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CN111269161B - 厚朴酚与萝卜硫素拼接物及其制备方法和应用 - Google Patents

厚朴酚与萝卜硫素拼接物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN111269161B
CN111269161B CN201911370139.4A CN201911370139A CN111269161B CN 111269161 B CN111269161 B CN 111269161B CN 201911370139 A CN201911370139 A CN 201911370139A CN 111269161 B CN111269161 B CN 111269161B
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China
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sulforaphane
magnolol
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dissolving
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陶成
陈健
曾永长
刘洁人
李利民
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Shenzhen Second Peoples Hospital
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Shenzhen Zhenxing Biomedical Research Center Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种厚朴酚与萝卜硫素拼接物及其制备方法和应用，所述厚朴酚与萝卜硫素拼接物包括：C25H29NO2S2(CT‑1)、C25H29NO4S2(CT‑2)、C25H29NO3S2(CT‑3)。本发明利用药物拼合原理，实现了厚朴酚与萝卜硫素拼接物(CT‑1，CT‑2，CT‑3)的首次合成。经生物学评价，其抗肿瘤效果显著优于厚朴酚和萝卜硫素，具有广谱的抗肿瘤活性和很强的成药性，是一个具有开发潜力的抗肿瘤化合物，也为新型抗肿瘤药物的开发提供了新的思路和途径。

Description

厚朴酚与萝卜硫素拼接物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物技术领域，特别涉及一种厚朴酚与萝卜硫素拼接物及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤已经成为人类的第二大死因，是目前威胁人类健康的重大疾病之一。我国天然药用资源丰富，从传统中药中筛选活性单体，并利用药物化学手段进行结构修饰和改造，对于发现新型抗肿瘤药物具有重大的意义。
厚朴酚(Magnolol)，又名木兰醇，是中药厚朴的主要成分之一，具有中度的抗肿瘤活性(Lin,S.Y.；Liu,J.D.；Chang,H.C.Magnolol suppresses proliferation ofcultured human colon and liver cancer cells by in hibitingDNAsynthesis andactivating apotosis[J].J.Cell Bio Chem.，2002，84,532-544)。近年来，对厚朴酚抗肿瘤机制的研究已成为该方面研究的热点，药物化学家也通过对厚朴酚进行结构修饰类进一步增强其抗肿瘤活性(Tang,H.；Zhang,Y.；Li,D.Discovery and synthesis of novelmagnolol derivatives with potent anticancer activity in non-small cell lungcancer[J].Eur J Med Chem.,2018，156,190-205)。
萝卜硫素(Sulforaphane)主要存在于十字花科植物中，是迄今为止发现的自然界中防癌、抗癌能力最强的异硫氰酸酯化合物(Springer TA.Traffic signals forlymphocyte recirculation and leukocyte emigration：the multistep paradigm[J].Cell，1994，76,301-314)。二者均具有很好的药用价值。因此，以这两类化合物作为先导化合物进行结构修饰和改造，开发新型抗肿瘤药物，具有重要的理论意义和现实价值。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种厚朴酚与萝卜硫素拼接物及其制备方法和应用。所述技术方案如下：
第一方面，一种厚朴酚与萝卜硫素拼接物，具有以下结构：
Figure GDA0003123717050000021
第二方面，一种厚朴酚与萝卜硫素拼接物的制备方法，包括以下步骤：
取厚朴酚溶于四氢呋喃，加入氢化钠和1,2-二溴乙烷，60℃反应3小时，加水后萃取，将有机相干燥后浓缩，分离得到化合物2；
取化合物2溶于N,N-二甲基甲酰胺，加入硫化钠，25℃反应2小时，调节PH为1，静置后过滤，收集沉淀，将沉淀溶于N,N-二甲基甲酰胺，加入碳酸钾和4-溴-1-丁胺，25℃反应12小时，将反应液浓缩后，溶于四氢呋喃中，0℃加入三乙胺和二硫化碳，然后在25℃反应2小时，加水后萃取，将有机相干燥后浓缩，分离得到化合物CT-1。
进一步的，所述方法还包括：
取化合物CT-1溶于二氯甲烷，加入间氯过氧苯甲酸，25℃反应1小时，加入碳酸氢钠饱和水溶液然后萃取，将有机相干燥后浓缩，分离得到化合物CT-2和化合物CT-3。
第三方面，上述第一方面所述的厚朴酚与萝卜硫素拼接物在制备抗癌药物中的应用。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明利用药物拼合原理，实现了厚朴酚与萝卜硫素拼接物(CT-1，CT-2，CT-3)的首次合成。经生物学评价，其抗肿瘤效果显著优于厚朴酚和萝卜硫素，具有广谱的抗肿瘤活性和很强的成药性，是一个具有开发潜力的抗肿瘤化合物，也为新型抗肿瘤药物的开发提供了新的思路和途径。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例
一、厚朴酚与萝卜硫素拼接物的制备
Figure GDA0003123717050000041
(1)取10mmol厚朴酚(2.66g)溶于100mL四氢呋喃中，向体系中加入40mmol 60％氢化钠和40mmol 1,2-二溴乙烷，于60℃反应3小时，然后向体系中加入30mL水，再用100mL乙酸乙酯萃取，萃取得到的有机相用硫酸钠干燥后浓缩，最后用硅胶柱分离浓缩后的有机相，得到6.5mmol化合物2(2.4g)，淡黄色液体，产率65％。
化合物2：Rf＝0.8(petroleum ether/EtOAc,10:1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.14(dd,J＝6.5,2.2Hz,2H),7.11–7.02(m,2H),6.94(dd,J＝8.6,4.3Hz,2H),6.07(s,1H),6.04–5.87(m,2H),5.12–5.02(m,4H),4.22(t,J＝6.2Hz,2H),3.45(t,J＝6.2Hz,2H),3.39–3.30(m,4H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ152.6,151.6,137.7,137.1,134.7,132.5,132.2,131.1,129.3,129.1,127.9,125.8,117.4,115.9,115.4,114.2,114.2,69.6,39.3,39.2,28.6；HRMS(ESI):m/z calcd for C20H21BrNaO2[M+Na]+:395.0623,found:395.0706.
(2)取10mmol化合物2(3.72g)溶于100mL N,N-二甲基甲酰胺，加入25mol硫化钠，于25℃反应2小时，然后加2mol/L盐酸调节PH为1，静置，过滤，收集沉淀，将沉淀溶于50mLN,N-二甲基甲酰胺，再加入25mol碳酸钾和25mmol的4-溴-1-丁胺，于25℃反应12小时，浓缩反应液，将反应液溶于30mL四氢呋喃中，0℃加入15mol三乙胺和5mol二硫化碳，于25℃反应2小时，再加入30mL水，然后用50mL乙酸乙酯萃取，萃取得到的有机相用硫酸钠干燥后浓缩，最后用硅胶柱分离浓缩后的有机相，得到6mmol，化合物CT-1(2.6g)，淡黄色液体，产率60％。
化合物CT-1：Rf＝0.2(petroleum ether/EtOAc,5:1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.24–7.03(m,4H),6.98(dd,J＝8.2,4.7Hz,2H),6.01(dddd,J＝14.6,10.2,7.0,3.3Hz,2H),5.21–4.99(m,4H),4.20(t,J＝6.3Hz,2H),3.49(t,J＝6.3Hz,2H),3.41(t,J＝6.1Hz,4H),2.83(t,J＝6.3Hz,2H),2.48(t,J＝6.9Hz,2H),1.75–1.66(m,2H),1.66–1.56(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ153.0,151.9,137.8,137.3,134.3,132.6,132.4,131.2,129.3,129.2,127.6,126.2,117.4,115.9,115.5,113.4,69.7,44.6,39.4,39.3,31.7,30.9,29.6,28.7,26.3；HRMS(ESI):m/z calcd for C25H29NNaO2S2[M+Na]+:462.1537,found:462.1770.
(3)取10mmol化合物CT-1(4.39g)于25℃(室温)溶于100mL二氯甲烷，加入11mol间氯过氧苯甲酸，25℃反应1小时，然后向反应液中加入30mL碳酸氢钠饱和水溶液，再用50mL二氯甲烷萃取，萃取得到的有机相用硫酸钠干燥后浓缩，最后用硅胶柱分离浓缩后的有机相，得到3.9mmol化合物CT-2(1.8g)，淡黄色液体，产率39％和6mol化合物CT-3(2.7g)，淡黄色液体，产率60％。
化合物CT-2：Rf＝0.6(petroleum ether/EtOAc,1:1)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.22(dd,J＝8.4,2.3Hz,1H),7.13(dd,J＝8.0,2.2Hz,2H),7.01(d,J＝2.2Hz,1H),6.93(dd,J＝16.4,8.3Hz,2H),6.02–5.88(m,2H),5.16–5.01(m,4H),4.42(t,J＝5.1Hz,2H),3.45–3.34(m,6H),3.30(t,J＝5.2Hz,2H),2.66(t,J＝7.2Hz,2H),1.72–1.65(m,2H),1.60–1.52(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ152.9,151.5,137.5,137.1,134.6,132.5,132.4,131.1,129.7,129.2,126.1,125.2,116.1,115.8,112.5,63.0,53.5,53.3,44.5,39.3,39.2,29.7,28.4,18.7；HRMS(ESI):m/z calcd for C25H29NNaO4S2[M+Na]+:494.1436,found:494.1854.
化合物CT-3：Rf＝0.2(petroleum ether/EtOAc,1:2)；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.20(dd,J＝8.4,2.3Hz,1H),7.16–7.07(m,2H),7.06–6.96(m,2H),6.91(d,J＝8.2Hz,1H),6.04–5.92(m,2H),5.17–5.04(m,4H),4.55–4.32(m,2H),3.49(t,J＝6.2Hz,2H),3.44–3.31(m,4H),3.13(ddd,J＝13.0,8.5,4.2Hz,1H),2.95(ddd,J＝13.9,5.5,3.4Hz,1H),2.71–2.57(m,1H),2.49(dt,J＝13.3,7.5Hz,1H),1.81–1.62(m,4H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ153.1,151.8,137.7,137.2,134.5,132.3,132.1,131.1,129.3,129.2,127.4,125.8,116.7,116.0,115.6,113.4,61.7,51.6,51.4,44.5,39.4,39.3,28.8,20.2；HRMS(ESI):m/z calcd for C25H29NNaO3S2[M+Na]+:478.1487,found:478.2287.
二、厚朴酚与萝卜硫素拼接物对人肺癌细胞株NCI-H460增殖的影响
1.实验材料
1.1细胞株
人肺癌细胞株NCI-H460
1.2药材、试剂和仪器
胎牛血清(Hyclone公司)，RPMI-1640培养基(Gibco公司)，DMSO(sigma公司)，CCK8试剂盒(大连美仑生物技术有限公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices公司)，低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，超净台(上海博迅实业责任有限公司医疗设备厂)，倒置显微镜(麦克奥迪公司)。
2.实验方法
2.1培养NCI-H460细胞，待生长至对数生长期时，即以0.25％胰蛋白酶消化，1000×g离心5min，细胞沉淀用含10％FBS的1640培养基调重悬，以5000个/孔的密度接种于96孔培养板，然后置于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养过夜。
2.2每组设6个复孔，每孔按以下条件加药，然后继续培养24h。
对照组：即不加药组。
厚朴酚组：加入厚朴酚，终浓度为20μM。
CT-1组：加入CT-1，终浓度为20μM。
CT-2组：加入CT-2，终浓度为20μM。
CT-3组：加入CT-3，终浓度为20μM。
以上细胞干预24h后，用CCK8试剂盒检测药物对肿瘤细胞增殖的影响。具体操作如下：每孔加入10μL CCK8溶液，继续培养2h，于酶标仪450nm波长处测定吸光度(OD)值，以对照组细胞生存率为100％，计算其他组的细胞生存率。
3.实验结果
表1厚朴酚与萝卜硫素拼接物对人肺癌细胞株NCI-H460增殖的影响
分组 抑制率(％)
对照组 0.00
厚朴酚组 1.20
CT-1组 18.41
CT-2组 70.34
CT-3组 98.99
结果如表1所示，厚朴酚与萝卜硫素拼接物CT-1、CT-2和CT-3均能显著抑制人肺癌细胞NCI-H460的增殖，且抑制效果明显优于阳性对照药物厚朴酚，其中以CT-3的抗肿瘤活性最强。
三、CT-3对7种人癌细胞株增殖的影响
1.实验材料
1.1细胞株
人神经胶质瘤细胞株U251、人肺癌细胞株H1650、人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、人胃癌细胞株AGS、人结肠癌细胞株LOVO、人卵巢癌细胞株OVCAR3。
1.2药材、试剂和仪器
胎牛血清(Hyclone公司)，RPMI-1640培养基(Gibco公司)，DMSO(sigma公司)，CCK8试剂盒(大连美仑生物技术有限公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices公司)，低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，超净台(上海博迅实业责任有限公司医疗设备厂)，倒置显微镜(麦克奥迪公司)。
2.实验方法
2.1培养上述7种癌细胞，待生长至对数生长期时，即以0.25％胰蛋白酶消化，1000×g离心5min，细胞沉淀用含10％FBS的1640培养基调重悬，以5000个/孔的密度接种于96孔培养板，然后置于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养过夜。
2.2每组设6个复孔，每孔按以下条件加药，然后继续培养24h。
对照组：即不加药组。
阳性对照组：厚朴酚组和萝卜硫素组各分为3组；
阳性对照组1：加入厚朴酚，终浓度为5.0μM。
阳性对照组2：加入厚朴酚，终浓度为10.0μM。
阳性对照组3：加入厚朴酚，终浓度为20.0μM。
阳性对照组4：加入萝卜硫素，终浓度为5.0μM。
阳性对照组5：加入萝卜硫素，终浓度为10.0μM。
阳性对照组6：加入萝卜硫素，终浓度为20.0μM。
CT-3组：将CT-3组分为3组：
CT-3组1：加入CT-3，终浓度为5.0μM。
CT-3组2：加入CT-3，终浓度为10.0μM。
CT-3组3：加入CT-3，终浓度为20.0μM。
以上细胞干预24h后，用CCK8试剂盒检测药物对肿瘤细胞增殖的影响。具体操作如下：每孔加入10μL CCK8溶液，继续培养2h，于酶标仪450nm波长处测定吸光度(OD)值，以对照组细胞生存率为100％，计算其他组的细胞生存率。
3.实验结果
表2 CT-3对7种人癌细胞株的半数致死量(IC50)(μM)
细胞株 CT-3 厚朴酚 萝卜硫素
U251 7.75 ＞45 22.47
H1650 6.92 ＞45 22.01
HepG2 6.24 ＞45 20.99
MDA-MB-231 7.48 ＞45 22.18
AGS 8.02 ＞45 18.41
LOVO 5.10 ＞45 18.52
OVCAR3 5.34 ＞45 18.44
结果如表2所示，CT-3能显著抑制7种人癌细胞的增殖，其IC50在5.10～8.02μM之间，明显低于阳性对照药物厚朴酚的＞45μM和萝卜硫素的18.41～22.47μM。说明CT-3的抗肿瘤活性显著高于阳性对照药物厚朴酚和萝卜硫素。
四、CT-3对人肺癌细胞株NCI-H460凋亡的影响
1.实验材料
1.1细胞株
人肺癌细胞株NCI-H460
1.2药材、试剂和仪器
胎牛血清(Hyclone公司)，RPMI-1640培养基(Gibco公司)，DMSO(sigma公司)，CCK8试剂盒(大连美仑生物技术有限公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices公司)，低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，超净台(上海博迅实业责任有限公司医疗设备厂)，倒置显微镜(麦克奥迪公司)，细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞仪(BD公司)。
2.实验方法
2.1培养NCI-H460细胞，待生长至对数生长期时，即以0.25％胰蛋白酶消化，1000×g离心5min，细胞沉淀用含10％FBS的1640培养基调重悬，以3.0×105个/孔的密度接种于96孔培养板，然后置于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养过夜。
2.2每组设3个复孔，每孔按以下条件加药，然后继续培养24h。
对照组：即不加药组。
厚朴酚组：加入厚朴酚，终浓度为10.0μM。
萝卜硫素组：加入萝卜硫素，终浓度为10.0μM。
CT-3组：加入CT-3，终浓度为10.0μM。
以上细胞干预24h后，用细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞术检测CT-3对肿瘤细胞凋亡的影响。
3.实验结果
表3 CT-3对人肺癌细胞株NCI-H460凋亡的影响
分组 凋亡率(％)
对照组 2.31
厚朴酚组 3.12
萝卜硫素组 18.90
CT-3组 73.82
结果如表3所示，CT-3能显著诱导人肺癌细胞NCI-H460的凋亡，且效果明显优于阳性对照药物厚朴酚和萝卜硫素。
五、CT-3对人结肠癌细胞株SW480增殖的影响
1.实验材料
1.1细胞株
人结肠癌细胞株SW480
1.2药材、试剂和仪器
胎牛血清(Hyclone公司)，RPMI-1640培养基(Gibco公司)，DMSO(sigma公司)，CCK8试剂盒(大连美仑生物技术有限公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices公司)，低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，超净台(上海博迅实业责任有限公司医疗设备厂)，倒置显微镜(麦克奥迪公司)，细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞仪(BD公司)。
2.实验方法
2.1培养SW480细胞，待生长至对数生长期时，即以0.25％胰蛋白酶消化，1000×g离心5min，细胞沉淀用含10％FBS的1640培养基调重悬，以3.0×105个/孔的密度接种于6孔培养板，然后置于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养过夜。
2.2每组设3个复孔，每孔按以下条件加药，然后继续培养24h。
对照组：即不加药组。
厚朴酚组：加入厚朴酚，终浓度为10.0μM。
萝卜硫素组：加入萝卜硫素，终浓度为10.0μM。
CT-3组：加入CT-3，终浓度为10.0μM。
以上细胞干预24h后，用细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞术检测CT-3对肿瘤细胞凋亡的影响。
3.实验结果
表4 CT-3对人结肠癌细胞株SW480凋亡的影响
分组 凋亡率(％)
对照组 3.11
厚朴酚组 4.02
萝卜硫素组 19.99
CT-3组 61.87
结果如表4所示，CT-3能显著诱导人结肠癌细胞株SW480的凋亡，且效果明显优于阳性对照药物厚朴酚和萝卜硫素。
六、CT-3对人肝正常细胞细胞株LO2凋亡的影响
1.实验材料
1.1细胞株
人肝正常细胞细胞株LO2
1.2药材、试剂和仪器
胎牛血清(Hyclone公司)，RPMI-1640培养基(Gibco公司)，DMSO(sigma公司)，CCK8试剂盒(大连美仑生物技术有限公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices公司)，低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，超净台(上海博迅实业责任有限公司医疗设备厂)，倒置显微镜(麦克奥迪公司)，细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞仪(BD公司)。
2.实验方法
2.1培养上述癌细胞，待生长至对数生长期时，即以0.25％胰蛋白酶消化，1000×g离心5min，细胞沉淀用含10％FBS的1640培养基调重悬，以3.0×105个/孔的密度接种于6孔细胞培养板，然后置于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养过夜。
2.2每组设3个复孔，每孔按以下条件加药，然后继续培养24h。
对照组：即不加药组。
厚朴酚组：加入厚朴酚，终浓度为10.0μM。
萝卜硫素组：加入萝卜硫素，终浓度为10.0μM。
CT-3组：加入CT-3，终浓度为10.0μM。
以上细胞干预24h后，用细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞术检测CT-3对肿瘤细胞凋亡的影响。
3.实验结果
表5 CT-3对人肝正常细胞细胞株LO2凋亡的影响
Figure GDA0003123717050000111
Figure GDA0003123717050000121
结果如表5所示，CT-3对人肝正常细胞细胞株LO2凋亡无明显诱导效果，说明CT-3对正常细胞无明显的毒副作用。
结论：CT-3可以抑制多种肿瘤细胞增殖，抗肿瘤活性显著优于阳性对照药物厚朴酚和萝卜硫素，且对正常细胞无明显毒副作用，是一个具有开发潜力的抗肿瘤化合物，可以直接用于相关疾病的治疗和相关药物的制备。
上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种厚朴酚与萝卜硫素拼接物，其特征在于，具有以下结构：
Figure FDA0003123717040000011
2.一种厚朴酚与萝卜硫素拼接物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取厚朴酚溶于四氢呋喃，加入氢化钠和1,2-二溴乙烷，60℃反应3小时，加水后萃取，将有机相干燥后浓缩，分离得到化合物2；
取化合物2溶于N,N-二甲基甲酰胺，加入硫化钠，25℃反应2小时，调节PH为1，静置后过滤，收集沉淀，将沉淀溶于N,N-二甲基甲酰胺，加入碳酸钾和4-溴-1-丁胺，25℃反应12小时，将反应液浓缩后，溶于四氢呋喃中，0℃加入三乙胺和二硫化碳，然后在25℃反应2小时，加水后萃取，将有机相干燥后浓缩，分离得到化合物CT-1；其中，所述化合物2和化合物CT-1的结构分别为
Figure FDA0003123717040000021
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
取化合物CT-1溶于二氯甲烷，加入间氯过氧苯甲酸，25℃反应1小时，加入碳酸氢钠饱和水溶液然后萃取，将有机相干燥后浓缩，分离得到化合物CT-2和化合物CT-3；其中，所述化合物CT-2和化合物CT-3的结构分别为
Figure FDA0003123717040000022
Figure FDA0003123717040000031
4.根据权利要求1所述的厚朴酚与萝卜硫素拼接物在制备抗癌药物中的应用。
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