CN111187812A - 使用低量总rna的直接测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用低量总RNA的直接测序方法，属于生物技术和分子生物学领域，包括以下步骤：微量样本总RNA的提取及其质量检测、起始总RNA的反转录和扩增富集、利用纳米孔测序仪进行RNA直接测序。本发明提供的测序方法无需进行mRNA纯化，或是将rRNA去除，节约实验时间和成本，所需最低起始量的样本核酸量可低至1‑3μg，能够实现那些获取大量总RNA困难的稀有样本测序，在稀有样本和特殊样本等多个测序领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和分子生物学领域，尤其涉及一种使用低量总RNA的直接测序方法。
背景技术
目前，以Illumina为代表的第二代测序平台测得的短读长仅能覆盖转录本的长度，因此依赖计算重构准确的异构体组装非常困难，同时短读长也表现出高比率的多重定位，因此纳米孔测序技术，又称第三代或第四代测序技术应运而生。使用纳米孔测序技术不仅没有读长上限的限制，还能实现对整个转录本进行单读长的端到端测序，真正实现了简单、准确的组装并能对高度相似的异构体进行区分，所以新一代的纳米孔测序技术已经成为研究RNA直接测序的一种新的且更为有效的方式。
目前，RNA直接测序技术对样本的起始RNA量要求较高，对于那些无法达到最低上样量的样本是无法进行测序分析的，但在许多情况下，例如在生殖发育生物学、干细胞、癌症、考古学、临床诊断等多个研究领域中，都无法获得足够上样数量的总RNA。因为上述研究中均涉及微量且稀有的样本，无法满足目前RNA直接测序的基本RNA量的需求，这无疑阻碍了RNA直接测序这项新技术的进一步应用与发展，因此，本领域迫切需要在传统RNA直接测序方法的技术之上建立一种针对微量样本的RNA直接测序方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用低量总RNA的直接测序方法，该方法无需进行mRNA纯化，或是将rRNA去除，而是直接使用总RNA进行测序的方法，同时对样本总RNA的需求量小，仅需要1-3μg的起始总RNA即可，能实现那些难以获得较大样本量样品的测序工作。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种使用低量总RNA的直接测序方法，所述方法包括以下步骤：
提取微量样本总RNA并进行质量检测，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为1-3μg；
将起始总RNA进行反转录和扩增富集后得到cDNA，并对所述cDNA进行浓度和质量检测；
利用所述cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用纳米孔测序仪进行测序。
作为优选，所述微量样本包括细胞样本和组织样本。
作为优选，所述细胞样本包括人类大肠癌细胞和骨髓瘤细胞，组织样本包括尤文肉瘤组织。
作为优选，所述起始总RNA进行扩增富集采用如下步骤：
在所述起始总RNA上通过第一次连接反应连接反转接头，得到反转接头-RNA；
所述反转接头-RNA在超级反转录酶的作用下进行反转录反应，得到cDNA，然后利用磁珠纯化所述cDNA，得到纯化后的cDNA；
所述纯化后的cDNA通过第二次连接反应连接RNA测序接头，得到测序接头-cDNA，然后利用磁珠纯化所述测序接头-cDNA，得到纯化后的测序接头-cDNA，并检测所述测序接头-cDNA的回收量＞500ng。
作为优选，所述第一次连接反应的反应条件为20-25℃反应1-1.5h。
作为优选，所述第一次连接反应的反应体系为：
起始总RNA 7.5μl、连接反应缓冲液3.0μl、反转接头2.0μl、DNA连接酶2.0μl、RNA标准链0.5μl，共计15.0μl。
作为优选，所述反转录反应的反应体系为：向完成所述第一次连接反应的体系中加入无酶水9.0μl、dNTPs 2.0μl、反应缓冲液8.0μl、DTT 4.0μl、超级反转录酶2.0μl；所述反转录反应的反应条件为50℃，50min；70℃，10min，4℃，保持。
作为优选，所述第二次连接反应的反应条件为20-25℃反应1-1.5h。
作为优选，所述第二次连接反应的反应体系为：
cDNA 20.0μl、连接反应缓冲液8.0μl、测序接头6.0μl、DNA连接酶3.0μl、无酶水3.0μl，共计40.0μl。
作为优选，利用Qubit DNA HS Assay检测纯化后的测序接头-cDNA的回收量。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明提供的使用低量总RNA的直接测序方法，有以下优点：(1)无需进行mRNA纯化，或是将rRNA去除，节约实验时间和成本；(2)对样品的需求量小，仅需要1-3μg的起始总RNA，能够实现那些难以获得大量总RNA的稀有样本的测序工作；(3)利用该测序方法得出的测序结果与现有技术中RNA直接测序方法推荐的起始总RNA使用量测得的结果无明显差异。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的使用低量总RNA的直接测序方法流程图；
图2为本发明实施例所提供的总RNA的质量检测结果图；
图3为本发明实施例所提供的RT-PCR结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种使用低量总RNA的直接测序方法，所述方法包括以下步骤：
提取微量样本总RNA并进行质量检测，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为1-3μg；
将起始总RNA进行反转录和扩增富集后得到cDNA，并对所述cDNA进行浓度和质量检测；
利用所述cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用纳米孔测序仪进行测序。
在一优选实施例中，所述微量样本包括细胞样本和组织样本。
在一优选实施例中，所述细胞样本包括人类大肠癌细胞和骨髓瘤细胞，组织样本包括尤文肉瘤组织。
在一优选实施例中，所述起始总RNA进行扩增富集采用如下步骤：
在所述起始总RNA上通过第一次连接反应连接反转接头，得到反转接头-RNA；
所述反转接头-RNA在超级反转录酶的作用下进行反转录反应，得到cDNA，然后利用磁珠纯化所述cDNA，得到纯化后的cDNA；
所述纯化后的cDNA通过第二次连接反应连接RNA测序接头，得到测序接头-cDNA，然后利用磁珠纯化所述测序接头-cDNA，得到纯化后的测序接头-cDNA，并检测所述测序接头-cDNA的回收量＞500ng。
在一优选实施例中，所述第一次连接反应的反应条件为20-25℃反应1-1.5h。
在上述优选实施例中，将第一次连接反应的反应时长限定在1-1.5h的原因在于：由于起始RNA的含量过低，为了使其最大限度的连接上反转序接头，如果反应时间过短，会直接影响到最终的检测结果。
在一优选实施例中，所述第一次连接反应的反应体系为：
起始总RNA 7.5μl、连接反应缓冲液3.0μl、反转接头2.0μl、DNA连接酶2.0μl、RNA标准链0.5μl，共计15.0μl。
在一优选实施例中，所述反转录反应的反应体系为：向完成所述第一次连接反应的体系中加入无酶水9.0μl、dNTPs 2.0μl、反应缓冲液8.0μl、DTT 4.0μl、超级反转录酶2.0μl；所述反转录反应的反应条件为50℃，50min；70℃，10min，4℃，保持。
在一优选实施例中，所述第二次连接反应的反应条件为20-25℃反应1-1.5h。
在上述优选实施例中，将第二次连接反应的反应时长限定在1-1.5h的原因在于：由于起始RNA的含量过低，为了使反转录得到的cDNA最大限度的连接上测序接头，如果反应时间过短，会直接影响到最终的检测结果。
在一优选实施例中，所述第二次连接反应的反应体系为：
cDNA 20.0μl、连接反应缓冲液8.0μl、测序接头6.0μl、DNA连接酶3.0μl、无酶水3.0μl，共计40.0μl。
在一优选实施例中，利用Qubit DNA HS Assay检测纯化后的测序接头-cDNA的回收量。
需要进一步说明的是，传统的测序方法由于样本总RNA中含有多种不同的RNA，如rRNA、tRNA和非编码RNA等，因此需要利用Oligo dT等方法将mRNA从总RNA中纯化出来，或者将rRNA(占总RNA的90％)从总RNA中去除后，再进行后续的测序工作，但本发明提供了一种使用低量总RNA的直接测序方法，该测序方法不需要进行mRNA纯化，可以利用总RNA进行直接测序，这不仅节约了时间，还节省了实验成本；本发明提供的测序方法对那些难以获得大量总RNA的稀有样本和特殊样本非常友好，起始RNA含量仅为1-3μg就能达到测序要求，并且经过验证后发现本发明提供的测序方法得出的测序结果与现有技术中的RNA直接测序方法推荐的起始总RNA(大约30-50μg)使用量测得的结果无明显差异，但我们的起始量只有推荐起始量的十分之一，甚至还不到。这说明利用本发明提供的测序方法得到的实验结果是十分可靠的。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的一种使用低量总RNA的直接测序方法，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1：使用低量总RNA的直接测序方法测定肿瘤总RNA序列
本次实验中选用的样本为疣文肉瘤组织总RNA，具体测序步骤如下：
S1、微量样本总RNA的提取及其质量检测：
微量样本总RNA作为起始总RNA，起始总RNA使用安捷伦RNA 6000 Nano试剂盒进行质量检测，测定该起始总RNA integrity number(RIN,RNA完整度)，测定结果如图2所示；
S2、起始总RNA的扩增富集：
S2-1：将7.5μl起始总RNA(2μg)与3.0μl连接反应缓冲液、0.5μl RNA标准链、2.0μl反转接头(RTA)和2μl T4 DNA连接酶混合于PCR试管中，并用ddH2O补足体系至15μl；离心后，放入预设为25℃的PCR仪中反应1h；
S2-2：取出PCR试管，放置于冰上，向其中加入9.0μl无酶水、2.0μl dNTPs(10mM)、8.0μl反应缓冲液和4.0μl DTT(0.1M)混匀，离心后，加入2μl of超级反转录酶，再次混匀离心后放入预设为50℃的PCR仪中进行反应，反应条件为：50℃，50min；70℃，10min；4℃，保持，得到cDNA；
S2-3：将200μl的XP磁珠溶液从4℃转至室温预热30min；
S2-4：将置于4℃保持的PCR试管中的样品和试剂转入1.5ml的试管中，涡旋混匀至磁珠悬液颜色均一后，向反应液中加入72μl的磁珠溶液，吹打至少10次以混匀混合液，室温静置5min；
S2-5：将上述装有样品和试剂的1.5ml试管放在磁力架上分离磁珠，静置至少5min，直至上清液完全澄清后，完全移弃上清；
S2-6：向上述步骤的试管中加入200μl的80％乙醇，室温下静置至少30s后，移弃上清，重复操作该步骤一次；
S2-7：将上述试管放置于磁力架上，室温静置5min，挥发残留的乙醇，然后从磁力架上移走试管，加入20μl的水重悬吹打或振荡混匀磁珠后，室温放置5min，然后将试管放置在磁力架上，待溶液澄清后，转移至PCR试管中；
S2-8：向上述步骤的PCR试管中加入20.0μl cDNA、8.0μl连接反应缓冲液、6.0μl测序接头、3.0μl无酶水和3.0μl T4 DNA连接酶混匀离心后，放入预设为25℃的PCR仪中，反应1h；
S2-9：将上述PCR试管中的液体全部转入一个1.5ml的试管中，涡旋混匀至磁珠悬液颜色均一，向反应液中加入40μl的磁珠溶液，吹打至少10次以混匀混合液，室温静置5min；
S2-10：将上述试管放置于磁力架上分离磁珠，静置至少5min，直至上清液完全澄清，移弃上清后加入150μl的Wash Buffer(WSB)，吹打至少20次以混匀混合液，移弃上清后，重复该操作一次，然后加入21μl的Elution Buffer重悬吹打或振荡混匀磁珠，室温放置5min后，将试管放置在磁力架上，溶液澄清后，转移至1.5ml的试管中，然后取出1μl检测纯化后的测序接头-cDNA；
S3、RNA直接测序：取20μl纯化后的测序接头-cDNA(大约400ng)，利用MinlON纳米孔测序仪对纯化后的测序接头-cDNA进行测序，得出测序结果进行数据分析，结果如下：
表1肿瘤总RNA直接测序结果
注释：hg38是人类参考基因组。
从直接测序数据中检测出的融合基因发现，有5个读数都指向了同一个融合基因，下面是其中一个读数：
>read 3e13c9ce-e90f-4e2e-8332-e38aa62c5749
ACCGTTGAGAACGAAGGAGAAAATGGCGTCACGGATTACATAAGATGGCACAAGCTGCTGGCGCTGACGGGCTCCACAGTGCTTACACCGCCCAGCCCACAAAGAACGGCCAGACTCCAGGCAACGGGCAACAAGGACTAACGGAACCTTAAGCAAGCCCTTGATGTCAGCTAATACCAGGCTTCAGACATGGCATATGGCAGACCGCCTATGCATTCATGGACAGCCTCCCACTGGTTGCATAACTCCGTGGCCCAGGCATCTGGCACAGCACATGACGGGATGGCACTGGTGTTATGATACCACTGCTACAGTTCTCACTCAGGCCTCTATGCTGGACTCAGTCTGCTGCACTAGCCTGCTTTGCCACGAGCCAACGGTTGGACAGCCAGCAGCACACTAGCACCTACAAGACATGGCAGGATGGGATCAAGCCTCAAGATGGTTTAACCTCAACAAAGCACAGGTAACATCTCCTGGTCCAGCACCGAGATCAGAGTAAACTTATAGTTAATTCCCAGGTACCAAAAGAGGATACCCCATGCAGCCAGTCTTGGTCACCTCCATCCTACCCTCCTACCAGCTATTCCTCTACACTGATGAACAGTTAGATCAGAGCAGTTACTACCGAGCAGAACACCTGCAGGCAACTTCGAGCTGGACTGGACAAATAGAGTAGCTGGTCAACAAGGTAAGCTTGGCTGGTCCCTCCATGTTACCCACCCCAAACAAGATCCTCAAGCACGGGTCCAAGTGCAATAGCCGCCAACAGAGCAAGCAGCTACGGGCTGGAAGAGTTTAACCGACAGGTTACCCAGAGTAGCACGGTGTTTATGGCAGGAGTTGGAGATTCCGGACACGAGAGAACCAGAGCATGAGTGGGCCTGAATAACCACGATACAGGAGGAAGAGGATCGTGATCGTGGAGGGTGAGCAGAGTGGGCGGGACGCAGGTAGAATGCAGGTTTTAACAGACCAGCTTACCAGCGACGCACCGGCAGAATCCTCATGTACGGGGAGCCGCCTGCCTGAGTGCGGAAGGCCTTCTGACAGCAGGAGCACCTGCAGCGCCACCGCGACACGCACACCCGGCAATACCAGCTGGTCCGGGCTCCGCGCTGTTCGCCTTGCCCGCCCAGAAGCCCCACGCGTGCTGCGAGTGTAGCAAGACACTGGCGCGAGCACCTGGTGCGCCACCGTTGGATGCTCGGGAGCGGCCATTGCCTGTCGAGTGTGGCGCAGGGTCACGACGCCGCGAGCGCGTGCTGCGTCACAGCTGCGCACAGCCAGGCAAGCGGCGGGCACAGCGCTACGGGCGGTAGCTCCAGGCCCGGATGGTAGAGGCCCTTCCCGCCCTGGCCCACGGTTAGCCGCCTACCCGGCCAGCGCGCAACCTGGTGTCCCGGGCAGTACCTGCTACACCCAGCTCTGCCTTCCCCTTCTTCCTCCTTCCCTCCCATCGTCCTTCCACCCTGCACCCTCCTGTCTGAACTCCCAACGCCACCAAACCACCAACCTTTCCCCAAATTTCCTTTCCAAGGTCTCCTCAGCCCCTTTACACCTGATTACCGGCCTCTCTGGTGAAGGCCTCTCCCTAATGTCTCCTTCCCCTTCACTCTCCTCATTGCCCAAGCCTCCTCCATTCCCTGCCCTTTTCCTGCCTGAAGAGCAGAGGGTCGACCTGGGACCTGAGTGGCGTCCAGGAGGAGCTGGGACACGCAGGGCCAGGCCCCTTGTGAAGCAGTGAAGAAAAGCTTGGGTTTGTCCCTGGGGAATTACCTCCGGGGAGATTGGGGTTGGGTAGCGAGCGGACAATCTGAAGCTGAACCCAGGGCCTGGCTGTGGTCAAAGCTTTGCTATCCAGCGACCTGGCGGGATGGCAGGATGCCTGCCCCGAAGCTGTTGGGGCAGTTTTCACCAGCAACACGGTATTGGTCTTGTGTAGACACCGGAAATCCTCCATACCCCAACCCTCATTATTTTCATTATTCAACATCTTAACCCACAAATGG
根据和人类参考基因组hg38的比对发现，上述读数中的一部分比对到了chr22:29272382-29287128，另一部分则比对到了chr19:56159806-56160856，指向的两个基因分别是EWSR1和ZNF444，然后利用RT-PCR和Sanger测序法证实了这个融合基因，其中RT-PCR结果如图3所示：
ATGGCGTCCACGGATTACAGTACCTATAGCCAAGCTGCAGCGCAGCAGGGCTACAGTGCTTACACCGCCCAGCCCACTCAAGGATATGCACAGACCACCCAGGCATATGGGCAACAAAGCTATGGAACCTATGGACAGCCCACTGATGTCAGCTATACCCAGGCTCAGACCACTGCAACCTATGGGCAGACCGCCTATGCAACTTCTTATGGACAGCCTCCCACTGGTTATACTACTCCAACTGCCCCCCAGGCATACAGCCAGCCTGTCCAGGGGTATGGCACTGGTGCTTATGATACCACCACTGCTACAGTCACCACCACCCAGGCCTCCTATGCAGCTCAGTCTGCATATGGCACTCAGCCTGCTTATCCAGCCTATGGGCAGCAGCCAGCAGCCACTGCACCTACAAGACCGCAGGATGGAAACAAGCCCACTGAGACTAGTCAACCTCAATCTAGCACAGGGGGTTACAACCAGCCCAGCCTAGGATATGGACAGAGTAACTACAGTTATCCCCAGGTACCTGGGAGCTACCCCATGCAGCCAGTCACTGCACCTCCATCCTACCCTCCTACCAGCTATTCCTCTACACAGCCGACTAGTTATGATCAGAGCAGTTACTCTCAGCAGAACACCTATGGGCAACCGAGCAGCTATGGACAGCAGAGTAGCTATGGTCAACAAAGCAGCTATGGGCAGCAGCCTCCCACTAGTTACCCACCCCAAACTGGATCCTACAGCCAAGCTCCAAGTCAATATAGCCAACAGAGCAGCAGCTACGGGCAGCAGAGTTCATTCCGACAGGACCACCCCAGTAGCATGGGTGTTTATGGGCAGGAGTCTGGAGGATTTTCCGGACCAGGAGAGAACCGGAGCATGAGTGGCCCTGATAACCGGGGCAGGGGAAGAGGGGGATTTGATCGTGGAGGCATGAGCAGAGGTGGGCGGGGAGGAGGACGCGGTGGAATGGGGTTTTT CAACAGACCAGCTCACCTGCTGCGCCACCGGCAGAGCCACTCGGGCGAGAAGCCGCACGCCTGCCCTGAGTGCGGGAAGGCCTTTCGGCGCAAGGAGCACCTGCGGCGCCACCGCGACACGCACCCCGGCAGCCCCGGCAGCCCCGGGCCCGCGCTGCGCCCTCTGCCCGCCCGTGAGAAGCCCCACGCGTGCTGCGAGTGTGGCAAGACCTTCTACTGGCGCGAGCACCTGGTGCGCCACCGCAAGACGCACTCGGGAGCGCGGCCCTTTGCCTGCTGGGAGTGTGGCAAGGGCTTCGGGCGCCGCGAGCACGTGCTGCGCCACCAGCGCATCCACGGCCGGGCAGCGGCCAGCGCGCAGGGGGCGGTAGCTCCGGGCCCGGATGGTGGAGGCCCCTTCCCGCCCTGGCCCTTGGGTTAG序列注释：①ATG为起始密码子，TAG为终止密码子；②ATG与GTTTTTCAACAG之间的序列是EWSR1基因的第一到第八号外显子；③GTTTTTCAACAG是插入序列；④GTTTTTCAACAG与TAG之间的序列是ZNF444基因的第五号外显子；⑤此融合基因编码的蛋白序列，序列如下：
5’-3’Frame 1
MetASTDYSTYSQAAAQQGYSAYTAQPTQGYAQTTQAYGQQSYGTYGQPTDVSYTQAQTTATYGQTAYATSYGQPPTGYTTPTAPQAYSQPVQGYGTGAYDTTTATVTTTQASYAAQSAYGTQPAYPAYPAYGQQPAATAPTRPQDGNKPTETSQPQSSTGGYNQPSLGYGQSNYSYPQVPGSYPMetQPVTAPPSYPPTSYSSTQPTSYDQSSYSQQQSSPRQDHPSSMetGVYGQESGGFSGPGENRSMetSGPDNRGRGRGGFDRGGMetSRGGRGGGRGGMetGFFNRPAHLLRHRQSHSGEKPHACPECGKAFRRKEHLRRHRDTHPGSPGPALRPLPAREKPHACCECGKTFYWREHLVRHRKTHSGARPFACWECGKGFGRREHVLRHQRIJGRAAASAQGAVAPGPDGGGPFPPWPLG Stop
实施例2：使用低量总RNA的直接测序方法测定人类大肠癌细胞系HCT116总RNA序列
本次实验中选用的样本为人类大肠癌细胞系HCT116，具体测序步骤如下：
S1、微量样本总RNA的提取及其质量检测：
微量样本总RNA作为起始总RNA，起始总RNA使用安捷伦RNA 6000 Nano试剂盒进行质量检测，测定该起始总RNA integrity number(RIN,RNA完整度)；
S2、起始总RNA的扩增富集：
S2-1：将7.5μl起始总RNA(2μg)与3.0μl连接反应缓冲液、0.5μl RNA标准链、2.0μl反转接头(RTA)和2μl T4 DNA连接酶混合于PCR试管中，并用ddH2O补足体系至15μl；离心后，放入预设为25℃的PCR仪中反应1h；
S2-2：取出PCR试管，放置于冰上，向其中加入9.0μl无酶水、2.0μl dNTPs(10mM)、8.0μl反应缓冲液和4.0μl DTT(0.1M)混匀，离心后，加入2μl of超级反转录酶，再次混匀离心后放入预设为50℃的PCR仪中进行反应，反应条件为：50℃，50min；70℃，10min；4℃，保持，得到cDNA；
S2-3：将200μl的磁珠溶液从4℃转至室温预热30min；
S2-4：将置于4℃保持的PCR试管中的样品和试剂转入1.5ml的试管中，涡旋混匀至磁珠悬液颜色均一后，向反应液中加入72μl的磁珠溶液，吹打至少10次以混匀混合液，室温静置5min；
S2-5：将上述装有样品和试剂的1.5ml试管放在磁力架上分离磁珠，静置至少5min，直至上清液完全澄清后，完全移弃上清；
S2-6：向上述步骤的试管中加入200μl的80％乙醇，室温下静置至少30s后，移弃上清，重复操作该步骤一次；
S2-7：将上述试管放置于磁力架上，室温静置5min，挥发残留的乙醇，然后从磁力架上移走试管，加入20μl的水重悬吹打或振荡混匀磁珠后，室温放置5min，然后将试管放置在磁力架上，待溶液澄清后，转移至PCR试管中；
S2-8：向上述步骤的PCR试管中加入20.0μl cDNA、8.0μl连接反应缓冲液、6.0μl测序接头、3.0μl无酶水和3.0μl T4 DNA连接酶混匀离心后，放入预设为25℃的PCR仪中，反应1h；
S2-9：将上述PCR试管中的液体全部转入一个1.5ml的试管中，涡旋混匀至磁珠悬液颜色均一，向反应液中加入40μl的磁珠溶液，吹打至少10次以混匀混合液，室温静置5min；
S2-10：将上述试管放置于磁力架上分离磁珠，静置至少5min，直至上清液完全澄清，移弃上清后加入150μl的Wash Buffer(WSB)，吹打至少20次以混匀混合液，移弃上清后，重复该操作一次，然后加入21μl的Elution Buffer重悬吹打或振荡混匀磁珠，室温放置5min后，将试管放置在磁力架上，溶液澄清后，转移至1.5ml的试管中，将试管放置在磁力架上，溶液澄清后，转移至1.5ml的试管中，然后取出1μl,检测纯化后的测序接头-cDNA回收量；
S3、RNA直接测序：取20μl纯化后的测序接头-cDNA(大约240ng)，利用MinlON纳米孔测序仪对纯化后的测序接头-cDNA进行测序，得出测序结果进行数据分析，结果如下：
表2人类大肠癌细胞系HCT116 RNA直接测序结果
注释：hg38是人类参考基因组。
实施例3:使用低量总RNA的直接测序方法测定三个骨髓瘤细胞系N082、N105和N122总RNA序列测序
本次实验中选用的样本为骨髓瘤细胞系N082、N105和N122，具体测序步骤如下：
S1、微量样本总RNA的提取及其质量检测：
骨髓瘤细胞系N082、N105和N122总RNA作为起始总RNA，起始总RNA使用安捷伦RNA6000 Nano试剂盒进行质量检测，测定该肿瘤总RNA integrity number(RIN,RNA完整度)；
S2、起始总RNA的扩增富集：
S2-1：将7.5μl起始总RNA(2.5μg)与3.0μl连接反应缓冲液、0.5μl RNA标准链、2.0μl反转接头(RTA)和2μl T4 DNA连接酶混合于PCR试管中，并用ddH2O补足体系至15μl；离心后，放入预设为25℃的PCR仪中反应1h；
S2-2：取出PCR试管，放置于冰上，向其中加入9.0μl无酶水、2.0μl dNTPs(10mM)、8.0μl反应缓冲液和4.0μl DTT(0.1M)混匀，离心后，加入2μl of超级反转录酶，再次混匀离心后放入预设为50℃的PCR仪中进行反应，反应条件为：50℃，50min；70℃，10min；4℃，保持，得到cDNA；
S2-3：将200μl的磁珠溶液从4℃转至室温预热30min；
S2-4：将置于4℃保持的PCR试管中的样品和试剂转入1.5ml的试管中，涡旋混匀至磁珠悬液颜色均一后，向反应液中加入72μl的磁珠溶液，吹打至少10次以混匀混合液，室温静置5min；
S2-5：将上述装有样品和试剂的1.5ml试管放在磁力架上分离磁珠，静置至少5min，直至上清液完全澄清后，完全移弃上清；
S2-6：向上述步骤的试管中加入200μl的80％乙醇，室温下静置至少30s后，移弃上清，重复操作该步骤一次；
S2-7：将上述试管放置于磁力架上，室温静置5min，挥发残留的乙醇，然后从磁力架上移走试管，加入20μl的水重悬吹打或振荡混匀磁珠后，室温放置5min，然后将试管放置在磁力架上，待溶液澄清后，转移至PCR试管中；
S2-8：向上述步骤的PCR试管中加入20.0μl cDNA、8.0μl连接反应缓冲液、6.0μl测序接头、3.0μl无酶水和3.0μl T4 DNA连接酶混匀离心后，放入预设为25℃的PCR仪中，反应1h；
S2-9：将上述PCR试管中的液体全部转入一个1.5ml的试管中，涡旋混匀至磁珠悬液颜色均一，向反应液中加入40μl的磁珠溶液，吹打至少10次以混匀混合液，室温静置5min；
S2-10：将上述试管放置于磁力架上分离磁珠，静置至少5min，直至上清液完全澄清，移弃上清后加入150μl的Wash Buffer(WSB)，吹打至少20次以混匀混合液，移弃上清后，重复该操作一次，然后加入21μl的Elution Buffer重悬吹打或振荡混匀磁珠，室温放置5min后，将试管放置在磁力架上，溶液澄清后，转移至1.5ml的试管中，将试管放置在磁力架上，溶液澄清后，转移至1.5ml的试管中，然后取出1μl,检测纯化后的测序接头-cDNA回收量；
S3、RNA直接测序：取20μl纯化后的测序接头-cDNA(N082 980ng，N104 1600ng，N122 1100ng)，利用MinlON纳米孔测序仪对纯化后的测序接头-cDNA进行测序，得出测序结果进行数据分析，结果如下：
表3骨髓瘤细胞系N082 RNA直接测序结果
注释：hg38是人类参考基因组。
表4骨髓瘤细胞系N104 RNA直接测序结果
注释：hg38是人类参考基因组。
表5骨髓瘤细胞系N122 RNA直接测序结果
注释：hg38是人类参考基因组。
通过对比表3-5中的数据可以看出，尽管三个样品的起始总RNA是一样的，但由于三个样品的RNA质量有所差别，RIN值从9.7到8.8(RIN值越高，说明RNA的质量越好，最高值为10，RIN值低于5的RNA样品不建议使用此方法测序)，最终得到的连有测序接头的cDNA量从980ng到1600ng不等。随着cDNA量的增加，总读数，比对到编码蛋白基因的读数，长链非编码RNA的读数均有增加，同时检测到的转录本数目也显著增加。我们也发现N104样品的最长读数是51kb,而N082和N122的最长读数只有15kb和9.9kb,这也反映了RNA的质量越好，得到的最长读数也长。
序列表
<110> 青岛普泽麦迪生物技术有限公司
<120> 使用低量总RNA的直接测序方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2012
<212> DNA
<213> 3e13c9ce-e90f-4e2e-8332-e38aa62c5749
<400> 1
1 ACCGTTGAGA ACGAAGGAGA AAATGGCGTC ACGGATTACA TAAGATGGCA CAAGCTGCTG
61 GCGCTGACGG GCTCCACAGT GCTTACACCG CCCAGCCCAC AAAGAACGGC CAGACTCCAG
121 GCAACGGGCA ACAAGGACTA ACGGAACCTT AAGCAAGCCC TTGATGTCAG CTAATACCAG
181 GCTTCAGACA TGGCATATGG CAGACCGCCT ATGCATTCAT GGACAGCCTC CCACTGGTTG
241 CATAACTCCG TGGCCCAGGC ATCTGGCACA GCACATGACG GGATGGCACT GGTGTTATGA
301 TACCACTGCT ACAGTTCTCA CTCAGGCCTC TATGCTGGAC TCAGTCTGCT GCACTAGCCT
361 GCTTTGCCAC GAGCCAACGG TTGGACAGCC AGCAGCACAC TAGCACCTAC AAGACATGGC
421 AGGATGGGAT CAAGCCTCAA GATGGTTTAA CCTCAACAAA GCACAGGTAA CATCTCCTGG
481 TCCAGCACCG AGATCAGAGT AAACTTATAG TTAATTCCCA GGTACCAAAA GAGGATACCC
541 CATGCAGCCA GTCTTGGTCA CCTCCATCCT ACCCTCCTAC CAGCTATTCC TCTACACTGA
601 TGAACAGTTA GATCAGAGCA GTTACTACCG AGCAGAACAC CTGCAGGCAA CTTCGAGCTG
661 GACTGGACAA ATAGAGTAGC TGGTCAACAA GGTAAGCTTG GCTGGTCCCT CCATGTTACC
721 CACCCCAAAC AAGATCCTCA AGCACGGGTC CAAGTGCAAT AGCCGCCAAC AGAGCAAGCA
781 GCTACGGGCT GGAAGAGTTT AACCGACAGG TTACCCAGAG TAGCACGGTG TTTATGGCAG
841 GAGTTGGAGA TTCCGGACAC GAGAGAACCA GAGCATGAGT GGGCCTGAAT AACCACGATA
901 CAGGAGGAAG AGGATCGTGA TCGTGGAGGG TGAGCAGAGT GGGCGGGACG CAGGTAGAAT
961 GCAGGTTTTA ACAGACCAGC TTACCAGCGA CGCACCGGCA GAATCCTCAT GTACGGGGAG
1021 CCGCCTGCCT GAGTGCGGAA GGCCTTCTGA CAGCAGGAGC ACCTGCAGCG CCACCGCGAC
1081 ACGCACACCC GGCAATACCA GCTGGTCCGG GCTCCGCGCT GTTCGCCTTG CCCGCCCAGA
1141 AGCCCCACGC GTGCTGCGAG TGTAGCAAGA CACTGGCGCG AGCACCTGGT GCGCCACCGT
1201 TGGATGCTCG GGAGCGGCCA TTGCCTGTCG AGTGTGGCGC AGGGTCACGA CGCCGCGAGC
1261 GCGTGCTGCG TCACAGCTGC GCACAGCCAG GCAAGCGGCG GGCACAGCGC TACGGGCGGT
1321 AGCTCCAGGC CCGGATGGTA GAGGCCCTTC CCGCCCTGGC CCACGGTTAG CCGCCTACCC
1381 GGCCAGCGCG CAACCTGGTG TCCCGGGCAG TACCTGCTAC ACCCAGCTCT GCCTTCCCCT
1441 TCTTCCTCCT TCCCTCCCAT CGTCCTTCCA CCCTGCACCC TCCTGTCTGA ACTCCCAACG
1501 CCACCAAACC ACCAACCTTT CCCCAAATTT CCTTTCCAAG GTCTCCTCAG CCCCTTTACA
1561 CCTGATTACC GGCCTCTCTG GTGAAGGCCT CTCCCTAATG TCTCCTTCCC CTTCACTCTC
1621 CTCATTGCCC AAGCCTCCTC CATTCCCTGC CCTTTTCCTG CCTGAAGAGC AGAGGGTCGA
1681 CCTGGGACCT GAGTGGCGTC CAGGAGGAGC TGGGACACGC AGGGCCAGGC CCCTTGTGAA
1741 GCAGTGAAGA AAAGCTTGGG TTTGTCCCTG GGGAATTACC TCCGGGGAGA TTGGGGTTGG
1801 GTAGCGAGCG GACAATCTGA AGCTGAACCC AGGGCCTGGC TGTGGTCAAA GCTTTGCTAT
1861 CCAGCGACCT GGCGGGATGG CAGGATGCCT GCCCCGAAGC TGTTGGGGCA GTTTTCACCA
1921 GCAACACGGT ATTGGTCTTG TGTAGACACC GGAAATCCTC CATACCCCAA CCCTCATTAT
1981 TTTCATTATT CAACATCTTA ACCCACAAAT GG
<210> 2
<211> 1402
<212> DNA
<213> 2
<400> 2
1 ATGGCGTCCA CGGATTACAG TACCTATAGC CAAGCTGCAG CGCAGCAGGG CTACAGTGCT
61 TACACCGCCC AGCCCACTCA AGGATATGCA CAGACCACCC AGGCATATGG GCAACAAAGC
121 TATGGAACCT ATGGACAGCC CACTGATGTC AGCTATACCC AGGCTCAGAC CACTGCAACC
181 TATGGGCAGA CCGCCTATGC AACTTCTTAT GGACAGCCTC CCACTGGTTA TACTACTCCA
241 ACTGCCCCCC AGGCATACAG CCAGCCTGTC CAGGGGTATG GCACTGGTGC TTATGATACC
301 ACCACTGCTA CAGTCACCAC CACCCAGGCC TCCTATGCAG CTCAGTCTGC ATATGGCACT
361 CAGCCTGCTT ATCCAGCCTA TGGGCAGCAG CCAGCAGCCA CTGCACCTAC AAGACCGCAG
421 GATGGAAACA AGCCCACTGA GACTAGTCAA CCTCAATCTA GCACAGGGGG TTACAACCAG
481 CCCAGCCTAG GATATGGACA GAGTAACTAC AGTTATCCCC AGGTACCTGG GAGCTACCCC
541 ATGCAGCCAG TCACTGCACC TCCATCCTAC CCTCCTACCA GCTATTCCTC TACACAGCCG
601 ACTAGTTATG ATCAGAGCAG TTACTCTCAG CAGAACACCT ATGGGCAACC GAGCAGCTAT
661 GGACAGCAGA GTAGCTATGG TCAACAAAGC AGCTATGGGC AGCAGCCTCC CACTAGTTAC
721 CCACCCCAAA CTGGATCCTA CAGCCAAGCT CCAAGTCAAT ATAGCCAACA GAGCAGCAGC
781 TACGGGCAGC AGAGTTCATT CCGACAGGAC CACCCCAGTA GCATGGGTGT TTATGGGCAG
841 GAGTCTGGAG GATTTTCCGG ACCAGGAGAG AACCGGAGCA TGAGTGGCCC TGATAACCGG
901 GGCAGGGGAA GAGGGGGATT TGATCGTGGA GGCATGAGCA GAGGTGGGCG GGGAGGAGGA
961 CGCGGTGGAA TGGGGTTTTT CAACAGACCA GCTCACCTGC TGCGCCACCG GCAGAGCCAC
1021 TCGGGCGAGA AGCCGCACGC CTGCCCTGAG TGCGGGAAGG CCTTTCGGCG CAAGGAGCAC
1081 CTGCGGCGCC ACCGCGACAC GCACCCCGGC AGCCCCGGCA GCCCCGGGCC CGCGCTGCGC
1141 CCTCTGCCCG CCCGTGAGAA GCCCCACGCG TGCTGCGAGT GTGGCAAGAC CTTCTACTGG
1201 CGCGAGCACC TGGTGCGCCA CCGCAAGACG CACTCGGGAG CGCGGCCCTT TGCCTGCTGG
1261 GAGTGTGGCA AGGGCTTCGG GCGCCGCGAG CACGTGCTGC GCCACCAGCG CATCCACGGC
1321 CGGGCAGCGG CCAGCGCGCA GGGGGCGGTA GCTCCGGGCC CGGATGGTGG AGGCCCCTTC
1381 CCGCCCTGGC CCTTGGGTTA G
<210> 3
<211> 417
<212> Protein
<213> Frame 1
<400> 3
1 MASTDYSTYS QAAAQQGYSA YTAQPTQGYA QTTQAYGQQS YGTYGQPTDV SYTQAQTTAT
61 YGQTAYATSY GQPPTGYTTP TAPQAYSQPV QGYGTGAYDT TTATVTTTQA SYAAQSAYGT
121 QPAYPAYPAY GQQPAATAPT RPQDGNKPTE TSQPQSSTGG YNQPSLGYGQ SNYSYPQVPG
181 SYPMetQPVT APPSYPPTSY SSTQPTSYDQ SSYSQQQSSP RQDHPSSMGV YGQESGGFSG
241 PGENRSMSGP DNRGRGRGGF DRGGMSRGGR GGGRGGMGFF NRPAHLLRHR QSHSGEKPHA
301 CPECGKAFRR KEHLRRHRDT HPGSPGPALR PLPAREKPHA CCECGKTFYW REHLVRHRKT
361 HSGARPFACW ECGKGFGRRE HVLRHQRIJG RAAASAQGAV APGPDGGGPF PPWPLG
Claims (10)
1.使用低量总RNA的直接测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
提取微量样本总RNA并进行质量检测，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为1-3μg；
将起始总RNA进行反转录和扩增富集后得到cDNA，并对所述cDNA进行浓度和质量检测；
利用所述cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用纳米孔测序仪进行测序。
2.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述微量样本包括细胞样本和组织样本。
3.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述细胞样本包括人类大肠癌细胞和骨髓瘤细胞，组织样本包括尤文肉瘤组织。
4.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述起始总RNA进行反转录和扩增富集采用如下步骤：
在所述起始总RNA上通过第一次连接反应连接反转接头，得到反转接头-RNA；
所述反转接头-RNA在超级反转录酶的作用下进行反转录反应，得到cDNA，然后利用磁珠纯化所述cDNA，得到纯化后的cDNA；
所述纯化后的cDNA通过第二次连接反应连接RNA测序接头，得到测序接头-cDNA，然后利用磁珠纯化所述测序接头-cDNA，得到纯化后的测序接头-cDNA，并检测所述测序接头-cDNA的回收量＞500ng。
5.根据权利要求4所述的测序方法，其特征在于，所述第一次连接反应的反应条件为20-25℃反应1-1.5h。
6.根据权利要求5所述的测序方法，其特征在于，所述第一次连接反应的反应体系为：
起始总RNA 7.5μl、连接反应缓冲液3.0μl、反转接头2.0μl、DNA连接酶2.0μl、RNA标准链0.5μl，共计15μl。
7.根据权利要求4所述的测序方法，其特征在于，所述反转录反应的反应体系为：向完成所述第一次连接反应的体系中加入无酶水9.0μl、dNTPs2.0μl、反应缓冲液8.0μl、DTT4.0μl、超级反转录酶2.0μl；所述反转录反应的反应条件为50℃，50min；70℃，10min，4℃，保持。
8.根据权利要求4所述的测序方法，其特征在于，所述第二次连接反应的反应条件为20-25℃反应1-1.5h。
9.根据权利要求8所述的测序方法，其特征在于，所述第二次连接反应的反应体系为：
cDNA 20.0μl、连接反应缓冲液8.0μl、测序接头6.0μl、DNA连接酶3.0μl、无酶水3.0μl，共计40.0μl。
10.根据权利要求4所述的测序方法，其特征在于，利用Qubit DNA HS Assay检测纯化后的测序接头-cDNA的回收量。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111996245A (zh) * | 2020-08-27 | 2020-11-27 | 复旦大学 | 一种基于全长小亚基核糖体rna的反转录来分析微生物群落结构的方法 |
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