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CN111278460A - 结合nkg2d、cd16和肿瘤相关抗原的蛋白质 - Google Patents

结合nkg2d、cd16和肿瘤相关抗原的蛋白质 Download PDF

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CN111278460A
CN111278460A CN201880051761.6A CN201880051761A CN111278460A CN 111278460 A CN111278460 A CN 111278460A CN 201880051761 A CN201880051761 A CN 201880051761A CN 111278460 A CN111278460 A CN 111278460A
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安·F·张
威廉·哈尼
布拉德利·M·伦德
比昂卡·普林茨
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Dragonfly Therapy Co ltd
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Abstract

描述了结合NKG2D受体、CD16和选自5T4、GPNMB、FR‑α、PAPP‑A和GPC3的肿瘤相关抗原的多特异性结合蛋白，以及可用于治疗癌症的药物组合物和治疗方法。

Description

结合NKG2D、CD16和肿瘤相关抗原的蛋白质
与相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月23日提交的美国临时专利申请号62/510,137、2017年5月23日提交的美国临时专利申请号62/510,168、2017年5月23日提交的美国临时专利申请号62/510,169、2017年5月23日提交的美国临时专利申请号62/510,167和2017年7月31日提交的62/539,425的利益和优先权，所述每个申请的内容为所有目的整体通过引用并入本文。
序列表
本申请含有以ASCII格式电子提交并整体通过引用并入本文的序列表。所述在2018年5月21日生成的ASCII拷贝被命名为DFY-018WO.txt，大小为144kb。
技术领域
本发明涉及结合到NKG2D、CD16和选自5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的肿瘤相关抗原的多特异性结合蛋白。
背景技术
尽管在文献中已报道了治疗癌症的大量研究尝试和科学进展，但这种疾病依然是显著的健康问题。一些最经常被诊断到的癌症包括前列腺癌、乳腺癌和肺癌。前列腺癌是男性中最常见的癌症形式。乳腺癌仍然是女性中死亡的主导原因。当前用于这些癌症的治疗选项不对所有患者有效和/或可能具有实质性严重副作用。其他类型的癌症对于使用现有治疗选项治疗来说也仍然具有挑战性。
癌症免疫疗法是理想的，因为它们是高度特异性的并且可以使用患者自己的免疫系统来促进癌细胞的破坏。融合蛋白例如双特异性T-细胞衔接器是文献中描述的结合到肿瘤细胞和T-细胞以促进肿瘤细胞破坏的癌症免疫疗法。结合到某些肿瘤相关抗原和结合到某些免疫细胞的抗体在文献中已有描述。参见例如WO 2016/134371和WO 2015/095412。
自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的组成部分，占循环淋巴细胞的大约15％。NK细胞事实上浸润所有组织，并且最初因它们不需前期致敏即可杀伤肿瘤细胞的能力而被表征。激活的NK细胞通过与细胞毒性T细胞相似的手段杀伤靶细胞，即通过含有穿孔素和颗粒酶的细胞溶解颗粒以及通过死亡受体途径。激活的NK细胞还分泌炎性细胞因子例如IFN-γ和促进其他白细胞向靶组织的召集的趋化因子。
NK细胞通过它们表面上的各种不同激活和抑制受体对信号做出响应。例如，当NK细胞遇到健康的自体细胞时，它们的活性通过杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的激活而被抑制。或者，当NK细胞遇到外来细胞或癌细胞时，它们通过它们的激活受体(例如NKG2D、NCR、DNAM1)而被激活。NK细胞也通过它们表面上的CD16受体被某些免疫球蛋白的恒定区激活。NK细胞对激活的总体灵敏度取决于刺激性和抑制性信号的总和。
人类滋养层糖蛋白5T4是一种N-糖基化的跨膜蛋白。它的表达在机制上与细胞通过上皮-间质转化的定向移动、CXCL12/CXCR4趋化性的促进以及在有利于非经典途径信号传导的同时经典的Wnt/β-连环蛋白途径的阻断相关。这些过程在发育中和成年人组织中受到高度调控，但它们帮助驱动癌细胞的扩散。已显示，5T4在正常成年人组织中具有非常有限的表达，但在许多癌症包括结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、肾癌和胃癌中是普遍的。
非转移性黑素瘤糖蛋白b(GPNMB)是一种I型跨膜蛋白，其与一种黑素细胞特异性蛋白pmel17前体显示出同源性。已报道GPNMB在各种不同的细胞类型中表达，包括：黑色细胞，破骨细胞，成骨细胞，树突状细胞。此外，它在各种不同类型的癌症包括黑素瘤、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、骨肉瘤和神经胶质瘤/成胶质细胞瘤中高度表达。已显示，GPNMB促进肿瘤细胞的迁移、侵入和转移。
在快速增殖的细胞中需要充足的叶酸摄入量，以进行一碳代谢反应和DNA生物合成、修复和甲基化。叶酸可以通过叶酸受体运输，其具有四个糖基多肽成员(FRα、FRβ、FRγ和FRδ)。α亚型FR-α是一种糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定膜蛋白，对叶酸的活性形式5-甲基四氢叶酸(5-MTF)的结合和协调转运具有高亲和力。已报道FR-α在实体肿瘤例如卵巢癌、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、肺腺癌和上皮起源的肿瘤中过表达。另一方面，FR-α在正常人类组织中的分布被限制到在某些器官例如肾、肺和脉络丛的顶表面中低水平表达。研究证实，FR-α的过表达可能通过既相关又独立于叶酸摄取的机制赋予癌细胞以生长优势。
妊娠相关血浆蛋白-A(PAPPA)是一种锌金属蛋白酶，并且它切割胰岛素样生长因子结合蛋白。它的蛋白水解功能在胶原蛋白结合后被激活，并且它被认为参与局部增殖性过程例如伤口愈合和骨骼重塑。已暗示PAPP-A与几种癌症包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌和尤文氏肉瘤有牵连。
磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)这种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在人类胚胎组织中表达，但从除了乳腺之外的大多数成年人组织中消失。几份报告将GPC3与癌症相联系。已显示GPC3在肝细胞癌、黑素瘤、威尔姆氏瘤、卵黄囊瘤、卵巢透明细胞癌、胃癌和食道癌中过表达。
发明内容
本发明提供了结合到自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体和选自5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的肿瘤相关抗原的多特异性结合蛋白。这些蛋白质可以结合超过一种NK激活受体，并且可以阻断天然配体与NKG2D的结合。在某些实施方式中，所述蛋白质可以在人类中激动NK细胞。在某些实施方式中，所述蛋白质可以在人类和其他物种例如啮齿动物和食蟹猴中激动NK细胞。本发明的各个不同方面和实施方式将在下文中更详细描述。
因此，本发明的一个方面提供了一种蛋白质，其包含：结合NKG2D的第一抗原结合位点；结合选自5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的肿瘤相关抗原的第二抗原结合位点；和抗体Fc结构域、其足以结合CD16的部分或结合CD16的第三抗原结合位点。
所述抗原结合位点可以各自包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域(例如像在抗体中那样排列或融合在一起以形成scFv)，或者一个或多个所述抗原结合位点可以是单域抗体，例如VHH抗体如骆驼抗体或VNAR抗体如在软骨鱼中发现的。
一方面，本发明提供了多特异性结合蛋白，其结合到自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以及选自5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的肿瘤相关抗原。所述NKG2D结合位点包括与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQID NO：61、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：93的氨基酸序列至少90％同一性的重链可变结构域。
在某些实施方式中，所述结合到NKG2D的第一抗原结合位点可以包含与SEQ IDNO：1相关的重链可变结构域，例如通过具有与SEQ ID NO：1至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列，和/或包含与SEQ ID NO：1的CDR1(SEQ ID NO：105)、CDR2(SEQ ID NO：106)和CDR3(SEQ ID NO：107)序列相同的氨基酸序列。所述与SEQ ID NO：1相关的重链可变结构域可以与各种不同的轻链可变结构域偶联，以形成NKG2D结合位点。例如，所述包含与SEQ ID NO：1相关的重链可变结构域的第一抗原结合位点还可以包含选自与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和40相关的任一序列的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点包含具有与SEQ ID NO：1至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的重链可变结构域和具有与选自SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和40的任一序列至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域。
可选地，所述第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO：41相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：42相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：41至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：41的CDR1(SEQ ID NO：43)、CDR2(SEQID NO：44)和CDR3(SEQ ID NO：45)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：42至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：42的CDR1(SEQ ID NO：46)、CDR2(SEQ ID NO：47)和CDR3(SEQ ID NO：48)序列相同的氨基酸序列。
在其他实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO：49相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：50相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：49至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：49的CDR1(SEQ ID NO：51)、CDR2(SEQ ID NO：52)和CDR3(SEQ ID NO：53)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：50至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：50的CDR1(SEQ ID NO：54)、CDR2(SEQ ID NO：55)和CDR3(SEQ ID NO：56)序列相同的氨基酸序列。
可选地，所述第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO：57相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：58相关的轻链可变结构域，例如通过分别具有与SEQ ID NO：57至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性和与SEQID NO：58至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与SEQID NO：59相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：60相关的轻链可变结构域，例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：59至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：59的CDR1(SEQ ID NO：186)、CDR2(SEQ ID NO：187)和CDR3(SEQ ID NO：188)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：60至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：60的CDR1(SEQ ID NO：189)、CDR2(SEQ ID NO：190)和CDR3(SEQ ID NO：191)序列相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述结合到NKG2D的第一抗原结合位点可以包含与SEQ IDNO：61相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：62相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：61至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：61的CDR1(SEQID NO：63)、CDR2(SEQ ID NO：64)和CDR3(SEQ ID NO：65)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：62至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：62的CDR1(SEQ ID NO：66)、CDR2(SEQ ID NO：67)和CDR3(SEQ ID NO：68)序列相同的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO：69相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：70相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：69至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：69的CDR1(SEQ ID NO：71)、CDR2(SEQ ID NO：72)和CDR3(SEQ ID NO：73)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：70至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：70的CDR1(SEQID NO：74)、CDR2(SEQ ID NO：75)和CDR3(SEQ ID NO：76)序列相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO：77相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：78相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：77至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：77的CDR1(SEQ ID NO：79)、CDR2(SEQ ID NO：80)和CDR3(SEQ ID NO：81)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：78至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：78的CDR1(SEQ ID NO：82)、CDR2(SEQ ID NO：83)和CDR3(SEQ ID NO：84)序列相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO：85相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：86相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：85至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：85的CDR1(SEQ ID NO：87)、CDR2(SEQ ID NO：88)和CDR3(SEQ ID NO：89)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：86至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：86的CDR1(SEQ ID NO：90)、CDR2(SEQ ID NO：91)和CDR3(SEQ ID NO：92)序列相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO：93相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：94相关的轻链可变结构域。例如，所述第一抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：93至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：93的CDR1(SEQ ID NO：95)、CDR2(SEQ ID NO：96)和CDR3(SEQ ID NO：97)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：94至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：94的CDR1(SEQ ID NO：98)、CDR2(SEQ ID NO：99)和CDR3(SEQ ID NO：100)序列相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO：101相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：102相关的轻链可变结构域，例如通过分别具有与SEQ IDNO：101至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性和与SEQ ID NO：102至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第一抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO：103相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：104相关的轻链可变结构域，例如通过分别具有与SEQ ID NO：103至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性和与SEQ ID NO：104至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述结合到5T4的第二抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO：109相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：113相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：109至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：109的CDR1(SEQ ID NO：110)、CDR2(SEQ ID NO：111)和CDR3(SEQ ID NO：112)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：113至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：113的CDR1(SEQ ID NO：114)、CDR2(SEQ ID NO：115)和CDR3(SEQ ID NO：116)序列相同的氨基酸序列。
可选地，所述结合到5T4的第二抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO：117相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：121相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：117至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：117的CDR1(SEQ ID NO：118)、CDR2(SEQ ID NO：119)和CDR3(SEQ ID NO：120)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：121至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：121的CDR1(SEQ ID NO：122)、CDR2(SEQ ID NO：123)和CDR3(SEQ ID NO：124)序列相同的氨基酸序列。
所述结合到5T4的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO：125相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：129相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：125至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：125的CDR1(SEQ ID NO：126)、CDR2(SEQ ID NO：127)和CDR3(SEQ ID NO：128)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：129至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：129的CDR1(SEQ ID NO：130)、CDR2(SEQ ID NO：131)和CDR3(SEQ ID NO：132)序列相同的氨基酸序列。
所述结合到5T4的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO：192相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：196相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：192至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：192的CDR1(SEQ ID NO：193)、CDR2(SEQ ID NO：194)和CDR3(SEQ ID NO：195)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：196至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：196的CDR1(SEQ ID NO：197)、CDR2(SEQ ID NO：198)和CDR3(SEQ ID NO：199)序列相同的氨基酸序列。
所述结合到5T4的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO：200相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：204相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：200至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：200的CDR1(SEQ ID NO：201)、CDR2(SEQ ID NO：202)和CDR3(SEQ ID NO：203)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：204至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：204的CDR1(SEQ ID NO：205)、CDR2(SEQ ID NO：206)和CDR3(SEQ ID NO：207)序列相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述结合到GPNMB的第二抗原结合位点可以包含与SEQ IDNO：134相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：138相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：134至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：134的CDR1(SEQ ID NO：135)、CDR2(SEQ ID NO：136)和CDR3(SEQ ID NO：137)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：138至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：138的CDR1(SEQ ID NO：139)、CDR2(SEQ ID NO：140)和CDR3(SEQ ID NO：141)序列相同的氨基酸序列。可选地，所述结合到GPNMB的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO：142相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：146相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：142至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ IDNO：142的CDR1(SEQ ID NO：143)、CDR2(SEQ ID NO：144)和CDR3(SEQ ID NO：145)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：146至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：146的CDR1(SEQ ID NO：147)、CDR2(SEQ ID NO：148)和CDR3(SEQID NO：149)序列相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述结合到FR-α的第二抗原结合位点可以包含与SEQ ID NO：151相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：155相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：151至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：151的CDR1(SEQ ID NO：152)、CDR2(SEQ ID NO：153)和CDR3(SEQ ID NO：154)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：155至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：155的CDR1(SEQ ID NO：156)、CDR2(SEQ ID NO：157)和CDR3(SEQ ID NO：158)序列相同的氨基酸序列。
可选地，所述结合到FR-α的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO：159相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：163相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：159至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：159的CDR1(SEQ ID NO：160)、CDR2(SEQ ID NO：161)和CDR3(SEQ ID NO：162)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：163至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：163的CDR1(SEQ ID NO：164)、CDR2(SEQ ID NO：165)和CDR3(SEQ ID NO：166)序列相同的氨基酸序列。
可选地，所述结合到FR-α的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQ ID NO：167相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：171相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：167至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：167的CDR1(SEQ ID NO：168)、CDR2(SEQ ID NO：169)和CDR3(SEQ ID NO：170)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：171至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：171的CDR1(SEQ ID NO：172)、CDR2(SEQ ID NO：173)和CDR3(SEQ ID NO：174)序列相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述结合到GPC3的第二抗原结合位点可以任选地包含与SEQID NO：177相关的重链可变结构域和与SEQ ID NO：181相关的轻链可变结构域。例如，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域可以与SEQ ID NO：177至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：177的CDR1(SEQ ID NO：178)、CDR2(SEQ ID NO：179)和CDR3(SEQ ID NO：180)序列相同的氨基酸序列。同样地，所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域可以与SEQ ID NO：181至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性，和/或包含与SEQ ID NO：181的CDR1(SEQ ID NO：182)、CDR2(SEQ ID NO：183)和CDR3(SEQ IDNO：184)序列相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第二抗原结合位点包含具有与所述第一抗原结合位点中存在的轻链可变结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在某些实施方式中，所述蛋白质包含抗体Fc结构域的足以结合CD16的部分，其中所述抗体Fc结构域包含铰链和CH2结构域，和/或与人类IgG抗体的第234-332位氨基酸序列至少90％同一性的氨基酸序列。
还提供了含有本文中描述的蛋白质中的任一者的剂型，含有表达所述蛋白质的一种或多种核酸的细胞，以及使用所述蛋白质增加肿瘤细胞死亡的方法。
本发明的另一方面提供了一种在患者中治疗癌症的方法。所述方法包括向需要的患者施用治疗有效量的本文描述的多特异性结合蛋白。使用靶向5T4的多特异性结合蛋白治疗的癌症包括表达5T4的任何癌症，例如结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、肾癌和胃癌。使用靶向GPNMB的多特异性结合蛋白治疗的癌症包括表达GPNMB的任何癌症，例如黑素瘤、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、骨肉瘤、神经胶质瘤和成胶质细胞瘤。使用靶向FR-α的多特异性结合蛋白治疗的癌症包括表达FR-α的任何癌症，例如卵巢癌、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、肺腺癌和上皮起源的肿瘤。使用靶向PAPP-A的多特异性结合蛋白治疗的癌症包括表达PAPP-A的任何癌症，例如肺癌、乳腺癌、卵巢癌和尤文氏肉瘤。使用靶向GPC3的多特异性结合蛋白治疗的癌症包括表达GPC3的任何癌症，例如肝细胞癌、黑素瘤、威尔姆氏瘤、卵黄囊瘤、卵巢透明细胞癌、胃癌和食道癌。
附图说明
图1是一种异二聚体多特异性抗体的图示。每个臂可以代表NKG2D结合结构域或用于5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A或GPC3的结合结构域。在某些实施方式中，所述NKG2D和抗原结合结构域可以享有共同轻链。
图2是一种异二聚体多特异性抗体的图示。所述NKG2D结合结构域或5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A或GPC3的结合结构域中的任一者可以采取scFv格式(右臂)。
图3是通过ELISA测定显示的NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对人类重组NKG2D的结合亲和力的线图。
图4是通过ELISA测定显示的NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对食蟹猴重组NKG2D的结合亲和力的线图。
图5是通过ELISA测定显示的NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对小鼠重组NKG2D的结合亲和力的线图。
图6是通过流式细胞术显示的NKG2D结合结构域(作为克隆列出)与表达人类NKG2D的EL4细胞的结合的柱状图，示出了平均荧光强度(MFI)与背景相比的倍数(FOB)。
图7是通过流式细胞术显示的NKG2D结合结构域(作为克隆列出)与表达小鼠NKG2D的EL4细胞的结合的柱状图，示出了平均荧光强度(MFI)与背景相比的倍数(FOB)。
图8是通过与天然配体ULBP-6的竞争显示的NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对重组人类NKG2D-Fc的特异性结合亲和力的线图。
图9是通过与天然配体MICA的竞争显示的NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对重组人类NKG2D-Fc的特异性结合亲和力的线图。
图10是通过与天然配体Rae-1δ的竞争显示的NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对重组小鼠NKG2D-Fc的特异性结合亲和力的线图。
图11是通过对表达人类NKG2D-CD3ζ融合蛋白的TNF-α阳性细胞百分率的定量测定显示的人类NKG2D被NKG2D结合结构域(作为克隆列出)激活的柱状图。
图12是通过对表达人类NKG2D-CD3ζ融合蛋白的TNF-α阳性细胞百分率的定量测定显示的小鼠NKG2D被NKG2D结合结构域(作为克隆列出)激活的柱状图。
图13是显示出人类NK细胞被NKG2D结合结构域(作为克隆列出)激活的柱状图。
图14是显示出人类NK细胞被NKG2D结合结构域(作为克隆列出)激活的柱状图。
图15是显示出小鼠NK细胞被NKG2D结合结构域(作为克隆列出)激活的柱状图。
图16是显示出小鼠NK细胞被NKG2D结合结构域(作为克隆列出)激活的柱状图。
图17是显示了NKG2D结合结构域(作为克隆列出)对肿瘤细胞的细胞毒性效应的柱状图。
图18是显示了通过差示扫描荧光测定法测量的NKG2D结合结构域(作为克隆列出)的熔解温度的柱状图。
图19A-19C是NK细胞使用CD16和NKG2D结合的协同激活的柱状图。图19A显示了CD107a的水平；图19B显示了IFNγ的水平；图19C显示了CD107a和IFNγ的水平。上述附图表明平均值(n＝2)±SD。数据代表了使用5位不同健康供体的5个独立实验。
图20是采取双特异性抗体(Triomab)形式的TriNKET的图示，其是一种维持IgG样形状的三功能、双特异性抗体。该嵌合体由源自于两个亲本抗体的两个半抗体构成，各自具有一条轻链和一条重链。Triomab型可以是含有1/2的大鼠抗体和1/2的小鼠抗体的异二聚体构建体。
图21是采取KiH共同轻链(LC)形式的TriNKET的图示，其包含杵臼结构(KIH)技术。KiH是含有结合到靶1和2的2个Fab和通过异二聚化突变稳定化的FC的异二聚体。采取KiH格式的TriNKET可以是具有结合到靶1和靶2的2个Fab，含有2个不同重链和与两个重链配对的共同轻链的异二聚体构建体。
图22是采取双可变结构域免疫球蛋白(DVD-IgTM)形式的TriNKET的图示，其将两个单克隆抗体的靶结合结构域通过柔性的天然存在的连接物结合，并产生四价IgG样分子。DVD-IgTM是同二聚体构建体，其中靶向抗原2的可变结构域被融合到靶向抗原1的Fab的可变结构域的N端。构建体含有正常的Fc。
图23是采取正交Fab界面(Ortho-Fab)形式的TriNKET，其是含有结合到融合到Fc的靶1和靶2的2个Fab的异二聚体构建体。LC-HC配对通过正交界面来确保。异二聚化通过Fc中的突变来确保。
图24是采取二合一Ig格式的TriNKET的图示。
图25是采取ES形式的TriNKET的图示，其是含有结合到融合到Fc的靶1和靶2的2个不同Fab的异二聚体构建体。异二聚化通过Fc中的静电操控突变来确保。
图26是采取Fab臂交换形式的TriNKET的图示：通过将重链和附连的轻链(半分子)与来自于另一个分子的重链-轻链对交换来交换Fab臂以产生双特异性抗体的抗体。Fab臂交换形式(cFae)是含有结合到靶1和2的2个Fab和通过异二聚化突变稳定化的Fc的异二聚体。
图27是采取SEED体形式的TriNKET的图示，其是含有结合到靶1和2的2个Fab和通过异二聚化突变稳定化的Fc的异二聚体。
图28是采取LuZ-Y形式的TriNKET的图示，其中使用亮氨酸拉链来诱导两个不同HC的异二聚化。所述LuZ-Y形式是含有结合到融合到Fc的靶1和2的两个不同scFab的异二聚体。异二聚化通过融合到Fc的C-端的亮氨酸拉链基序来确保。
图29是采取Cov-X体形式的TriNKET的图示。
图30A-30B是采取κλ体形式的TriNKET的图示，其是具有融合到通过异二聚化突变稳定化的Fc的2个不同Fab的异二聚体构建体：靶向抗原1的Fab1含有κLC，而靶向抗原2的第二个Fab含有λLC。图30A是κλ体的一种形式的示例性图示；图30B是另一种κλ体的示例性图示。
图31是Oasc-Fab异二聚体构建体，其包括结合到融合到Fc的靶1的Fab和结合到靶2的scFab。异二聚化通过Fc中的突变来确保。
图32是DuetMab，其是含有结合到抗原1和2的2个不同Fab和通过异二聚化突变稳定化的Fc的异二聚体构建体。Fab 1和2含有不同的S-S桥，其确保正确的轻链(LC)和重链(HC)配对。
图33是CrossmAb，其是具有融合到通过异二聚化稳定化的Fc的结合到靶1和2的2个不同Fab的异二聚体构建体。CL和CH1结构域与VH和VL结构域被调换，例如CH1与VL内联融合，而CL与VH内联融合。
图34是Fit-Ig，其是一种同二聚体构建体，其中结合到抗原2的Fab被融合到结合到抗原1的Fab的HC的N端。所述构建体含有野生型Fc。
图35是示出了靶向5T4的TriNKET和5T4单克隆抗体(mAb)与表达在EL4细胞上的NKG2D的剂量依赖性结合的曲线。
图36是靶向5T4的TriNKET和5T4单克隆抗体(mAb)与表达在原代人类NK细胞上的NKG2D的结合曲线。
图37是示出了靶向5T4的TriNKET和5T4单克隆抗体(mAb)与表达在BxPC3人类胰腺癌细胞上的5T4的剂量依赖性结合的曲线。
图38是靶向5T4的TriNKET和5T4单克隆抗体(mAb)与表达在H146人类小细胞肺癌细胞上的5T4的结合曲线。
图39是靶向5T4的TriNKET和5T4单克隆抗体(mAb)与表达在H1975人类非小细胞肺癌细胞上的5T4的结合曲线。
图40是靶向5T4的TriNKET和5T4单克隆抗体(mAb)与表达在HCT116人类结肠癌细胞上的5T4的结合曲线。
图41是靶向5T4的TriNKET和5T4单克隆抗体(mAb)与表达在MCF7人类乳腺癌细胞上的5T4的结合曲线。
图42是示出了靶向5T4的TriNKET和5T4单克隆抗体(mAb)与表达在N87人类胃癌细胞上的5T4的剂量依赖性结合的结合曲线。
图43A和图43B是示出了TriNKET与亲本抗5T4单克隆抗体相比介导NK细胞对表达5T4的H1975人类非小细胞肺癌细胞的更高水平的细胞毒性的柱状图。在图43A中使用6.7μg/ml的TriNKET或单克隆抗体。在图43B中使用20μg/ml的TriNKET或单克隆抗体。效应细胞与靶细胞比例为10∶1。
图44是示出了TriNKET与亲本抗5T4单克隆抗体相比介导NK细胞对表达5T4的MCF7人类乳腺癌细胞的更高水平的细胞毒性的曲线。效应细胞与靶细胞比例为10∶1。
图45A和图45B是示出了TriNKET与亲本抗5T4单克隆抗体相比介导NK细胞对表达5T4的N87人类胃癌细胞的更高水平的细胞毒性的柱状图。使用6.7μg/ml的TriNKET或单克隆抗体。效应细胞与靶细胞比例为10∶1。对于图45A和图45B中的实验来说，利用了源自于不同健康供体的NK细胞。
图46是示出了TriNKET与亲本抗5T4单克隆抗体相比介导NK细胞对表达5T4的HCT116人类结肠癌细胞的更高水平的细胞毒性的剂量响应曲线。效应细胞与靶细胞比例为10∶1。
详细描述
本发明提供了结合自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以及选自5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的肿瘤相关抗原的多特异性结合蛋白。在某些实施方式中，所述多特异性蛋白还包括结合肿瘤相关抗原的另外的抗原结合位点。本发明还提供了包含这些多特异性结合蛋白的药物组合物，以及使用这些多特异性蛋白和药物组合物用于例如治疗癌症目的的治疗方法。本发明的各个不同方面在下文分章节阐述；然而，在一个特定章节中描述的本发明的方面不应限于任何特定章节。
为了便于本发明的理解，下文定义了许多术语和短语。
当在本文中使用时，没有具体数目的指称意味着“一个或多个”，并包括复数指称物，除非上下文不适合。
当在本文中使用时，术语“抗原结合位点”是指免疫球蛋白分子的参与抗原结合的部分。在人类抗体中，抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N-端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。所述重链和轻链的V区内的三个高度趋异的区段被称为“高变区”，它们插入在被称为“构架区”或“FR”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在人类抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此配置，以形成抗原结合表面。所述抗原结合表面与被结合的抗原的三维表面互补，并且每个重链和轻链的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。在某些动物例如骆驼和软骨鱼中，抗原结合位点由单一抗体链形成，提供了“单域抗体”。抗原结合位点可以存在于完整抗体中、抗体的保留了抗原结合表面的抗原结合片段中或重组多肽例如scFv中，所述scFv在单一多肽中使用肽连接物将重链可变结构域连接到轻链可变结构域。
当在本文中使用时，术语“肿瘤相关抗原”意味着与癌症相关的任何抗原，包括但不限于蛋白质、糖蛋白、神经节苷脂、糖类、脂类。这些抗原可以表达在恶性细胞上或肿瘤微环境中，例如与肿瘤相关的血管、细胞外基质、间充质基质或免疫浸润物上。
当在本文中使用时，术语“受试者”和“患者”是指将要通过本文描述的方法和组合物治疗的生物体。这些生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠科、猿猴、马科、牛科、猪科、犬科、猫科动物等)，更优选地包括人类。
当在本文中使用时，术语“有效量”是指化合物(例如本发明的化合物)的足以实现有益或所需结果的量。有效量可以在一次或多次施用、施用或剂量中施用，并且不打算限于特定剂型或施用途径。当在本文中使用时，术语“治疗”包括导致病症、疾病、障碍等的改善的任何效应例如减轻、降低、调节、改善或消除或改善其症状。
当在本文中使用时，术语“药物组合物”是指活性药剂与惰性或有活性的载体的组合，使得所述组合物特别适合于体内或离体诊断或治疗用途。
当在本文中使用时，术语“可药用载体”是指任何标准的制药载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种不同类型的润湿剂。所述组合物也可以包括稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin，《Remington′s制药学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第15版，Mack Publ.Co.，Easton，PA[1975]。
当在本文中使用时，术语“可药用盐”是指本发明的化合物的任何制药上可接受的盐(例如酸或碱式盐)，其在施用到受试者后，能够提供本发明的化合物或其有活性的代谢物或残留物。正如本领域技术人员所知，本发明的化合物的“盐”可以源自于无机或有机酸和碱。示例性的酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、延胡索酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸例如草酸，尽管本身不是可药用的，但可用于制备在获得本发明的化合物及其可药用酸加成盐中可用作中间体的盐。
示例性的碱包括但不限于碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨和式NW4 +的化合物(其中W是C1-4烷基)等。
示例性的盐包括但不限于：乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐，柠檬酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊烷丙酸盐，二葡萄糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，延胡索酸盐，氟代庚酸盐，甘油磷酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，2-羟基乙磺酸盐，乳酸盐，马来酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，苯基丙酸盐，苦味酸盐，新戊酸盐，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，甲苯磺酸盐，十一烷酸盐等。盐的其他实例包括与适合的阳离子例如Na+、NH4 +和NW4 +(其中W是C1-4烷基)等化合的本发明的化合物的阴离子。
对治疗应用来说，设想的本发明的化合物的盐是可药用的。然而，不可药用的酸和碱的盐也可以在例如可药用化合物的制备或纯化中发现用途。
在整个本描述中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分时，或在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤时，设想了另外还存在基本上由所叙述的组分构成或由所叙述的组分构成的本发明的组合物，并且还存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本发明的过程和方法。
一般来说，除非另有规定，否则规定百分率的组成是以重量计的。此外，如果变量不伴有定义，则以所述变量的以前的定义为准。
I.蛋白质
本发明提供了结合到自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以及选自5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的肿瘤相关抗原的多特异性结合蛋白。所述多特异性结合蛋白在本文描述的药物组合物和治疗方法中有用。所述多特异性结合蛋白与自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体的结合增强了所述自然杀伤细胞对表达5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和/或GPC3抗原的肿瘤细胞的破坏的活性。所述多特异性结合蛋白与表达5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A或GPC3的细胞的结合将所述癌细胞带到所述自然杀伤细胞附近，促进了所述癌细胞被所述自然杀伤细胞的直接和间接破坏。一些示例性的多特异性结合蛋白的进一步描述在下文中提供。
所述多特异性结合蛋白的第一组分结合到表达NKG2D受体的细胞，其可以包括但不限于NK细胞、γδT细胞和CD8+αβT细胞。在结合NKG2D后，所述多特异性结合蛋白可以阻断天然配体例如ULBP6和MICA结合到NKG2D并激活NKG2D受体。
所述多特异性结合蛋白的第二组分结合到5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A或GPC3。表达5T4的细胞可以在例如结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、肾癌和胃癌中发现。表达GPNMB的细胞可以在例如黑素瘤、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、骨肉瘤、神经胶质瘤和成胶质细胞瘤中发现。表达FR-α的细胞可以在例如卵巢癌、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、肺腺癌和上皮起源的肿瘤中发现。表达PAPP-A的细胞可以在例如肺癌、乳腺癌、卵巢癌和尤文氏肉瘤中发现。表达GPC3的细胞可以在例如肝细胞癌、黑素瘤、威尔姆氏瘤、卵黄囊瘤、卵巢透明细胞癌、胃癌和食道癌中发现。
所述多特异性结合蛋白的第三组分结合到表达CD16的细胞，所述CD16是白细胞包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞和滤泡树突细胞的表面上的Fc受体。
本文中描述的多特异性结合蛋白可以采取各种不同的格式。例如，一种格式是异二聚体多特异性抗体，其包括第一免疫球蛋白重链、第一免疫球蛋白轻链、第二免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白轻链(图1)。所述第一免疫球蛋白重链包括第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域、第一重链可变结构域和任选的第一CH1重链结构域。所述第一免疫球蛋白轻链包括第一轻链可变结构域和第一轻链恒定结构域。所述第一免疫球蛋白轻链与所述第一免疫球蛋白重链一起，形成结合NKG2D的抗原结合位点。所述第二免疫球蛋白重链包含第二Fc(铰链-CH2-CH3)结构域、第二重链可变结构域和任选的第二CH1重链结构域。所述第二免疫球蛋白轻链包括第二轻链可变结构域和第二轻链恒定结构域。所述第二免疫球蛋白轻链与所述第二免疫球蛋白重链一起，形成结合5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A或GPC3的抗原结合位点。所述第一Fc结构域和第二Fc结构域一起能够结合到CD16(图1)。在某些实施方式中，所述第一免疫球蛋白轻链与所述第二免疫球蛋白轻链相同。
另一种示例性格式涉及一种异二聚体多特异性抗体，其包括第一免疫球蛋白重链、第二免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链(图2)。所述第一免疫球蛋白重链包括通过连接物或抗体铰链融合到单链可变片段(scFv)的第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域，所述scFv由配对并结合NKG2D或结合选自5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的抗原的重链可变结构域和轻链可变结构域构成。所述第二免疫球蛋白重链包括第二Fc(铰链-CH2-CH3)结构域、第二重链可变结构域和任选的CH1重链结构域。所述免疫球蛋白轻链包括轻链可变结构域和轻链恒定结构域。所述第二免疫球蛋白重链与所述免疫球蛋白轻链配对并结合到NKG2D或结合选自5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的肿瘤相关抗原。所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域一起能够结合到CD16(图2)。
一个或多个另外的结合基序，可以任选地通过连接物序列融合到所述恒定区CH3结构域的C-端。在某些实施方式中，所述抗原结合位点可以是单链或二硫键稳定的可变区(scFv)或可以形成四价或三价分子。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取三功能抗体形式，其是维持IgG样形状的三功能、双特异性抗体。这种嵌合体由源自于两个亲本抗体的两个半抗体构成，各自具有一条轻链和一条重链。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白是KiH共同轻链(LC)形式，其涉及杵臼结构(KIH)技术。所述KIH包括工程化的CH3结构域，以在每条重链中产生“杵”或“臼”来促进异二聚化。在“杵臼结构(KiH)”Fc技术背后的概念是通过将小残基用大体积的残基替换而在一个CH3结构域(CH3A)中引入“杵”(例如采取EU编号的T366WCH3A)。为了容纳所述“杵”，通过将最邻近所述杵的残基用较小的残基代替，在另一个CH3结构域(CH3B)上产生互补的“臼”表面(例如T366S/L368A/Y407VCH3B)。所述“臼”突变通过结构化指导的噬菌体筛选进行优化(Atwell S，Ridgway JB，Wells JA，Carter P.，使用噬菌体展示文库从同二聚体的结构域界面的重塑得到的稳定的异二聚体(Stable heterodimers from remodeling thedomain interface of a homodimer using a phage display library)，J Mol Biol(1997)270(1)：26-35)。KiH Fc变体的X-射线晶体结构(Elliott JM，Ultsch M，Lee J，TongR，Takeda K，Spiess C等，杵和臼非糖基化半抗体同二聚体的反平行构象由CH2-CH3疏水相互作用介导(Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction)，J MolBiol(2014)426(9)：1947-57；Mimoto F，Kadono S，Katada H，Igawa T，Kamikawa T，Hattori K等，对FcγR具有提高的亲和力的新的不对称工程化Fc变体的晶体结构(Crystalstructure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improvedaffinity for FcgammaRs)，Mol Immunol(2014)58(1)：132-8)证实了由CH3结构域间核心界面处的空间互补性驱动的疏水相互作用使异二聚化在热力学上有利，而杵-杵和臼-臼界面分别由于空间位阻和有利相互作用的破坏而不利于同二聚作用。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取双可变结构域免疫球蛋白(DVD-IgTM)形成，其通过柔性的天然存在的连接物将两个单克隆抗体的靶结合结构域合并，并得到四价IgG样分子。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取正交Fab界面(Ortho-Fab)形式。在ortho-Fab IgG方法中(Lewis SM，Wu X，Pustilnik A，Sereno A，Huang F，Rick HL等，通过正交Fab界面的基于结构的设计产生双特异性IgG抗体(Generation of bispecific IgGantibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface)，Nat.Biotechnol.(2014)32(2)：191-8)，基于结构的区域性设计在仅仅一个Fab中的LC和HCvH-CH1界面处引入互补突变，对另一个Fab没有做出任何改变。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取二合一Ig格式。在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取ES形式，其是含有结合到融合到Fc的靶1和靶2的2个不同Fab的异二聚体构建体。异二聚化通过所述Fc中的静电操控突变来确保。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取κλ体形式，其是具有融合到通过异二聚化突变稳定化的Fc的2个不同Fab的异二聚体构建体：靶向抗原1的Fab1含有κLC，而靶向抗原2的第二Fab含有λLC。图30A是一种形式的κλ体的示例性图示；图30B是另一种κλ体的示例性图示。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取Fab臂交换形式(通过将重链和附连的轻链(半分子)与来自于另一个分子的重链-轻链对交换来交换Fab臂以产生双特异性抗体的抗体)。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取SEED体形式(所述链交换工程化结构域(SEED)平台被设计成产生不对称且双特异性的抗体样分子，这种能力扩展了天然抗体的治疗性应用。这种蛋白质工程化平台是基于保守的CH3结构域内免疫球蛋白的结构相关的序列的交换。所述SEED设计允许高效产生AG/GA异二聚体，而不利于AG和GA SEED CH3结构域的同二聚作用。(Muda M.等，Protein Eng.Des.Sel.，2011，24(5)：447-54)。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取LuZ-Y形式，其中使用亮氨酸拉链来诱导两个不同HC的异二聚化(Wranik，BJ.等，J.Biol.Chem.(2012)，287：43331-9)。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取Cov-X体形式。在双特异性CovX体中，两个不同的肽使用支链氮杂环丁酮连接物联结在一起，并在温和条件下以位点特异性方式融合到支架抗体。所述抗体支架提供长的半衰期和Ig样分布，而所述药效团负责功能活性。所述药效团可以被化学优化或用其他药效团代替，以产生优化的或独特的双特异性抗体(Doppalapudi VR等，PNAS(2010)，107(52)；22611-22616)。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取Oasc-Fab异二聚体形式，其包括结合到融合到Fc的靶1的Fab和结合到靶2的scFab。异二聚化通过所述Fc中的突变来确保。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取DuetMab形式，其是含有结合到抗原1和2的2个不同Fab和通过异二聚化突变稳定化的Fc的异二聚体构建体。Fab 1和2含有不同的S-S桥，其确保正确的LC和HC配对。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取CrossmAb形式，其是具有融合到通过异二聚化稳定化的Fc的结合到靶1和2的2个不同Fab的异二聚体构建体。CL和CH1结构域与VH和VL结构域被调换，例如CH1与VL内联融合，而CL与VH内联融合。
在某些实施方式中，所述多特异性结合蛋白采取Fit-Ig形式，其是一种同二聚体构建体，其中结合到抗原2的Fab被融合到结合到抗原1的Fab的HC的N端。所述构建体含有野生型Fc。
表1列出了相组合可以结合到NKG2D的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。所述NKG2D结合结构域在它们对NKG2D的结合亲和力方面可以不同，然而它们都激活人类NKG2D和NK细胞。
Figure BPA0000284511690000261
Figure BPA0000284511690000271
Figure BPA0000284511690000281
Figure BPA0000284511690000291
Figure BPA0000284511690000301
Figure BPA0000284511690000311
Figure BPA0000284511690000321
Figure BPA0000284511690000331
Figure BPA0000284511690000341
Figure BPA0000284511690000351
Figure BPA0000284511690000361
可选地，由SEQ ID NO：101所表示的重链可变结构域可以与由SEQ ID NO：102所表示的轻链可变结构域配对，以形成如US 9,273,136中所示的可以结合到NKG2D的抗原结合位点。
SEQ ID NO：101
Figure BPA0000284511690000362
SEQ ID NO：102
Figure BPA0000284511690000363
可选地，由SEQ ID NO：103表示的重链可变结构域可以与由SEQ ID NO：104所表示的轻链可变结构域配对，以形成如US 7,879,985中所示的可以结合到NKG2D的抗原结合位点。
SEQ ID NO：103
Figure BPA0000284511690000371
SEQ ID NO：104
Figure BPA0000284511690000372
一方面，本公开提供了结合到自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以及抗原5T4的多特异性结合蛋白。表2列出了相组合可以结合到5T4的重链可变结构域和轻链可变结构域的一些示例性序列。
Figure BPA0000284511690000373
Figure BPA0000284511690000381
Figure BPA0000284511690000391
可选地，可以通过筛选与SEQ ID NO：133所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到5T4的新的抗原结合位点。
SEQ ID NO：133
Figure BPA0000284511690000392
Figure BPA0000284511690000401
一方面，本公开提供了结合到自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以及抗原GPNMB的多特异性结合蛋白。表3列出了相组合可以结合到GPNMB的重链可变结构域和轻链可变结构域的一些示例性肽序列。
Figure BPA0000284511690000402
Figure BPA0000284511690000411
可选地，可以通过筛选与SEQ ID NO：150所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到GPNMB的新的抗原结合位点。
SEQ ID NO：150
Figure BPA0000284511690000412
一方面，本公开提供了结合到自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以及抗原FR-α的多特异性结合蛋白。表4列出了相组合可以结合到FR-α的重链可变结构域和轻链可变结构域的一些示例性肽序列。
Figure BPA0000284511690000421
Figure BPA0000284511690000431
可选地，可以通过筛选与SEQ ID NO：175所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到FR-α的新的抗原结合位点。
SEQ ID NO：175
Figure BPA0000284511690000432
可以通过筛选与SEQ ID NO：176所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到PAPP-A的抗原结合位点。
SEQ ID NO：176
Figure BPA0000284511690000441
Figure BPA0000284511690000451
一方面，本公开提供了结合到自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以及抗原GPC3的多特异性结合蛋白。表5列出了相组合可以结合到GPC3的重链可变结构域和轻链可变结构域的一些示例性肽序列。
Figure BPA0000284511690000452
可选地，可以通过筛选与SEQ ID NO：185所定义的氨基酸序列的结合，来鉴定可以结合到GPC3的新的抗原结合位点。
SEQ ID NO：185
Figure BPA0000284511690000461
在所述Fc结构域内，CD16结合由所述铰链区和CH2结构域介导。例如，在人类IgG1内，与CD16的相互作用主要聚焦于氨基酸残基Asp265-Glu 269、Asn 297-Thr 299、Ala327-Ile 332、Leu 234-Ser 239和CH2结构域中的糖残基N-乙酰基-D-葡萄糖胺(参见Sondermann等，Nature，406(6793)：267-273)。在所述已知结构域的基础上，可以选择突变以提高或降低与CD16的结合亲和力，例如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面展示cDNA文库，或者可以在相互作用的已知三维结构的基础上设计突变。
异二聚体抗体重链的组装可以通过在同一细胞中表达两种不同抗体重链序列来实现，这可能导致每种抗体重链的同二聚体的组装以及异二聚体的组装。促进异二聚体的偏好性组装可以通过在每种抗体重链恒定区的CH3结构域中并入不同的突变来实现，如US13/494870、US16/028850、US11/533709、US12/875015、US13/289934、US14/773418、US12/811207、US13/866756、US14/647480和US14/830336中所示。例如，可以在人类IgG1的基础上在CH3结构域中制造突变，并在第一多肽和第二多肽内并入不同对的氨基酸替换，以允许这两条链选择性地彼此异二聚化。下面示出的氨基酸替换的位置都按照Kabat中的EU指数来编号。
在一种情形中，所述第一多肽中的氨基酸替换将原始氨基酸用选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)的较大氨基酸代替，并且所述第二多肽中的至少一个氨基酸替换将原始氨基酸用选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)的较小氨基酸代替，使得所述较大氨基酸替换(突起)契合到所述较小氨基酸替换(孔穴)的表面中。例如，一个多肽可以包含T366W替换，并且另一个多肽可以包含三个替换，包括T366S、L368A和Y407V。
本发明的抗体重链可变结构域可以被任选地偶联到与抗体恒定区、例如包括铰链、CH2和CH3结构域并含有或不含CH1结构域的IgG恒定区至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述恒定区的氨基酸序列与人类抗体恒定区例如人类IgG1恒定区、IgG2恒定区、IgG3恒定区或IgG4恒定区至少90％同一性。在某些其他实施方式中，所述恒定区的氨基酸序列与来自于另一种哺乳动物例如兔、狗、猫、小鼠或马的抗体恒定区至少90％同一性。与人类IgG1恒定区相比可以在所述恒定区内并入一个或多个突变，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和/或K439处。示例性的替换包括例如Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E。
在某些实施方式中，可以并入到人类IgG1恒定区的CH1中的突变可以在氨基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171和/或V173处。在某些实施方式中，可以并入到人类IgG1恒定区的Cκ中的突变可以在氨基酸E123、F116、S176、V163、S174和/或T164处。
可选地，氨基酸替换可以选自下面表6中示出的成组替换。
表6
第一多肽 第二多肽
组1 S364E/F405A Y349K/T394F
组2 S364H/D401K Y349T/T411E
组3 S364H/T394F Y349T/F405A
组4 S364E/T394F Y349K/F405A
组5 S364E/T411E Y349K/D401K
组6 S364D/T394F Y349K/F405A
组7 S364H/F405A Y349T/T394F
组8 S364K/E357Q L368D/K370S
组9 L368D/K370S S364K
组10 L368E/K370S S364K
组11 K360E/Q362E D401K
组12 L368D/K370S S364K/E357L
组13 K370S S364K/E357Q
组14 F405L K409R
组15 K409R F405L
可选地，氨基酸替换可以选自下面表7中示出的成组替换。
Figure BPA0000284511690000481
Figure BPA0000284511690000491
可选地，氨基酸替换可以选自下面表8中示出的成组替换。
表8
第一多肽 第二多肽
组1 T366K/L351K L351D/L368E
组2 T366K/L351K L351D/Y349E
组3 T366K/L351K L351D/Y349D
组4 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E
组5 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E
组6 E356K/D399K K392D/K409D
可选地，每条多肽链中的至少一个氨基酸替换可以选自表9。
Figure BPA0000284511690000492
可选地，至少一个氨基酸替换可以选自下面表10中的成组替换，其中在所述第一多肽列中标注的位置被任何已知的带负电荷的氨基酸代替，并且在所述第二多肽列中标注的位置被任何已知的带正电荷的氨基酸代替。
Figure BPA0000284511690000493
Figure BPA0000284511690000501
可选地，至少一个氨基酸替换可以选自下面表11中的成组替换，其中在所述第一多肽列中标注的位置被任何已知的带正电荷的氨基酸代替，并且在所述第二多肽列中标注的位置被任何已知的带负电荷的氨基酸代替。
表11
第一多肽 第二多肽
D399，E356或E357 K409，K439，K370或K392
可选地，氨基酸替换可以选自下面表12中的成组替换。
表12
第一多肽 第二多肽
T350V，L351Y，F405A和Y407V T350V，T366L，K392L和T394W
可选地或另外地，异多聚体蛋白的结构稳定性可以通过在所述第一或第二多肽链任一者上引入S354C并在相对的多肽链上引入Y349C来提高，所述突变在所述两个多肽的界面内形成人造二硫桥。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在T366位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自T366、L368和Y407的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自T366、L368和Y407的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在T366位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自L351、D399、S400和Y407的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自T366、N390、K392、K409和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自T366、N390、K392、K409和T411的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自L351、D399、S400和Y407的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自Q347、Y349、K360和K409的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自Q347、E357、D399和F405的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自Q347、E357、D399和F405的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、K360、Q347和K409的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自K370、K392、K409和K439的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自D356、E357和D399的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自D356、E357和D399的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自K370、K392、K409和K439的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自L351、E356、T366和D399的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、L351、L368、K392和K409的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列在选自Y349、L351、L368、K392和K409的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列在选自L351、E356、T366和D399的一个或多个位置处不同于IgG1恒定区的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于S354C替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于Y349C替换。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于Y349C替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于S354C替换。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于K360E和K409W替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于O347R、D399V和F405T替换。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于O347R、D399V和F405T替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于K360E和K409W替换。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T366W替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T366S、T368A和Y407V替换。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T366S、T368A和Y407V替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T366W替换。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T350V、L351Y、F405A和Y407V替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T350V、T366L、K392L和T394W替换。
在某些实施方式中，所述抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T350V、T366L、K392L和T394W替换，并且其中所述抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列的差异在于T350V、L351Y、F405A和Y407V替换。
上述的多特异性蛋白可以使用本领域技术人员公知的重组DNA技术来制造。例如，可以将编码所述第一免疫球蛋白重链的第一核酸序列克隆到第一表达载体中；可以将编码所述第二免疫球蛋白重链的第二核酸序列克隆到第二表达载体中；可以将编码所述免疫球蛋白轻链的第三核酸序列克隆到第三表达载体中；并且可以将所述第一、第二和第三表达载体一起稳定转染到宿主细胞中，以产生所述多聚体蛋白。
为了获得所述多特异性蛋白的最高产量，可以探索所述第一、第二和第三表达载体的不同比率，以确定用于转染到所述宿主细胞中的最佳比率。在转染后，可以使用本领域中已知的方法例如有限稀释法、ELISA、FACS、显微术或Clonepix来分离单一克隆，用于细胞库产生。
可以将克隆在适合于生物反应器规模放大的条件下培养，并维持所述多特异性蛋白的表达。所述多特异性蛋白可以使用本领域中已知的方法包括离心、深度过滤、细胞裂解、匀浆、冻融、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用交换层析和混合模式层析来分离和纯化。
II.多特异性蛋白的特征
本文描述的多特异性蛋白包括NKG2D结合位点、CD16结合位点和选自5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，所述多特异性蛋白结合到表达NKG2D和/或CD16的细胞例如NK细胞，并同时结合到表达任一上述抗原的肿瘤细胞。所述多特异性蛋白与NK细胞的结合能够提高所述NK细胞对所述癌细胞的破坏的活性。
在某些实施方式中，所述多特异性蛋白以与相应的亲本单克隆抗体相近的亲和力结合到选自5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，所述多特异性蛋白与对应的相应单克隆抗体相比在杀伤表达所述抗原的肿瘤细胞中更加有效。
在某些实施方式中，本文中描述的包括NKG2D结合位点和用于选自5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的肿瘤相关抗原的结合位点的多特异性蛋白，当与分别表达5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的细胞共培养时激活原代人类NK细胞。NK细胞激活以CD107a脱颗粒和IFN-γ细胞因子生产的增加为特征。此外，与对应的亲本单克隆抗体相比，在表达抗原5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A或GPC3的细胞存在下，所述多特异性蛋白可能显示出人类NK细胞的更高的激活。
在某些实施方式中，本文中描述的包括NKG2D结合位点和用于选自5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的肿瘤相关抗原的结合位点的多特异性蛋白，提高与分别表达5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的细胞共培养的静息和IL-2激活的人类NK细胞的活性。
在某些实施方式中，与结合到5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A或GPC3的相应亲本单克隆抗体相比，所述多特异性蛋白在介导对分别表达中和低水平的5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和GPC3的肿瘤细胞的NK细胞细胞毒性中提供优势。
III.治疗性应用
本发明提供了使用本文中描述的多特异性结合蛋白和/或本文中描述的药物组合物治疗癌症的方法。所述方法可用于治疗表达5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A和/或GPC3的各种不同的癌症。通过靶向5T4的多特异性结合蛋白治疗的示例性癌症可以是结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、肾癌或胃癌。通过靶向GPNMB的多特异性结合蛋白治疗的示例性癌症可以是黑素瘤、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、骨肉瘤、神经胶质瘤或成胶质细胞瘤。通过靶向FR-α的多特异性结合蛋白治疗的示例性癌症可以是恶性黑素瘤、前列腺癌、慢性成淋巴细胞性白血病、血液恶性肿瘤、卵巢癌、三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌或结肠直肠癌。通过靶向PAPP-A的多特异性结合蛋白治疗的示例性癌症可以是卵巢癌、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、肺腺癌或上皮起源的肿瘤。通过靶向GPC3的多特异性结合蛋白治疗的示例性癌症可以是肝细胞癌、黑素瘤、威尔姆氏瘤、卵黄囊瘤、卵巢透明细胞癌、胃癌或食道癌。
在某些其他实施方式中，所述待治疗的癌症包括脑癌、直肠癌和子宫癌。在其他实施方式中，所述癌症是鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、肉瘤(例如血管肉瘤或软骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、胆管癌、甲状腺癌、肢端雀斑痣样黑素瘤、光化性角化病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、肛管癌、肛门癌、肛门直肠癌、星形胶质细胞瘤、巴氏腺癌、基底细胞癌、胆管癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺体癌、类癌瘤、胆管上皮癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓系白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊腺瘤、消化系统癌症、十二指肠癌、内分泌系统癌症、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、内皮细胞癌、室管膜癌、上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、眼和眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、胃窦癌、胃底癌、胃泌素瘤、成胶质细胞瘤、胰高血糖素瘤、心脏癌症、成血管细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝胆管癌、肝细胞癌、霍奇金氏病、回肠癌、胰岛细胞瘤、上皮内瘤变、上皮内鳞状细胞瘤变、肝内胆管癌、侵入性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、卡波斯肉瘤、盆腔癌、大细胞癌、大肠癌、平滑肌肉瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、恶性黑素瘤、恶性间皮肿瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移性癌、口腔癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌、神经系统癌症、神经上皮腺癌、结节性黑素瘤、非上皮性皮肤癌、非霍奇金氏淋巴瘤、燕麦细胞癌、少突神经胶质癌、口腔癌、骨肉瘤、浆液性乳头状腺癌、阴茎癌、舌咽癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌症、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、分泌生长抑素的肿瘤、脊椎癌、鳞状细胞癌、横纹肌癌、间皮下癌、浅表扩散性黑素瘤、T细胞白血病、舌癌、未分化癌、输尿管癌、尿道癌、尿道膀胱癌、泌尿系统癌症、宫颈癌、宫体癌、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、疣状癌、血管活性肠肽瘤、外阴癌、高分化癌或肾母细胞瘤。
在某些其他实施方式中，所述待治疗的癌症是非霍奇金氏淋巴瘤例如B-细胞淋巴瘤或T-细胞淋巴瘤。在某些实施方式中，所述非霍奇金氏淋巴瘤是B-细胞淋巴瘤，例如弥漫性大B-细胞淋巴瘤、原发性纵隔B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B-细胞淋巴瘤、淋巴结外边缘区B-细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B-细胞淋巴瘤、脾边缘区B-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病或原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤。在某些其他实施方式中，所述非霍奇金氏淋巴瘤是T-细胞淋巴瘤，例如前T淋巴母细胞淋巴瘤、外周T-细胞淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T-细胞淋巴瘤、淋巴结外自然杀伤细胞/T-细胞淋巴瘤、肠病型T-细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T-细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤或外周T-细胞淋巴瘤。
IV.组合疗法
本发明的另一方面提供了组合疗法。本文描述的多特异性结合蛋白可以与其他治疗剂组合使用以治疗癌症。
可以在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的示例性治疗剂包括例如放射线、丝裂霉素、维甲酸、盐酸苯达莫司汀(ribomustin)、吉西他滨、长春新碱、依托泊苷、克拉屈滨、二溴甘露醇、甲氨蝶呤、多柔比星、卡波醌、喷司他丁、硝基可润、净司他丁、西曲瑞克、来曲唑、雷替曲塞、柔红霉素、法倔唑、福莫司汀、胸腺法新、索布佐生、奈达铂、阿糖胞苷、比卡鲁胺、长春瑞滨、维司力农、氨鲁米特、安吖啶、丙谷胺、依利醋铵、酮色林、去氧氟尿苷、依曲替酯、异维甲酸、链脲佐菌素、尼莫司汀、长春地辛、氟他胺(flutamide)、氟他胺(drogenil)、布缩宫素、卡莫氟、雷佐生、西佐喃、卡铂、二溴卫矛醇、替加氟、异环磷酰胺、泼尼莫司汀、毕西巴尼、左旋咪唑、替尼泊苷、英丙舒凡、依诺他滨、麦角乙脲、羟甲烯龙、他莫昔芬、孕酮、美雄烷、环硫雄醇、福美司坦、干扰素-α、干扰素-2α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子-1、集落刺激因子-2、地尼白介素、白介素-2、黄体生成激素释放因子和上述药剂的可能表现出对同源受体的差异结合和增加或减少的血清半衰期的变化形式。
可以在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的另一类药剂是免疫检查点抑制剂。示例性的免疫检查点抑制剂包括抑制下述一者或多者的药剂：(i)细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，(ii)程序化细胞死亡蛋白1(PD1)，(iii)PDL1，(iv)LAG3，(v)B7-H3，(vi)B7-H4，和(vii)TIM3。CTLA4抑制剂伊匹单抗已被美国食品和药品监督管理局(United StatesFood and Drug Administration)批准用于治疗黑素瘤。
可以在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的另一类药剂是靶向非检查点靶的单克隆抗体(例如赫赛汀)和非细胞毒性药剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)。
另一类抗癌药剂包括例如：(i)选自ALK抑制剂、ATR抑制剂、A2A拮抗剂、碱基切除修复抑制剂、Bcr-Ab1酪氨酸激酶抑制剂、Bruton′s酪氨酸激酶抑制剂、CDC7抑制剂、CHK1抑制剂、周期蛋白依赖性激酶抑制剂、DNA-PK抑制剂、DNA-PK和mTOR两者的抑制剂、DNMT1抑制剂、DNMT1抑制剂加2-氯-脱氧腺苷、HDAC抑制剂、Hedgehog信号传导途径抑制剂、IDO抑制剂、JAK抑制剂、mTOR抑制剂、MEK抑制剂、MELK抑制剂、MTH1抑制剂、PARP抑制剂、磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂、PARP1和DHODH两者的抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶-II抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、VEGFR抑制剂和WEE1抑制剂的抑制剂；(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS的激动剂；和(iii)选自IL-12、IL-15、GM-CSF和G-CSF的细胞因子。
本发明的蛋白质也可用作原发性病灶的手术去除的辅助物。
为了实现所需的组合治疗效果，可以选择多特异性结合蛋白和其他治疗剂的量和施用的相对时间安排。例如，当向需要这种施用的患者施用组合疗法时，所述组合的治疗剂或包含所述治疗剂的一种或多种药物组合物可以以任何顺序施用，例如顺序、并行、一起、同时施用等。此外，例如，多特异性结合蛋白可以在所述其他治疗剂发挥其预防或治疗效果的时间内施用，或与之相反。
V.药物组合物
本发明还描述了含有治疗有效量的本文中描述的蛋白质的药物组合物。所述组合物可以被配制成用于各种不同的药物递送系统。对于适合的剂型来说，一种或多种生理上可接受的赋形剂或载体也可以包含在所述组合物中。适合在本公开中使用的剂型参见《Remington′s制药学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publi shingCompany，Philadelphia，Pa.，17th ed.，1985)。对于用于药物递送的方法的简要综述，参见例如Langer(Science 249：1527-1533，1990)。
本公开的静脉内药物递送剂型可以包含在袋子、笔或注射器中。在某些实施方式中，所述袋子可以被连接到包含管和/或针头的通道。在某些实施方式中，所述剂型可以是冷冻干燥剂型或液体剂型。在某些实施方式中，所述剂型可以被冷冻干燥(冻干)并包含在约12-60个小瓶中。在某些实施方式中，所述剂型可以被冷冻干燥，并且可以将45mg所述冷冻干燥的剂型包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，可以将约40mg-约100mg所述冷冻干燥的剂型包含在一个小瓶中。在某些实施方式中，将来自于12、27或45个小瓶的冷冻干燥的剂型合并，以获得所述蛋白质在静脉内药物剂型中的治疗剂量。在某些实施方式中，所述剂型可以是液体剂型，并以约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶储存。在某些实施方式中，所述剂型可以是液体剂型并以约600mg/小瓶储存。在某些实施方式中，所述剂型可以是液体剂型并以约250mg/小瓶储存。
本公开的蛋白质可以以水性液体药物剂型的形式存在，其在形成剂型的缓冲溶液中包括治疗有效量的所述蛋白质。
这些组合物可以通过常规的灭菌技术灭菌，或者可以除菌过滤。得到的水性溶液可以原样包装以备使用，或者可以被冷冻干燥，所述冷冻干燥的制剂在施用之前与无菌水性载体合并。所述制剂的pH通常在3至11之间，更优选地在5至9之间或6至8之间，最优选地在7至8之间，例如7至7.5。所述得到的固体形式的组合物可以被包装在多个单一剂量单元中，各自含有固定量的上述一种或多种药剂。所述固体形式的组合物也可以以灵活的量包装在容器中。
在某些实施方式中，本公开提供了具有延长的储存期限的剂型，其包含本公开的蛋白质与甘露糖醇、单水柠檬酸、柠檬酸钠、二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、氯化钠、聚山梨醇酯80、水和氢氧化钠的组合。
在某些实施方式中，制备了一种水性剂型，其在pH缓冲的溶液中包含本公开的蛋白质。本发明的缓冲液可以具有约4至约8，例如约4.5至约6.0或约4.8至约5.5范围内的pH，或者可以具有约5.0至约5.2的pH。在上述pH之间的范围也打算作为本公开的一部分。例如，打算包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值范围。将pH控制在这个范围之内的缓冲剂的实例包括乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡萄糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。
在某些实施方式中，所述剂型包括含有柠檬酸盐和磷酸盐的缓冲系统，以将pH维持在约4至约8的范围内。在某些实施方式中，所述pH范围可以是约4.5至约6.0或约pH 4.8至约5.5，或在约5.0至约5.2的pH范围内。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括单水柠檬酸、柠檬酸钠、二水磷酸氢二钠和/或二水磷酸二氢钠。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括约1.3mg/ml柠檬酸(例如1.305mg/ml)、约0.3mg/ml柠檬酸钠(例如0.305mg/ml)、约1.5mg/ml二水磷酸氢二钠(例如1.53mg/ml)、约0.9mg/ml二水磷酸二氢钠(例如0.86)和约6.2mg/ml氯化钠(例如6.165mg/ml)。在某些实施方式中，所述缓冲系统包括1-1.5mg/ml柠檬酸、0.25至0.5mg/ml柠檬酸钠、1.25至1.75mg/ml二水磷酸氢二钠、0.7至1.1mg/ml二水磷酸二氢钠和6.0至6.4mg/ml氯化钠。在某些实施方式中，所述剂型的pH用氢氧化钠调节。
充当等渗剂并且可以使抗体稳定的多元醇，也可以包含在所述剂型中。所述多元醇以可能根据剂型的所需等渗性而变的量添加到所述剂型。在某些实施方式中，所述水性剂型可以是等渗的。添加的多元醇的量也可能根据所述多元醇的分子量而变。例如，与二糖(例如海藻糖)相比，可以添加较低量的单糖(例如甘露糖醇)。在某些实施方式中，可以在所述剂型中用作等渗剂的多元醇是甘露糖醇。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约5至约20mg/ml。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约7.5至15mg/ml。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约10-14mg/ml。在某些实施方式中，甘露糖醇的浓度可以是约12mg/ml。在某些实施方式中，多元醇山梨糖醇可以包含在所述剂型中。
也可以向所述剂型添加去污剂或表面活性剂。示例性的去污剂包括非离子型去污剂例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。添加的去污剂的量使得它减少所述配制的抗体的聚集和/或将所述剂型中颗粒物的形成降至最低和/或减少吸附。在某些实施方式中，所述剂型可以包含作为表面活性剂的聚山梨醇酯。在某些实施方式中，所述剂型可以含有去污剂聚山梨醇酯80或吐温80。吐温80是用于描述聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯的术语(参见Fiedler，Lexikon der Hifsstoffe，EditioCantor Verlag Aulendorf，4th ed.，1996)。在某些实施方式中，所述剂型可以含有约0.1mg/mL至约10mg/mL之间或约0.5mg/mL至约5mg/mL之间的聚山梨醇酯80。在某些实施方式中，可以在所述剂型中添加约0.1％聚山梨醇酯80。
在实施方式中，本公开的蛋白质产品被配制成液体剂型。所述液体剂型可以以10mg/mL的浓度存在于USP/Ph Eur I型50R小瓶中，用橡胶塞封闭并用铝制压合密封盖密封。所述橡胶塞可以由符合USP和Ph Eur的弹性体制成。在某些实施方式中，小瓶可以装填有61.2mL所述蛋白质产品溶液，以便允许可抽出体积为60mL。在某些实施方式中，可以将所述液体剂型用0.9％盐水溶液稀释。
在某些实施方式中，来自于本公开的蛋白质的液体剂型可以被制备成浓度为10mg/mL的溶液，并与稳定剂水平的糖相组合。在某些实施方式中，所述液体剂型可以在水性载体中制备。在某些实施方式中，稳定剂可以以不超过可能产生对静脉内施用来说不理想或不适合的黏度的量添加。在某些实施方式中，所述糖可以是二糖例如蔗糖。在某些实施方式中，所述液体剂型也可以包括一种或多种缓冲剂、表面活性剂和防腐剂。
在某些实施方式中，所述液体剂型的pH可以通过添加可药用酸和/或碱来设定。在某些实施方式中，所述可药用酸可以是盐酸。在某些实施方式中，所述碱可以是氢氧化钠。
除了聚集之外，脱酰胺是肽和蛋白质在发酵、收获/细胞澄清、纯化、药物物质/药物制品储存期间和样品分析期间可能发生的常见产品变异。脱酰胺是从蛋白质失去NH3，形成琥珀酰亚胺中间体，其可能经历水解。所述琥珀酰亚胺中间体引起母体肽的质量减少17道尔顿。随后的水解导致质量增加18道尔顿。由于在水性条件下不稳定，所述琥珀酰亚胺中间体的分离是困难的。因此，脱酰胺通常可检测为质量增加1道尔顿。天冬酰胺的脱酰胺产生天冬氨酸或异天冬氨酸。影响脱酰胺速率的参数包括pH、温度、溶剂介电常数、离子强度、一级序列、局部多肽构象和三级结构。在肽链中与Asn相邻的氨基酸残基影响脱酰胺速率。蛋白质序列中Asn之后的Gly和Ser导致对脱酰胺更高的敏感性。
在某些实施方式中，来自于本公开的蛋白质的液体剂型可以在防止所述蛋白质产品脱酰胺的pH和湿度条件下保存。
本文中感兴趣的水性载体是可药用(对于向人类施用来说安全且无毒)并且可用于制备液体剂型的水性载体。说明性载体包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。
防腐剂可以任选地添加到本发明的剂型以减少细菌作用。防腐剂的添加可以例如便于生产多次使用(多剂)剂型。
在特定情况下，例如当患者在医院中在移植后通过IV途径接受所有药物时，静脉内(IV)剂型可能是优选的施用途径。在某些实施方式中，在施用前将所述液体剂型用0.9％氯化钠溶液稀释。在某些实施方式中，所述稀释的注射用药物产品是等渗的，并适合于通过静脉内输注施用。
在某些实施方式中，盐或缓冲剂组分可以以10mM-200mM的量添加。所述盐和/或缓冲剂是可药用的，并源自于各种不同的已知酸(无机和有机酸)和“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是磷酸盐缓冲剂。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲剂，在所述情况下，钠、钾或铵离子可以充当平衡离子。
防腐剂可以任选地添加到本发明的剂型以减少细菌作用。防腐剂的添加可以例如便于生产多次使用(多剂)剂型。
本文中感兴趣的水性载体是可药用(对于向人类施用来说安全且无毒)并且可用于制备液体剂型的水性载体。说明性载体包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。
本公开的蛋白质可以以冷冻干燥剂型的形式存在，其包括所述蛋白质和冻干保护剂。所述冻干保护剂可以是糖例如二糖。在某些实施方式中，所述冻干保护剂可以是蔗糖或麦芽糖。所述冷冻干燥剂型也可以包括一种或多种缓冲剂、表面活性剂、增量剂和/或防腐剂。
可用于使所述冷冻干燥的药物制品稳定的蔗糖或麦芽糖的量可以是蛋白质与蔗糖或麦芽糖至少1∶2的重量比。在某些实施方式中，所述蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可以为1∶2至1∶5。
在某些实施方式中，在冷冻干燥之前，所述剂型的pH可以通过添加可药用酸和/或碱来设定。在某些实施方式中，所述可药用酸可以是盐酸。在某些实施方式中，所述可药用碱可以是氢氧化钠。
在冷冻干燥之前，含有本公开的蛋白质的溶液的pH可以被调整到6至8之间。在某些实施方式中，用于所述冷冻干燥的药物制品的pH范围可以是7至8。
在某些实施方式中，盐或缓冲剂组分可以以10mM-200mM的量添加。所述盐和/或缓冲剂是可药用的，并源自于各种不同的已知酸(无机和有机酸)和“成碱”金属或胺。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是磷酸盐缓冲剂。在某些实施方式中，所述缓冲剂可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲剂，在所述情况下，钠、钾或铵离子可以充当平衡离子。
在某些实施方式中，可以添加“增量剂”。“增量剂”是为冻干混合物增添质量并对冻干饼的物理结构有贡献(例如便于生产维持开放孔隙结构的基本上均匀的冻干饼)的化合物。说明性的增量剂包括甘露糖醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨糖醇。本发明的冷冻干燥剂型可以含有这些增量剂。
防腐剂可以任选地添加到本发明的剂型以减少细菌作用。防腐剂的添加可以例如便于生产多次使用(多剂)剂型。
在某些实施方式中，所述冷冻干燥的药物制品可以用水性载体构造。本文中感兴趣的水性载体是可药用(例如对于向人类施用来说安全且无毒)并且可用于在冷冻干燥后制备液体剂型的水性载体。说明性稀释剂包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。
在某些实施方式中，本公开的冷冻干燥的药物制品用USP级无菌注射用水(SWFI)或USP级0.9％氯化钠注射液重构。在重构期间，将所述冷冻干燥的粉剂溶解在溶液中。
在某些实施方式中，本公开的冷冻干燥的蛋白质产品构造到约4.5mL注射用水，并用0.9％盐水溶液(氯化钠溶液)稀释。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，以便获得对特定患者、组合物和施用方式来说有效实现所需治疗响应并且对所述患者无毒的活性成分的量。
具体剂量可以是对每位患者来说均一的剂量，例如50-5000mg蛋白质。或者，患者的剂量可以根据所述患者的大致的体重或表面积定制。确定适合剂量的其他因素可以包括待治疗或预防的疾病或病症、疾病的严重性、施用途径和患者的年龄、性别和医疗状况。确定用于治疗的适合剂量所必需的计算的进一步精化由本领域技术人员按常规进行，特别是根据本文中公开的剂量信息和测定法。所述剂量也可以通过使用用于确定使用剂量的已知测定法并联合适合的剂量响应数据来确定。当监测到疾病进展时，个体患者的剂量可以进行调整。可以测量患者中可靶向构建体或复合物的血液水平，以观察是否需要调整剂量来达到或维持有效浓度。可以使用药物基因组学来确定哪些可靶向构建体和/或复合物及其剂量最可能对给定个体有效(Schmitz等，Clinica Chimica Acta 308：43-53，2001；Steimer等，Clinica Chimica Acta 308：33-41，2001)。
一般来说，基于体重的剂量是每kg体重约0.01μg至约100mg，例如约0.01μg至约100mg/kg体重、约0.01μg至约50mg/kg体重、约0.01μg至约10mg/kg体重、约0.01μg至约1mg/kg体重、约0.01μg至约100μg/kg体重、约0.01μg至约50μg/kg体重、约0.01μg至约10μg/kg体重、约0.01μg至约1μg/kg体重、约0.01μg至约0.1μg/kg体重、约0.1μg至约100mg/kg体重、约0.1μg至约50mg/kg体重、约0.1μg至约10mg/kg体重、约0.1μg至约1mg/kg体重、约0.1μg至约100μg/kg体重、约0.1μg至约10μg/kg体重、约0.1μg至约1μg/kg体重、约1μg至约100mg/kg体重、约1μg至约50mg/kg体重、约1μg至约10mg/kg体重、约1μg至约1mg/kg体重、约1μg至约100μg/kg体重、约1μg至约50μg/kg体重、约1μg至约10μg/kg体重、约10μg至约100mg/kg体重、约10μg至约50mg/kg体重、约10μg至约10mg/kg体重、约10μg至约1mg/kg体重、约10μg至约100μg/kg体重、约10μg至约50μg/kg体重、约50μg至约100mg/kg体重、约50μg至约50mg/kg体重、约50μg至约10mg/kg体重、约50μg至约1mg/kg体重、约50μg至约100μg/kg体重、约100μg至约100mg/kg体重、约100μg至约50mg/kg体重、约100μg至约10mg/kg体重、约100μg至约1mg/kg体重、约1mg至约100mg/kg体重、约1mg至约50mg/kg体重、约1mg至约10mg/kg体重、约10mg至约100mg/kg体重、约10mg至约50mg/kg体重、约50mg至约100mg/kg体重。
药剂可以每日、每周、每月或每年施用一次或多次，或甚至每2至20年施用一次，本领域普通技术人员可以根据体液或组织中可靶向构建体或复合物的测量到的停留时间和浓度，容易地估算施用的重复率。本发明的施用可以是静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、胸膜内、鞘内、腔内、通过导管灌注或通过直接病灶内注射。这可以施用每日一次或多次、每周一次或多次、每月一次或多次或每年一次或多次。
上面的描述描述了本发明的多个方面和实施方式。本申请具体来说设想了所述方面和实施方式的所有组合和排列。
实施例
现在正一般性描述的本发明，通过下面的实施例将更容易被理解，包括所述实施例仅仅是出于说明本发明的某些方面和实施方式，并不打算限制本发明。
实施例1-NKG2D结合结构域结合到NKG2D
NKG2D结合结构域结合到纯化的重组NKG2D
将人类、小鼠或食蟹猴NKG2D胞外结构域(ectodomains)的核酸序列与编码人类IgG1 Fc结构域的核酸序列融合，并引入到哺乳动物细胞中进行表达。在纯化后，将NKG2D-Fc融合蛋白吸附到微孔板的孔。在用牛血清白蛋白阻断所述孔以防止非特异性结合后，对NKG2D结合结构域进行滴定并将其添加到预先吸附有NKG2D-Fc融合蛋白的孔。第一抗体结合使用偶联到辣根过氧化物酶并特异性识别人类κ轻链以避免Fc交叉反应性的第二抗体来检测。向所述孔添加辣根过氧化物酶的底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)以可视化结合信号，所述信号在450nM处测量并在540nM处校正。向每个孔添加NKG2D结合结构域克隆、同种型对照或阳性对照(包含选自SEQ ID NO：101-104的重链和轻链可变结构域，或可以在eBioscience获得的抗小鼠NKG2D抗体克隆MI-6和CX-5)。
所述同种型对照显示出与重组NKG2D-Fc蛋白极小的结合，而所述阳性对照最强结合到所述重组抗原。由所有克隆产生的NKG2D结合结构域都表现出跨人类、小鼠和食蟹猴重组NKG2D-Fc蛋白的结合，尽管在不同克隆之间具有不同的亲和力。总体来说，每种抗NKG2D克隆以相近的亲和力结合到人类(图3)和食蟹猴(图4)重组NKG2D-Fc，但结合到小鼠(图5)重组NKG2D-Fc的亲和力较低。
NKG2D结合结构域结合到表达NKG2D的细胞
对EL4小鼠淋巴瘤细胞系进行工程化改造，以表达人类或小鼠NKG2D-CD3ζ信号传导结构域嵌合抗原受体。将NKG2D结合克隆、同种型对照或阳性对照以100nM的浓度用于染色在所述EL4细胞上表达的细胞外NKG2D。抗体结合使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体来检测。细胞通过流式细胞术进行分析，并使用表达NKG2D的细胞与母体EL4细胞的平均荧光强度(MFI)的比较来计算高于背景的倍数(FOB)。
由所有克隆产生的NKG2D结合结构域都结合到表达人类和小鼠NKG2D的EL4细胞。阳性对照抗体(包含选自SEQ ID NO：101-104的重链和轻链可变结构域，或可以在eBioscience获得的抗小鼠NKG2D抗体克隆MI-6和CX-5)给出最好的FOB结合信号。在表达人类NKG2D(图6)和小鼠(图7)NKG2D的细胞之间，每种克隆的NKG2D结合亲和力相近。
实施例2-NKG2D结合结构域阻断天然配体结合到NKG2D
与ULBP-6的竞争
将重组人类NKG2D-Fc蛋白吸附到微孔板的孔，并将所述孔用牛血清白蛋白阻断以降低非特异性结合。向所述孔添加饱和浓度的ULBP-6-His-生物素，然后添加NKG2D结合结构域克隆。在温育2小时后，将孔清洗，并通过链亲合素偶联的辣根过氧化物酶和TMB底物检测仍结合于NKG2D-Fc包被的孔的ULBP-6-His-生物素。吸收值在450nM处测量并在540nM处校正。在减去背景后，从被阻断与孔中的NKG2D-Fc蛋白结合的ULBP-6-His-生物素的百分率，来计算NKG2D结合结构域与NKG2D-Fc蛋白的特异性结合。阳性对照抗体(包含选自SEQID NO：101-104的重链和轻链可变结构域)和各种不同的NKG2D结合结构域阻断ULBP-6结合到NKG2D，而同种型对照显示出很小的与ULBP-6的竞争(图8)。
ULBP-6序列由SEQ ID NO：108表示
Figure BPA0000284511690000681
与MICA的竞争
将重组人类MICA-Fc蛋白吸附到微孔板的孔，并将所述孔用牛血清白蛋白阻断以降低非特异性结合。向所述孔添加NKG2D-Fc-生物素，然后添加NKG2D结合结构域。在温育和清洗后，使用链亲合素-HRP和TMB底物检测仍结合于MICA-Fc包被的孔的NKG2D-Fc-生物素。吸收值在450nM处测量并在540nM处校正。在减去背景后，从被阻断与MICA-Fc包被的孔结合的NKG2D-Fc-生物素的百分率，来计算NKG2D结合结构域与NKG2D-Fc蛋白的特异性结合。阳性对照抗体(包含选自SEQ ID NO：101-104的重链和轻链可变结构域)和各种不同的NKG2D结合结构域阻断MICA结合到NKG2D，而同种型对照显示出很小的与MICA的竞争(图9)。
与Rae-1δ的竞争
将重组小鼠Rae-1δ-Fc(购自R&D Systems)吸附到微孔板的孔，并将所述孔用牛血清白蛋白阻断以降低非特异性结合。向所述孔添加小鼠NKG2D-Fc-生物素，然后添加NKG2D结合结构域。在温育和清洗后，使用链亲合素-HRP和TMB底物检测仍结合于Rae-1δ-Fc包被的孔的NKG2D-Fc-生物素。吸收值在450nM处测量并在540nM处校正。在减去背景后，从被阻断与Rae-1δ-Fc包被的孔结合的NKG2D-Fc-生物素的百分率，来计算NKG2D结合结构域与NKG2D-Fc蛋白的特异性结合。阳性对照(包含选自SEQ ID NO：101-104的重链和轻链可变结构域，或可以在eBioscience获得的抗小鼠NKG2D抗体克隆MI-6和CX-5)和各种不同的NKG2D结合结构域克隆阻断Rae-1δ结合到小鼠NKG2D，而同种型对照抗体显示出很小的与Rae-1δ的竞争(图10)。
实施例3-NKG2D结合结构域克隆激活NKG2D
将人类和小鼠NKG2D的核酸序列融合到编码CD3ζ信号传导结构域的核酸序列以获得嵌合抗原受体(CAR)构建体。然后将所述NKG2D-CAR构建体使用Gibson组装克隆到反转录病毒载体中，并转染到expi293细胞中用于反转录病毒生产。将EL4细胞用含有NKG2D-CAR的病毒与8μg/mL聚凝胺一起感染。感染后24小时，通过流式细胞术分析所述EL4细胞中NKG2D-CAR的表达水平，并选择在细胞表面上表达高水平NKG2D-CAR的克隆。
为了确定NKG2D结合结构域是否激活NKG2D，将它们吸附到微孔板的孔，并将NKG2D-CAR EL4细胞在布雷菲德菌素-A和莫能菌素存在下在抗体片段包被的孔上培养4小时。通过流式细胞术测定细胞内TNF-α生产这种NKG2D激活的指示。将TNF-α阳性细胞归一化到用阳性对照处理的细胞。所有NKG2D结合结构域激活人类NKG2D(图11)和小鼠NKG2D(图12)两者。
实施例4-NKG2D结合结构域激活NK细胞
原代人类NK细胞
使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。使用磁珠负选择从PBMC分离NK细胞(CD3-CD56+)，分离到的NK细胞的纯度通常＞95％。然后将分离的NK细胞在含有100ng/mL IL-2的培养基中培养24-48小时，然后将它们转移到吸附有NKG2D结合结构域的微孔板孔，并在含有荧光团偶联的抗CD107a抗体、布雷菲德菌素-A和莫能菌素的培养基中培养。在培养后，使用荧光团偶联的针对CD3、CD56和IFN-γ的抗体通过流式细胞术测定NK细胞。在CD3-CD56+细胞中分析CD107a和IFN-γ染色，以评估NK细胞激活。CD107a/IFN-γ双阳性细胞的增加指示了通过接合两个激活受体而不是一个受体的更好的NK细胞激活。NKG2D结合结构域和阳性对照(例如由SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：103表示的重链可变结构域，和由SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：104表示的轻链可变结构域)与同种型对照相比显示出变成CD107a+和IFN-γ+的NK细胞的百分率更高(图13和图14代表了来自于两个独立实验的数据，其各自使用不同供体的PBMC用于NK细胞制备)。
原代小鼠NK细胞
从C57B1/6小鼠获得脾脏并将其通过70μm细胞筛压碎，以获得单细胞悬液。将细胞离心沉淀并重悬浮在ACK裂解缓冲液(购自Thermo Fisher Scientific#A1049201；155mM氯化铵，10mM碳酸氢钾，0.01mM EDTA)中，以除去红细胞。将剩余的细胞用100ng/mL人类IL-2(hIL-2)培养72小时，然后收获并准备用于NK细胞分离。然后用磁珠使用反向贫化技术从脾细胞分离NK细胞(CD3-NK1.1+)，通常纯度＞90％。将纯化的NK细胞在含有100ng/mL小鼠IL-15(mIL-15)的培养基中培养48小时，然后将它们转移到吸附有NKG2D结合结构域的微孔板孔，并在含有荧光团偶联的抗CD107a抗体、布雷菲德菌素-A和莫能菌素的培养基中培养。在NKG2D结合结构域包被的孔中培养后，使用荧光团偶联的针对CD3、NK1.1和IFN-γ的抗体通过流式细胞术测定NK细胞。在CD3-NK1.1+细胞中分析CD107a和IFN-γ染色，以评估NK细胞激活。CD107a/IFN-γ双阳性细胞的增加指示了通过接合两个激活受体而不是一个受体的更好的NK细胞激活。NKG2D结合结构域和阳性对照(选自可以在eBioscience获得的抗小鼠NKG2D抗体克隆MI-6和CX-5)与同种型对照相比显示出变成CD107a+和IFN-γ+的NK细胞的百分率更高(图15和图16代表了来自于两个独立实验的数据，其各自使用不同小鼠用于NK细胞制备)。
实施例5-NKG2D结合结构域能够引起对靶肿瘤细胞的细胞毒性
人类和小鼠原代NK细胞激活测定法显示了在与NKG2D结合结构域温育后NK细胞上的细胞毒性标志物增加。为了研究这是否转变成肿瘤细胞裂解的增加，利用了基于细胞的测定法，其中将每个NKG2D结合结构域开发成单特异性抗体。将Fc区用作一个靶向臂，而Fab区(NKG2D结合结构域)充当另一个靶向臂，以激活NK细胞。将人类起源并表达高水平Fc受体的THP-1细胞用作肿瘤靶，并使用Perkin Elmer DELFIA细胞毒性试剂盒。将THP-1细胞用BATDA试剂标记，并以105/mL重悬浮在培养基中。然后将标记的THP-1细胞与NKG2D抗体和分离的小鼠NK细胞在微孔板的孔中合并，在37℃下温育3小时。在温育后，取出20μL培养上清液，与200μL Europium溶液混合，并在暗处振摇温育15分钟。通过装备有时间分辨荧光模块(激发337nm，发射620nm)的PheraStar读板器随时间测量荧光，并按照试剂盒说明书计算特异性裂解。
阳性对照ULBP-6、即NKG2D的天然配体，显示出THP-1靶细胞被小鼠NK细胞的特异性裂解的增加。NKG2D抗体也增加了THP-1靶细胞的特异性裂解，而同种型对照抗体显示出特异性裂解的减少。虚线指示在不添加抗体的情况下THP-1细胞被小鼠NK细胞的特异性裂解(图17)。
实施例6-NKG2D抗体显示出高的热稳定性
使用差示扫描荧光测定法测定NKG2D结合结构域的熔解温度。外推的表观熔解温度相对于典型的IgG1抗体来说更高(图18)。
实施例7-人类NK细胞被交联的NKG2D和CD16的协同激活
原代人类NK细胞激活测定法
使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。使用负磁珠(StemCell#17955)从PBMC纯化NK细胞。通过流式细胞术确定NK细胞为＞90％CD3-CD56+。然后将分离的NK细胞在含有100ng/mL hIL-2(Peprotech#200-02)的培养基中扩增48小时，然后用于激活测定法中。将抗体以2μg/ml(抗CD16抗体，Biolegend#302013)和5μg/mL(抗NKG2D抗体，R&D#MAB139)的浓度，在100μL无菌PBS中在96孔平底板上在4℃包被过夜，然后充分清洗所述孔以除去过量抗体。为了评估脱颗粒，将IL-2激活的NK细胞以5×105个细胞/ml重悬浮在增补有100ng/mL人类IL-2(hIL2)和1μg/mL APC偶联的抗CD107a mAb(Biolegend#328619)的培养基中。然后将1×105个细胞/孔添加到抗体包被的板上。分别以1∶1000和1∶270的最终稀释度添加蛋白质转运抑制剂布雷菲德菌素A(BFA，Biolegend#420601)和莫能菌素(Biolegend#420701)。将铺板的孔在5％CO2中在37℃下温育4小时。对于IFN-γ的细胞内染色来说，将NK细胞用抗CD3抗体(Biolegend#300452)和抗CD56mAb(Biolegend#318328)标记，然后固定并通透化，并用抗IFN-γmAb(Biolegend#506507)标记。在对活的CD56+CD3-细胞进行门选后，通过流式细胞术分析NK细胞的CD107a和IFN-γ表达。
为了调查受体组合的相对效能，通过板结合刺激进行了NKG2D或CD16的交联和两种受体的共同交联。如图19(图19A-19C)中所示，CD16和NKG2D的组合刺激产生大大提高的CD107a水平(脱颗粒)(图19A)和/或IFN-γ生产(图19B)。虚线表示每种受体的单独刺激的累加效应。
在用抗CD16抗体、抗NKG2D抗体或两种单克隆抗体的组合进行4小时的板结合刺激后，分析IL-2激活的NK细胞的CD107a水平和细胞内IFN-γ生产。图指示了平均值(n＝2)±SD。图19A显示了CD107a的水平；图19B显示了IFNγ的水平；图19C显示了CD107a和IFNγ的水平。图19A-19C中示出的数据代表了使用5位不同健康供体的5个独立实验。
实施例8-TriNKET结合到人类NKG2D
使用原代人类NK细胞和工程化改造以表达人类NKG2D的EL4小鼠淋巴瘤细胞系来试验三特异性结合蛋白(TriNKET)与NKG2D的结合亲和力。如图1中所示，试验的每种TriNKET含有NKG2D结合结构域、肿瘤相关抗原结合结构域(例如5T4结合结构域)和结合到CD16的Fc结构域。将TriNKET稀释到20μg/mL，然后连续稀释。TriNKET或亲本抗5T4单克隆抗体与NKG2D的结合使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体来检测。细胞通过流式细胞术进行分析，并通过将平均荧光强度(MFI)归一化到人类重组IgG1染色对照，来计算高于背景的倍数(FOB)。
试验的抗5T4单克隆抗体包括5T4R(包含SEQ ID NO：200-207)和5T4A(包含SEQ IDNO：192-199)。试验的TriNKET包括A49-TriNKET-5T4R，其包括来自于5T4R单克隆抗体的5T4结合结构域和来自于克隆ADI-27749的NKG2D结合结构域；以及A49-TriNKET-5T4A，其包括来自于5T4A单克隆抗体的5T4结合结构域和来自于克隆ADI-27749的NKG2D结合结构域。图35示出了各自包括5T4结合结构域和不同NKG2D结合结构域的TriNKET以剂量依赖性方式结合到EL4细胞上的NKG2D。图36示出了TriNKET以剂量依赖性方式结合到原代人类NK细胞上的NKG2D，而抗5T4单克隆抗体5T4R和5T4A不结合。
实施例9-TriNKET与细胞表达的人类癌抗原的结合的评估
使用表达肿瘤相关的5T4抗原的人类癌细胞系(BxPC3、H146、H1975、HCT116、MCF7和N87)来测定靶向5T4的TriNKET与所述抗原的结合。在分开的实验中，将TriNKET或亲本抗5T4单克隆抗体与每种所述细胞系温育，并使用荧光团偶联的抗人类IgG第二抗体检测TriNKET或抗5T4单克隆抗体与所述细胞的结合。使用流式细胞术来分析TriNKET或抗5T4单克隆抗体与所述细胞的结合，并通过将平均荧光强度(MFI)归一化到人类重组IgG1染色对照，来计算高于背景的倍数(FOB)。
A49-TriNKET-5T4R和A49-TriNKET-5T4A两者都结合到表达在BxPC3人类胰腺癌细胞(图37)、H146人类小细胞肺癌(图38)、H1975非小细胞肺癌细胞(图39)、HCT116人类结肠癌细胞(图40)、MCF7人类乳腺癌细胞(图41)和N87人类胃癌细胞(图42)上的5T4。
所述结果证实，与亲本抗5T4R单克隆抗体相比，A49-TriNKET-5T4R显示出更高的最大结合和结合亲和力。对照TriNKET包含用于5T4之外的癌抗原的结合位点和来自于克隆ADI-27749的NKG2D结合结构域。
实施例10-TriNKET增强人类NK细胞对癌细胞的细胞毒性
为了试验在TriNKET存在下人类NK细胞裂解癌细胞的能力，使用了人类NK细胞系KHYG-1的细胞或原代NK细胞。
使用密度梯度离心从人类外周血血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMC)。使用磁珠负选择从PBMC分离NK细胞(CD3-CD56+)，分离到的NK细胞的纯度通常＞90％。将分离的NK细胞在没有细胞因子的情况下静息过夜，并在第二天将所述静息NK细胞用于细胞毒性测定法中。
将KHYG-1维持在含有10ng/mL细胞因子IL-2的10％HI-FBS-RPMI-1640中。在使用前一天从培养物收获KHYG-1细胞，洗掉含有IL-2细胞因子的培养基，并在没有IL-2细胞因子的情况下在10％HI-FBS-RPMI-1640中重悬浮过夜。
所有细胞毒性测定体系如下制备：从培养物收获表达感兴趣的靶的人类癌细胞系(例如5T4阳性癌细胞)，将细胞用PBS清洗，以106/mL重悬浮在生长培养基中，用于使用荧光增强配体(BATDA)试剂的乙酰氧基甲基酯(Perkin Elmer AD0116)标记。按照制造商的说明书标记所述靶细胞。在标记后，将细胞用PBS清洗3x，并以0.5-1.0×105/mL重悬浮在培养基中。为了制备背景孔，放置标记细胞的等分试样，并将细胞从培养基离心出来。小心地一式三份向孔添加100μL所述培养基，以避免扰动沉积的细胞。向96孔板的每个孔添加100μLBATDA标记的细胞。保留用于来自于靶细胞的自发释放的孔，并通过添加1％Triton-X制备用于靶细胞的最大裂解的孔。将针对感兴趣的肿瘤靶的单克隆抗体和TriNKET(例如A49-TriNKET-5T4R)在培养基中稀释，并向相应的孔添加50μL稀释的单克隆抗体和TriNKET。将KHYG-1细胞清洗，并根据10∶1的效应细胞与靶细胞的比例以105-2.0×106/mL重悬浮在培养基中。向每个板孔添加50μL NK细胞，以使总培养体积为200μL。在测定法显色之前将所述板在37℃和5％CO2下温育3-4小时。在培养3-4小时后，将板从温箱取出并通过以200g离心5分钟将细胞沉积。将20μL培养上清液转移到由制造商提供的清洁的微孔板，向每个孔添加200μL室温的europium溶液。将板避光并在摇板器上以250rpm温育15分钟。使用Victor 3或SpectraMax i3X仪器读板。特异性裂解的％如下计算：特异性裂解的％＝((实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放))*100％。
LDH释放细胞毒性测定法：
从培养物收获表达感兴趣的靶的人类癌细胞系，以5×103个细胞/孔的密度在96孔板中铺板，并在37℃和5％CO2下培养过夜。包含下述对照：用于确定培养基背景的无细胞对照，含有未处理的效应细胞的效应细胞自发LDH释放对照，含有未处理的靶细胞的靶细胞自发LDH释放对照，和在细胞毒性试剂之前添加裂解溶液的靶细胞最大LDH释放对照。将针对感兴趣的肿瘤靶的单克隆抗体或TriNKET在培养基中稀释，向相应的孔添加50μL稀释的mAb或TriNKET(例如A49-TriNKET-5T4R)。从培养物收获静息NK细胞，将细胞清洗，并根据所需的E∶T比例以105-2.0×106/mL重悬浮在培养基中。向每个板孔添加50μL NK细胞，以使总培养体积为200μL。在测定法显色之前将所述板在37℃和5％CO2下温育3-4小时。
在培养3-4小时后，将板从温箱取出并向每个孔添加50μL细胞毒性试剂。将板避光并在室温温育30分钟。向每个孔添加50μL终止溶液。使用Victor 3或SpectraMax i3X仪器读板以获得在490nm处的吸收值。特异性裂解的％如下计算：
特异性裂解的％＝(实验LDH释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)*100％
靶向5T4的TriNKET介导人类NK细胞对5T4阳性H1975非小细胞肺癌细胞的细胞毒性。如图43A-43B中所示，TriNKET与它们的亲本5T4单克隆抗体相比，介导更有效的靶癌细胞的杀伤。试验了两种不同浓度的TriNKET或5T4单克隆抗体。如图43A中所示，6.7μg/ml的TriNKET与6.7μg/ml的5T4抗体相比具有更高的特异性裂解百分率。如图43B中所示，20μg/ml的TriNKET与20μg/ml的5T4抗体相比具有更高的特异性裂解百分率。
靶向5T4的TriNKET介导人类NK细胞对5T4阳性MCF7人类乳腺癌细胞的细胞毒性。如图44中所示，TriNKET与它们的亲本5T4单克隆抗体相比，介导更有效的靶癌细胞的杀伤。
靶向5T4的TriNKET介导人类NK细胞对5T4阳性N87人类胃癌细胞的细胞毒性。如图45A和图45B中所示，6.7μg/ml的TriNKET与它们的亲本5T4单克隆抗体相比，介导更有效的靶癌细胞的杀伤。
靶向5T4的TriNKET介导人类NK细胞对5T4阳性HCT116人类结肠癌细胞的细胞毒性。如图46中所示，TriNKET与它们的亲本5T4单克隆抗体相比，更有效的介导靶癌细胞的杀伤。
通过参考并入
本文中提到的每个专利文献和科学论文的整个公开内容为所有目的通过参考并入本文。
等同性
本发明可以以其他特定形式体现而不背离其精神或本质特征。因此，前述实施方式应该在所有情况下被认为是说明性的而不是限制本文描述的发明。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是上面的描述指明，并且打算将进入权利要求书的意义和等同性范围之内的所有变化涵盖在其中。
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Claims (49)

1.一种蛋白质，其包含：
(a)结合NKG2D的第一抗原结合位点；
(b)结合5T4、GPNMB、FR-α、PAPP-A或GPC3的第二抗原结合位点；和
(c)抗体Fc结构域或其足以结合CD16的部分，或结合CD16的第三抗原结合位点。
2.权利要求1所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点结合到人类或非人类灵长动物中的NKG2D。
3.权利要求1或2所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其中所述重链可变结构域和轻链可变结构域存在于同一多肽上。
5.根据权利要求3或4所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域。
6.根据权利要求5所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点的重链可变结构域和轻链可变结构域存在于同一多肽上。
7.根据权利要求5或6所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点的轻链可变结构域具有与所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：93的氨基酸序列至少90％同一性的的重链可变结构域。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：41至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：42至少90％同一性的轻链可变结构域。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：49至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：50至少90％同一性的轻链可变结构域。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：57至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：58至少90％同一性的轻链可变结构域。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：59至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：60至少90％同一性的轻链可变结构域。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：61至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：62至少90％同一性的轻链可变结构域。
14.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：69至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：70至少90％同一性的轻链可变结构域。
15.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：77至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：78至少90％同一性的轻链可变结构域。
16.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：85至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：86至少90％同一性的轻链可变结构域。
17.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：93至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：94至少90％同一性的轻链可变结构域。
18.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：101至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：102至少90％同一性的轻链可变结构域。
19.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：103至少90％同一性的重链可变结构域和与SEQ ID NO：104至少90％同一性的轻链可变结构域。
20.权利要求1或2所述的蛋白质，其中所述第一抗原结合位点是单域抗体。
21.权利要求20所述的蛋白质，其中所述单域抗体是VHH片段或VNAR片段。
22.根据权利要求1-2或20-21中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域。
23.根据权利要求22所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点的重链可变结构域和轻链可变结构域存在于同一多肽上。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合5T4，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域包含与SEQ ID NO：109至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：113至少90％同一性的氨基酸序列。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合5T4，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域包含与SEQ ID NO：117至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：121至少90％同一性的氨基酸序列。
26.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合5T4，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域包含与SEQ ID NO：125至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：129至少90％同一性的氨基酸序列。
27.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合5T4，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域包含与SEQ ID NO：192至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：196至少90％同一性的氨基酸序列。
28.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合5T4，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域包含与SEQ ID NO：200至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：204至少90％同一性的氨基酸序列。
29.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合GPNMB，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域包含与SEQ ID NO：134至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：138至少90％同一性的氨基酸序列。
30.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合GPNMB，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域包含与SEQ ID NO：142至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：146至少90％同一性的氨基酸序列。
31.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合FR-α，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域包含与SEQ ID NO：151至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：155至少90％同一性的氨基酸序列。
32.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合FR-α，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域包含与SEQ ID NO：159至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：163至少90％同一性的氨基酸序列。
33.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合FR-α，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域包含与SEQ ID NO：167至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：171至少90％同一性的氨基酸序列。
34.根据权利要求1-23中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点结合GPC3，所述第二抗原结合位点的重链可变结构域包含与SEQ ID NO：177至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合位点的轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：181至少90％同一性的氨基酸序列。
35.根据权利要求1-4或8-21中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点是单域抗体。
36.权利要求35所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点是VHH片段或VNAR片段。
37.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含抗体Fc结构域的足以结合CD16的部分，其中所述抗体Fc结构域包含铰链和CH2结构域。
38.根据权利要求37所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域包含人类IgG1抗体的铰链和CH2结构域。
39.根据权利要求37或38所述的蛋白质，其中所述Fc结构域包含与人类IgG1抗体的第234-332位氨基酸至少90％同一性的氨基酸序列。
40.根据权利要求39所述的蛋白质，其中所述Fc结构域包含与人类IgG1的Fc结构域至少90％同一性的氨基酸序列，并在选自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、K439的一个或多个位置处有差异。
41.一种剂型，其包含根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质和可药用载体。
42.一种细胞，其包含表达根据权利要求1-40中任一项所述的蛋白质的一种或多种核酸。
43.一种增加肿瘤细胞死亡的方法，所述方法包括将肿瘤细胞和自然杀伤细胞暴露于有效量的根据权利要求1-40中任一项所述的蛋白质。
44.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患者施用有效量的根据权利要求1-40中任一项所述的蛋白质或根据权利要求41所述的剂型。
45.权利要求44所述的方法，其中所述蛋白质的第二抗原结合位点结合5T4，所述待治疗的癌症选自结肠直肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、肾癌和胃癌。
46.权利要求44所述的方法，其中所述蛋白质的第二抗原结合位点结合GPNMB，所述待治疗的癌症选自黑素瘤、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、骨肉瘤、神经胶质瘤和成胶质细胞瘤。
47.权利要求44所述的方法，其中所述蛋白质的第二抗原结合位点结合FR-α，所述待治疗的癌症选自卵巢癌、乳腺癌包括三阴性乳腺癌、肺腺癌和上皮起源的肿瘤。
48.权利要求44所述的方法，其中所述蛋白质的第二抗原结合位点结合PAPP-A，所述待治疗的癌症选自肺癌、乳腺癌、卵巢癌和尤文氏肉瘤。
49.权利要求44所述的方法，其中所述蛋白质的第二抗原结合位点结合GPC3，所述待治疗的癌症选自肝细胞癌、黑素瘤、威尔姆氏瘤、卵黄囊瘤、卵巢透明细胞癌、胃癌和食道癌。
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