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CN111206090A - Ptpn22基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Ptpn22基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN111206090A
CN111206090A CN202010090321.0A CN202010090321A CN111206090A CN 111206090 A CN111206090 A CN 111206090A CN 202010090321 A CN202010090321 A CN 202010090321A CN 111206090 A CN111206090 A CN 111206090A
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CN
China
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number variation
probe
dna
ptpn22
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Pending
Application number
CN202010090321.0A
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徐瑶
郑潇
李家俊
盛杰
郭辉
龙文林
卓情
张同存
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Wuhan University of Science and Technology WHUST
Original Assignee
Wuhan University of Science and Technology WHUST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
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Abstract

本发明涉及一种PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括用于检测PTPN22基因CNV区域的第一探针和第一引物对以及用于检测内参基因的第二探针和第二引物对。采用该试剂盒和ddPCR技术相配合可快速准确检测出PTPN22基因的拷贝数，为糖尿病的临床诊断和评估提供参考。

Description

PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法。
背景技术
随着生命科学和测序技术的不断发展，从单核苷酸突变到显微镜可见的染色体倒置，越来越多的基因组变异类型被鉴定出来。其中，一种亚显微水平(长度从kb到Mb)的基因结构变异即拷贝数变异(Copy number variation，CNV)受到研究者们的广泛关注，包括拷贝数减少、增加、复制和复合多位点的变异。
CNV涉及的基因片段较长，往往包含功能基因的编码区或调控区。因此，CNV不仅成为遗传多态性和进化表征的分子基础，而且在人类疾病的发生发展过程中发挥了至关重要的作用。
虽然CN102108408A公开了一种用于检测I型糖尿病易感性的试剂盒，该试剂盒包括同时检测PTPN22(蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22)基因的rs2476601位点、CTLA-4的rs231775位点和VDR的rs22285570位点的引物对和特异性延伸探针，通过单核苷酸微阵列分型技术，将I型糖尿病易感人群筛选出来。然而，该试剂盒涉及3个基因的单核苷酸突变，其影响基因序列较小，在评价疾病易感性方面存在一定的局限性。而CNV变异是亚显微水平的基因结构变异，能够影响整个基因编码区或调控区，能够有效检测II型糖尿病的易感性。
此外，该专利文献公开的技术方案采用该检测I型糖尿病易感性的试剂盒检测时还需要纯化PCR扩增产物、引物延伸反应、杂交等步骤，操作繁琐。
发明内容
基于此，有必要提供一种PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法，能够快速准确检测PTPN22基因拷贝数变异，为II型糖尿病的临床诊断和评价提供指导。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒，包括用于检测PTPN22基因CNV区域的第一探针和第一引物对以及用于检测内参基因的第二探针和第二引物对；
所述第一探针的序列如SEQ ID NO.1所示，且所述第一探针的5’端结合第一荧光基团，3’端结合第一荧光淬灭基团；
所述第一引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
所述内参基因为AP3B1基因，所述第二探针的序列如SEQ ID NO.4所示，且所述第二探针的5’端结合第二荧光基团、3’端结合第二荧光淬灭基团；
所述第二引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
在其中一个实施例中，所述第一荧光基团为FAM，第一荧光淬灭基团为MGB。
在其中一个实施例中，所述第二荧光基团为HEX，第二荧光淬灭基团为TRMRA。
在其中一个实施例中，所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒还包括含DNA聚合酶的混合液。
在其中一个实施例中，所述第一引物对和所述第二引物对的浓度为10pmol/μL，所述第一探针和所述第二探针的浓度为4pmol/μL。
上述所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒在采用ddPCR检测PTPN22基因拷贝数变异中的应用。
本发明还提供一种PTPN22基因拷贝数变异检测方法，包括如下步骤：
提取模板DNA；
利用上述所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒和所述模板DNA制备反应混合液，并将所述混合液上样于芯片中，进行ddPCR反应；
将ddPCR反应后的芯片置于数据采集系统上，采集FAM荧光信号和HEX荧光信号；
计算FAM荧光信号与HEX荧光信号的比值，即得所述PTPN22基因拷贝数。
在其中一个实施例中，所述ddPCR的反应体系为：
Figure BDA0002383490290000031
在其中一个实施例中，所述ddPCR的反应程序为：4℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，72℃再延伸5min，12℃保存。
在其中一个实施例中，所述提取模板DNA包括如下步骤：采集抗凝血液置于灭菌离心管，加入磷酸缓冲液混匀，多次离心和再溶解至上清液透明、沉淀呈透明色；向离心管中加入DNA抽提缓冲液，37℃水浴；再加蛋白酶K，混匀，55℃水浴中消化过夜至絮状沉淀不见，得澄清溶液；将所述澄清溶液冷却，加入Tris饱和酚溶液，混匀，离心，将上层水相转入另一灭菌离心管，再加入氯仿，混匀，离心，将上层水相转入另一灭菌离心管，再加入氯仿异戊醇混合液(V氯仿:V异戊醇＝24:1)，混匀，离心，再将上层水相转入另一灭菌离心管，加入预冷无水乙醇使DNA呈絮状沉淀，离心，弃去乙醇，向下层沉积中再加入预冷70％乙醇，离心，多次漂洗DNA沉淀，离心弃上清液，室温下使下层DNA沉积中的乙醇挥发干净；再向下层DNA沉积中加入TE缓冲液溶解DNA，4℃保存，直至DNA完全溶解，得模板DNA。
优选地，所述模板DNA的浓度大于50ng/μL。
研究发现：蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22(PTPN22)基因存在CNV变异，并且进一步生物信息学统计分析发现PTPN22基因的CNV可能与II型糖尿病的易感性有关相关。
本发明的有益效果是：
本发明采用包括用于检测PTPN22基因CNV区域的第一探针和第一引物对以及用于检测内参基因的第二探针和第二引物对的试剂盒，可利用ddPCR技术，并根据靶标基因与内参基因的荧光比值，快速检测确定PTPN22基因具体拷贝数目，灵敏度高，特异性好，对于II型糖尿病(尤其是II型糖尿病肾病)的临床诊断与临床评估提供参考。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种用于检测靶向PTPN22基因CNV区域的第一探针和第一引物对。
其中，用于快速检测靶向PTPN22基因CNV的第一探针(命名为PTPN22-Probe)序列为：TTGGCCAGACCATGATGTACCTTC(SEQ ID No.1)，且该第一探针的5’端结合FAM，3’端结合MGB。
用于快速检测靶向PTPN22基因CNV的第一引物对,包括上游引物PTPN22-F和下游引物PTPN22-R:
PTPN22-F:CTATCTACCAGTTTCATTACAAGA(SEQ ID No.2)，
PTPN22-R:GAGGATGACAGTGTTCCCATATG(SEQ ID No.3)。
第一探针和第一引物对送至生物公司合成。
值得说明的是，与其它荧光基团修饰第一探针序列相比，本实施例中第一探针的3’端选择MGB修饰时，其杂交能力更强、更加稳定。
本实施例中使用的第一探针和第一引物是遵循如下原则筛选得到的，能够特异性鉴定PTPN22基因CNV。
具体设计原则如下：
(1)探针设计原则
①探针位置尽可能地靠近上游引物；
②探针长度20-30bp，以保证结合特异性；
③检测探针的DNA折叠和二级结构；
④Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃)，GC含量在40％－70％；
⑤探针的5’端避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；
⑥整条探针中，碱基C的含量明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；
⑦为确保引物探针的特异性，将设计好的序列在blast中核实一次，排除非特异性互补区。
(2)引物设计原则
①序列选取基因的保守区段；
②避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；
③典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量；
④Tm值在55－65℃(因为60℃核酸外切酶活性最高)；
⑤避免引物之间的Tm相差超过2℃；
⑥引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；
⑦Taqman探针技术要求扩增片段长度在50bp－150bp。
实施例2
本实施例提供一种靶向内参基因AP3B1的第二探针和第二引物对，与实施例1的用于检测靶向PTPN22基因CNV区域的第一探针和第一引物对配合使用。
其中，用于快速检测靶向内参基因AP3B1的第二探针(命名为基因AP3B1-Probe)序列为：CCTGTGTCACCTTTCCCCATCTCTCCT(SEQ ID No.4),且该第一探针的5’端结合HEX，3’端结合TRMRA。
用于快速检测靶向靶向内参基因AP3B1的第二引物对,包括上游引物AP3B1-F和下游引物AP3B1-R:
AP3B1-F:TCAAGATTGCCATCATGTTTTACTT(SEQ ID No.5)，
AP3B1-R:TTCTTGCTTTTAATACACAATAAACCAC(SEQ ID No.6)。
本实施例中使用的第二探针和第二引物是遵循与实施例1基本相同的原则筛选得到的。第二探针和第二引物对送至生物公司合成。
实施例3
本实施例提供一种PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒，包括实施例1的用于检测靶向PTPN22基因CNV区域的第一探针和第一引物对以及实施例2的用于检测靶向内参基因AP3B1的第二探针和第二引物对。
优选地，该PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒还可以包括常规市售的含DNA聚合酶的预混液。
实施例4
本实施例提供一种PTPN22基因拷贝数变异检测方法，包括如下步骤：
(1)提取模板DNA。
S1，采集待测抗凝血液置于灭菌离心管，加入磷酸缓冲液混匀，多次离心和再溶解至上清液透明、沉淀呈透明色。
S2，向离心管中加入DNA抽提缓冲液，37℃水浴；再加蛋白酶K，混匀，55℃水浴中消化过夜至絮状沉淀不见，得澄清溶液。
S3，将澄清溶液冷却，加入Tris饱和酚溶液，混匀，离心，将上层水相转入另一灭菌离心管，再加入氯仿，混匀，离心，将上层水相转入另一灭菌离心管，再加入氯仿异戊醇混合液(V氯仿:V异戊醇＝24:1)，混匀，离心，再将上层水相转入另一灭菌离心管，加入预冷无水乙醇使DNA呈絮状沉淀，离心，弃去乙醇，向下层沉积中再加入预冷70％乙醇，离心，多次漂洗DNA沉淀，离心弃上清液，室温下使下层DNA沉积中的乙醇挥发干净。
S4，再向下层DNA沉积中加入TE缓冲液溶解DNA，4℃保存，直至DNA完全溶解。
S5，进行质量和含量测定，保证DNA浓度>50ng/μL，得模板DNA。
(2)利用模板DNA和实施例3的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒进行ddPCR反应。
S1，配置反应体系，见下表1：
表1 ddPCR反应体系组成
组成 用量
含DNA聚合酶的预混液 8μL
实施例1的第一引物对 浓度为10pmol/μL，体积1.44μL
实施例1的第一探针 浓度为4pmol/μL，体积0.32μL
实施例2的第二引物对 浓度为10pmol/μL，体积1.44μL
实施例2的第二探针 浓度为4pmol/μL，体积0.32μL
模板DNA 1μL
灭菌水 补至总体积16μL
S2，上样：
将表1的反应体系混合液通过上样器均匀涂抹在芯片内，使芯片中20000个孔均含有1个DNA分子，加入密封液，注意不要产生气泡，将密封好的芯片置于PCR仪中。
S3，扩增反应：
按照如下反应程序进行扩增反应：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，72℃再延伸5min，12℃终止反应。
(3)采集数据并计算
将PCR结束后的芯片置于数据采集系统上采集FAM和HEX的荧光信号YFAM和YHEM，YFAM/YHEM比值即为PTPN22基因的拷贝数目。
本实施例利用PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒进行ddPCR检测，控制退火温度为60℃、芯片扩增90min，最后根据靶标基因与内参基因的荧光比值快速确定PTPN22基因具体的拷贝数目，方法方便、快捷,结果准确。
效果试验
采用209例II型糖尿病患者(包含50例II型糖尿病肾病患者)和223个正常人的基因组DNA分别按照实施例4的PTPN22基因拷贝数变异检测方法进行检测。
其中，209例II型糖尿病患者和223个正常人的基因组DNA的提取步骤具体为：
1)采集1mL糖尿病病人(采自武汉科技大学附属天佑医院内分泌科)或正常健康人(采自武汉科技大学医院体检科)的抗凝血液，置于2mL灭菌离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动15min，4℃，12000r/min离心5min，弃上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。
2)离心管中加入DNA抽提缓冲液1mL，轻轻吹打使血细胞沉淀脱离离心管壁，37℃水浴1h。
3)加蛋白酶K至终浓度为6μg/mL，混匀，55℃水浴中消化过夜至絮状沉淀不见，溶液澄清。
4)反应液冷却至室温，加入等体积Tris饱和酚，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管，重复上述步骤1次。
5)加入等体积氯仿，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管。
6)加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，温和摇动15min，使其充分混匀，4℃，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管。
7)加入2倍体积预冷无水乙醇(-20℃)，在-20℃放置30min后，轻轻颠倒试管使DNA呈絮状沉淀。4℃，12000r/min离心10min，弃去乙醇。
8)加入预冷的70％乙醇1ml，温和摇动10min，4℃，12000r/min离心5min，漂洗DNA沉淀1-2次。
9)4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净；
10)加入100-300μL TE缓冲液溶解DNA，4℃保存，直至DNA完全溶解，即得模板DNA。
检测209个糖尿病患者(包含50个糖尿病肾病患者)和223个正常健康人的PTPN22基因拷贝数变异的结果如下表2：
表2 检测结果统计表
Figure BDA0002383490290000101
Figure BDA0002383490290000111
尿白蛋白含量是临床上用来评价糖尿病肾病的核心指标。从结果可以看出，糖尿病合并肾病的患者表现出PTPN22拷贝数的明显增加，且尿液中的尿白蛋白含量随着拷贝数的增加而显著升高，而对照组中PTPN22基因拷贝数为1-3的人群占比高达84.3％，说明PTPN22基因拷贝数目增加与II型糖尿病及其并发症的患病风险显著相关，因此，可为糖尿病的临床诊断与临床评估提供参考，适于推广应用。
另外，值得说明的是，经大量研究发现：本发明PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒的检测下限可达0.001，灵敏度高。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉科技大学
<120> PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒及检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttggccagac catgatgtac cttc 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctatctacca gtttcattac aaga 24
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggatgaca gtgttcccat atg 23
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctgtgtcac ctttccccat ctctcct 27
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcaagattgc catcatgttt tactt 25
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttcttgcttt taatacacaa taaaccac 28

Claims (10)

1.一种PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测PTPN22基因CNV区域的第一探针和第一引物对以及用于检测内参基因的第二探针和第二引物对；
所述第一探针的序列如SEQ ID NO.1所示，且所述第一探针的5’端结合第一荧光基团，3’端结合第一荧光淬灭基团；
所述第一引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
所述内参基因为AP3B1基因，所述第二探针的序列如SEQ ID NO.4所示，且所述第二探针的5’端结合第二荧光基团、3’端结合第二荧光淬灭基团；
所述第二引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，所述第一荧光基团为FAM，第一荧光淬灭基团为MGB。
3.根据权利要求1所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，所述第二荧光基团为HEX，第二荧光淬灭基团为TRMRA。
4.根据权利要求1至3任一项所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒，其特征在于，还包括含DNA聚合酶的预混液。
5.权利要求1至4任一项所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒在采用ddPCR检测PTPN22基因拷贝数变异中的应用。
6.一种PTPN22基因拷贝数变异检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取模板DNA；
利用权利要求1至4任一项所述的PTPN22基因拷贝数变异检测试剂盒和所述模板DNA制备反应混合液，并将所述混合液上样于芯片中，进行ddPCR反应；
将ddPCR反应后的芯片置于数据采集系统上，采集FAM荧光信号和HEX荧光信号；
计算FAM荧光信号与HEX荧光信号的比值，即得所述PTPN22基因拷贝数。
7.根据权利要求6所述的PTPN22基因拷贝数变异检测方法，其特征在于，ddPCR的反应体系为：
Figure FDA0002383490280000021
8.根据权利要求7所述的PTPN22基因拷贝数变异检测方法，其特征在于，所述ddPCR的反应程序为：4℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，72℃再延伸5min，12℃终止反应。
9.根据权利要求6至8任一项所述的PTPN22基因拷贝数变异检测方法，其特征在于，所述提取模板DNA包括如下步骤：
采集抗凝血液置于灭菌离心管，加入磷酸缓冲液混匀，多次离心和再溶解至上清液透明、沉淀呈透明色；
向离心管中加入DNA抽提缓冲液，37℃水浴；再加蛋白酶K，混匀，55℃水浴中消化过夜至絮状沉淀不见，得澄清溶液；
将所述澄清溶液冷却，加入Tris饱和酚溶液，混匀，离心，将上层水相转入另一灭菌离心管，再加入氯仿，混匀，离心，将上层水相转入另一灭菌离心管，再加入氯仿异戊醇混合液(V氯仿:V异戊醇＝24:1)，混匀，离心，再将上层水相转入另一灭菌离心管，加入预冷无水乙醇使DNA呈絮状沉淀，离心，弃去乙醇，向下层沉积中再加入预冷70％乙醇，离心，多次漂洗DNA沉淀，离心弃上清液，室温下使下层DNA沉积中的乙醇挥发干净；
再向下层DNA沉积中加入TE缓冲液溶解DNA，4℃保存，直至DNA完全溶解，得模板DNA。
10.根据权利要求9所述的PTPN22基因拷贝数变异检测方法，其特征在于，所述模板DNA的浓度大于50ng/μL。
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