit对各引物和探针的特异性进行初步分析和验证的基础上，进一步将用所设计的引物和探针检测，以来源相同或症状相似的病原体的病毒标准品为模板，RNase-free water为阴性对照，以质粒作为阳性对照进行特异性试验。

1.7精密度试验

运用病原体的10³copies/μL和10¹copies/μL标准品进行重复性检测。每个浓度设置10个平行样，计算各病毒对应的各浓度的CT值平均值及标准差，并计算变异系数来检验反应体系的精密度。

2.结果

2.1阳性重组质粒的验证

将含有HAV、HBV、HCV、HEV、TP、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、 HBOV、TTV、HCMV、B19、DENV、ZIKV、WNV、巴贝斯虫、克氏锥虫和疟原虫目的片段的重组质粒采用测序法进行验证，序列结果与病原体靶基因序列一致，部分测序结果见图1-5。

2.2引物和探针的验证

多重实时荧光PCR反应检测中，HBV/HCV、HIV1/HIV2/TP、 HTLV1/HTLV2/HBOV和TTV/HCMV/B19、DENV/ZIKV/WNV、巴贝斯虫/克氏锥虫/疟原虫、HAV/HEV对10²copies/μL和10⁴copies/μL的阳性对照检出率为 100.0％，见表2。说明七组引物和探针可用于乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒I型、人类免疫缺陷病毒II型、梅毒螺旋体、人类嗜T细胞病毒I型、人类嗜T细胞病毒II型、人博卡病毒、输血传播病毒、人巨细胞病毒、人类微小病毒B19、登革病毒、西尼罗病毒、巴贝斯虫、克氏锥虫、疟原虫、甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒多重实时荧光PCR分型检测。

表2引物和探针对各重组质粒的检测结果

2.3引物和探针用量

在25μl反应体系中的引物和探针的终浓度比例为600nmol/L：400nmol/L、600nmol/L：200nmol/L、400nmol/L：200nmol/L和400nmol/L：100nmol/L。组1、组2和组3对所有浓度的阳性对照均可检出，组4的克氏锥虫对10²copies/μL的阳性对照检出率为达不到100％，见表3。因此选择用量较少的组3作为反应体系最佳引物和探针用量，即引物终浓度为400nmol/L，探针终浓度为200nmol/L。

表3引物和探针用量对各重组质粒的检测结果

2.4退火温度优化

经对荧光PCR反应过程退火温度55℃、58℃、60℃共三个退火温度进行优化。组1、组2和组3对10²copies/μL和10⁴copies/μL阳性对照检出率均为100.0％，不同的退火温度对检测没有影响，见表4。后续实验选择60℃作为退火温度，即50℃30min；95℃5min；95℃10s，60℃40s，45个循环；在60℃40s阶段收集荧光。

表4退火温度对各重组质粒的检测结果

2.5各组分试剂用量

在25μL反应体系中，按照OneStep RT-PCR说明书的推荐用量，7.5μL OneStep RT-PCR扩增反应液、5μL Enzyme Mix酶混合液、引物探针检测液 7.5μL、模板各取5μL。反应条件为50℃30min；95℃5min；95℃10s，60℃40s， 45个循环；在60℃40s阶段收集荧光。多重荧光PCR检测结果HBV/HBV、 HIV1/HIV2/TP、HTLV1/HTLV2/HBOV和TTV/HCMV/B19见图6， DENV/ZIKV/WNV、巴贝斯虫/克氏锥虫/疟原虫、HAV/HEV和阴性对照见图7。

2.6灵敏度

利用含特异性片段的质粒进行10倍梯度稀释后，制备浓度为 1×10¹copies/μL的标准品，以之为模板，进行荧光PCR检测。每个重组质粒 (1×10¹copies/μL)稀释4份，每份重复检测24次，总检测次数为96次。以1×10¹copies/μL的标准品用于验证本反应体系的最低检测限。实验结果见表5，对实验结果进行统计分析，浓度为1×10¹copies/μL的标准品检出率分别都大于 95％。因此本反应体系的灵敏度确定为1×10¹copies/μL。

表5多重荧光PCR阵列对各重组质粒检测的灵敏度

2.7特异性

19种(型)病原体的引物和探针之间做交叉实验进行实时荧光PCR特异性验证：各病毒之间无交叉反应，只有病毒与引物之间的特异性扩增，扩增结果见表6。由实验结果可以看出，各病原体间在该PCR反应体系种中均没有扩增，因此，所建立的荧光PCR方法具有较好的特异性。

表6多重荧光PCR在各病原体间的检测特异性

2.8重复性

采用19种(型)病原体的重组质粒(1×10¹copies/μL和1×10³copies/μL)进行重复性检测。每个浓度设置10个平行样，计算各病毒对应的各浓度的CT值平均值及标准差，并计算变异系数来检验反应体系的重复性。

结果表明：各体系的变异系数都小于5％，详细结果见表7。该结果显示该多重荧光PCR阵列技术的可重复性良好。

表7多重荧光PCR阵列对各重组质粒检测的精密度

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 山西国际旅行卫生保健中心（太原海关口岸门诊部）

<120> 一种检测输血性传播病原体的试剂组合、试剂盒及应用

<130> JIA-2020-1-W-001

<160> 60

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaccattcaa cgccggag 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgccctaag cacagaga 18

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcatccagt ggatgcattg agtg 24

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agaagaactc cctcgcctc 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actaacattg agattcccg 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcttctgcga cgcggcgatt 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctcatggtg cacggtct 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgcctgatag ggtgcttgcg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taatcttgct gatacgcttc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgtcctgct gtgcgttctc 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacgctctcg cacccat 17

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

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<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cggagaggct ggcagat 17

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcgactagga gagatgg 17

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caggtagagc ctgggtgttc c 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcagcatcca tcagagtctc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aggctgactt tgattgcgaa 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tatggtcagc accttcccct tc 22

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctccttcccc acccagag 18

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggtgggttcc atgtatcc 18

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

agggtggaat gttgggggtt gtatg 25

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ctccttcccc acccagaga 19

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gttggttcca ggcatccat 19

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ctgtctcccc caaggttcca cctgc 25

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gtgcttcaat gagtacgaat gt 22

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ctgtgaatgc gtaggacaaa gg 22

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ccaagaggaa atgagtttgg 20

<210> 31

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gtgccggagg tgagtt 16

<210> 32

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ccatagcccg gccagt 16

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cgagcccgaa ttgccccttg ac 22

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cgccactgcc ttactttgt 19

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ttacgtaacg tgtgcgagt 19

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cctccagtcc ctcgtccgcc 20

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

atacactgtg gttttatggg c 21

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ggaaagtttt cattattcca g 21

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

caggaaaaac aaacttggca at 22

<210> 40

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ccacttcaac aagctcca 18

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gcagtctccc ggatgctc 18

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

cattgtggtt ccctgccgcc 20

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

agaccagaga tcctgctgtc t 21

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

accattccat tttctggcgt t 21

<210> 45

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

agcatcattc caggcac 17

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gaaggaggac cccacatg 18

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

gcctttgtta acccagtc 18

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

caaagcccag tgtcagacca cgct 24

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

cctgggcctc tgtgttagat 20

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

acgttgcagc agccaagaa 19

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

ctaacgggca ttgggggatt atact 25

<210> 52

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

tcggctgatc gttttcga 18

<210> 53

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

ctcctccaag cagcggat 18

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

ctggacacca aacaaccctg 20

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

tctttcttga tttcttggat gg 22

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

tcgttcgtta tcggaattaa cc 22

<210> 57

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

cgtttttagt tcgtgaatat gatttg 26

<210> 58

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

gatttggacc tgcgagc 17

<210> 59

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

gcggctgtct ccacaag 17

<210> 60

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

ctgacctgaa ggctctgcgc g 21

Claims (7)

1.一种检测病原体的试剂组合，其特征在于，所述病原体包括HAV、HBV、HCV、HEV、TP、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、HBOV、TTV、HCMV、B19、DENV、ZIKV、WNV、巴贝斯虫、克氏锥虫和疟原虫，所述试剂组合包括检测所述病原体的引物对：

检测所述HAV的引物对包括SEQ ID No. 1所示的上游引物和SEQ ID No. 2所示的下游引物；检测所述HBV的引物对包括SEQ ID No. 4所示的上游引物和SEQ ID No. 5所示的下游引物；检测HCV所述的引物对包括SEQ ID No. 7所示的上游引物和SEQ ID No. 8所示的下游引物；检测所述HEV的引物对包括SEQ ID No. 10所示的上游引物和SEQ ID No. 11所示的下游引物；检测所述HIV1的引物对包括SEQ ID No. 13所示的上游引物和SEQ ID No.14所示的下游引物；检测所述HIV2的引物对包括SEQ ID No. 16所示的上游引物和SEQ IDNo. 17所示的下游引物；检测所述TP的引物对包括SEQ ID No. 19所示的上游引物和SEQID No. 20所示的下游引物；检测所述HTLV1的引物对包括SEQ ID No. 22所示的上游引物和SEQ ID No. 23所示的下游引物；检测所述HTLV2的引物对包括SEQ ID No. 25所示的上游引物和SEQ ID No. 26所示的下游引物；检测所述HBOV的引物对包括SEQ ID No. 28所示的上游引物和SEQ ID No. 29所示的下游引物；检测所述TTV的引物对包括SEQ ID No. 31所示的上游引物和SEQ ID No. 32所示的下游引物；检测所述HCMV的引物对包括SEQ IDNo. 34所示的上游引物和SEQ ID No. 35所示的下游引物；检测所述B19的引物对包括SEQID No. 37所示的上游引物和SEQ ID No. 38所示的下游引物；检测所述ZIKV的引物对包括SEQ ID No. 40所示的上游引物和SEQ ID No. 41所示的下游引物；检测所述DENV的引物对包括SEQ ID No. 43所示的上游引物和SEQ ID No. 44所示的下游引物；检测所述WNV的引物对包括SEQ ID No. 46所示的上游引物和SEQ ID No. 47所示的下游引物；检测所述巴贝斯虫的引物对包括SEQ ID No. 49所示的上游引物和SEQ ID No. 50所示的下游引物；检测所述克氏锥虫的引物对包括SEQ ID No. 52所示的上游引物和SEQ ID No. 53所示的下游引物；检测所述疟原虫的引物对包括SEQ ID No. 55所示的上游引物和SEQ ID No. 56所示的下游引物。

2.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，还包括检测所述病原体的探针。

3.根据权利要求2所述的试剂组合，其特征在于，检测所述HAV的探针如SEQ ID No. 3所示；检测所述HBV的探针如SEQ ID No. 6所示；检测HCV所述的探针如SEQ ID No. 9所示；检测所述HEV的探针如SEQ ID No. 12所示；检测所述HIV1的探针如SEQ ID No. 15所示；检测所述HIV2的探针如SEQ ID No. 18所示；检测所述TP的探针如SEQ ID No. 21所示；检测所述HTLV1的探针如SEQ ID No. 24所示；检测所述HTLV2的探针如SEQ ID No. 27所示；检测所述HBOV的探针如SEQ ID No. 30所示；检测所述TTV的探针如SEQ ID No. 33所示；检测所述HCMV的探针如SEQ ID No. 36所示；检测所述B19的探针如SEQ ID No. 39所示；检测所述ZIKV的探针如SEQ ID No. 42所示；检测所述DENV的探针如SEQ ID No. 45所示；检测所述WNV的探针如SEQ ID No. 48所示；检测所述巴贝斯虫的探针如SEQ ID No. 51所示；检测所述克氏锥虫的探针如SEQ ID No. 54所示；检测所述疟原虫的探针如SEQ ID No. 57所示。

4.权利要求1~3任一所述的试剂组合在制备用于检测血液制品质量的试剂盒中的应用，其特征在于，所述病原体包括HAV、HBV、HCV、HEV、TP、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、HBOV、TTV、HCMV、B19、DENV、ZIKV、WNV、巴贝斯虫、克氏锥虫和疟原虫。

5.一种检测血液制品质量的试剂盒，包括权利要求1~3任一所述的试剂组合，其特征在于，所述病原体包括HAV、HBV、HCV、HEV、TP、HIV1、HIV2、HTLV1、HTLV2、HBOV、TTV、HCMV、B19、DENV、ZIKV、WNV、巴贝斯虫、克氏锥虫和疟原虫。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶。

7.一种非诊断目的检测血液制品质量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）获得所述血液制品的核酸样本；

（2）利用权利要求5-6任一所述的试剂盒对所述核酸样本进行qPCR扩增；

（3）根据qPCR检测结果，判断所述血液制品的质量。