CN111184950A - 用于治疗抑郁症的低强度脉冲超声 - Google Patents

Abstract

一种用于治疗心理健康障碍、综合症或疾病的便携式LIPUS治疗设备，包括：(a)可穿戴头带装置，所述可穿戴头带装置包括至少一个转换器元件，所述至少一个转换器元件包括压电晶体、液态偶联介质和弹性盖；(b)控制器，所述控制器用于使所述转换器产生具有在约30mW/cm2至约150mW/cm2之间的强度、在约1.0MHz至约2.0MHz之间的频率的脉冲超声，其中脉冲重复率在约0.5kHz至约2.0kHz之间以及占空比在约10％至50％之间。还提供了该设备在在治疗哺乳动物的心理健康障碍、综合症或疾病中的用途，以及该设备在在治疗人类抑郁症中的用途。

Description

用于治疗抑郁症的低强度脉冲超声

技术领域

本发明涉及用于使用低强度脉冲超声治疗抑郁症和其他心理健康综合症或疾病的设备和方法。

背景技术

尽管抗抑郁剂的临床应用广泛，但是20％–40％的患者从当前的抗抑郁剂充分受益，且20％的患者对任何抗抑郁药物都是有抗药性的(refractory，抗拒的，难以治愈的)¹。因此，必须研发更有效的治疗选项。超声是一种频率高于人类听力范围上限(～20kHz)的振荡机械压力波²。在响应的患者中，通常在2-3周或更长时间后，临床改善变得明显(Taylor等人，2006)。超声对中枢神经系统(CNS)的影响的初步研究表明，低强度、低频率超声通过触发电压门控钠和钙通道可以非侵入地且远程地激发神经元和网络活动³。经颅脉冲超声刺激的短期应用引起海马结构中的脑源性神经营养因子(BDNF)阳性点(positive puncta)的密度增加，表明超声在小鼠海马结构中激起神经元活动并促进内源性大脑可塑性⁴。经颅聚焦超声还引起新生细胞增殖和分化及其作为成熟神经元的存活率的增加⁵。由于抑郁症的发病机理可能涉及神经再生不足⁶、神经营养支持损失⁷以及神经可塑性改变⁸，因此治疗性超声可以是替代的非侵入抗抑郁策略。

因此，现有技术需要治疗抑郁症及相关疾病或障碍的设备和方法。

发明内容

本发明至少部分地基于对应用低强度脉冲超声(LIPUS)——一种特定类型的超声——作为治疗抑郁症的治疗选项进行调查的研究的结果。LIPUS刺激显著提高了神经元样SH-SY5Y细胞和原代神经胶质细胞二者的体外存活率。蛋白质分析表明，LIPUS促进了原代神经胶质细胞中β-连环蛋白的磷酸化，提高了两种细胞类型中脑源性神经营养因子(BDNF)的水平。随后使用重复束缚应激(RRS)模型进行的动物研究表明，LIPUS施用在蔗糖偏好试验(SPT)、悬尾试验(TST)、强迫游泳试验(FST)和Y迷宫试验(YMT)中显著缓解了小鼠的抑郁样行为。进一步测试表明，LIPUS对抑郁症产生有益效果的潜在机制与促进神经再生和BDNF水平提高相关联。利用铜宗(CPZ)诱导脱髓鞘动物模型，证明了LIPUS缓解了CPZ诱导的对成熟髓磷脂和少突胶质前体细胞(OPC)二者的损伤。

这些发现表明，LIPUS可以用作治疗抑郁症的治疗方法，不仅通过促进神经再生和提高BDNF水平来治疗，二者通过保护和促进髓磷脂和少突细胞(OL)来治疗。

在另一方面，本发明可以包括便携式LIPUS治疗设备。便携式特征允许患者随时随地接受治疗。在一些实施方式中，设备可以包括：

(a)可穿戴头带装置，可穿戴头带装置包括至少一个转换器元件，至少一个转换器元件包括压电晶体、液态偶联介质和弹性盖；

(b)控制器，控制器用于产生具有在约30mW/cm2至约150mW/cm2之间的可调整强度、大于约1.0MHz至约2.0MHz的频率的脉冲超声，其中，脉冲重复率在约0.5kHz至约2.0kHz之间以及占空比在约10％至50％之间。

附图说明

在附图中，类似的元件指定了类似的附图标记。附图不一定按比例，相反，重点放在本发明的原理上。另外，所示实施方式中的每一个只是利用本发明的基础理念的多种可能布置中的一种。

图1图的上部：LIPUS治疗设备的示意图。图的下部：具有手持单元的LIPUS治疗设备的示意图。

图2 LIPUS设备系统的图。

图3主板(顶部)和驱动板(左下角)的PCB布局。

图4从三个不同角度看的设计转换器盖；(a)组合壳体的视图；(b)公壳体和转换器的视图；(C)母壳体和橡胶的内视图。

图5所提出的用于测量声阻抗的装置(setup，设置)的图。

图6假手术组和橡胶组在不同偶联剂中的声音强度测量和衰减拟合强度。

图7传输速度的对比。

图8图的上部：LIPUS设备和实验装置。中心图是LIPUS生成盒；左上的图示出了细胞实验装置；右上的图示出了细胞实验的放大略图；左下的图示出了用小鼠进行RRS的装置；下中的图示出了对小鼠进行LIPUS治疗的装置；右下的图示出了对小鼠进行LIPUS治疗的放大略图。图的下部：顶部：体外细胞研究的实验设计；中部：使用RRS模型进行体内动物研究的实验设计；底部：使用CPZ模型进行体内动物研究的实验设计。

图9LIPUS对神经元样SH-SY5Y细胞和原代神经胶质细胞的细胞存活率以及其中的pβ-连环蛋白和BDNF水平的影响。a)LIPUS和SH-SY5Y细胞的存活率。b)LIPUS和原代神经胶质细胞的存活率。c)示出了强度为15mW/cm²和30mW/cm²的LIPUS对SH-SY5Y细胞中的pβ-连环蛋白的水平没有显著影响的代表性蛋白质印迹图像。所有组中的pβ-连环蛋白的相对量以柱状图展示。d)示出了LIPUS对原代神经胶质细胞中pβ-连环蛋白的水平的影响的代表性蛋白质印迹图像。所有组中的pβ-连环蛋白的相对量以柱状图展示。e)示出了LIPUS对SH-SY5Y细胞中BDNF的水平的影响的代表性蛋白质印迹图像。f)示出了LIPUS对原代神经胶质细胞中BDNF的水平的影响的代表性蛋白质印迹图像。所有组中的BDNF蛋白的相对量以柱状图展示。值表示组平均值±S.E.M.。*p<0.05vs.0mW/cm²(对照)，#p<0.05vs.15mW/cm²。

图10 LIPUS对小鼠在抑郁样行为的试验中的表现的影响。a)在蔗糖偏好试验中，蔗糖偏好因RRS暴露而降低并被LIPUS治疗逆转。b)蔗糖性能试验中的总流体消耗未显著受蔗糖偏好试验中的治疗的影响。c)在悬尾试验中，通过RRS暴露，总静止时间有不太显著的上升趋势，并且该静止时间被LIPUS治疗显著降低。d)在FST中，通过RRS暴露，总静止时间有不太显著的上升趋势，且该静止时间被LIPUS治疗显著降低。e)在Y迷宫试验中，通过RRS暴露，自发性变化有不太显著的降低趋势，且该降低被LIPUS治疗显著逆转。f)Y迷宫试验测试的臂进入(arm entry)总数没有观察到显著差异。值表示组平均值±S.E.M.；n＝每组8-9只小鼠。*p<0.05vs.CTL；#p<0.05vs.RRS。

图11 LIPUS提高了暴露于RRS的小鼠中双皮质蛋白(DCX)和BDNF的水平。a)示出了LIPUS对暴露于或未暴露于RRS的小鼠中的DCX的水平的影响的代表性蛋白质印迹图像。所有组中的DCX蛋白的相对量以柱状图展示。b)示出了LIPUS对BDNF的水平的影响的代表性蛋白质印迹图像。所有组中的BDNF蛋白的相对量以柱状图展示。值表示组平均值±S.E.M.；n＝每组6只小鼠(对于a)或5只小鼠(对于b)。*p<0.05vs.CTL；#p<0.05vs.RRS。

图12 LIPUS对暴露于CPZ的小鼠中的MBP和NG2的水平的影响。a)示出了LIPUS对MBP的水平的影响在暴露于CPZ之后提高的代表性蛋白质印迹图像。两组中的MBP蛋白的相对量以柱状图展示。b)示出LIPUS对MBP的水平的影响的代表性免疫组织化学染色图像。两组中的胼胝体的MBP阳性标记的相对量以柱状图展示。c)示出了LIPUS对NG2的水平的影响的代表性蛋白质印迹图像。两组中的NG2蛋白的相对量在下面以柱状图展示。d)示出了在CPZ暴露之后LIPUS对NG2的水平的影响的代表性免疫组织化学染色图像。两组中的胼胝体的NG2阳性标记的相对量以柱状图展示。值表示组平均值±S.E.M.；n＝每组3-4只小鼠。*p<0.05vs.CPZ+假手术组；**p<0.01vs.CPZ+假手术组。柱，150μm(对于b)或100μm(对于d)。

具体实施方式

在一方面，本发明包括可穿戴的LIPUS治疗设备。设备包括由弹性体诸如聚氨酯橡胶制成的用以覆盖金属转换器的新型可更换盖。如果橡胶盖内存在适合的偶联剂，则聚氨酯橡胶是优选的用于传声材料。在一些实施方式中，偶联剂可以包括净化水(诸如Milli-Q^TM水或I类——ASTM D1193.91)、变压器油和/或超声凝胶。传声系数研究表明，净化水是优选的偶联剂，具有39.76％的传输速率。

设备可以与其他设备通信，诸如通过互联网。在一些实施方式中，安装在移动计算机诸如智能电话上的移动设备应用可以使用户诸如治疗医师能够远程控制超声剂量(强度和持续时间)。移动设备可以通过有线或无线连接诸如WiFi^TM和/或Bluetooth^TM与治疗设备通信。

超声生成器可以通过适合的脉冲信号诸如从阻抗匹配板生成的脉冲方波信号驱动转换器。通过将转换器和盖嵌入头带装置内，患者可以简单地通过左右颞颥放置LIPUS头带装置进行治疗。超声波可以传输通过颅骨，并激励大脑海马结构中的脑神经。

常用的超声在压电晶体的顶部具有金属盖，以防止电极直接暴露于流体或身体。研究员还调查了压电致动的金属盖的挠曲模态对波束宽度和频率的影响。然而，由于超声由压电晶体生成，因此不适合于使用金属壳体盖接触面部区域(尤其是颞颥)。在一些实施方式中，用于超声转换器的可更换弹性盖是适合的。

实验中使用了被LIPUS设备驱动的四个相同超声转换器，以检查在盖设计和不同的超声偶联剂情况下的传输声音强度(假手术组、净化水、变压器油和超声凝胶)。通过数据分析和曲线拟合识别用于超声输出系统的优选材料。

通过比较超声强度传输速率，证明净化水是填充在弹性盖(聚氨酯橡胶)和转换器/压电晶体之间的最佳偶联剂材料。

A.转换器设备设计和电路优化

双通道LIPUS生成器设备的优选信号规格为：30mW/cm2至150mW/cm2的可调节强度，具有1kHz的脉冲重复率的1.5MHz的频率，以及20％的占空比。图2中示出了实现上述设计的所提出的模块图。

在图2中，微控制器经由通过蓝牙通信连接的移动设备上的移动应用发送的指令来设置脉冲方波的幅度和持续时间。放置在由脉冲方波驱动的头带装置中的压电转换器生成LIPUS信号。脉冲方波阻抗匹配网络允许足够的输送功率，以驱动压电转换器。因此，LIPUS穿过橡胶盖，以治疗大脑中感兴趣的期望功能区域。

图3示出了两个PCB板布局设计(主板和驱动板)。主板包括蓝牙模块、微控制器、脉冲方波信号生成器和供应电压幅度控制装置。包括阻抗匹配电路的驱动板放置在头戴式耳机内，靠近转换器，以驱动转换器。

可穿戴LIPUS设备的潜在优点包括：该可穿戴LIPUS设备帮助患者方便地接受LIPUS治疗。通过使用移动电话上的app，患者和医生可以远程控制并制定治疗。头带装置内的弹性转换器盖通过减少生理和心理损害，适合于精神疾病治疗。

B.超声盖设计

传声材料可以是固体或流体。理想的传声材料允许声波在没有任何反射的情况下穿过传声层。因此，材料的特性声阻抗优选地与水的特性声阻抗匹配。材料的衰减常数应尽可能小。在该情况下，聚氨酯橡胶由于其良好的声学特性，是优选的材料。

聚氨酯橡胶的声阻抗Z，ρc的值(即，橡胶的密度与橡胶中声波的传播速度的乘积)与声波传播介质如水的ρc值匹配[14]。(声阻抗是材料的性质——测量在对应声振动下向介质施加了多少声压，其通常表示为介质的密度ρ与声音在介质中的速度C的乘积，单位：g/cm2·s)。

当声波穿过橡胶时，声能损失较小。已知的是，橡胶在各种频率范围中具有相对较小的插入损耗和高回声降低。由声波引起的塑性变形导致声能衰减。随着温度升高(从3.9℃到33.6℃)，频率相关的声速和声衰减降低。

声音入射通过聚氨酯橡胶，声衰减值取决于橡胶成分，这包括两部分：一个是橡胶品种的选择；另一个是配合剂的选择。

如图4所示，在一些实施方式中，塑料基部固定在转换器的底部。塑料的另一侧与聚氨酯橡胶粘合，聚氨酯橡胶被灌注为具有1.6mm厚度的盖。可拆卸塑料盖与橡胶连接，并固定在转换器的前面。转换器的传输线缆被设计在压电晶体的背部，其提供空间以构建用于转换器的壳体。生产了其上套有橡胶的螺旋壳体。

在一些实施方式中，如图4(b)和(c)所示，公壳体卡在压电转换器上，母壳体与柱形橡胶附接。图4(c)所示的母壳体用超声偶联剂填充，并与公壳体通过旋拧在一起进行组合，如图4(a)所示。该设计允许母壳体每次使用后就丢弃，防止交叉感染。该整个超声转换器盖将隐藏在头带装置内，以治疗如图1所示的特定区域(如，颞颥)。

之前的证据已经表明了超声的使用与情绪改善之间的关联⁹。本发明包括将低强度脉冲超声(LIPUS)应用作为治疗抑郁症和抑郁症相关影响的可能治疗选项。不受限于理论，可以认为LIPUS，以神经再生和神经营养作为内在机制，可以对哺乳动物——包括人类——有抗抑郁效果，而且认为髓磷脂和少突细胞(OL)的保护和促进也可能是LIPUS的治疗目标。虽然单胺假说——其声明在抑郁症中大脑的某些部位中的去肾上腺素和/或血清素(5-羟色胺，5-HT)存在功能缺陷(Stahl等人，2013)——多年来主要思考抑郁症的病因，但明显的是，其他因素也是涉及在内的(Hindmarch等人，2002)。近年来的研究已经发展了抑郁症的病灶聚焦于海马结构中神经再生中断的假说(Jaako-Movits等人，2006；Schmidt和Durman，2010；Boldrini等人，2012；Ohira等人，2013)。

首先进行了体外细胞研究，以调查LIPUS刺激是否可以提高神经细胞存活率，通过神经再生相关细胞信号通路作用。Wnt信号通路在神经再生方面是重要的，经由β连环蛋白——一种胞间信号转导蛋白——介导成体海马祖细胞中的成神经细胞增殖和神经元分化。经报道，自闭症、精神分裂症和抑郁症中该通路中断^11,12。DCX是由神经元嵌体细胞和未成熟神经元表达的微管相关蛋白质，并被视为神经再生的标记¹³。BDNF是一种神经营养因子，经报道，其表达通过若干类型的抗抑郁疗法在啮齿动物大脑中增加^14-19。

使用两种类型的培养细胞，神经元样SH-SY5Y细胞和原代神经胶质细胞，并进行了细胞存活率、β-连环蛋白、DCX和BDNF的测量。用这些细胞得到的感兴趣的结果表明有必要用动物模型进行后续研究。然后我们使用两个抑郁症模型——重复束缚应激(RRS)模型和铜宗(CPZ)诱导脱髓鞘模型——在体内动物研究中应用了LIPUS。进行了行为试验[蔗糖偏好试验(SPT)、悬尾试验(TST)、强迫游泳试验(FST)和Y迷宫试验(YMT)]，以评估LIPUS是否可以改善动物的抑郁样行为。进行了关于MBP和NG2的利用蛋白质印迹和免疫组织化学(IHC)染色的后续蛋白质分析，以揭示LIPUS的有益效果是否与促进神经再生和/或防止白质不足相关联。MBP是用于成熟OL的蛋白质标记物，并且对于髓鞘形成的过程是必要的。NG2是用于在正常和脱髓鞘情况下均能产生新OL的OPC的蛋白质标记物²⁰。据我们所知，这是集中于超声作为用于抑郁症的非侵入治疗选项在CNS中的长期影响并采用体外细胞研究和体内动物研究二者的首次研究。

本发明至少部分地基于下述证明，LIPUS提高神经元样SH-SY5Y细胞和原代神经胶质细胞的体外存活率并提高其BDNF水平，以及减少抑郁样症状，并提高暴露于RRS的小鼠中DCX和BDNF的大脑水平，而且减弱暴露于RRS和CPZ二者的小鼠的神经生物变化。

经颅超声作为用于神经调节的有前景的选项吸引了注意力。超声可以直接调整海马结构中的神经元活动³，在神经元中诱发动作电位²⁶，并刺激小鼠的运动皮质²⁷和人类的躯体感觉皮质²⁸。LIPUS——一种特定类型的超声——对若干类型的祖细胞具有激发效应，该祖细胞包括新鲜的造血干/祖(HSP)细胞²⁹，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞³⁰和成骨细胞³¹。与超声对神经元和神经网络活动的即时效应结合²⁸，这些研究意味着LIPUS可以对CNS活动提供刺激效应，并可以作为治疗性抗抑郁剂选项。近期的先导研究报道了超声的施用与人类情绪提高之间的潜在关联，并且在使用聚焦超声与循环微泡的结合以打开海马区中的血脑屏障的对大鼠进行的研究报道：在接受两周的治疗后，大鼠显示出抗抑郁样的效果(Mooney等人，2018)。本研究中用RRS模型进行行为测试的结果支持该论点。在我们的研究中，我们首先使用不同的细胞类型进行了体外实验，快速有效地确定了超声是否施加将论证使用体内模型进行的进一步探究的任何有益影响。组织测试揭示了神经再生和BDNF的标记物在存在LIPUS治疗的情况下的变化。在一些实施方式中，LIPUS是强度低于约40mW/cm²的超声。选择处于15和30mW/cm²的LIPUS来测试对细胞存活率的影响。处于15mW/cm²的LIPUS加速SH-SY5Y细胞生长(图9a)。在30mW/cm²时，对照值没有变化。似乎SH-SY5Y细胞的生长仅在一定强度范围内受到影响，约15mW/cm²时影响显著。LIPUS提高原代神经胶质细胞的存活率(图9b)。在施用15mW/cm²的情况系下，细胞存活率出现显著提升。在30mW/cm²，细胞的数量与对照没有显著差异，并且比15mW/cm²的低。重要的是，注意LIPUS刺激对细胞存活率、β-连环蛋白的磷酸化和BDNF水平的影响在所需强度和持续时间方面高度取决于细胞类型。

15mW/cm²的LIPUS提高了原代神经胶质细胞中β-连环蛋白的磷酸化(图9d)，但对神经元样SH-SY5Y细胞中的β-连环蛋白的磷酸化没有影响(图9c)。该发现表明，LIPUS对细胞存活率的积极影响可能与这些神经细胞中Wnt通路的激活相关联。

在我们的体外细胞试验中，处于15mW/cm²的LIPUS显著提高了神经元样SH-SY5Y细胞(图9e)和原代神经胶质细胞(图9f)二者中的BDNF水平，而处于30mW/cm²的LIPUS还诱导SH-SY5Y细胞中的BDNF水平显著提高，但原代神经胶质细胞中并未显著提高，表明这两种细胞类型对LIPUS刺激的响应模式之间的不同。

有趣的是，我们没有观察到暴露于RRS的小鼠的BDNF水平显著降低(图11b)。之前的研究已显示，每天6小时持续3周的慢性束缚应激不会改变海马BDNF的水平^32,33。然而，另一研究发现，每天1小时持续3周的束缚导致动物的血浆BDNF相对增加³⁴。在将来应进行使用由慢性应激诸如不可预见慢性温和应激(UCMS)——相比于预测应激模型，其与实际人类患者的经历更相关³⁵——诱导的其他的抑郁症动物模型调查LIPUS对BDNF表达的影响的进一步研究，以更好地理解关系。

抑郁症的关键症状是快感缺乏。SPT中蔗糖溶液摄入降低是啮齿动物快感缺乏的行为测量³⁶。在本研究中，暴露于RRS的小鼠的蔗糖偏好指数降低，而LIPUS治疗显著逆转了这种降低(图10a)。各组的总流体消耗未显示差异(图10b)。与我们的发现一致的是，之前的研究已显示慢性束缚应激引起动物的蔗糖偏好降低³⁷，这可以通过抗抑郁氟西汀和瑞波西汀逆转³⁸。在TST和FST，LIPUS还通过降低动物保持静止的总时间，对抑郁症相关的缺乏逃避相关行为有影响(图3c和图3d)。TST和FST³⁹均用于筛选可能的抗抑郁剂，之前的研究已显示，抗抑郁剂诸如氟西汀⁴⁰、文拉法辛⁴¹、安非他酮⁴²和喹硫平⁴³以及神经刺激疗法——包括电惊厥疗法(ECT)⁴⁴、经颅磁谱法(TMS)⁴⁵和深部脑刺激(DBS)⁴⁶——在TST或FST中减少总静止时间。YMT评估了空间工作记忆。暴露于RRS的小鼠有较低自发性变化的不太显著的倾向(图10e)，且LIPUS治疗在该试验中显著提高了表现。

为了进一步探究LIPUS对行为的影响的可能的机制，我们调查了抑郁症发病机理中涉及的重要机制。大量研究表明在抑郁症的发病中，神经再生不足^47,48。最主要的抗抑郁药物类型⁴⁹以及神经刺激疗法如ECT和rTMS^50,51引起动物海马神经再生。

暴露于RRS的小鼠与对照组相比具有DCX水平显著降低的趋势(p＝0.090)，而LIPUS治疗显著逆转了该降低——经DCX的蛋白质分析确认的发现(图11a)。仅LIPUS组具有比正常对照组显著高的DCX水平，表明LIPUS还促进普通动物的神经再生(图11a)。与我们的发现类似，其他研究已表明抗抑郁剂通过促进成体海马神经干细胞增殖提高海马神经再生⁵² _, ⁵³。施用ECT⁵⁰和rTMS⁵¹会增加成年再生迁移成神经细胞的数量和树状复杂性。

对CPZ模型进行了研究，以评估LIPUS在抑郁症中对髓磷脂和OL的影响。之前的研究已提出，脱髓鞘和受损的OL功能可能在抑郁症的病因中起作用^54,55，并且抑郁症在患有多发性硬化、涉及脱髓鞘的障碍的患者中是常见的症状⁵⁶。我们的体内研究显示，经TST、FST和YMT测试后，LIPUS未显著减弱暴露于CPZ之后的小鼠的抑郁样行为。LIPUS可以视为温和的治疗，而CPZ能在CNS中产生广泛的脱髓鞘并引起LIPUS可能无法明显缓解的严重的行为和神经生物功能紊乱⁵⁷。进一步研究应将该模型中的LIPUS的抗抑郁疗效与其他标准化治疗选项进行比较。

MBP在髓鞘形成的过程中起关键作用，并且是成熟OL的标记物。我们发现在CPZ暴露后LIPUS显著提高MBP水平(图12a和图5b)，表明LIPUS对成熟髓磷脂和OL针对CPZ毒性的保护效果。我们之前的研究发现，暴露于CPZ持续6周的动物中，MBP显著降低⁵⁸；通过用喹硫平——也具有抗抑郁性质的一种抗精神病药——进行慢性治疗逆转了该降低^59,60。另一研究表明，通过用咯利普兰——研发作为可能的抗抑制剂——进行慢性治疗减弱了CPZ引起的MBP的降低，在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)髓鞘脱失动物模型中还发现咯利普兰减弱MBP不足^61,62。当前关于MBP的发现表明，LIPUS治疗的有益效果部分地与髓磷脂和OL的保护相关联。

NG2是在若干祖细胞群——包括OPC——中发现的整合膜蛋白多糖。OPC损失或缺乏以及随之的分化OL缺乏与髓鞘形成损失、轴突支持减少以及之后的神经功能受损相关联。NG2的表达在髓鞘脱失动物模型——包括CPZ暴露⁶³和EAE模型⁶⁴——中被显著干扰。从我们团队之间的研究发现，通过用喹硫平⁶⁰、氟西汀(未公布数据)和rTMS(未公布数据)进行治疗，减弱了NG2表达的这种干扰。类似地，本研究发现LIPUS显著提高了暴露于CPZ的小鼠的大脑中的NG2水平(图12c)。之后的IHC染色揭示，经LIPUS施用后，小鼠的NG2-阳性细胞的数量显著超过没有LIPUS的小鼠的NG2-阳性细胞(图12d)。之前的研究已发现，NG2-阳性细胞在抑郁症中被改变⁶⁵，并且连续的ECT治疗大幅提高了动物的海马结构⁶⁶和杏仁核⁶⁷中的NG2表达神经胶质细胞的增殖。本研究的结果支持OPC的促进在LIPUS的有益效果中起作用的理论。

该研究提供了证据证明LIPUS能显著缓解暴露于RRS后小鼠的抑郁行为。体内和体外结果表明，LIPUS对抑郁症的有益效果的可能机制是促进神经再生、提高BDNF以及保护和促进髓磷脂和OL。该发现为LIPUS作为用于抑郁症的有前景的治疗选项提供支持。

实施例

下述实施例意在说明要求保护的本发明的方面和特征，并不限制要求保护的本发明，除非明确记载为限制。

在一个实施方式中，超声转换器是USA Mackeyville的APC International,Ltd公司制造的纵波转换器。入射波垂直于表面。APC研发的压电晶体880具有215m/V的压电电荷常数d₃₃、2110m/s的频率常数以及1000的机械品质因数，外径25mm，且长度12.5mm。d₃₃越大，压电体的发射性能越好，振动和超声越强[16]。

使用电化学测量站(法国Seyssinet-Pariset的BioLogic Inc.公司，SP-200)进行了阻抗频谱测量。在1.5MHz的固定频率下，四个转换器具有几乎相同的阻抗频谱，幅度97.72Ohm，相位1.15度，这用于设计阻抗匹配电路。

由BINARY实验室设计了低强度脉冲超声设备。输出电压是幅度可调节的1.5MHz方波信号，具有的重复率为1kHz、占空比为20％。峰到峰的幅度从1.25V到12.5V变化。入射波强度随着输出信号幅度增加而增加。

聚氨酯橡胶被铸造为柱形盖，并且粘合在塑料保持器的前面。将橡胶磨至1.6mm的厚度，并用三种不同的超声偶联剂(净化水、变压器油和超声凝胶)填充转换器与橡胶之间的间隙。表1示出了三种超声剂和聚氨酯橡胶的声学参数。

表1材料的声性质

B.实验方法

如图4所示，使用LIPUS设备生成幅度可调节的方波形。LIPUS在加拿大的BINARYLAB制作，并且输出幅度可以由移动电话经由蓝牙控制。使用上述装置，进行了一组测量，在该组测量期间从超声功率计(马里兰州Ohmic Instruments Co.公司的UPM-DT-1AV型号)读取了由超声转换器生成的声强度。在1.5MHz的标称共振频率左右进行这些测量。在超声功率计上方放置塑料保持器。通过变换塑料保持器上的不同转换器盖(无盖/假手术组，用水填充的盖，用油填充的盖以及用凝胶填充的盖)，我们得到了同一驱动信号下的对应强度。随着幅度增加，不同盖的强度相应地增加。

在得到声强度数据后，我们使用MATLAB分析了每种盖的衰减/传输系数(电能转换为机械能的效率)。通过拟合衰退强度与初始强度之间的线性函数调查传输效率。

图5描述了与没有盖的超声转换器的强度相比，具有用不同超声偶联剂填充的聚氨酯橡胶的超声转换器的测得超声强度和拟合强度。三个点数据组(误差条形图)是与假手术组相比的不同超声剂的强度测量数据。每个数据点表示四次测量的平均值，并且计算了标准偏差以绘制误差条形图。通过由超声功率计测得的超声功率除以转换器的5cm2有效面积得到强度值。由于我们在实验中使用的强度非常低，因此超声功率可能受到桌子或人移动的轻微振动的影响。然而，相比于强度值，每个强度的整体标准偏差是非常微不足道的。

为了更好地表达强度衰减，因此通过图6中所示的多项式曲线拟合生成了用于每种偶联剂的超声强度衰减线性拟合(实线、虚线和点划线)。我们选择线性拟合，因为基于图6的数据超声强度的衰减是线性的。可以容易地看出，具有净化水的橡胶盖具有的斜率比其他两组的高。

进行了三种不同超声偶联剂(净化水、变压器油和超声凝胶)之间的强度衰减对比，如图6所示。结果返回使用MATLAB对各种数据进行最佳拟合的1阶(斜率)多项式的系数。不明显的偏离(0阶多项式)被弃用，因为所有的关系应从坐标原点开始。

当超声波垂直于足够大的光滑平坦界面时，界面传输波强度I_t和入射波强度I₀的比被称为声强度的传输系数，用T表示[16]：

其中，Z₁和Z₂表示两种介质各自的声阻抗。基于(1)，我们可以看到，当入射波和传输波介质的声阻抗(Z₁和Z₂)相等或近似时，声强度的传输系数接近1。另一方面，声阻抗失配越大，在一个介质与另一介质之间的界面处被反射的能量百分比就越大。

用净化水填充的聚氨酯橡胶盖具有的传输率明显比用油和超声凝胶填充的盖高。理论上，三种介质相比，超声凝胶具有最接近的声阻抗ρc值，基于(1)，这应得到最佳的传输率。但是，超声凝胶具有较高的衰减系数，这在超声波传输通过凝胶时是不可忽视的，如表1所示的。不受限于理论，这可能是为什么将超声凝胶用作填充介质结果是情况最差的主要原因。具有第二最接近的声阻抗的偶联剂是净化水，得到39.76％的最佳传输率。

实验装置使用在1.5MHz的频率和1.0kHz的脉冲重复率下运行的SonaCell^TM(加拿大埃德蒙顿IntelligentNano Inc.公司)(图8)，生成LIPUS。使用的脉冲占空比为20％。为了进行细胞研究，应用LIPUS刺激培养箱中封闭无菌的12孔细胞培养板中的细胞(图8)。超声经由转换器与板之间的传输凝胶传输通过孔的底部(图8)。强度调整为15或30mW/cm²。在3天内进行每天5分钟的治疗。在动物研究中，强度调整为25mW/cm²，且治疗持续时间为每天20分钟。小鼠被限制在塑料管中，其中超声转换器固定在管的端部附近，在小鼠头部的正上方。在皮肤与转换器之间放置传输凝胶(图8)。在这些研究中，刺激整个大脑。

细胞培养

在37℃、5％CO₂和95％空气下，在涂覆多聚-D-赖氨酸表面上培养SH-SY5Y细胞系(圣路易斯Sigma-Aldrich)。在具有含完全胎牛血清(FBS)的介质的12孔板中以1x10⁵个细胞/孔接种细胞，然后转至无血清DMEM/F-12介质，持续18小时。用15或30mW/cm²的LIPUS对细胞进行治疗，每天5分钟，持续3阶段。最后一次治疗后的二十四小时，进行细胞存活率试验或收集细胞蛋白质(图8)。

使用如前所述的1天龄新生大鼠的大脑皮质神经胶质制备原代细胞培养基²¹。用15或30mW/cm²的LIPUS对细胞进行治疗，每天5分钟，持续3阶段。最后一次刺激之后的二十四小时，进行细胞存活率试验或收集细胞蛋白质(图8)。

细胞存活率试验

基于制造商的指示，试验使用细胞增殖试剂比色测定，水溶性四唑-1(WST-1)试剂盒(巴塞尔，Roche)。在450nm测量吸收率。

细胞蛋白质分析

经LIPUS刺激后，使用三乙二胺四乙酸(EDTA)裂解缓冲液(1％Triton X-100、20mMTris、2mM EDTA、pH 7.6)与新添加的蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)收集样本。进行蛋白质印迹，如下节概述。使用的第一抗体(德国达姆施塔特EMD Millipore公司)：兔BDNF抗体(稀释1:500)，小鼠磷酸化β-连环蛋白(pβ-连环蛋白抗体)(稀释1:1000)，兔β-连环蛋白抗体(稀释1:500)。

蛋白质印迹

用二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(美国沃尔瑟姆Thermo FisherScientific)确定蛋白质浓度后，煮沸样品并装载(15μL/孔)在SDS-PAGE微型凝胶上。在室温下通过80V电泳分离蛋白质，长达1.5小时，然后在冰冷转移缓冲液中以120mA电泳转移至PVDF膜上，长达2小时。在室温下使用Tris缓冲盐水加吐温20(TBST)中的5％(w/v)脱脂牛奶将膜封闭1小时，然后用一系列第一抗体温育(4℃过夜)。β-肌动蛋白是内部装载对照。用TBST冲洗膜3x，在室温下用稀释1:5000的辣根过氧化物酶(HRP)缀合第二抗体(英国剑桥Abcam山羊抗兔；加拿大伯灵顿Cedarlane山羊抗小鼠)温育2小时。使用增强化学发光(ECL)底物试剂盒(ThermoFisher Scientific)使免疫反应蛋白质可视化。使用ImageJ软件(64版，NIH，Bethesda)通过化学发光暴露的膜的密度分析免疫印迹的量化，且结果表达为靶蛋白与β-肌动蛋白的比。

动物

七周龄的雌性C57BL/6小鼠来自Charles River(Montréal)。动物设施在22±0.5℃、60％湿度下维持12小时/12小时的光暗循环。所有动物程序均遵守加拿大动物管理委员会指南，并经大学动物管理和使用委员会批准。

重复束缚应激(RRS)施用

经过2周的环境适应后，小鼠被分为下述组：对照组(CTL)、假手术组(有设备，但转换器未与LIPUS生成盒连接)、RRS、LIPUS、RRS加LIPUS(RRS+LIPUS)。用正常食物饲养小鼠。每周测量体重。通过将小鼠放置在鼻端有气孔的塑料管中诱导RRS(图8)，每天3小时，持续3周。该程序与本研究中的超声施用类似(详情见图8)，提供适合的实验设置以开始调查在没有超声治疗程序独自产生的额外干扰的情况下LIPUS的影响。最后一次RRS处理之后的24小时的时候，进行试验以评估抑郁样行为，然后收集大脑组织(图8)。

铜宗(CPZ)施用

正常进食适应环境2周后，将小鼠分为CPZ+假手术组和CPZ+LIPUS组。CPZ(Sigma-Aldrich)以0.2％(w/w)的浓度混入磨碎的LabDiet(圣路易斯)啮齿动物食物。用CPZ食物喂养小鼠5周。每周测量体重。对LIPUS组，小鼠每天施用20分钟的LIPUS。假手术组小鼠每天在LIPUS设备中20分钟，线缆和生成盒未连接。在最后一次CPZ处理之后的24小时的时候，进行试验以评估抑郁样行为，并收集大脑组织(图8)。

行为试验

如前所述，我们的团队进行了蔗糖偏好试验(SPT)、悬尾试验(TST)、强迫游泳试验和Y迷宫试验^22-24。

组织处理

用异氟烷麻醉小鼠，并经心脏内灌注pH 7.4的0.01M PBS。然后移除大脑(不包括小脑、脑桥和延髓)。将右半球分离为前皮质、内侧皮质和后皮质以及海马结构，急冻，并在-80℃下储存，以用于蛋白质印迹。左半球在4％多聚甲醛(PFA)的PBS溶液中后固定48小时，然后在30％蔗糖中进行低温保护(4℃/72小时)。通过低温恒温器(德国韦茨拉尔LeicaBiosystems)切割系列冠状切片，并收集在含0.01M PBS的24孔板中，进行IHC染色。

动物蛋白质分析

从每组随机选取小鼠(4-6只)，使用EDTA裂解缓冲液与添加蛋白酶抑制剂混合物从内侧皮质或海马结构收集蛋白样本。进行蛋白质印迹，如在蛋白质印迹一节所述。使用的第一抗体：豚鼠双皮质素抗体(DCX)(德国达姆施塔特EMD Millipore公司；稀释1:1000)，兔BDNF抗体(EMD Millipore公司，稀释1:500)，鸡髓磷脂碱性蛋白(MBP)抗体(美国泰格德Aves Labs；稀释1:2000)，兔神经/神经胶质抗原2(NG2)抗体(EMD Millipore公司，稀释1:1000)。

免疫组织化学(IHC)染色

自由漂浮脑切片用PBS清洗3x并在含3％H₂0₂的PBS中冷浸，以封闭内源性过氧化物酶活性。切片在室温下在3％正常山羊血清、1％BSA和0.3％Triton X-100的PBS溶液中封闭60分钟，然后在4℃下用下述第一抗体温育过夜：鸡MBP抗体(Aves Labs，稀释1:1000)，兔NG2抗体(EMD Millipore公司，稀释1:200)。在室温下以1:400的稀释度将特定第二生物素化抗体(山羊抗鸡&山羊抗兔，美国伯林盖姆Vector Laboratories)温育1.5小时。用TBST清洗3x后，用亲和素-生物素复合体(ABC)试剂将载玻片温育30分钟。用二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(Sigma-Aldrich)使抗原-抗体复合体可视化。载玻片在黑暗中被风干，用LeicaDMI6000B Microscope(Wetzlar)安装并观察明场和暗场，并用LAS AF计算机软件捕捉。以16X(MBP)或100X(NG2)的放大倍率检查了CPZ+假手术组和CPZ+LIPUS组中每个动物的四个或五个随机场。使用ImageJ测量了MBP阳性和NG2阳性染色的光密度，并将其表达为相对密度。

统计分析

使用社会科学统计软件包(SPSS，版本20，IBM，纽约，美国)。结果被表达为平均值±SEM。试验组之间的差异通过单向或双向方差分析(ANOVA)确定，然后通过Newman-Keuls事后实验进行多次对比。使用针对独立样本的两尾t试验进行两组对比。p值<0.05认为是统计显著的。

结果

LIPUS对细胞存活率的影响

15mW/cm²的LIPUS显著提高SH-SY5Y细胞的细胞存活率，而30mW/cm²则没有(图9a)。在原代神经胶质细胞的情况下，处于15mW/cm²的LIPUS显著提高细胞存活率，而30mW/cm²的刺激相比于15mW/cm²则导致细胞存活率显著降低(图9b)。

LIPUS对Wnt信号通路和BDNF的影响

对于神经元样SH-SY5Y细胞，处于15mW/cm²或30mW/cm²的LIPUS未产生变化(显示出提高pβ-连环蛋白水平的趋势不太显著)(图9c)。对于原代神经胶质细胞与非刺激对照组相比，处于15mW/cm²的LIPUS显著提高pβ-连环蛋白的水平，而处于30mW/cm²的刺激则没有(图9d)。

在SH-SY5Y细胞的情况下，处于15和30mW/cm²的LIPUS相比于未刺激的对照组均显著提高BDNF的水平(图9e)。在原代神经胶质细胞中，处于15mW/cm²的LIPUS显著提高BDNF的水平，而30mW/cm²刺激则没有(图9f)。

LIPUS对暴露于RRS的小鼠的抑郁样行为的影响

用SPT、TST、FST和YMT测试了抑郁样行为。对于SPT，RRS小鼠的偏好指数明显比对照组低，并且LIPUS治疗显著提高了RRS小鼠的偏好指数(图10a)。各组流体消耗没有显著变化(图10b)。

在TST中，相比于RRS小鼠，RRS+LIPUS小鼠的总静止时间显著下降(图10c)。在FST中，LIPUS显著降低了RRS组中的总静止时间(图10d)。

抑郁症中常见的是认知缺陷²⁵，因此使用YMT评估空间工作记忆。更迭表现存在变化，LIPUS治疗显著提高RRS小鼠的自发更迭(图10e)。各组的总的臂进入没有显著差异(图10f)

3.4 LIPUS对暴露于RRS的小鼠的DCX和BDNF的影响

海马蛋白质的分析表明，RRS小鼠内侧皮质的DCX水平相比于对照组小鼠显示出显著下降的趋势(p＝0.09)，并且相比于RRS组，LIPUS治疗提高了值(图11a)。LIPUS还显著提高对照组动物的DCX水平(图11a)。

LIPUS显著提高两个对照组小鼠的海马结构中的BDNF水平，RRS+LIPUS组的BDNF水平明显比对照组高，并且BDNF水平比仅RRS组高的趋势不太显著(图11b)。

暴露于CPZ后LIPUS未引起动物行为差异

还用TST、FST和YMT对给予CPZ、有或没有LIPUS的小鼠进行了测试。在TST和FST的情况下，这两组之间的总静止时间没有显著区别。在YMT的情况下，这两组之间的自发更迭或总的臂进入没有显著区别。

LIPUS对暴露于CPZ的小鼠的MBP和NG2水平的影响

当比较CPZ+假手术组和CPZ+LIPUS组的小鼠的皮质时，LIPUS显著提高暴露于CPZ的小鼠的MBP水平(图12a)。之后的IHC染色显示LIPUS显著提高暴露于CPZ的动物的胼胝体的MBP阳性染色(图12b)。

LIPUS显著提高暴露于CPZ的小鼠的NG2水平(图12c)。之后的IHC染色显示LIPUS显著提高暴露于CPZ的动物的胼胝体的NG2阳性染色(图12d)。

定义和解释

已为说明和描述之目的呈现了本发明的描述，但该描述并不意在是详尽的或局限于所公开的发明形式。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，许多修改或变型对于本领域普通技术人员将是明显的。选择和描述了实施方式，以最好地解释本发明的原理以及实际应用，使本领域普通技术人员理解，只要适合所设想的特定用途，本发明的各种实施方式有各种修改。

本说明书所附权利要求中的对应结构、材料、动作和所有手段或步骤以及功能元件的同等物意在包括用于结合具体要求保护的其他要求保护元件进行功能的任何结构、材料或动作。

说明书中提到“一个实施方式”、“实施方式”等意指所描述的实施方式可以包括特定方面、特征、结构或特性，但不是每个实施方式都一定包括该方面、特征、结构或特性。此外，这种词组可以但不一定指本说明书其他部分提及的同一实施方式。此外，当结合实施方式描述特定方面、特征、结构或特性时，结合其他实施方式实现或联系这种特征、结构或特性在本领域技术人员的知识范围内，无论其他实施方式是否明确描述。换言之，任何元件或特征都可以与不同实施方式中的任何其他元件或特征结合，除非二者之间存在明显或固有的不相容，或者明确排除。

还要注意，权利要求可以撰写为不包括任何可选元件。因此，这种表述意在用作与权利要求元素的引用或“消极限制”的使用相关的排他性术语诸如“唯一”、“仅”等等的使用的引用基础。术语“优选地”、“优选的”、“优选”、“可选地”、“可以”以及类似术语用于指所指的项、条件或步骤是本发明的可选(非必要)特征。

单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该”包括复数指称，除非上下文明确另外指示。术语“和/或”指项中的任意一个、项的任意组合或与该术语相关联的所有项。

技术人员将理解，所有数字——包括表达试剂或成分的数量的数字，性质诸如分子量、反应条件等，是近似值并理解为在所有实例中通过术语“约”可选地改动。取决于本领域技术人员使用本文描述的教导力求得到的期望性质，这些值可以变化。还要理解，这些值固有地包含变化性，变化性必然来自其相应测试测量的标准偏差。

术语“约”可以指指定值的±5％、±10％、±20％或±25％的变化。例如，约“50”％在一些实施方式中可以从45％到55％变化。对于整数范围，术语“约”可以包括比该范围每端记载的整数大和/或小的一个或两个整数。除非本文另有指示，则术语“约”意在包括在成分或实施方式的功能方面同等的与记载范围近似的值和范围。

本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别地在提供书面描述方面，本文记载的所有范围还包含任何和所有可能的子范围及其子范围的组合，以及组成该范围的单个值，特别是整数值。记载的范围(如，重量百分比或碳基团)包括范围内的每个具体值、整数、小数或同一性。任何所列的范围可以容易地理解为充分描述并使得同一范围能分解为至少两等份、三等份、四等份、五等份或十等份。作为非限制性实施例，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。

本领域技术人员还将理解，所有语言诸如“最高达”、“至少”、“大于”、“小于”、“多于”、“或更多”等包括记载的数字，这种术语指之后可以分解为上文讨论的子范围的范围。同样地，本文记载的所有比例还包括落入较宽比例的所有子比例。因此，记载的自由基、取代基和范围的具体值仅为说明；其不排除对自由基和取代基限定的范围内的其他限定值或其他值。

本领域技术人员还将容易理解，在成员以常见方式组在一起诸如Markush组的情况下，本发明不仅包含所列组整体，还单独包含组中的每个成员以及主组的所有可能子组。另外，出于所有目的，本发明不仅包含主组，还包含没有组成员中的一个或多个的主组。因此，本发明设想了明确排除记载组中的任何一个或多个成员。因此，限制条款还适用于所公开类别或实施方式中的任一个，其中，记载元素、品种或实施方式中的任何一个或多个可以从例如在明确消极限制中使用的这种类别或实施方式中排除。

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提供下述参考文献说明本领域技术水平，出于所有目的，其全部内容通过引用并入本文，禁止之处除外。

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Claims (6)

1.一种用于治疗心理健康障碍、综合症或疾病的便携式LIPUS治疗设备，包括：

(a)可穿戴头带装置，所述可穿戴头带装置包括至少一个转换器元件，所述至少一个转换器元件包括压电晶体、液态偶联介质和弹性盖；

(b)控制器，所述控制器用于使所述转换器产生具有在约30mW/cm2至约150mW/cm2之间的强度、在约1.0MHz至约2.0MHz之间的频率的脉冲超声，其中脉冲重复率在约0.5kHz至约2.0kHz之间以及占空比在约10％至50％之间。

2.根据权利要求1的设备在治疗哺乳动物的心理健康障碍、综合症或疾病中的用途。

3.根据权利要求1所述的设备，其中，所述液态偶联介质包括净化水。

4.根据权利要求1所述的设备，其中，所述弹性盖包括聚氨酯橡胶。

5.根据权利要求1、3或4所述的设备，包括两个转换器元件，所述两个转换器元件定位于所述头带装置上，以接触穿戴所述头带装置的用户的左颞颥和右颞颥。

6.根据权利要求2所述的在治疗人类抑郁症中的用途。

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