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CN111205303B - 噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物及其用途 - Google Patents

噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物及其用途 Download PDF

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CN111205303B
CN111205303B CN202010140982.XA CN202010140982A CN111205303B CN 111205303 B CN111205303 B CN 111205303B CN 202010140982 A CN202010140982 A CN 202010140982A CN 111205303 B CN111205303 B CN 111205303B
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Abstract

本发明涉及噻吩并[2,3‑d]嘧啶基异羟肟酸衍生物及其用途，属于抗肿瘤药物技术领域。本发明解决的技术问题是提供一种新型的BRD4和HDACs双靶点抑制剂。本发明噻吩并[2,3‑d]嘧啶基异羟肟酸衍生物，其结构为式Ⅰ或式Ⅱ所示。本发明的化合物结构新颖，可作为小分子BRD4和HDACs双抑制剂，与RVX‑208和vorinostat相比，具有更好的抗结直肠癌增殖能力，通过选择性抑制BRD4和HDACs以及随后的自噬性细胞死亡，是一种很有前景的抗癌药物。
Figure DDA0002399083240000011

Description

噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物及其用途
技术领域
本发明涉及噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物及其用途，属于抗肿瘤药物技术领域。
背景技术
结直肠癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，在男性和女性成人中分别是导致癌症相关死亡的第二和第三大原因。虽然在诊断和有效的治疗方法上已经有了改进，但是治疗晚期结直肠癌的新方法仍然是迫切需要的.此外，临床上使用的表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、西妥昔单抗、贝伐单抗等大肠癌分子靶向药物，在转移性大肠癌(mCRC)患者中的作用似乎有限，但却大大增加了治疗成本。
肿瘤组织中的组蛋白乙酰化是mCRC最常见的变化之一.免疫组化检测组蛋白乙酰化水平与大肠癌的分期、转移及预后密切相关。在组蛋白乙酰化过程中，有两类蛋白家族被认为是潜在的药物靶标：一类是含有溴代氨基的蛋白4(BRD4)，它起着组蛋白乙酰化赖氨酸“读取器”的作用；另一类是组蛋白去乙酰化酶(HDACs)，它起着乙酰化赖氨酸“橡皮擦”的作用。BRD4是bromodomain和extra-terminal(BET)蛋白家族的一员，在组蛋白或非组蛋白底物的识别中起着核心作用，它可能在表观遗传修饰和基因转录中调节许多分子和细胞过程.HDACs是赖氨酸残基脱乙酰反应的促动因子，近年来被认为是人类恶性肿瘤潜在的治疗靶点。
现有的BRD4抑制剂或HDACs抑制剂，均为单一效果，且由于肿瘤细胞的抗药性，需要更多结构新颖的抗肿瘤化合物。
发明内容
针对以上缺陷，本发明解决的技术问题是提供一种新型的BRD4和HDACs双靶点抑制剂。
本发明噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物，其结构为式Ⅰ或式Ⅱ所示：
Figure BDA0002399083220000011
其中，R1为氢、C1-C4烷基或苄基；R2为C1-C5烷基、
Figure BDA0002399083220000012
Figure BDA0002399083220000021
R3为羟基、氨基或
Figure BDA0002399083220000022
优选的，R1为C1-C4烷基；优选R1为甲基。
优选的，R3为羟基或
Figure BDA0002399083220000023
优选R3为羟基。
作为优选方案，其结构为式Ⅰ所示。
作为优选方案，本发明噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物的结构为下述结构式中的任一种：
Figure BDA0002399083220000024
本发明还提供本发明所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物的异构体、可药用的盐以及水合物。
本发明还提供本发明所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物在制备BRD4抑制剂中的用途。
本发明还提供本发明所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物在制备HDACs抑制剂中的用途。
本发明还提供本发明所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。
优选的，所述肿瘤为结直肠癌。
本发明还提供一种药物组合物。
本发明药物组合物，由有效成分和药学上可接受的辅料组成，所述有效成分包含治疗有效量的本发明所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物或其异构体或可药用的盐或水合物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明设计并合成了一系列新的BRD4-HDACs双抑制剂，并进行了随后的体外和体内生物学评价。该类化合物通过下调c-myc、组蛋白H3去乙酰化、抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2和干扰HCT-116结直肠癌细胞自噬溶酶体的形成，诱导细胞凋亡和自噬性死亡。此外该类化合物主要抑制HDAC 1、2、3和6，而western blotting和IHC分析均显示对组蛋白H3的脱乙酰化有明显的抑制作用，对HCT-116大肠癌异种移植小鼠有良好的治疗作用，通过激活IL6-JAK-STAT信号通路增加了细胞毒性T细胞浸润。
本发明的化合物结构新颖，可作为小分子BRD4和HDACs双抑制剂，与RVX-208和vorinostat相比，具有更好的抗结直肠癌增殖能力，通过选择性抑制BRD4和HDACs以及随后的自噬性细胞死亡，是一种很有前景的抗癌药物。
附图说明
图1为化合物9c对正常人结肠上皮细胞NCM460和6种肿瘤细胞抑制的IC50值。
图2为不同浓度的化合物9c(0.2uM，0.5uM)处理HCT-116细胞后的细胞周期分析。
图3为Annexin V-FITC/PI双染法后的双变量流式细胞仪散点图。
图4为通过Hoechst 33258染色的荧光显微照片。
图5为化合物9c在移植瘤模型中抗肿瘤活性测试结果图。
具体实施方式
本发明噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物，其结构为式Ⅰ或式Ⅱ所示：
Figure BDA0002399083220000041
其中，R1为氢、C1-C4烷基或苄基；R2为C1-C5烷基、
Figure BDA0002399083220000042
Figure BDA0002399083220000043
R3为羟基、氨基或
Figure BDA0002399083220000044
本发明中，“C1-C5烷基”是指具有1～5个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、异戊基、新戊基等。“C1-C4烷基”是指具有1～4个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基等。
优选的，R1为C1-C4烷基；R2为C1-C5烷基；
Figure BDA0002399083220000045
Figure BDA0002399083220000046
R3为羟基、氨基或
Figure BDA0002399083220000047
更优选的，R1为甲基，R2为C1-C5烷基；
Figure BDA0002399083220000048
Figure BDA0002399083220000049
R3为羟基、氨基或
Figure BDA00023990832200000410
作为一种优选的实施方式，R1为氢、C1-C4烷基或苄基；R2为C1-C5烷基；
Figure BDA00023990832200000411
Figure BDA00023990832200000412
R3为羟基或
Figure BDA00023990832200000413
优选的，R1为氢、C1-C4烷基或苄基；R2为C1-C5烷基；
Figure BDA00023990832200000414
Figure BDA0002399083220000051
R3为羟基。
作为一种优选的实施方式，R1为C1-C4烷基；R2为C1-C5烷基；
Figure BDA0002399083220000052
Figure BDA0002399083220000053
R3为羟基或
Figure BDA0002399083220000054
优选的，R1为C1-C4烷基；R2为C1-C5烷基；
Figure BDA0002399083220000055
Figure BDA0002399083220000056
R3为羟基。
作为一种优选的实施方式，R1为甲基，R2为C1-C5烷基；
Figure BDA0002399083220000057
Figure BDA0002399083220000058
R3为羟基或
Figure BDA0002399083220000059
优选的，R1为甲基；R2为C1-C5烷基；
Figure BDA00023990832200000510
R3为羟基。
作为优选方案，本发明化合物的结构为式Ⅰ所示。
以下为本发明优选的一些化合物结构式：
Figure BDA00023990832200000511
Figure BDA0002399083220000061
本发明还涉及如通式Ⅰ或通式Ⅱ所示化合物的异构体、可药用的盐以及水合物及。其中，可药用的盐包括但不限于本发明化合物与无机酸组成的盐、本发明化合物与有机酸组成的盐。其中，无机酸包括但不限于盐酸、磷酸、亚磷酸、硫酸、硝酸或氢溴酸；有机酸包括但不限于苹果酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、延胡索酸、酒石酸、乙酸、乳酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、棕榈酸等。本发明中的一些化合物可能用水或各种有机溶剂结晶或重结晶，在这种情况下，可能形成各种溶剂化物。本发明包括那些化学计量的溶剂化物，包括水合物，也包括在用低压升华干燥法制备时形成的包含可变量水的化合物。
本发明化合物，可用于制备BRD4抑制剂。
本发明化合物，还可用于制备HDACs抑制剂。
本发明化合物，可用于制备抗肿瘤药物。
作为优选方案，所述肿瘤为结直肠癌，即本发明化合物优选用于抗结直肠癌中。
本发明的化合物或其可药用的盐可以单独使用，也可与可药用的载体或赋形剂一起以药物组合物的形式使用，当以药物组合物的形式使用时，通常将治疗有效量的本发明化合物或其可药用盐或水合物以及一种或多种可药用载体或稀释剂结合制成适当的施用形式或剂量形式。因此，本发明还提供了药物组合物，它包含治疗有效量的本发明所述的化合物、其所有可能的异构体或其可药用的盐或水合物以及至少一种可药用的载体。
本发明化合物的制备，可以采用常规的化学合成方法，具体的，采用如下工艺流程进行合成：
Figure BDA0002399083220000071
试剂和条件：(a)NCCH2CO2Et，S8，Et3N，EtOH，回流，12h；(b)DBU，THF，回流，24h；(c)CH3OH，NaOH，30min；(d)DCC/HOBt，DCM，24h；(e)氯甲酸乙酯，N-甲基吗啉，1,4-二恶烷，15min，然后NH2OH，CH3OH，20min；(f)化合物2a-e，HCl-1,4-二恶烷，25℃，48h。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1 N-(2-氨基苯基)-4-(2,6-二甲基-4-(7-甲基-4-氧代-3,4,5,6,7,8-六氢吡啶[4'，3'：4,5]噻吩[2,3-d]嘧啶-2-基)苯氧基)丁酰胺(8b)的制备
Figure BDA0002399083220000081
反应a：2-氨基-6-甲基-4,5,6,7-四氢噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸乙酯(2a)的制备
混合N-甲基哌啶酮(4.90g,50mmol),氰基乙酸乙酯(5.66g,100.0mmol),三乙胺(10mL)和升华硫(1.60g,50.0mmol)在100mL无水乙醇中回流反应12小时，反应液浓缩，残余物用水和乙酸乙酯萃取，分离有机层浓缩，用100ml乙醇重结晶的2a，收率79％,淡黄色粉末。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.23(s,2H,NH2),4.15(q,J＝7.2Hz,2H,OCH2CH3),3.22(t,J＝2.0Hz,2H,N-CH2-Thiophene),2.66(t,J＝5.2Hz,2H,N-CH2-CH2),2.53(t,J＝6.0Hz,2H,N-CH2-CH2),2.29(s,3H,N-CH3),1.24(t,J＝7.2Hz,3H,CH2CH3).
反应b：4-(4-氰基-2,6-二甲基苯氧基)丁酸甲酯(4b)的制备
4-羟基-3,5-二甲基苯乙腈(1.47g,10mmol),4-溴丁酸甲酯(2.17g,12mmol)溶于100mlTHF,加入DBU(3.04g,20mmol)，回流反应24h.反应液浓缩用水和乙酸乙酯萃取，分离有机层并浓缩,残余物经硅胶柱层析，石油醚:乙酸乙酯(12:1),得4b，收率70％,浅黄色油状物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.53(s,2H,Ar-H),3.82(t,J＝6.4Hz,2H,OCH2),3.62(s,3H,OCH3),2.55(t,J＝7.4Hz,2H,CH2COOCH3),2.23(s,6H,2Ar-CH3),2.01(p,J＝6.8Hz,2H,OCH2CH2).
反应c：4-(4-氰基-2,6-二甲基苯氧基)丁酸甲酯(5b)的制备
将4b(1.24g,5mmol)溶于30ml CH3OH中，加入1M NaOH(30ml),室温反应30分钟，用盐酸中和至pH＝3,析出白色固体,用甲醇洗涤得5b，收率76％,白色粉末。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.19(brs,1H,COOH),7.54(s,2H,Ar-H),3.81(t,J＝6.4Hz,2H,OCH2),2.45(t,J＝7.2Hz,2H,CH2COOH),2.24(s,6H,2Ar-CH3),1.97(p,J＝6.8Hz,2H,OCH2CH2).
反应d：N-(2-氨基苯基)-4-((4-氰基-2,6-二甲基苯氧基)甲基)苯甲酰胺(6b)的制备.
将5b(281mg,1mmol)和邻苯二胺(432mg,4mmol)溶于无水CH2Cl2(15ml)中，加入EDCI(192mg,1mmol)和HOBt(135mg,1mmol),室温反应24小时。粗品经硅胶柱层析石油醚:乙酸乙酯(5:1),得6b，收率67％,白色固体。mp:194.3-195.5℃，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.69(brs,1H,NH),8.03(d,J＝7.8Hz,2H,Ar-H),7.62(d,J＝8.2Hz,2H,Ar-H),7.59(s,2H,Ar-H),7.18(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H,Ar-H),6.79(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H,Ar-H),6.61(td,J＝7.2,1.4Hz,1H,Ar-H),4.98(s,2H,CH2),4.91(brs,2H,NH2),2.29(s,6H,2Ar-CH3).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.47,159.82,143.64,140.69,134.80,133.23(4C),128.44,128.18,127.19,126.99,123.71,119.34,116.71,116.59,106.99,73.53,16.43.HRMS(ESI):calcdfor C23H22N3O2 +[M+H]+,372.1707；found 372.1711.
反应f：N-(2-氨基苯基)-4-(2,6-二甲基-4-(7-甲基-4-氧代-3,4,5,6,7,8-六氢吡啶[4'，3'：4,5]噻吩[2,3-d]嘧啶-2-基)苯氧基)丁酰胺(8b)的制备
化合物2a(105.50mg,0.5mmol)和化合物6b(161.50mg,0.5mmol)置于25mL的封管中,加入5ml 1,4-二氧六环的饱HCl溶液,室温反应48小时,浓缩反应液,加入10ml H2O,并用NaHCO3中和至pH＝7,离心(4500rounds/minute),用乙酸乙酯(5ml)和乙醇(5ml)分别洗涤to得8b.淡黄色固体，收率38％。mp:239.8-241.8℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.38(brs,1H,Pyrimidine-H),9.71(s,1H,CONH),8.04(s,2H,Ar-H),7.91(s,2H,Ar-H),7.64(s,2H,Ar-H),7.19(s,1H,Ar-H),6.98(s,1H,Ar-H),6.80(s,1H,Ar-H),6.61(s,1H,Ar-H),4.97(s,2H,O-CH2),4.92(s,2H,NH2),3.56(s,2H,N-CH2-Thiophene),2.97(s,2H,N-CH2-CH2),2.67(s,2H,N-CH2-CH2),2.38(s,3H,N-CH3),2.33(s,6H,2Ar-CH3).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.50,164.01,159.23,158.57,152.52,143.64,141.05,134.69,131.60,130.16,129.37,128.81,128.42,128.09,127.72,127.19,126.97,123.75,120.62,116.71,116.59,73.44,53.50,51.73,45.53,26.24,16.76.HRMS(ESI):calcd for C32H32N5O3S+[M+H]+,566.2220；found 566.2224.
实施例2 N-(2-氨基苯基)-2-(2,6-二甲基-4-(7-甲基-4-氧代-3,4,5,6,7,8-六氢吡啶[4'，3'：4,5]噻吩[2,3-d]嘧啶-2-基)苯氧基)乙酰胺(8a)的制备
Figure BDA0002399083220000091
参照实施例1的制备方法，将反应b中的原料4-溴丁酸甲酯改为4-溴乙酸甲酯，得到化合物8a。
淡黄色固体，收率35％。mp:243.7-245.8℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.39(brs,1H,Pyrimidine-H),9.80(s,1H,CONH),8.15(s,1H,Ar-H),8.02(d,J＝7.6Hz,1H,Ar-H),7.92(s,2H,Ar-H),7.72(d,J＝7.6Hz,1H,Ar-H),7.57(t,J＝7.6Hz,1H,Ar-H),7.19(d,J＝7.8Hz,1H,Ar-H),6.98(t,J＝7.6Hz,1H,Ar-H),6.80(d,J＝8.0Hz,1H,Ar-H),6.61(t,J＝7.6Hz,1H,Ar-H),4.95(s,4H,O-CH2,NH2),3.56(s,2H,N-CH2-Thiophene),2.97(t,J＝5.6Hz,2H,N-CH2-CH2),2.67(t,J＝5.6Hz,2H,N-CH2-CH2),2.38(s,3H,N-CH3),2.35(s,6H,2Ar-CH3).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ165.61,164.26,160.45,158.33,153.33,143.66,137.97,135.27,131.45,131.28,129.40,129.30,128.88,128.81,128.58,127.93,127.89,127.24,126.93,123.82,120.46,116.68,116.65,73.60,53.56,51.79,45.56,26.33,16.77.HRMS(ESI):calcd for C32H32N5O3S+[M+H]+,566.2220；found 566.2224.
实施例3 N-(2-氨基苯基)-6-(2,6-二甲基-4-(7-甲基-4-氧代-3,4,5,6,7,8-六氢吡啶[4'，3'：4,5]噻吩[2,3-d]嘧啶-2-基)苯氧基)己酰胺(8c)的制备
Figure BDA0002399083220000101
参照实施例1的制备方法，将反应b中的原料4-溴丁酸甲酯改为4-溴己酸甲酯，得到化合物8c。
收率37％,黄色固体。mp:222.2-223.8℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.34(brs,1H,Pyrimidine-H),9.13(s,1H,CONH),7.87(s,2H,Ar-H),7.16(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H,Ar-H),6.89(td,J＝7.6,1.6Hz,1H,Ar-H),6.71(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H,Ar-H),6.54(td,J＝7.6,1.6Hz,1H,Ar-H),4.82(s,2H,NH2),3.80(t,J＝6.4Hz,2H,O-CH2),3.55(s,2H,N-CH2-Thiophene),2.95(d,J＝5.6Hz,2H,N-CH2-CH2),2.66(t,J＝5.6Hz,2H,N-CH2-CH2),2.39-2.34(m,5H,N-CH3,CH2CONH),2.28(s,6H,2Ar-CH3),1.80(p,J＝6.8Hz,2H,OCH2CH2CH2CH2CH2),1.69(p,J＝7.2Hz,2H,OCH2CH2CH2CH2CH2),1.54(m,1.60–1.50,2H,OCH2CH2CH2CH2CH2).13C NMR(100MHz,CF3COOD)δ178.18,163.31,156.55,150.17,149.69,135.10,129.59,129.27,128.99,128.86,128.31,126.98,126.52,126.35,118.03,114.38,111.56,73.12,51.71,51.56,42.75,35.50,29.00,25.40,24.95,21.93,14.82.HRMS(ESI):calcd for C30H36N5O3S+[M+Na]+,546.2533；found 546.2540.
实施例4 3-((2,6-二甲基-4-(7-甲基-4-氧-3,4，5，6，7，8-六氢吡啶并[4',3':4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-2基)苯氧基)甲基)-N-羟基苯甲酰胺(9a).
Figure BDA0002399083220000111
参照实施例2的方法，得到化合物5a；
反应e：将盐酸羟胺(345mg,5mmol)加入到10ml的甲醇钠(270mg,5mmol)的甲醇溶液中，室温搅拌30min，过滤，滤液备用。
将化合物5a(281mg，1mmol)溶于10ml四氢呋喃中，加入N-甲基吗啉(130mg,1.3mmol)，冰浴下滴加氯甲酸乙酯(130mg,1.2mmol)，室温反应15min，过滤，滤液加入上述新制备的羟胺甲醇溶液中反应20min。反应液浓缩，经硅胶柱层析，二氯甲烷：丙酮＝5:1得化合物7a，收率：60％,类白色固体。mp:137.9-138.6℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.44(brs,1H,OH),8.75(brs,1H,NH),7.53(s,2H,Ar-H),3.80(t,J＝6.4Hz,2H,O-CH2),2.24(s,6H,2Ar-CH3),2.20(t,J＝7.6Hz,2H,C＝O-CH2),1.97(p,J＝6.8Hz,2H,CH2-CH2-CH2).13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ169.02,160.04,133.13,132.98,119.35,106.63,71.81,29.12,26.38,16.21.HRMS(ESI):calcd for C13H16N2NaO3 +[M+Na]+,271.1053；found 271.1060.
反应f：化合物2a(105.50mg,0.5mmol)和化合物7a(148mg,0.5mmol)置于25mL的封管中,加入5ml 1,4-二氧六环的饱HCl溶液,室温反应48小时,浓缩反应液,加入10ml H2O,并用NaHCO3中和至pH＝7,离心(4500rounds/minute),用乙酸乙酯(5ml)和乙醇(5ml)分别洗涤to得9a，收率41％，黄色固体。mp:184.1-186.1℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.39(brs,1H,Pyrimidine-H),11.29(brs,1H,OH),9.07(brs,1H,C＝ONH),7.93(s,1H,Ar-H),7.90(s,2H,Ar-H),7.75(d,J＝7.5Hz,1H,Ar-H),7.65(d,J＝7.4Hz,1H,Ar-H),7.51(t,J＝7.6Hz,1H,Ar-H),4.91(s,2H,OCH2),3.58(s,2H,N-CH2-Thiophene),2.96(t,J＝5.7Hz,2H,N-CH2-CH2),2.68(t,J＝5.7Hz,2H,N-CH2-CH2),2.39(s,3H,N-CH3),2.32(s,6H,2Ar-CH3).13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.02,159.19,158.50,152.52,138.03,133.46,132.99,131.63,131.12,130.08,129.35,128.99,128.81,127.69,127.07,126.86,120.60,73.57,53.46,51.70,45.48,26.20,16.72.HRMS(ESI):calcd for C26H27N4O4S+[M+H]+,491.1748；found491.1752.
实施例5 4-((2,6-二甲基-4-(7-甲基-4-氧-3,4，5，6，7，8-六氢吡啶并[4',3':4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-2基)苯氧基)甲基)-N-羟基苯甲酰胺(9b).
Figure BDA0002399083220000121
参照实施例4的方法，将3-溴甲基苯甲酸甲酯改为4-溴甲基苯甲酸甲酯，得到化合物9b。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.93(s,2H,Ar-H),7.81(s,2H,Ar-H),7.58(s,2H,Ar-H),4.90(s,2H,OCH2),3.53(s,2H,N-CH2-Thiophene),2.97(s,2H,N-CH2-CH2),2.66(s,2H,N-CH2-CH2),2.37(s,3H,N-CH3),2.30(s,6H,2Ar-CH3).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ164.58,131.22,131.09,129.27,128.80,128.76,128.16,120.31,73.37,53.68,51.95,45.63,16.75.HRMS(ESI):calcd for C26H27N4O4S+[M+H]+,491.1748；found 491.1750.
实施例6 6-(2,6-二甲基-4-(7-甲基-4-氧-3,4，5，6，7，8-六氢吡啶并[4',3':4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-2基)苯氧基)-N-羟基己酰胺(9c).
Figure BDA0002399083220000122
参照实施例4的方法，将3-溴甲基苯甲酸甲酯改为6-溴己酸甲酯，得到化合物9c。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.42(brs,1H,OH),8.75(s,1H,NH),7.90(s,2H,Ar-H),3.75(t,J＝6.4Hz,2H,ArOCH2),3.51(s,2H,N-CH2-Thiophene),2.96(t,J＝5.8Hz,2H,N-CH2-CH2),2.64(t,J＝5.8Hz,2H,N-CH2-CH2),2.36(s,3H,N-CH3),2.27(s,6H,2Ar-CH3),2.03–1.96(m,2H,CH2C＝O),1.74(p,J＝7.2Hz,2H,ArOCH2CH2),1.58(p,J＝7.2Hz,2H,CH2CH2C＝O),1.51–1.40(m,2H,ArOCH2CH2CH2).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ169.45,165.12,157.84,130.51,129.11,128.81,128.70,128.66,126.49,119.87,72.10,53.79,52.10,45.68,32.69,30.12,26.67,25.69,25.48,16.59.HRMS(ESI):calcd for C24H31N4O4S+[M+H]+,471.2061；found 471.2057.
实施例7 4-(2,6-二甲基-4-(7-甲基-4-氧-3,4，5，6，7，8-六氢吡啶并[4',3':4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-2基)苯氧基)-N-羟基己酰胺(9d).
Figure BDA0002399083220000123
参照实施例4的方法，将3-溴甲基苯甲酸甲酯改为4-溴丁酸甲酯，得到化合物9d。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.17(brs,Pyrimidine-H),10.45(s,1H,OH),7.85(s,2H,Ar-H),3.79(t,J＝6.3Hz,2H,OCH2),3.55(s,2H,N-CH2-Thiophene),2.95(t,J＝5.7Hz,2H,N-CH2-CH2),2.67(t,J＝5.7Hz,2H,N-CH2-CH2),2.37(s,3H,N-CH3),2.28(s,6H,2Ar-CH3),2.21(t,J＝7.4Hz,2H,CH2C＝O),1.99(q,J＝6.8Hz,2H,OCH2CH2).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ169.06,164.03,159.22,158.77,152.56,131.35,130.05,129.33,128.72,127.37,120.54,71.65,53.48,51.71,45.51,29.22,26.47,26.23,16.57.HRMS(ESI):calcdfor C22H27N4O4S+[M+H]+,443.1748；found 443.1750.
实施例8 (E)-3-(4-((2,6-二甲基-4-(7-甲基-4-氧-3,4，5，6，7，8-六氢吡啶并[4',3':4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-2基)苯氧基)甲基)苯基)-N-羟基丙烯酰胺(9e).
Figure BDA0002399083220000131
参照实施例4的方法，将3-溴甲基苯甲酸甲酯改为4-溴甲基肉桂酸甲酯，得到化合物9e。
1H NMR(400MHz,)δ8.03(d,J＝8.7Hz,2H,Ar-H),7.91(s,2H,Ar-H),7.73(d,J＝20.6Hz,2H,Ar-H),5.18(s,2H,OCH2Ar),4.20–3.54(m,4H,Piperidline-H),3.36(d,J＝9.6Hz,2H,Piperidline-H),2.56–2.36(m,9H,2Ar-CH3,N-CH3).HRMS(ESI):calcd forC28H29N4O4S+[M+H]+,517.1904；found 517.1912.
实施例9 (E)-3-(4-((2-(2,6-二甲基-4-(7-甲基-4-氧-3,4，5，6，7，8-六氢吡啶并[4',3':4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-2基)苯氧基)乙氧基)甲基)苯基)-N-羟基丙烯酰胺(9f).
Figure BDA0002399083220000132
参照实施例4的方法，将3-溴甲基苯甲酸甲酯改为4-溴乙氧甲基肉桂酸甲酯，得到化合物9f。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.90–7.74(m,3H,Ar-H,Ar-CH＝CH),7.56(s,2H,Ar-H),7.41(s,2H,Ar-H),6.48(s,1H,Ar-CH＝CH),4.61(s,2H,OCH2Ar),4.01(s,2H,ArOCH2CH2),3.78(s,2H,ArOCH2CH2),3.56(s,2H,Piperidline-H),2.96(s,2H,Piperidline-H),2.67(s,2H,Piperidline-H),2.42–2.22(m,9H,2Ar-CH3,N-CH3).HRMS(ESI):calcd for C30H33N4O5S+[M+Na]+,583.1986；found 583.1995.
试验例1 体外酶活性测试和抗肿瘤细胞增殖活性测试
测定实施例1～9制备的化合物的体外酶活性和抗肿瘤细胞的增殖活性，其中，BRD4体外酶活实验步骤如下：
1)缓冲液的配置：配置羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)50mM，NaCl 100mM，0.1％牛血清蛋白，3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)0.05％，pH＝7.4的缓冲液平衡至室温。
2)将待测的BRD4抑制剂用1:3连续稀释呈浓度为0-100μM的样品，取4uL转移到小容量的384孔平板上，加入4μL的谷胱甘肽标记的BRD4蛋白，室温孵育30分钟，RVX-208作阳性对照。
3)加入4μL的等浓度的生物素化的组蛋白H4的KAc多肽，继续孵育30分钟。
4)最后加入HTRF供体4μL(25ug/mL)和受体4μL(25ug/mL)，期间注意避光。
5)将平板用避光室温孵育60分钟后，处理后，与DMSO的空白对照组读取荧光值变化，算出IC50值，并与RVX-208阳性对照比较。
BRD4/HDAC双靶点抑制剂的酶活实验步骤与BRD4抑制剂酶活实验一样，选用SAHA作HDACs的阳性对照，anti-H3K9单克隆抗体和荧光标记的链霉亲和素作为显色标记。
测试结果如表1所示。
表1 化合物的体外酶活性测试和抗肿瘤细胞增殖活性测试结果
Figure BDA0002399083220000141
aND:Not determined b RVX-208和SAHA摩尔比为1:1。
RVX-208和SAHA均为现有的抑制剂，为阳性对照。
从实验结果可知：1)8a-c和9a-f对BRD4、HDACs和各种结直肠癌细胞均具有良好抑制活性。2)以异羟肟酸作为锌离子结合区的化合物9a-f对HDACs的抑制活性普遍比以邻苯二胺作为锌离子结合区的化合物活性高。3)所有的化合物对HDAC2和HDAC6的抑制活性优于HDAC7，提示这种双靶点的抑制剂对HDACs可选择性的抑制第I类HDACs和第IIb类HDACs。4)所有的双靶点化合物仍然具有较好的BRD4抑制活性，提示在BRD4骨架做衍生后对BRD4抑制活性仅仅有微弱的影响。5)最后，我们筛选出活性最为优秀的化合物9c，它对HDAC2和HDAC6的抑制IC50分别是58nM和73nM，相对于HDAC7(IC50>10uM)而言具有很好的选择性。同时化合物9c具有良好的BRD4抑制活性(IC50＝710nM)，甚至优于阳性对照RVX-208的活性，其对HCT-116，SW620和DLD1抗增殖活性的IC50分别为0.45，1.78和2.11uM，均优于阳性对照，提示具有强大的抗肿瘤活性潜力。
试验例2 化合物9c对HDAC1-3和HDAC6的抑制活性
对化合物9c对BRDs和HDACs亚型的选择性进行了进一步的测试，测试方法参照试验例1，测试结果如表2所示。
表2 化合物9c对BRDs和HDACs抑制活性
Figure BDA0002399083220000151
aND:Not determined
从表2可以看出，化合物9c对HDAC1-3和HDAC6的抑制活性非常好，IC50在46至75nM，对HDAC8和HDAC10抑制的IC50也在微摩尔水平以下，而对于第IIa类和IV类HDACs，当浓度升至10uM时也没有抑制活性，其对HDACs的选择性与伏立诺他一致。另一方面，化合物9c对BRD4的选择性优先于其他的BRDs，其选择性优于阳性对照JQ-1。对此我们选择化合物9c作为BRD4/HDAC双靶点抑制剂的候选药物，并对其进行进一步的抗结直肠癌活性测试。
试验例3 化合物9c诱导HCT-116细胞凋亡实验
通过MTT法分析，我们发现化合物9c对正常人结肠上皮细胞NCM460抑制时的IC50值远远大于对其余6株肿瘤细胞抑制的IC50值(图1)，这说明9c在对正常组织的细胞的增殖抑制能力较低，对正常细胞的毒性较弱，预示其安全性较高。随后在细胞周期分期分析中发现与生理盐水对照组相比，当用不同浓度的化合物9c(0.2uM，0.5uM)处理HCT-116细胞后，均不同程度的出现SubG1期的细胞，且与浓度正相关，提示化合物9c能诱导HCT-116细胞凋亡(图2)。Annexin V-FITC/PI双染法中Annexin V可结合早凋亡细胞从细胞膜内转移到细胞膜外脂酰丝氨酸(PS)呈绿色荧光而碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)够透过凋亡中晚期细胞的细胞膜而使细胞核染红。在Annexin V-FITC/PI双染法后的双变量流式细胞仪散点图上(图3)，左下象限为(FITC-/PI-)，表示活细胞；右上象限为(FITC+/PI+)，表示晚期凋亡细胞；而右下象为(FITC+/PI-)，表示早期凋亡细胞。从图中我们得知，早期凋亡细胞NS组为2.8％，化合物9c组分别为8.2％和9.5％；晚期凋亡NS(生理盐水)组为3.51％，化合物9c组分别为23.0％和35.9％；总凋亡化合物9c分别为33.2±5.30％(0.2uM)和45.3±6.8％(0.5uM)明显高于NS组(6.3±0.4％,p<0.05)，进一步证实化合物9c具有诱导HCT-116细胞凋亡的作用，且呈剂量依赖关系。
通过Hoechst 33258染色的荧光显微照片(图4)，我们可以看到，NS组的细胞呈弥散均匀荧光；而化合物9c(0.2uM，0.5uM)明显出现了大量的浓染致密的颗粒、块状荧光。由于Hoechst33258是一种可以穿透细胞膜的特异性DNA蓝色荧光染料，细胞发生凋亡后染色质固缩染色呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染颜色有些发白，而正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，这就说明了与NS组的细胞相比实验组的细胞确实发生了凋亡。
试验例4 化合物9c在移植瘤模型中抗肿瘤活性测试
为了评价化合物9c的体内抗结直肠癌活性，我们建立了小鼠HCT-116结直肠癌移植瘤模型。经过连续19天的给药我们发现化合物9c和SAHA在给予的剂量下均有明显的抗肿瘤活性，化合物9c的平均抑瘤率可达68.8％。与生理盐水对照组相比，化合物9c减少肿瘤组织体积与给药量呈正相关。与阳性对照组相比，化合物9c的抗肿瘤效果优于RVX-208和SAHA，并且对小鼠的整体体重影响较小，提示化合物9c对肿瘤细胞具有一定的选择性。免疫组化实验结果显示c-Myc的表达在RVX-208组和化合物9c组明显下调，由于BRD4可促进c-Myc的表达，说明BRD4有被抑制可能；Ac-H3的表达在SAHA组和化合物9c组明显上调，说明HDACs的活性被抑制，使体内乙酰化的组蛋白增多；Ki-67检测肿瘤细胞增殖比率的实验中，可将大部分G0期以外的细胞标记,Ki-67的阳性率越高，说明处于增殖周期的细胞比例越高，肿瘤生长越快，化合物9c组Ki-67的阳性率明显降低，提示增殖周期的细胞比例减少，肿瘤生长被抑制；TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡实验中，将凋亡细胞断裂的DNA的3-OH末端进行标记的染色，因而TUNEL的阳性率越高，说明凋亡的细胞比例越大，化合物9c组TUNEL染色阳性率明显增加，提示经化合物9c治疗后凋亡的肿瘤细胞比例很大(图5)。对此，我们得出化合物9c在体内基于BRD4/HDAC双靶点的作用机制，具有良好的抗结直肠癌活性，并且对癌细胞具有一定的选择性。

Claims (13)

1.噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物，其特征在于：其结构为式Ⅰ或式Ⅱ所示：
Figure FDA0002967977520000011
其中，R1为氢、C1-C4烷基或苄基；
R2为C1-C5亚烷基、
Figure FDA0002967977520000012
Figure FDA0002967977520000013
R3为羟基、氨基或
Figure FDA0002967977520000014
2.根据权利要求1所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物，其特征在于：R1为C1-C4烷基。
3.根据权利要求2所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物，其特征在于：R1为甲基。
4.根据权利要求1所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物，其特征在于：R3为羟基或
Figure FDA0002967977520000015
5.根据权利要求4所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物，其特征在于：R3为羟基。
6.根据权利要求1～5任一项所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物，其特征在于：结构为式Ⅰ所示。
7.根据权利要求1所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物，其特征在于，其结构为下述结构式中的任一种：
Figure FDA0002967977520000016
Figure FDA0002967977520000021
8.权利要求1～7任一项所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物的可药用的盐。
9.权利要求1～7任一项所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物在制备BRD4抑制剂中的用途。
10.权利要求1～7任一项所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物在制备HDACs抑制剂中的用途。
11.权利要求1～7任一项所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途，其特征在于：所述肿瘤为结直肠癌。
13.一种药物组合物，其特征在于：由有效成分和药学上可接受的辅料组成，所述有效成分包含治疗有效量的权利要求1～7任一项所述的噻吩并[2,3-d]嘧啶基异羟肟酸衍生物或其可药用的盐。
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