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CN111269280B - 用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物、对应内标和试剂盒 - Google Patents

用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物、对应内标和试剂盒 Download PDF

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CN111269280B
CN111269280B CN202010232077.7A CN202010232077A CN111269280B CN 111269280 B CN111269280 B CN 111269280B CN 202010232077 A CN202010232077 A CN 202010232077A CN 111269280 B CN111269280 B CN 111269280B
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Abstract

本发明公开了一种用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物、对应内标和试剂盒。所述化合物具有如下式Ⅰ所示结构：
Figure DDA0002429575750000011
所述溶酶体贮积症相关酶包括酸性β‑葡萄糖脑苷脂酶、β‑半乳糖脑苷酯酶、α‑半乳糖苷酶和酸性α‑葡糖苷酶中的一种或多种。本发明提供的用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物中用于连接糖苷与氨醇的部分含有苯环且苯环通过酯键与氨醇端部连接，该结构增加了底物与相关酶的接触灵活性，可以提高酶与底物的结合效率。另外，本发明优选R1和R2配合来提高检测的特异性，增加检测灵敏度。

Description

用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物、对应内标和试剂盒
技术领域
本发明涉及酶活性检测领域，具体地，涉及一种用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物、对应内标和试剂盒。
背景技术
溶酶体贮积症(Lysosomal storage disorders,LSDs)是一组遗传性代谢疾病，是由于基因突变致溶酶体中有关酸性水解酶缺陷，导致机体中相应的生物大分子不能正常降解而在溶酶体中贮积，引起细胞组织器官功能的障碍。溶酶体贮积症既可导致多种系统的病变，也可仅限于神经系统，自出生至成年期均可发病。临床症状不尽相同，病情呈进行性加重。绝大多数溶酶体贮积症以常染色体隐性方式遗传，其中的每一种病发病率虽低，但作为一组病来说就是常见的人类遗传病之一。虽然目前已确认的50多种LSD的症状差异非常大，但它们都有一个共同点——都由溶酶体病变引起。其中，法布里病(Fabry)的发病率1/110000～1/40000，由于α-半乳糖苷酶的缺乏，导致身体不能分解被称为球形三酰神经酰胺(globotriaosylceramide)的特定脂质；戈谢病(Gaucher)是由于不能分解葡糖脑苷脂引起的溶酶体贮积病，患者体内不能合成葡糖脑苷脂酶，导致这些脂质聚集在肝、脾和骨髓的细胞内；蓬佩病(Pompe)是由于酸性α-葡糖苷酶的缺乏导致糖原在身体内的多种组织和器官中聚集而引起的溶酶体贮积病。克拉伯病(Krabbe)是由于体内β-半乳糖脑苷酯酶缺乏，导致脑白质内有许多半乳糖脑苷的沉积而发病。尼曼匹克A/B、粘多糖贮积症I型(MPS-I)这些疾病大部分是儿科疾病。在大多数患者中，患者在出生时是正常的，在过后的一些时间里渐进地开始神经学上恶化。在一些患者中，该疾病在成年期表现，临床表型取决于生化缺陷的类型和严重性。
LSDs的筛查方法主要有：串联质谱法、荧光法和多免疫定量法(免疫捕获法溶酶体酶丰度的测定)、生物标志物的检测。荧光法因非特异性不能同时测定多种酶活性且易导致较高的假阳性或假阴性，例如：Niemann-Pick-A/B病的荧光底物能够导致严重的假阴性问题；多免疫定量法和生物标志物检测法因尚未商品化还难以推广；而串联质谱技术灵敏度高、准确度好、且一次实验能同时筛查多种疾病，因而更适用于LSDs的辅助诊断。综合来说，MS/MS方法适用戈谢病(Gaucher)、尼曼匹克病(A/B(Niemann-pick-A/B))、克拉伯病(Krabbe)、黏多糖贮积症I型(MPS-I)、法布里病(Fabry)、庞贝病(Pompe)的新生儿筛查，也可用于相关LSDs患者治疗后的酶活监测。但是，采用目前的酶底物还存在稳定性、特异性不足以及反应性差的缺陷。
因此，在目前的科研和实践中，需要设计新的底物，以提高底物的稳定性、特异性和反应速率，提高检测效率、重现性和精确性。
发明内容
针对现有LSDs串联质谱检测技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物，该化合物作为与相关酶结合作用的底物。
本发明的目的之二在于提供一种与上述化合物对应的内标化合物。
本发明的目的之三在于提供一种用于检测溶酶体贮积症相关酶的试剂盒。
一种用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物，具有如下式Ⅰ所示结构：
Figure BDA0002429575730000031
其中，G为通过糖苷键连接的己糖；
R1是C1-C10烷基或C2-C20烯基；
R2是C1-C20烷基、具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基、C3-C20烯基或具有N、O或S的取代基的C3-C20烯基；
R3、R4各自独立地为C1-C3烷基或H。
对于本发明用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物而言，用于连接糖苷与氨醇的部分含有苯环且苯环通过酯键与氨醇端部连接，通过相关实验验证了该结构可增强底物与相关酶特异性，可以提高酶与底物的反应效率。
对于底物(即本发明的化合物)对特定溶酶体酶的特异性可以通过以下几部分提供：第一部分是通过糖部分G来提供，比如G为β-葡萄糖或β-半乳糖，则底物会对能够水解这类糖形成的糖苷键具有特异性；示例性的糖部分G可以为用于检测蓬佩病的α-D-葡萄糖；用于检测戈谢病的β-D-葡萄糖；用于检测法布里病的α-D-半乳糖；和用于检测克拉伯病的β-D-半乳糖。第二部分，底物的特异性通过R1和R2的配合来控制，比如R1脂肪族酰胺基团内的碳长度和饱和程度的变化同时配合R2的碳链长度和饱和程度来增加底物对酶的特异性；示例性地，R1为6-8个碳的烷基且R2为13个碳的饱和烷基时对于具有水解β型己糖糖苷键功能的酶具有非常理想的特异性；当R1为6-8个碳的烷基且R2为14个碳的双烯烃时对于水解α型己糖糖苷键的酶具有非常理想的特异性。另外，当R1为6个碳的烷基时对具有水解葡萄糖糖苷功能的酶具有更优异的特异性，当R1为8个碳的烷基时对具有水解半乳糖糖苷功能的酶具有更优异的特异性。这样，同时检测一种以上溶酶体贮积症时可以针对各自酶采用本发明设计的不同底物，检测结果互相不受影响，可以确保检测结果的特异性和灵敏性。
在上述用于检测溶酶体贮积症(LSDs)相关酶的化合物中，作为一种优选实施方式，G为D-葡萄糖或D-半乳糖。
在上述用于检测溶酶体贮积症(LSDs)相关酶的化合物中，作为一种优选实施方式，R1为C5-C8烷基。
在上述用于检测溶酶体贮积症(LSDs)相关酶的化合物中，作为一种优选实施方式，R2为C12-C20烷基或C12-C20烯基。
在上述用于检测溶酶体贮积症(LSDs)相关酶的化合物中，作为一种优选实施方式，R3、R4均是CH3，苯环上的R3、R4均是CH3相比于二者均为氢时具有更优秀的底物与相关酶的接触灵活性。
在上述用于检测溶酶体贮积症(LSDs)相关酶的化合物中，作为一种优选实施方式，所述化合物具有如下式Ⅱ或式Ⅲ所示结构：
Figure BDA0002429575730000041
或者
Figure BDA0002429575730000051
优选地，式Ⅱ中G为β-葡萄糖，式Ⅲ中G为β-半乳糖。
在上述用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物中，作为一种优选实施方式，所述化合物具有如下式Ⅳ或式Ⅴ所示结构：
Figure BDA0002429575730000052
或者
Figure BDA0002429575730000053
优选地，式Ⅳ中G为α-葡萄糖，式Ⅴ中为α-半乳糖。
在上述用于检测溶酶体贮积症(LSDs)相关酶的化合物中，作为一种优选实施方式，所述LSDs相关酶包括酸性β-葡萄糖脑苷脂酶(ABG)、β-半乳糖脑苷酯酶(GALC)、酸性α-半乳糖苷酶(GLA)和酸性α-葡糖苷酶(GAA)中的一种或多种。本发明的化合物可以作为特定溶酶体酶的靶向底物，这些酶的底物被用来检测样品中相对应酶的活性，由此其可用于检测下列溶酶体贮积病：粘多糖贮积症Ⅰ型(MPS-Ⅰ)、法布里病(Fabry)、戈谢病(Gaucher)、克拉伯病(Krabbe)、尼曼匹克病(A/B(Niemann-pick-A/B))和蓬佩病(Pompe)。
一种与上述用于检测溶酶体贮积症(LSDs)相关酶的化合物对应的内标化合物，具有如下式Ⅵ所示结构：
Figure BDA0002429575730000061
其中，R1是C1-C10烷基或C2-C20烯基；
R2是C1-C20烷基、具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基、C3-C20烯基或具有N、O或S的取代基的C3-C20烯基；
R3、R4各自独立地为C1-C3烷基或H；
且式Ⅵ所示化合物中存在同位素D、13C、15N、17O、18O、34S中的一种或多种；
本发明的内标被用来测量酶作用于本发明底物后形成的产物的量。内标与酶作用于底物后产生的产物结构相同，但某些元素被其同位素取代。优选地，不同的底物对应不同的内标，当采用式Ⅱ作为底物时其对应的内标中的R1和R2部分应该与式Ⅱ的R1和R2部分相同，同理，采用式Ⅲ、式Ⅳ和式Ⅵ作为酶的底物时，其各自对应的内标中的R1和R2部分应该与相应底物上的R1和R2部分相同。因此，本发明的内标是稳定的同位素标记的切割产物的类似物，其中一个或多个原子被相应的原子的同位素取代，以便产生质量的变化，比如烷基上的H被D取代，则具有取代的D的“较重的”内标分子在质谱法谱结果上显示与切割产物不同m/z，质量的变化被用来在质谱法实验中识别切割产物与内标，内标会被加到分析溶液中与酶作用于底物后的产物同时被检测。
优选地，与R1连接的酰胺键上的氧为18O、氮为15N，氢为D。
一种用于检测溶酶体贮积症(LSDs)相关酶的试剂盒，包括：
上述用于检测溶酶体贮积症(LSDs)相关酶的化合物以及所述对应的内标化合物。
本发明的底物可用于串联质谱法和多免疫定量法检测溶酶体贮积症相关酶的活性，但尤其适合用于串联质谱法检测LSDs相关酶的活性。
采用串联质谱法进行检测时使用的样品可以是血清、血浆、全血、尿、唾液等在滤纸上沉积并干燥的干滤纸样品。检测方法具体包括：用打孔器取3mm直径的DBS样品，并将其沉积在深孔板或微量滴定板孔中，向其中加入分析溶液。分析溶液包括缓冲液(例如Tris-HCl缓冲液)、底物和内标，以及可选择的蛋白酶抑制剂如用于竞争性糖苷酶的抑制剂，得到样品混合液。然后，将样品混合液在30-41℃温育2-5h。温育后，通过加入用于沉淀酶的溶液(比如醇、乙腈或稀释的三氟乙酸)来中止酶反应。将部分温育产物转移到新的试管中，并加入新的与试管中温育产物等体积的甲醇、乙腈、水-甲醇混合物或水-乙腈混合物等以与串联质谱法分析相容。此操作方法可以减少内生竞争性物质的量，以便相对增加串联质谱法分析的灵敏性。将稀释的样品直接注入串联质谱仪。将串联质谱仪设定为同时检测加入的底物、酶产物和相应的内标。这样的检测通过母离子扫描、母体离子扫描或多反应监控扫描来实现。观察的产物和相应内标的相对丰度以测量相应的酶活性。
因此，本发明的试剂盒中还可以包括上述用于串联质谱法检测所需的试剂，比如蛋白酶抑制剂、醇、乙腈等。
与现有技术相比，本发明具有如下显著效果：所述溶酶体贮积症相关酶包括酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、β-半乳糖脑苷酯酶、α-半乳糖苷酶和酸性α-葡糖苷酶中的一种或多种。本发明提供的用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物中用于连接糖苷与氨醇的部分含有苯环且苯环通过酯键与氨醇端部连接，该结构增强了底物与相关酶的结合的特异性，可以提高酶与底物的反应效率。另外，本发明优选式R1和R2配合来增加检测的特异性，增加检测灵敏度，由此提高底物的稳定性、特异性和反应性，提高检定效率、再现性和精确性。
附图说明
图1是化合物A的液质分析结果。
图2是化合物B的液质分析结果。
图3是化合物C的液质分析结果。
具体实施方式
特定实施例的以下描述在本质上仅为示例性的且不限制当然可以变化的本发明的范围、其应用或用途。本发明使用的定义和术语不设计成作为对本发明的范围或实践的限制，而是呈现为仅用于说明性和描述性目的。
除非另外定义，否则本文中所用的术语具有与本发明所属领域的技术人员的通常所理解相同的含义。应进一步理解，术语应被解释为具有与其在相关技术以及本发明的上下文中的含义一致的含义，并且不应以理想化或过度形式化意义进行解释，除非本文中明确地这样定义。
实施例1用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物A的制备
化合物A的结构式如下：
Figure BDA0002429575730000091
制备方法如下：
(1)在带有搅拌装置、温度计及分水装置的反应系统中加入4-羟基-3,5-二甲基苯甲酸甲酯195g，升温至80℃，在搅拌过程中慢慢加入200gβ-D-葡萄糖，搅拌至溶液为无色透明均相溶液时加入大孔强酸性阳离子交换树脂D001 43g，控制反应温度100℃，反应绝对压强60mmHg，搅拌速度100r/min进行反应，同时蒸出反应生成的水；当残糖含量低于0.2％时反应结束，反应液经减压过滤，回收大孔强酸性阳离子交换树脂D001催化剂；然后用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，蒸干，经柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)得产物1，共152g。具体反应方程式如下：
Figure BDA0002429575730000092
Figure BDA0002429575730000101
(2)将产物1用甲醇溶解，在氢氧化钾溶液存在的条件下室温反应2h，然后旋除甲醇，再将剩下的反应液调成pH为5.5，最后用水洗即可得到产物2，具体反应如下：
Figure BDA0002429575730000102
(3)向酯化反应装置中加入乙腈100mL、50g的产物2、68g的N-己酰基-D-神经鞘氨醇，加入DMAP 15g作为催化剂，反应温度为120℃左右，反应器反应压力为0.10MPaG，反应时间为5h。反应结束后通过蒸馏的方式得到白色固体化合物A，共计62g。具体反应如下：
Figure BDA0002429575730000103
Figure BDA0002429575730000111
化合物A通过高效液相HPLC进行分析，其分子量为：723。
化合物A通过液质分析，其纯度达99.342％，参见图1。
实施例2用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物B的制备
化合物B的结构式如下：
Figure BDA0002429575730000112
化合物B的制备方法基本上与化合物A相同，除步骤(1)中将β-D-葡萄糖换成β-D-半乳糖、将步骤(3)中N-己酰基-D-神经鞘氨醇换成N-辛酰基-D-神经鞘氨醇以外，其他制备工艺与实施例1相同。
得到的化合物B通过高效液相HPLC进行分析，其分子量为：751。
化合物B通过液质分析，其纯度达98.985％，结果参见图2。
实施例3用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物C的制备
化合物C的结构式如下：
Figure BDA0002429575730000121
化合物C的制备方法基本上与化合物A相同，除步骤(1)中将β-D-葡萄糖换成α-D-半乳糖、将步骤(3)中N-己酰基-D-神经鞘氨醇换成N-辛酰基-D-鞘氨醇agelasphin-10以外，其他制备工艺与实施例1相同。
得到的化合物C通过高效液相HPLC进行分析，其分子量为：761。
化合物C通过液质分析，其纯度达99.92％，结果参见图3。
实施例4用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物D的制备
化合物D的结构式如下：
Figure BDA0002429575730000122
化合物D的制备方法基本上与化合物A相同，除步骤(1)中将β-D-葡萄糖换成α-D-葡萄糖、将步骤(3)中N-己酰基-D-神经鞘氨醇换成N-己酰基-D-鞘氨醇agelasphin-10以外，其他制备工艺与实施例1相同。
得到的化合物C通过高效液相HPLC进行分析，其分子量为：733。
实施例5用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物E的制备
化合物E的结构式如下：
Figure BDA0002429575730000131
化合物E的制备方法基本上与化合物A相同，除步骤(1)中将β-D-葡萄糖换成α-D-半乳糖、将步骤(3)中N-己酰基-D-神经鞘氨醇换成N-辛酰基-D-神经鞘氨醇以外，其他制备工艺与实施例1相同。
得到的化合物C通过高效液相HPLC进行分析，其分子量为：751。
实施例6用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物F的制备
化合物F的结构式如下：
Figure BDA0002429575730000132
化合物F的制备方法基本上与化合物A相同，除步骤(1)中将β-D-葡萄糖换成β-D-半乳糖、将步骤(3)中N-己酰基-D-神经鞘氨醇换成N-辛酰基-D-鞘氨醇agelasphin-10以外，其他制备工艺与实施例1相同。
得到的化合物C通过高效液相HPLC进行分析，其分子量为：761。
实施例7用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物G的制备
化合物G的结构式如下：
Figure BDA0002429575730000141
化合物G的制备方法基本上与化合物A相同，除步骤(1)中将β-D-葡萄糖换成β-D-葡萄糖、将步骤(3)中N-己酰基-D-神经鞘氨醇换成N-己酰基-D-鞘氨醇agelasphin-10以外，其他制备工艺与实施例1相同。
得到的化合物C通过高效液相HPLC进行分析，其分子量为：733。
实施例8用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物H的制备
化合物H的结构式如下：
Figure BDA0002429575730000142
化合物H的制备方法基本上与化合物A相同，除步骤(1)中将β-D-葡萄糖换成α-D-葡萄糖，其他制备工艺与实施例1相同。
得到的化合物C通过高效液相HPLC进行分析，其分子量为：723。
实施例9内标化合物1的制备
针对实施例1和8制备相同的内标，因为二者的酶产物是相同的，因此可以使用相同的内标，具体结构如下：
Figure BDA0002429575730000151
内标1，其中，R1连接的酰胺键上的氧为18O、氮为15N，氢为D；
制备方法如下：向酯化反应装置中加入乙腈100mL、25g的4-羟基-3,5-二甲基苯甲酸、69g的N-己酰基-D-神经鞘氨醇，加入DMAP 10g作为催化剂，反应温度为110℃左右，反应器反应压力为0.20MPaG，反应时间为3h。反应结束后通过蒸馏的方式得到内标1，共计43g。
得到的内标1通过高效液相HPLC进行分析，其分子量为：548。
实施例10内标化合物2的制备
针对实施例2和5制备相同的内标，因为二者的酶产物是相同的，因此可以使用相同的内标，具体结构如下：
Figure BDA0002429575730000152
内标2，其中，R1连接的酰胺键上的氧为18O、氮为15N，氢为D；
制备方法如下：
向酯化反应装置中加入乙腈100mL、25g的4-羟基-3,5-二甲基苯甲酸、70g的N-辛酰基-D-神经鞘氨醇，加入DMAP 10g作为催化剂，反应温度为110℃左右，反应器反应压力为0.20MPaG，反应时间为3h。反应结束后通过蒸馏的方式得到内标2，共计45g。
得到的内标2通过高效液相HPLC进行分析，其分子量为：576。
实施例11内标化合物3的制备
针对实施例3和6制备相同的内标，因为二者的酶产物是相同的，因此可以使用相同的内标，具体结构如下：
Figure BDA0002429575730000161
内标3，其中，R1连接的酰胺键上的氧为18O、氮为15N，氢为D；
制备方法如下：
向酯化反应装置中加入乙腈100mL、25g的4-羟基-3,5-二甲基苯甲酸、70g的N-辛酰基-D-鞘氨醇agelasphin-10，加入DMAP 10g作为催化剂，反应温度为110℃左右，反应器反应压力为0.20MPaG，反应时间为3h。反应结束后通过蒸馏的方式得到内标3，共计40g。
得到的内标3通过高效液相HPLC进行分析，其分子量为：586。
实施例12内标化合物4的制备
针对实施例4和7制备相同的内标，因为二者的酶切产物是相同的，因此可以使用相同的内标，具体结构如下：
Figure BDA0002429575730000171
内标4，其中，R1连接的酰胺键上的氧为18O、氮为15N，氢为D；
制备方法如下：
向酯化反应装置中加入乙腈100mL、24g的4-羟基-3,5-二甲基苯甲酸、68g的N-己酰基-D-鞘氨醇agelasphin-10，加入DMAP 10g作为催化剂，反应温度为110℃左右，反应器反应压力为0.20MPaG，反应时间为3h。反应结束后通过蒸馏的方式得到内标4,共计42g。
得到的内标4通过高效液相HPLC进行分析，其分子量为：558。
试验例1采用串联质谱同时检测样品中溶酶体多种酶活性
(1)制备干血片：将受试者的血液涂抹在滤纸上，干燥后得到干血片样品；
(2)样品的处理：采用打孔器取3mm干血滤纸片，置于96孔板中，每孔加入80μl提取液(20mmol/L NaH2PO4)，37℃密封震荡提取1h，得到血斑提取液。
(3)底物和相应内标混合液的配制：将实施例制备的底物化合物A-D加入到0.45ml120g/L牛磺胆酸钠溶液中，混匀后加入到14.67μl的血斑提取液中使
实施例1、2、3和4制备的底物化合物A-D各自的最终浓度为100μmol/L，同时加入内标1-4使其各自最终浓度为1μmol/L，再向其中加入含有牛磺胆酸钠的乙酸钠缓冲液使乙酸钠最终浓度为0.5mol/L，混合液的最终体积为30μl。
(4)然后将该混合液在37℃下在回旋式震荡(150rpm)的情况下培育20h，培育结束后将50∶50(V/V)甲醇/乙酸乙酯添加到混合液中以终止酶促反应，随后补充300μl HPLC级乙酸乙酯和300μl水，经离心后上层液体转移到新96孔板中并在氮气下蒸发。然后用含有0.1％甲酸的80％乙腈水溶液复溶，用于上机检测。
(5)通过MS/MS分析以检测底物、酶反应产物和内标。流动相为含有0.1vol％甲酸的80vol％乙腈水溶液，流速0.2ml/min，每份样本测定时间为2min，进样量10μl。对于质谱分析，电喷雾源以正离子模式操作，且离子以母离子扫描模式检测。根据酶反应产物与内标离子峰强度比值(P/IS)进行定量分析，得到酶活性。
结果：GLA、ABG、GALC、GAA四种酶的活性依次为：12.12μmol/(L·h)、14.83μmol/(L·h)、8.04μmol/(L·h)、10.77μmol/(L·h)。
试验例2采用串联质谱同时检测样品中溶酶体多种酶活性
除了将试验例1中的实施例1-4的底物替换成实施例5-8的底物化合物以外，本试验例的各测试步骤与试验例1相同，且干血片样品来源相同即来源于相同的测试对象。
结果：GLA、ABG、GALC、GAA四种酶的活性依次为：9.32μmol/(L·h)、10.59μmol/(L·h)、6.18μmol/(L·h)、8.29μmol/(L·h)。
试验例3采用串联质谱同时检测样品中酸性β-葡萄糖脑苷脂酶(ABG)活性
本试验例采用的底物化合物结构如下：
Figure BDA0002429575730000191
对应内标结构为：
Figure BDA0002429575730000192
其中，R1连接的酰胺键上的氧为18O、氮为15N，氢为D；
检测方法：除了将试验例1中的实施例1-4的底物和内标替换成本实验例的底物化合物和内标以外，本试验例的各测试步骤与试验例1相同，且干血片样品来源相同即来源于相同的测试对象。
结果：ABG酶的活性为：8.24μmol/(L·h)。
从试验例1-3可知，采用本发明的底物化合物检测溶酶体多种酶活性具有更高的底物稳定性、特异性和反应性，试验例1中采用的底物化合物测定的酶活性是试验例2的1.3-1.4倍，是试验例3的1.8倍。

Claims (5)

1.一种用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物，其特征在于，具有如下所示结构：
Figure FDA0003031543340000011
或者
Figure FDA0003031543340000012
或者
Figure FDA0003031543340000013
或者
Figure FDA0003031543340000014
其中，式I中G为β-葡萄糖，式II中G为β-半乳糖，式III中G为α-葡萄糖，式IV中为α-半乳糖。
2.根据权利要求1所述的用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物，其特征在于，所述溶酶体贮积症相关酶选自酸性β-葡萄糖脑苷脂酶、β-半乳糖脑苷酯酶、α-半乳糖苷酶和酸性α-葡糖苷酶中的一种或多种。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物对应的内标化合物，其特征在于，具有如下所示结构：
Figure FDA0003031543340000021
其中，式V中的酰胺键上的氧为18O、氮为15N、氢为D；或者
Figure FDA0003031543340000022
其中，式VI中的酰胺键上的氧为18O、氮为15N、氢为D；或者
Figure FDA0003031543340000023
其中，式VII中的酰胺键上的氧为18O、氮为15N、氢为D；或者
Figure FDA0003031543340000024
其中，式VIII中的酰胺键上的氧为18O、氮为15N、氢为D。
4.一种用于检测溶酶体贮积症相关酶的试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1-2任一项所述的用于检测溶酶体贮积症相关酶的化合物以及权利要求3所述对应的内标化合物。
5.根据权利要求4所述的的试剂盒，其特征在于，还包括串联质谱检测所需的试剂。
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