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CN111166527A - 一种软组织修复补片及其制备方法 - Google Patents

一种软组织修复补片及其制备方法 Download PDF

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CN111166527A
CN111166527A CN201911411488.6A CN201911411488A CN111166527A CN 111166527 A CN111166527 A CN 111166527A CN 201911411488 A CN201911411488 A CN 201911411488A CN 111166527 A CN111166527 A CN 111166527A
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patch
soft tissue
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decellularization
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李晶
杨利霞
樊立涛
徐兰举
杜亚东
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Original Assignee
Hebei Aineng Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种软组织修复补片及其制备方法，该补片以哺乳动物的皮肤组织为原料，经过前处理去除皮下附属组织、制备皮片、一次脱细胞、交联改性、二次脱细胞，最后经过清洗、裁剪、干燥复合、终端灭菌制备而成。该方法制备的生物脱细胞组织补片不仅具有完整的胶原蛋白三维结构，同时拥有良好的力学性能、预防腹腔粘连等特性。本发明补片产品适用于外科手术中各类软组织的损伤和修复、腹壁缺损修复，还可用于生物工程领域作为生物支架材料。

Description

一种软组织修复补片及其制备方法
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种软组织修复补片及其制备方法。
背景技术
由外伤、感染及肿瘤切除等原因导致的腹壁缺损是临床上经常面临的问题。腹壁缺损后的功能重建，特别是对缺损范围较大或张力较高的腹壁缺损的修复重建，至今仍是外科的临床难题之一。
在腹壁缺损治疗的发展过程中，应用材料进行修补具有划时代的意义。目前不可降解材料虽因其力学强度大可显著降低术后复发率，但也因潜在并发症如浆液肿、感染、慢性疼痛、补片收缩以及可能导致的复发和粘连等均使其应用受到限制。而使用生物材料通过加工改性，使其具有符合腹腔要求的生物相容性和力学强度，为腹壁缺损修复提供一种新的材料和思路。
脱细胞真皮基质（Acellular dermal matrix, ADM）是采用脱细胞技术，将真品组织中引起宿主免疫排斥反应的所有细胞成分、MHCⅠ类、Ⅱ类抗原去除，同时完整保留真皮的细胞外基质和立体支架结构。ADM作为天然材料，植入体内后可诱导新生血管生成和宿主细胞的长入，通过细胞的增殖及细胞外基质的分泌，最终实现组织重建。而且植入后不会引起明显的免疫排斥反应，是一种理想的组织修复材料。
现在常用的组织器官的脱细胞方法有物理、化学、酶消化法，使用不同的工艺流程和方法，细胞去除效率及对材料的影响和损伤也不一样，会不同程度的改变材料的生物化学成分、空间结构和生物力学性能，这些均会影响宿主对材料的植入后的反应，因此，工艺制备过程中材料基质特性的改变是导致产品植入后效果差异的最主要原因。作为补片修补腹壁时由于人体腹内压的存在，修复材料的力学强度也成为是否能够成功修复的重要指标。
现有专利或文献中制备的脱细胞真皮基质存在细胞去除不彻底、生物相容性差、抗张强度低、或者处理强度大严重破坏材料的天然空间结构等缺点。如中国专利201310376619.8中使用分散酶、脱氧核糖核酸酶和半乳糖苷酶，以及专利201410377104.4中使用角蛋白酶和胰酶进行脱脂、脱细胞处理，其中多种酶的应用会使基质材料中空间结构过度松散，从而影响产品的力学性能和修复效果。中国专利201210060671.8中针对动物真皮基质使用碱、表面活性剂进行脱脂处理，使用胰酶、硫酸铵、SDS等进行脱细胞处理，其中脱脂、脱细胞的时间均为0.5～1h，处理时间短、对基质破坏程度小，但通过验证其去细胞效果不均一，反而增加了产品植入体内后的免疫排斥风险。专利号为CN1387923的中国专利公开了一种异种无细胞真皮支架及其制备方法，该支架系用胰蛋白酶和戊二醛处理乳猪皮而得，这种方法处理后的真皮支架具有抗张强度高、生物相容性好的优点，但其渗透性差，创面易产生积液、积气，血管化慢，且戊二醛对细胞有毒性，有潜在的危险。除此之外，上述脱细胞类的组织补片应用在腹腔时关注的一个要点就是材料与腹腔内组织的防粘连问题，一旦发生材料与腹腔内粘连，就会产生肠梗阻、肠瘘、腹痛等多种类型的术后并发症，严重影响产品的使用效果，该问题并没有得到有效解决。
综上所述，如何完全去除基质材料中的细胞等抗原成分、降低对材料空间结构的破坏程度，并且保证其安全性和有效性，是制备生物组织补片当前需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种力学性能良好、具有预防组织粘连效果的软组织修复补片，并同时提供其制备方法。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
一种软组织修复补片的制备方法，其具体包括如下步骤：
（1）制备断层皮片
取厚度范围为0.5～2.0mm的动物断皮片，如猪、牛、羊等，用PBS缓冲液、生理盐水或纯化水清洗干净；
（2）灭活
将步骤（1）获得的断层皮片浸泡于消毒液中对皮片进行初步的灭活处理，所述灭活处理任选如下：消毒液为70~80%的乙醇溶液室温浸泡1～3h，或消毒液为0.1%～1.0%的过氧乙酸溶液浸泡10min～30min，或消毒液为0.1%的新洁尔灭浸泡30min～1h；
（3）一次脱细胞
将步骤（2）灭活处理后的材料用含0.1%～0.25%（质量体积比g/100ml）的胰酶和5～10mM EDTA的PBS溶液，室温预处理1h～4h，然后4℃～10℃脱细胞处理4h～20h；
（4）交联
将步骤（3）处理后的材料用交联液浸泡4～12h，所述交联液为含有N,N-二环己基碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和2-吗啉乙磺酸的水溶液或含有上述三种物质的乙醇水溶液
（5）二次脱细胞
对步骤（4）处理后的材料用含0.2%～0.6%（V/V）TritonX-100或/和含0.1%～0.5%（g/100ml）SDS的PBS溶液，浸泡1~3h，取出，PBS冲洗；
（6）干燥复合
步骤（5）得到的材料和含有防粘连物质的纯化水溶液或生理盐水溶液混合均匀后，放置入冻干机中，-30℃预冻2～4h，之后抽真空缓慢升温至30℃，干燥12～36h；
（7）病毒灭活
将干燥完成的材料进行Co-60辐照或电子束辐照灭菌，即得成品。
作为本发明的一些实施方案，所述防粘连物质选自壳聚糖和透明质酸钠的任一种或两种。
作为本发明的一些实施方案，步骤（6）壳聚糖的纯化水溶液或生理盐水溶液的浓度为为3～10mg/ml，透明质酸钠的纯化水溶液或生理盐水溶液的浓度为0.1～5mg/ml。
作为本发明的一些实施方案，步骤（6）得到的材料的上表面积和含有防粘连物质的纯化水溶液或生理盐水溶液的体积比为1cm2:0.2~1ml。
作为本发明的一些实施方案，所述步骤（4）交联液的配制方法为首先配制浓度为30～60mmol/L的2-吗啉乙磺酸水溶液或乙醇水溶液，将pH调至5.4～5.5后加入20～50mmol/l的N,N-二环己基碳化二亚胺和20～50mmol/l的N- 羟基丁二酰亚胺，混合均匀即得。
作为本发明的一些实施方案，所述步骤（4）的乙醇水溶液的浓度为30~50%。
本发明另一方面提供了一种上述方法制备的软组织修复补片。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：
本发明消毒液对皮片进行初步的灭活处理，不仅能杀灭细菌，同时对真菌孢子也有一定的杀灭作用，灭活处理后能够迅速降低材料表面的微生物数量。
本发明通过一次脱细胞，使用胰酶进行皮片材料的初次脱细胞处理，解除胶原蛋白与其它蛋白间的连接，松散组织，对可引发宿主细胞识别反应的细胞成分、抗原蛋白进行处理。加入EDTA后能螯合金属离子，破坏细胞对基质材料的黏附。交联，可以避免植入后降解过快，同时保持材料的一定的力学性能。二次脱细胞可以进一步去除残余的细胞及其细胞碎片等抗原物质，提高材料的生物相容性。经过一次脱细胞、交联和二次脱细胞可以再保证力学性能的前提下，去除抗原物质，提高生物相容性。
本发明在干燥一步复合防粘连物质，在产品应用时使防粘连面朝向腹腔，经动物实验证明，能有效的降低脱细胞组织补片修补腹壁缺损时粘连的发生率。
本发明制备的生物脱细胞组织补片克服了传统的细胞去除不彻底、生物相容性差、抗张强度低、或者严重破坏材料的天然空间结构等缺点，通过采用两步的脱细胞处理过程彻底去除材料中有可能引起免疫排斥反应的物质，同时能够保持胶原完整的空间三维结构。运用交联改性保持了补片材料的顺应性和力学性能，满足腹壁修复对力学性能的要求，经过检测补片在拉伸强度、缝合强度、顶破强度方面表现出明显的优势，完全能够满足临床要求。针对腹腔内植入材料本发明还复合了的防粘连物质，能够有效的降低脱细胞组织补片修补腹壁缺损时粘连的发生率和发生程度，降低各种由粘连引起并发症的概率。
本发明制备的脱细胞组织补片原料来源广泛、制备方法简单、可操作性强、能够实现大规模的产业化生产。所制备的生物组织补片用于腹壁修复及疝修复，有生物相容性良好，无过量瘢痕组织和炎症反应，有效防止腹腔粘连等，并且随着宿主组织的张入，补片会逐步的降解最终被新生的宿主组织所替代。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1制备的生物脱细胞组织补片外观图；
图2为对比例1、对比例2、和实施例1制备的组织补片的组织学对比照片，图中A为对比例1、B为对比例2、C为实施例1；
图3为本发明实施例1工艺制备的组织补片的扫描电镜图；
图4为本发明实施例1工艺制备的组织补片的顶破强度测定图；
图5为本发明实施例1工艺制备的组织补片修复猪腹壁缺损结果：A为术后1M腹腔镜观察结果；B为术后3M组织学观察结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。
在以下实施例中，所用的PBS的制备方法如下：
NaCl 8.00g/L；
KCl 0.20g/L；
Na2HPO4 1.56g/L；
KH2PO4 0.20g/L；
将上述各成分依次溶解于含有800ml水的容量瓶中，补加水至1000ml，混匀。
实施例1
步骤一、制备断层皮片：将经过前处理的猪皮肤使用取皮机反鼓取皮，制备成厚度范围为0.6～0.8mm断层皮片，用纯化水清洗干净。
步骤二、灭活：将获得的皮片浸泡于0.1%的新洁尔灭浸泡30min进行初步消毒处理。
步骤三、一次脱细胞：采用浓度为0.125%胰酶（质量体积比g/100ml）、10mM EDTA的PBS溶液进行初次的脱细胞处理，处理条件为室温25℃预处理2h，之后转入低温4℃脱细胞处理6h。
步骤四、交联改性：将步骤三处理完的材料使用含50mmol/L EDC、40mmol/LNHS、40mmol/LMES的水溶液进行交联改性处理，室温25℃交联4h。
步骤五、去污剂脱细胞：选用0.5% TritonX-100、0.25% SDS混合配置的PBS溶液进行二次脱细胞处理1h，取出，PBS冲洗。
步骤六、干燥复合：将经过处理的材料清洗干净，放置入冻干机中，同时加入含8mg/ml壳聚糖的生理盐水溶液，所述材料的上表面积和含壳聚糖的生理盐水溶液的体积比为1cm2:0.6ml， -30℃预冻3h，之后抽真空缓慢升温至30℃，干燥24h。
步骤七、裁剪、灭菌：将补片使用模具裁剪，包装后进行钴60辐照，灭菌剂量为25kGy。
本实施例制备的生物脱细胞组织补片厚度约为0.9 mm，顶破强度为290 N（见附图4），力学性能符合腹腔修复的要求。
如附图3所示，从扫描电镜的结果观察来看，本实施例1制备的生物脱细胞组织补片为天然胶原纤维的三维空间网状结构，纤维束交错缠绕，彼此间存在不同大小的空隙，有利于补片植入后宿主细胞的长入和新生血管的形成，生物相容性良好，可用于腹壁切口疝、腹壁缺损的修复。
实施例2
步骤一、制备断层皮片：将经过前处理的牛的皮肤使用取皮机反鼓取皮，制备成厚度范围为0.5～0.7mm断层皮片。用磷酸盐缓冲液清洗干净。
步骤二、灭活：将获得的皮片浸泡于75%乙醇溶液室温浸泡2h进行初步消毒处理。
步骤三、酶脱细胞：采用质0.1%（质量体积比g/100ml）的胰酶、8mM EDTA的PBS溶液进行初次的脱细胞处理，处理条件为室温25℃预处理1h，之后转入低温6℃处理10h。
步骤四、交联改性：将脱细胞处理完的材料使用40mmol/L EDC、20mmol/LNHS、20mmol/LMES配制的40%乙醇溶液进行交联改性，室温交联6h，PBS冲洗。
步骤五、去污剂脱细胞：选用0.6%的TritonX-100配置的PBS溶液进行二次脱细胞处理2h，取出PBS冲洗。
步骤六、干燥复合：将经过处理的材料清洗干净，放置入冻干机中，同时加入含5mg/ml壳聚糖的生理盐水溶液，所述材料的上表面积和含壳聚糖的生理盐水溶液的体积比为1cm2:0.8ml，-30℃预冻2h，之后抽真空缓慢升温至30℃，干燥36h；
步骤七、裁剪、灭菌：将补片使用模具裁剪，包装后进行电子束辐照，灭菌剂量为15kGy。
本实施例制备的生物脱细胞组织补片厚度约为0.8 mm，顶破强度为275 N，力学性能符合腹腔修复的要求，经组织学观察与其它脱细胞方法相比无明显细胞残留，生物相容性良好，可用于腹壁软组织缺损、腹股沟疝的修复。
实施例3、
步骤一、制备断层皮片：将经过前处理的羊的皮肤使用取皮机反鼓取皮，制备成厚度范围为0.8～1.0mm断层皮片，用生理盐水清洗干净。
步骤二、灭活：将获得的皮片浸泡于0.5%的过氧乙酸消毒液中20min进行初步的消毒处理。
步骤三、酶脱细胞：采用0.2%（质量体积比g/100ml） 胰酶、5mM EDTA的PBS溶液进行初次的脱细胞处理，处理条件为室温25℃预处理2h，之后转入低温8℃脱细胞处理16h。
步骤四、交联改性：将脱细胞处理完的材料使用30mmol/l EDC、20mmol/l NHS、20mmol/l MES的水溶液配置为交联液，室温交联5h。
步骤五、去污剂脱细胞：选用0.25% SDS-PBS溶液进行二次脱细胞处理3h，取出，PBS冲洗。
步骤六、干燥复合：将经过处理的材料清洗干净，放置入冷冻干机中，同时加入含10mg/ml壳聚糖的生理盐水溶液，所述材料的上表面积和含壳聚糖的生理盐水溶液的体积比为1cm2:0.5ml， -30℃预冻4h，之后抽真空缓慢升温至30℃，干燥20h；
步骤七、裁剪、灭菌：将补片使用模具裁剪，包装后进行钴60辐照，灭菌剂量为20kGy。
本实施例制备的生物脱细胞组织补片厚度约为1.1 mm，顶破强度为320 N，力学性能符合腹腔修复的要求，经组织学观察与其它脱细胞方法相比无明显细胞残留，生物相容性良好，可用于腹壁全层缺损的修复。
实施例4
步骤一、制备断层皮片：将经过前处理的猪的皮肤使用取皮机反鼓取皮，制备成厚度范围为0.6～0.8mm断层皮片，用生理盐水清洗干净。
步骤二、灭活：将获得的皮片浸泡于0.1%新洁尔灭浸泡30min进行初步的消毒处理。
步骤三、酶脱细胞：采用0.125%（质量体积比g/100ml） 胰酶、10mM EDTA的PBS溶液进行初次的脱细胞处理，处理条件为室温25℃预处理2h，之后转入低温4℃脱细胞处理6h。
步骤四、交联改性：将脱细胞处理完的材料使用50mmol/l EDC、40mmol/l NHS、40mmol/l MES的水溶液配置为交联液，室温交联4h。
步骤五、去污剂脱细胞：选用0.5% TritonX-100、0.25% SDS溶液进行二次脱细胞处理1h，取出，PBS冲洗。
步骤六、干燥复合：将经过处理的材料清洗干净，放置入冷冻干机中，同时加入含3mg/ml透明质酸钠的生理盐水溶液，所述材料的上表面积和含透明质酸钠的生理盐水溶液的体积比为1cm2:0.8ml， -30℃预冻3h，之后抽真空缓慢升温至30℃，干燥24h；
步骤七、裁剪、灭菌：将补片使用模具裁剪，包装后进行钴60辐照，灭菌剂量为25kGy。
本实施例制备的生物脱细胞组织补片厚度约为0.9mm，顶破强度为280N，力学性能符合腹腔修复的要求，经组织学观察与其它脱细胞方法相比无明显细胞残留，生物相容性良好，可用于腹壁切口疝、腹壁缺损的修复。
实施例5
步骤一、制备断层皮片：将经过前处理的牛的皮肤使用取皮机反鼓取皮，制备成厚度范围为0.5～0.7mm断层皮片。用磷酸盐缓冲液清洗干净。
步骤二、灭活：将获得的皮片浸泡于75%乙醇溶液室温浸泡2h进行初步消毒处理。
步骤三、酶脱细胞：采用质0.1%（质量体积比g/100ml）的胰酶、8mM EDTA的PBS溶液进行初次的脱细胞处理，处理条件为室温25℃预处理1h，之后转入低温6℃处理10h。
步骤四、交联改性：将脱细胞处理完的材料使用40mmol/L EDC、20mmol/LNHS、20mmol/LMES配制的40%乙醇溶液进行交联改性，室温交联6h，PBS冲洗。
步骤五、去污剂脱细胞：选用0.6%的TritonX-100配置的PBS溶液进行二次脱细胞处理2h，取出PBS冲洗。
步骤六、干燥复合：将经过处理的材料清洗干净，放置入冻干机中，同时加入含0.5mg/ml透明质酸钠的生理盐水溶液，所述材料的上表面积和透明质酸钠的生理盐水溶液的体积比为1cm2:1ml，-30℃预冻2h，之后抽真空缓慢升温至30℃，干燥36h；
步骤七、裁剪、灭菌：将补片使用模具裁剪，包装后进行电子束辐照，灭菌剂量为15kGy。
本实施例制备的生物脱细胞组织补片厚度约为0.9mm，顶破强度为270 N，力学性能符合腹腔修复的要求，经组织学观察与其它脱细胞方法相比无明显细胞残留，生物相容性良好，可用于腹壁软组织缺损、腹股沟疝的修复。
实施例6
步骤一、制备断层皮片：将经过前处理的羊的皮肤使用取皮机反鼓取皮，制备成厚度范围为0.8～1.0mm断层皮片，用生理盐水清洗干净。
步骤二、灭活：将获得的皮片浸泡于0.5%的过氧乙酸消毒液中20min进行初步的消毒处理。
步骤三、酶脱细胞：采用0.2%（质量体积比g/100ml） 胰酶、5mM EDTA的PBS溶液进行初次的脱细胞处理，处理条件为室温25℃预处理2h，之后转入低温8℃脱细胞处理16h。
步骤四、交联改性：将脱细胞处理完的材料使用30mmol/l EDC、20mmol/l NHS、20mmol/l MES的水溶液配置为交联液，室温交联5h。
步骤五、去污剂脱细胞：选用0.25% SDS-PBS溶液进行二次脱细胞处理3h，取出，PBS冲洗。
步骤六、干燥复合：将经过处理的材料清洗干净，防置入冷冻干机中，同时加入含5mg/ml透明质酸钠水溶液，所述材料的上表面积和透明质酸钠水溶液的体积比为1cm2:0.3ml， -30℃预冻4h，之后抽真空缓慢升温至30℃，干燥20h；
步骤七、裁剪、灭菌：将补片使用模具裁剪，包装后进行钴60辐照，灭菌剂量为20kGy。
本实施例制备的生物脱细胞组织补片厚度约为1.2 mm，顶破强度为290 N，力学性能符合腹腔修复的要求，经组织学观察与其它脱细胞方法相比无明显细胞残留，生物相容性良好，可用于腹壁全层缺损的修复。
对比例1
步骤一、制备断层皮片：将经过前处理的猪皮肤使用取皮机反鼓取皮，制备成厚度范围为0.6～0.8mm断层皮片，用纯化水清洗干净。
步骤二、灭活：将获得的皮片浸泡于0.1%的新洁尔灭浸泡30min进行初步消毒处理。
步骤三、一次脱细胞：采用质0.1%（质量体积比g/100ml）的胰酶、8mM EDTA的PBS溶液进行初次的脱细胞处理，处理条件为室温25℃预处理1h，之后转入低温6℃处理10h。
步骤四、交联改性：将步骤三处理完的材料使用含50mmol/L EDC、40mmol/LNHS、40mmol/LMES的水溶液进行交联改性处理，室温25℃交联4h。
步骤五、去污剂脱细胞：选用50mg/L的
Figure 556463DEST_PATH_IMAGE001
-半乳糖苷酶PBS溶液进行二次脱细胞处理，取出后PBS冲洗。
对比例2
步骤一、制备断层皮片：将经过前处理的动物皮肤使用取皮机反鼓取皮，制备成厚度范围为0.6～0.8mm断层皮片，用纯化水清洗干净。
步骤二、灭活：将获得的皮片浸泡于0.1%的新洁尔灭浸泡30min进行初步消毒处理。
步骤三、一次脱细胞：采用质0.1%（质量体积比g/100ml）的胰酶、8mM EDTA的PBS溶液进行初次的脱细胞处理，处理条件为室温25℃预处理1h，之后转入低温6℃处理10h。
步骤四、交联改性：将步骤三处理完的材料使用含50mmol/L EDC、40mmol/LNHS、40mmol/LMES的水溶液进行交联改性处理，室温25℃交联4h。
步骤五、去污剂脱细胞：选用0.5%SDS（质量体积比g/100ml）水溶液进行二次脱细胞处理，取出后PBS冲洗。。
效果例1
对实施例1、对比例1和2得到的软组织补片进行脱细胞效果的组织学染色观察，具体见图2，A是对比例1组织补片的组织学染色结果，从图中可以看出经过处理后补片中已经观察不到明显的细胞，但由于制备过程中酶的处理强度较大，对胶原和基质成分的破坏程度较大，材料出现松散现象。B是对比例2得到的补片的检测结果，可以看出去污剂处理不能完全去除材料中具有抗原性的表皮细胞、成纤维细胞等，内部观察依然有较多的细胞残留。C是采用本申请实施例1的脱细胞组织补片，可见通过酶和去污剂结合处理组织学观察无完整的细胞结构，同时补片中胶原纤维结构完整，排列整齐。
效果例2 顶破强度测定
按照YY0500-2004中8.3.3.2规定的检测方法，将样品裁剪成至少5*5cm的正方形置于万能拉力机环形夹具的开口上，夹具固定样品后设置球形探头的移动速度为100mm/min，球形探针移动穿过样品，直至样品破裂时的负载即为产品的顶破强度，单位为N。
如图4所示，正常人在日常活动中腹壁承受的压力值范围在11～27 N，有呕吐、咳嗽等活动时腹内压会迅速增加，通过实验确定腹壁筋膜的顶破力平均约为232 N。本专利工艺制备的组织补片本身的承受压力值范围在274.6 ± 33.32 N，组织补片植入体内后可以提供足够的力学支持，而且随着细胞长入和组织再生，这一特性会进一步保持，这样最大限度的保证了患者的术后安全和远期疗效。
效果例3本发明工艺制备的组织补片修复猪腹壁缺损试验
使用小型猪制作腹壁缺损模型，缺损大小5*8cm，选取本发明专利制备的合适尺寸组织补片进行修复，术后1M腹腔镜观察修复部位的组织粘连情况，从图5A中可以看到，材料修复部位朝向腹腔面表面光滑平整，与腹腔内的脏器无粘连情况发生。术后3M取材进行HE染色观察，修复材料周围有少量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，胶原纤维排列整齐，可见明显的新生血管生成。
效果例4 本发明工艺制备的组织补片的外观和孔径实验对实施例1和实施例4得到的组织补片的脱细胞层和防粘连层进行孔径和孔隙率测定，结果见表1。
表1 组织补片的孔径测试结果
外观 孔径(µm) 孔隙率(%0
实施例1脱细胞层 表面呈多孔网络状 50~300 85%
实施例1防粘连层 截面呈蜂窝状孔结构 100~200 93%
实施例3脱细胞层 表面呈多孔网络状 50~300 82%
实施例4防粘连层 截面呈蜂窝状孔结构 100~200 89%
通过扫描电镜和排液法测定产品的孔径和孔隙率，扫描电子显微镜观察下补片产品的表面呈多孔网络状，有大小不同的孔分布，且与材料内部相通，内部结构疏松，相互连通的孔道多而明显，脱细胞层的孔径由于天然材料的特性，在50-~300μm左右，防粘连层的孔径在100~200um之间，符合细胞生长对支架材料结构（孔道连通）与孔径尺寸（80~150μm）的要求，能够有利于各类组织细胞的浸润和长入，实现快速的血管化和组织再生。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种软组织修复补片的制备方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：
（1）制备断层皮片
取厚度范围为0.5～2.0mm的动物断皮片，用PBS缓冲液、生理盐水或纯化水清洗干净；
（2）灭活
将步骤（1）获得的断层皮片浸泡于消毒液中对皮片进行初步的灭活处理，所述灭活处理任选如下：消毒液为70~80%的乙醇溶液室温浸泡1～3h，或消毒液为0.1%～1.0%的过氧乙酸溶液浸泡10min～30min，或消毒液为0.1%的新洁尔灭浸泡30min～1h；
（3）一次脱细胞
将步骤（2）灭活处理后的材料用含0.1%～0.25%（质量体积比g/100ml）的胰酶和5～10mM EDTA的PBS溶液，室温预处理1h～4h，然后4℃～10℃脱细胞处理4h～20h；
（4）交联
将步骤（3）处理后的材料用交联液浸泡4～12h，所述交联液为含有N,N-二环己基碳化二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和2-吗啉乙磺酸的水溶液或含有上述三种物质的乙醇水溶液
（5）二次脱细胞
对步骤（4）处理后的材料用含0.2%～0.6%（V/V）TritonX-100或/和含0.1%～0.5%（g/100ml）SDS的PBS溶液，浸泡1~3h，取出，PBS冲洗；
（6）干燥复合
步骤（5）得到的材料和含有防粘连物质的纯化水溶液或生理盐水溶液混合均匀后，放置入冻干机中，-30℃预冻2～4h，之后抽真空缓慢升温至30℃，干燥12～36h；
（7）病毒灭活
将干燥完成的材料进行Co-60辐照或电子束辐照灭菌，即得成品。
2.根据权利要求1所述的一种软组织修复补片的制备方法，其特征在于，所述防粘连物质选自壳聚糖和透明质酸钠的任一种或两种。
3.根据权利要求1所述的一种软组织修复补片的制备方法，其特征在于，步骤（6）壳聚糖的纯化水溶液或生理盐水溶液的浓度为3～10mg/ml，透明质酸钠的纯化水溶液或生理盐水溶液的浓度为0.1～5mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种软组织修复补片的制备方法，其特征在于，步骤（6）得到的材料的上表面积和含有防粘连物质的纯化水溶液或生理盐水溶液的体积比为1cm2:0.2～1ml。
5.根据权利要求1所述的一种软组织修复补片的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）交联液的配制方法为首先配制浓度为30～60mmol/L的2-吗啉乙磺酸水溶液或乙醇水溶液，将pH调至5.4～5.5后加入20～50mmol/l的N,N-二环己基碳化二亚胺和20～50mmol/l的N-羟基丁二酰亚胺，混合均匀即得。
6.根据权利要求1所述的一种软组织修复补片的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）的乙醇水溶液的浓度为30～50%。
7.一种软组织修复补片，其特征在于，所述软组织修复补片是采用权利要求1-6任一项所述的方法制的。
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