CN111148536A

CN111148536A - 非细胞根管填料以及非细胞牙体组织再生促进试剂盒

Info

Publication number: CN111148536A
Application number: CN201880062522.0A
Authority: CN
Inventors: 中岛美砂子; 庵原耕一郎
Original assignee: National Center for Geriatrics and Gerontology
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2038-09-21
Also published as: US20200261321A1; JP2022116298A; CN111148536B; WO2019065478A1; EP3689386B1; EP3689386A4; JP2019063191A; EP3689386A1; US11969487B2

Abstract

本发明提供一种非细胞牙体组织再生促进试剂盒，即使在不移植自体或同种异体干细胞或干细胞来源成分的情况下，也能够有效地使牙体组织再生。该试剂盒包含：含有丝氨酸蛋白酶的预处理剂，以及非细胞根管填料；其中，所述非细胞根管填料包含：含有CCR3拮抗剂、CCL11中和抗体以及ALK5抑制剂中的至少任一种的再生促进化合物，以及细胞外基质。优选用于中高龄个体。

Description

非细胞根管填料以及非细胞牙体组织再生促进试剂盒

技术领域

本发明涉及一种促进牙髓、牙本质以及根尖牙周组织再生的、不使用干细胞或干细胞成分的非细胞根管填料以及非细胞牙体组织再生促进试剂盒。

背景技术

在超高龄社会中，拥有健康且能咀嚼利落的牙齿对于健康长寿至关重要。但是，在中高龄(中老年)人中，已去除牙齿的神经(拔髓)的牙齿在数十年后再次感染而陷入脓液积聚于牙根下的疾病(感染根管)者超过20％，而且约25％即使接受治疗也无法完全治愈。这种慢性感染病灶对免疫力降低的高龄(老年)人全身的影响很大。在老年人中，多数情况下，在骨质疏松症治疗药服用中无法拔牙。另外，在中老年人中，即使在拔牙的情况下也仍能适用种植体的病例减少。

另一方面，牙齿缺失会导致咬合·发音·味觉·触觉·美观性降低、QOL降低。最近，担心由牙齿或口腔功能降低引起的口腔·虚弱(oral·frail)会导致由肌肉力量低或体格功能低等肌肉减少症或营养不良等从而引起生活功能的降低，甚至陷入需要护理的状态。

因此，为了维持牙齿以及口腔功能，已经开发了一种牙髓再生治疗法，该方法是将从自己不用的牙齿中分离提取的牙髓干细胞进行自体移植，或者将从其他人不用的牙齿中分离提取的牙髓干细胞进行同种异体移植，这样可以使牙齿恢复原状，即使拔髓也不至于感染根管·拔牙(专利文献1～3)。另外，不仅是牙髓干细胞，即使是将来源于骨髓或脂肪的其他组织的干细胞进行自体或同种异体移植，牙髓也可以被再生。

但是，与牙髓干细胞移植相比，牙髓再生量、血管新生量(新生血管形成量)、神经再生量较差(专利文献4)。已经通过临床研究证实了通过自体牙髓干细胞移植的牙髓再生治疗法的安全性，并显示了其有效性(非专利文献1)。

另一方面，牙髓再生治疗中，相对于前者的干细胞治疗(stem cell therapy)(干细胞移植法)，存在细胞归巢(cell homing)(细胞迁移法)。相对于幼龄(年轻)人的牙根未成熟的牙齿，主流的方法是不使用牙髓干细胞，而在根管内填充血块(非专利文献2)。或者，也有注入PRP(富血小板血浆、Platelet-Rich Plasma)代替血块的方法(非专利文献3)。

但是，据说几乎没有观察到牙髓固有组织的再生，主要不过是再生了富含血管的纤维性·骨样组织(非专利文献4)。动物实验中，还开发了不使用干细胞而使用基质细胞衍生因子(stromal cell derived factor(SDF1α))、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor(bFGF))、血小板源性生长因子(platelet-derived growthfactor(PDGF))、干细胞因子(stem cell factor(SCF))、以及粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF))等的细胞生长因子(growth factor)或细胞因子作为趋化因子的细胞归巢(细胞迁移法)(非专利文献5)。

但是，据报道，不能进行充分的牙髓再生，且大部分是伴随血管的非常致密的纤维性结缔组织，还存在根管全部被钙化的情况(非专利文献6、7)。因此，迄今为止，已经考虑到干细胞对于牙髓组织的再生是必不可少的，特别是在根发育完全的牙齿中(非专利文献8)。

但是，自体干细胞移植存在如下缺点：在使用牙髓干细胞时需要智齿等自己不用的牙齿，在确认细胞加工物的安全性上花费高昂的成本，在必要时不能立即供给细胞，另外，中老年人的干细胞特性发生变化，能够分离提取的牙髓干细胞总数减少，扩增也花费时间。在同种异体移植中，尽管由于每一批的细胞制品数的增加，细胞制造加工后的安全性确认所需的成本与自体移植相比减少，但仍然存在诸如下述未解决的问题：确保安全性的牙齿供给源的问题，因牙髓干细胞制品化而对供给牙齿的人的权利或报酬等法律问题，人的免疫反应的安全性问题等。

因此，希望开发出在不使用干细胞或干细胞来源成分的情况下促进拔髓或感染根管治疗之后的牙体组织(即，牙髓、牙本质、根尖部牙周组织)再生的技术。另一方面，通过对用于牙髓再生且能促进宿主细胞迁移(细胞移行)的干细胞来源的进一步研究，认为可以选择适当的信号因子。即，希望今后开发出通过适当的信号因子的牙髓再生法，该信号因子能促进具有血管生成能力或神经分化能力的宿主干细胞的迁移，抑制具有骨形成或牙骨质形成能力的细胞的迁移(非专利文献9)。

其中，中高龄个体的牙髓再生与幼龄个体相比延迟。近年来，通过犬类动物实验，在中高龄的牙髓干细胞移植的牙髓再生治疗中，将CCL11中和抗体/CCR3拮抗剂(antagonist)或ALK5抑制剂(inhibitor)与牙髓干细胞一起进行移植则会促进牙髓再生。或者，在牙髓干细胞移植前，使用胰蛋白酶(Trypsin)对中高龄牙齿的根管内进行预处理则促进牙髓再生(专利文献5)。CCL11中和抗体或CCR3拮抗剂可抑制CCL11与CCR3结合，阻断信号传导。另外，GDF11与type I TGF-beta superfamily receptors ACVR1B(ALK4)、TGFBR1(ALK5)以及ACVR1C(ALK7)结合，但是信号传导由ALK4及ALK5进行。ALK5抑制剂阻断了GDF11的信号传导。牙髓再生时，认为来自牙本质中蓄积的牙髓干细胞的分泌因子从牙本质中游离出来，从而促进牙髓再生(非专利文献10)。在体外(in vitro)通过在含有老化牙髓干细胞的分泌因子的培养上清中添加CCR3拮抗剂，显著提高了培养上清中的神经突起伸长(神经突起生长)的促进作用以及迁移的促进作用。另外，通过添加ALK5抑制剂，显著提高了培养上清的血管诱导能力以及神经突起伸长促进作用。因此，揭示出中高龄犬中的CCR3拮抗剂或ALK5抑制剂的牙髓再生促进作用是由血管诱导促进、神经突起伸长促进以及迁移促进作用引起的。

但是，在幼犬的牙髓再生中，即使将CCR3拮抗剂或ALK5抑制剂与牙髓干细胞一起进行移植，也未观察到效果(专利文献5)。另一方面，胰蛋白酶作为药物用于达到以下目的：使坏死组织或凝血、变性蛋白质得以溶解，并使创面正常化从而促进抗生素的作用(非专利文献11)。在体外(in vitro)在胰蛋白酶处理的牙本质面上接种牙髓干细胞时，细胞的附着性增加，观察到向牙本质细胞的分化增进。

由此给出如下提示：在中高龄犬的胰蛋白酶预处理下的牙髓再生促进作用，是通过由蛋白溶解作用引起的中高龄牙本质中蓄积的抑制剂失活或者由前体的切断引起的活性化、对细胞附着于牙本质的促进、牙本质细胞分化促进作用所引起的。

但是，在幼犬的牙髓再生中，完全没有发现胰蛋白酶预处理的效果(专利文献5)。另外，在仅进行胰蛋白酶预处理而不移植牙髓干细胞的情况下，或者在仅使用CCR3拮抗剂或ALK5抑制剂而不移植牙髓干细胞的情况下，几乎没有观察到牙髓再生(专利文献5)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特许5621105号公报

专利文献2：日本特许6031658号公报

专利文献3：日本特许5748194号公报

专利文献4：日本特许5939559号公报

专利文献5：日本特愿2016-072306、PCT/JP2017/13572

非专利文献

非专利文献1：Nakashima M.,Iohara K.,Murakami M.,Nakamura H.,Sato Y.,Ariji Y.,Matsushita K.:Pulp regeneration by transplantation of dental pulpstem cells in pulpitis:A pilot clinical study.Stem Cell Res Therapy.8(1):61,2017.

非专利文献2：Galler KM.：Clinical procedures for revitalization:currentknowledge and considerations.Int Endod J.2016Oct；49(10):926-36.

非专利文献3：Kontakiotis EG,Filippatos CG,Tzanetakis GN,Agrafioti A.:Regenerativeendodontic therapy:a data analysis of clinical protocols.JEndod.41(2):146-54.2015.

非专利文献4：Del Fabbro M,Lolato A,Bucchi C,Taschieri S,Weinstein RL.:Autologous plateletconcentrates for pulp and dentin regeneration:a literaturereview of animal studies.J Endod.42(2):250-7,2016.

非专利文献5：Yang J.,Yuan G.,Chen Z.:Pulp Regeneration:CurrentApproachesand Future Challenges.Front Physiol.:7:58,2016.

非专利文献6：He L,Kim SG,Gong Q,Zhong J,Wang S,Zhou X,Ye L,Ling J,Mao JJ.:Regenerative endodontics for adult patients.J Endod.43(9S):S57-S64,2017.

非专利文献7：Iohara K,Murakami M,Takeuchi N,Osako Y,Ito M,Ishizaka R,Utunomiya S,Nakamura H,Matsushita K,Nakashima M.:A novel combinatorialtherapy with pulp stem cells and granulocyte colony-stimulating factor fortotal pulp regeneration.Stem Cells Transl.Med.2(7):521-533,2013.

非专利文献8：Cao Y,Song M,Kim E,Shon W,Chugal N,Bogen G,Lin L,Kim RH,ParkNH,Kang MK.：Pulp-dentin Regeneration:Current State and Future Prospects.JDent Res.94(11):1544-51,2015.

非专利文献9：Yang J,Yuan G,Chen Z.:Pulp Regeneration:Current Approachesand Future Challenges.Front Physiol.7:58,2016.eCollection2016.

非专利文献10:KawamuraR,Hayashi Y,Murakami H,Nakashima M.:EDTA solublechemical components and the conditioned medium from mobilized dental pulpstem cells contain an inductive microenvironment,promoting cellproliferation,migration and odontoblastic differentiation.Stem CellRes.Ther.7(1):77,2016.

非专利文献11：皮肤科性病科杂志第64卷，野口义国等，497-506页1954年。

发明的内容

发明要解决的问题

本发明就是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供一种非细胞根管填料以及使用该非细胞根管填料的非细胞牙体组织再生促进试剂盒，其中该填料在进行牙体组织再生时，在非细胞的情况下、特别是在不移植自体干细胞或同种异体干细胞或干细胞来源成分的情况下也能够有效地使牙体组织再生。

解决问题的手段

本发明的用于牙体组织再生的非细胞根管填料，其特征在于，其包含：含有CCR3拮抗剂、CCL11中和抗体以及ALK5抑制剂中的至少任一种的再生促进化合物，以及细胞外基质。非细胞根管填料中可以包含G-CSF、bFGF以及SDF-1等中的至少一种趋化因子。

本发明的用于牙体组织再生的非细胞牙体组织再生促进试剂盒包含：含有丝氨酸蛋白酶的预处理剂，含有CCR3拮抗剂、CCL11中和抗体以及ALK5抑制剂中的至少任一种的再生促进化合物，以及细胞外基质。非细胞牙体组织再生促进试剂盒可以包含G-CSF、bFGF以及SDF-1等中的至少一种趋化因子。

发明的效果

基于本发明，即使在不移植自体或同种异体牙髓干细胞或这些干细胞来源的成分(上清、分泌组(secretome)或外泌体(exosome))的情况下，也能够有效地使牙体组织再生。

附图简单说明

图1是示出在2岁犬中针对基于非细胞牙体组织再生促进试剂盒的再生牙髓组织与基于常规的细胞根管填料的再生牙髓组织进行了比较的移植后28天的H-E染色照片的图；在此，A、B是低倍率的，箭头(arrow head)是再生组织最上部；C、D是倍率的，黑色箭形符号表示牙本质细胞样细胞；白色箭形符号表示牙本质样硬组织形成。其中，A和C是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，且移植了非细胞根管填料及趋化因子G-CSF，其中该填料是将再生促进化合物(CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂)混合于去端肽胶原而成。B和D是不进行预处理，且移植了细胞根管填料，其中该填料是将同种异体牙髓干细胞(MDPSCs)和趋化因子G-CSF混合于去端肽胶原而成。E是牙髓再生量的统计学分析。

图2是示出在2岁龄犬中将再生组织中的血管新生及神经纤维伸长基于非细胞牙体组织再生促进试剂盒与基于常规的细胞根管填料的情况进行了比较的移植后28天的照片的图；在此，A、B表示血管新生(BS-1lectin染色，即凝集素(BS-1lectin)染色)，V表示新生血管，C、D是神经纤维伸长(PGP9.5染色)，箭形符号表示神经突。其中A和C是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是将CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂以及G-CSF混入去端肽胶原而成；B和D是不进行预处理，且移植了细胞根管填料，其中该填料是将同种异体牙髓干细胞(MDPSCs)和G-CSF混合于去端肽胶原而成。E是血管新生量的统计学分析，F是神经纤维伸长量的统计学分析。

图3是示出在2岁龄犬中使用了牙髓标记及牙本质细胞标记的移植后28天的再生组织的照片的图；在此，A、B是牙髓标记(TRH-DE免疫染色)，箭头是阳性细胞；C、D是牙本质细胞标记Enamelysin(釉质溶解素)mRNA的原位杂交(in situ hybridization)，箭形符号表示阳性细胞。其中，A和C是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，且移植了非细胞根管填料及趋化因子G-CSF，其中该填料是将再生促进化合物(CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂)混合于去端肽胶原而成；B和D是不进行预处理，且移植了细胞根管填料，其中该填料是将同种异体牙髓干细胞(MDPSCs)和G-CSF混合于去端肽胶原而成。

图4是示出在8月龄犬中针对基于有无再生促进化合物ALK5抑制剂的非细胞根管填料的再生牙髓组织进行了比较的移植后13天的H-E染色照片的图；在此，A、B是低倍率的，箭形符号表示再生组织最上部；C、D是倍率的，黑色箭形符号表示牙本质细胞样细胞，白色箭形符号表示牙本质样硬组织形成。其中A和C是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂以及ALK5抑制剂混合于去端肽胶原而成。B和D是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是仅将CCR3拮抗剂混合于去端肽胶原而成。

图5是示出在8月龄犬中针对基于有无再生促进化合物ALK5抑制剂的非细胞根管填料的再生组织的、血管新生及神经纤维伸长进行了比较的移植后13天的照片的图。A、B表示血管新生(BS-1lectin染色)、V表示新生血管，C、D是神经纤维伸长(PGP9.5染色)，箭形符号表示神经突。其中A和C是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂以及ALK5抑制剂混合于去端肽胶原而成。B和D是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是仅将再生促进化合物CCR3拮抗剂混合于去端肽胶原而成。

图6是示出在8月龄犬中基于有无再生促进化合物ALK5抑制剂的非细胞根管填料的、使用再生组织中的牙髓标记及牙本质细胞标记的移植后13天的再生组织的照片的图；在此，A、B是牙髓标记(TRH-DE免疫染色)，箭形符号表示阳性细胞，C、D是牙本质细胞标记Enamelysin mRNA的原位杂交。其中A和C是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂及ALK5抑制剂混合于去端肽胶原而成。B和D是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是仅将CCR3拮抗剂混合于去端肽胶原而成。

图7是示出在8月龄犬中针对基于添加有趋化因子bFGF或G-CSF的非细胞牙体组织再生促进试剂盒的再生牙髓组织进行了比较的移植后13天的H-E染色照片的图。在此，A、B是低倍率的，箭形符号表示再生组织最上部；C、D是倍率的，黑色箭形符号表示牙本质细胞样细胞，白色箭形符号表示牙本质样硬组织形成。其中A和C是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂以及趋化因子bFGF混合于去端肽胶原而成。B和D是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，且移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂以及趋化因子G-CSF混合于去端肽胶原而成。

图8是示出在8月龄犬中针对基于添加有趋化因子bFGF或G-CSF的非细胞牙体组织再生促进试剂盒的再生牙髓组织中的血管新生及神经纤维伸长进行了比较的移植后13天的照片的图；在此，A、B表示血管新生(BS-1lectin染色)，V表示新生血管，C、D是神经纤维伸长(PGP9.5染色)，箭形符号表示神经突。其中A和C是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂以及趋化因子bFGF混合于去端肽胶原而成。B和D是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂以及趋化因子G-CSF混合于去端肽胶原而成。

图9是示出在8月龄犬中基于添加有趋化因子bFGF或G-CSF的非细胞牙体组织再生促进试剂盒的、使用了再生牙髓组织中的牙髓标记及牙本质细胞标记的移植后13天的再生组织的照片的图；在此，A、B是牙髓标记(TRH-DE免疫染色)，箭形符号表示阳性细胞，C、D是牙本质细胞标记Enamelysin mRNA的原位杂交。其中A和C是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂以及趋化因子bFGF混合于去端肽胶原而成。B和D是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，且移植了非细胞牙髓再生促进剂，其中该再生促进剂是将再生促进化合物CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂以及趋化因子G-CSF混合于去端肽胶原而成。

图10是示出在2岁龄犬中针对基于有无胰蛋白酶预处理的非细胞根管填料的再生牙髓组织进行了比较的移植后28天的H-E染色照片的图；在此，A、B是低倍率的，箭头(arrowhead)表示再生组织最上部，C、D是倍率的，黑色箭形符号表示牙本质细胞样细胞，白色箭形符号表示牙本质样硬组织形成。其中A和C是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂以及趋化因子G-CSF混合于去端肽胶原而成。B和D是不进行胰蛋白酶预处理，且移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂以及趋化因子G-CSF混合于去端肽胶原而成。

图11是示出在2岁龄犬中针对基于有无胰蛋白酶预处理的非细胞根管填料的再生牙髓组织的血管新生及神经纤维伸长进行了比较的移植后28天的照片的图；在此，A、B表示血管新生(BS-1lectin染色)，C、D是神经纤维伸长(PGP9.5染色)，箭形符号表示神经突。其中A和C是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂以及趋化因子G-CSF混合于去端肽胶原而成。B和D是不进行胰蛋白酶预处理，且移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂以及趋化因子G-CSF混合于去端肽胶原而成。

图12是示出在2岁龄犬中基于有无胰蛋白酶预处理的非细胞根管填料的、使用了再生牙髓组织中的牙髓标记及牙本质细胞标记的移植后28天的再生组织的照片的图；在此，A、B是牙髓标记(TRH-DE免疫染色)，箭形符号表示阳性细胞，C、D是牙本质细胞标记EnamelysinmRNA的原位杂交。其中A和C是使用由胰蛋白酶组成的预处理剂处理10分钟，并移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂以及趋化因子G-CSF混合于去端肽胶原而成。B和D是不进行胰蛋白酶预处理，且移植了非细胞根管填料，其中该填料是将再生促进化合物CCR3拮抗剂、ALK5抑制剂以及趋化因子G-CSF混合于去端肽胶原而成。

图13是示出人的幼龄(年轻人)及高龄(老年人)来源的牙髓干细胞(DPSCs)的各批次中CCL11和CCR3的mRNA表达的图。

具体实施方式

以下，参照附图具体说明本发明的实施方式，该实施方式是为了容易理解本发明的原理，本发明的范围不限于下述的实施方式，本领域技术人员适当置换以下实施方式的结构的其他实施方式也包含在本发明的范围内。

本实施方式的用于牙体组织再生的非细胞根管填料包含：含有CCR3拮抗剂、CCL11中和抗体以及ALK5抑制剂中的至少任一种的再生促进化合物，以及细胞外基质。非细胞根管填料中可以包含G-CSF、bFGF以及SDF-1等中的至少一种趋化因子。

本实施方式的用于牙体组织再生的非细胞牙体组织再生促进试剂盒包含：含有丝氨酸蛋白酶的预处理剂，含有CCR3拮抗剂、CCL11中和抗体以及ALK5抑制剂中的至少任一种的再生促进化合物，以及细胞外基质。非细胞牙体组织再生促进试剂盒可以包含G-CSF、bFGF以及SDF-1等中的至少一种趋化因子。

牙体组织再生是指包含牙髓、牙本质、以及根尖牙周组织中的至少任一种组织的再生。

ALK5抑制剂以及CCR3拮抗剂或CCL11中和抗体均对牙髓再生有效果，但在血管新生中，ALK5抑制剂比CCR3拮抗剂或CCL11中和抗体更有效果，另一方面，在神经新生中，CCR3拮抗剂或CCL11中和抗体比ALK5抑制剂更有效果。在使用ALK5抑制剂以及CCR3拮抗剂或CCL11中和抗体的混合物的情况下，其混合比例没有特别限定，例如可以是10重量％:90重量％～90重量％:10重量％。

ALK5抑制剂没有特别限定，例如为下述化合物。

另外，CCR3拮抗剂没有特别限定，例如为下述化合物。

其中，A为CH₂或O，R¹为NHR(R为C1～C6烷基)，R²为C1～C6亚烷基-苯基，R³为H或C1～C6烷基，R⁴为H或C1～C6烷基。

CCL11以CCR3作为受体传导信号，但是抗CCL11中和抗体与CCL11结合，具有抑制CCL11与CCR3结合的作用，抑制CCL11的信号传导。另一方面，CCR3拮抗剂也与受体CCR3结合，同样具有抑制CCL11与CCR3结合的作用。抗CCL11中和抗体可以使用市售的抗体。

本实施方式的抑制CCL11的CCL11中和抗体或CCR3拮抗剂、或者抑制GDF11的信号传导的ALK5抑制剂，例如为50ng/mL～50μg/mL，优选为3μg/mL～30μg/mL。

细胞外基质没有特别限定，例如，包含胶原蛋白、人工蛋白多糖、明胶、水凝胶、纤维蛋白、磷蛋白(phosphophorin)、硫酸乙酰肝素、肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、海藻酸、透明质酸、几丁质、壳聚糖、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、羟基磷灰石、β-TCP、碳酸钙、钛以及金中的至少任一种。

非细胞根管填料中可以包含趋化因子。趋化因子，例如，包含G-CSF、SDF-1、bFGF、TGF-β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF以及HGF中的至少任一种。添加目的在于促进和年龄一起衰弱的牙齿周围的宿主干细胞的迁移能力。趋化因子优选G-CSF或bFGF或SDF-1。

本实施方式的非细胞根管填料，优选用于幼龄个体，但也可以用于中高龄个体。此外，对于幼龄个体没有特别限定，例如，在人的情况下，年龄1岁以上29岁以下，在大鼠的情况下，出生后1周以上29周以下，在犬的情况下，出生后1周以上1年以下。

本实施方式的非细胞牙体组织再生促进试剂盒包含：含有丝氨酸蛋白酶的预处理剂，以及上述非细胞根管填料。

预处理剂，是在将非细胞根管填料插入根管前使用。预处理是将含有丝氨酸蛋白酶的液体注入根管内。通过使用预处理剂，能够分解抑制牙齿或牙周组织中的组织再生的抑制剂，或者使趋化因子活性化，或者将潜在型(latent form)变为活性型(active form)。

丝氨酸蛋白酶是具有丝氨酸残基的蛋白酶(蛋白质分解酶)，所述丝氨酸残基是作为催化残基进行亲核攻击。丝氨酸蛋白酶基于氨基酸序列或构象的相似性而被分类为枯草杆菌蛋白酶样(subtilisin-like)丝氨酸蛋白酶、以及糜蛋白酶样(chymotrypsin-like)丝氨酸蛋白酶。前者包括枯草杆菌蛋白酶BPN'(subtilisin BPN')、嗜热蛋白酶(thermitase)、蛋白酶K(proteinase K)、羊毛硫抗生素肽酶(lantibiotic peptidase)、科星(kexin)、黄瓜素(cucumisin)等，后者包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶(thrombin)、Xa因子、弹性蛋白酶(elastase)等。优选地，丝氨酸蛋白酶为糜蛋白酶样(chymotrypsin-like)丝氨酸蛋白酶，更优选胰蛋白酶。

预处理剂所含的丝氨酸蛋白酶的浓度没有特别限制，只要它可以分解抑制牙齿或牙周组织中的组织再生的抑制剂，或者可以使趋化因子进行活性化处理即可，例如为10μg/mL(0.001％)～50mg/mL(5％)，优选为500μg/mL(0.05％)～5mg/mL(0.5％)。

将预处理剂注入根管内的时间没有特别限制，只要可以分解抑制牙齿或牙周组织中的组织再生的抑制剂，或者可以使趋化因子进行活性化处理即可，例如为3分钟～30分钟，优选为5分钟～20分钟，更优选为10分钟。

本实施方式的预处理剂，除了丝氨酸蛋白酶以外，还可以包含纳米微泡。纳米微泡包含由脂质形成的囊泡、以及填充该囊泡内的气体或气体前体。对于纳米微泡的直径没有特别限定，例如为10～500nm，优选为70～300nm。此外，纳米微泡的直径通过例如纳米粒子分布测定装置(SALD-7100，日本岛津制作所)测定。可以适当设计纳米微泡的脂质组成、带电状态、密度、重量、粒径等。对用于制备囊泡的脂质没有特别限定，但通过含有脂质类的膜构成成分来组成。对于脂质类而言，例如是磷脂、甘油糖脂以及鞘糖脂(sphingoglycolipid)以及这些脂质中导入伯氨基、仲氨基、叔氨基或季铵基而得到的阳离子脂质。

在预处理剂中包含纳米微泡的情况下，纳米微泡浓度通过预处理剂中纳米微泡的个数来表示。对于纳米微泡浓度没有特别的限定，例如可以是2×10⁷个/cm³～2×10⁹个/cm³。纳米微泡浓度可以通过例如电子自旋共振法(ESR)来进行定量分析。

本实施方式的非细胞牙体组织再生促进试剂盒，优选用于中高龄个体。对于中龄(中年)个体没有特别限定，例如，在人的情况下，年龄30岁以上49岁以下，在大鼠的情况下，出生后30周以上39周以下，在犬的情况下，出生后2年以上4年以下。对于高龄(老年)个体没有特别限定；例如，在人的情况下，年龄50岁以上，在大鼠的情况下，出生后40周以上，在犬的情况下，出生后5年龄以上。因此，本说明书中，人的中高龄个体规定为30岁以上的个体，大鼠的中高龄个体规定为出生后30周以上的个体，犬的中高龄个体规定为出生后2年以上的个体。

实施例

实施例1

(犬同种异体膜分离提取牙髓干细胞)

幼龄犬中实施全身麻醉后，拔出上颚犬牙齿，用涡轮棒从齿冠至齿根部沿纵向放入至未达到牙髓割线的程度，将含有20μg/mL庆大霉素(ゲンタロール(注册商标)，株式会社日本点眼药研究所)以及0.25μg/mL两性霉素B(ファンギゾン(注册商标)、Bristol-Myers公司)的Hanks液作为输送液，使用特殊的搬运容器，在温度管理下1小时以内运输牙齿。在超净工作台内取出牙髓，切碎，加入0.04mg/mL释放酶(Liberase)溶液5mL颠倒混和后，在恒温混匀仪(Elependorf公司)上37℃、500rpm振荡30分钟。振荡后，悬浮30次后，以200rpm离心1分钟，采集离心管内的上清。将该上清以2000rpm离心5分钟，在沉淀的细胞中加入含有10％犬血清的DMEM，悬浮后以2000rpm离心5分钟。在再次离心的细胞中加入含有10％犬血清的DMEM 5mL，悬浮30次。将细胞悬浮液与台盼蓝(0.4％，SIGMA)等量混合，悬浮10次，计数活细胞数。将剩余的悬浮液均匀地接种到T25烧瓶后，在CO₂培养箱(松下株式会社)(37℃，CO₂5％)内培养，观察形态。在达到60～70％汇合后继代细胞。然后，在第2代中，通过干细胞膜分取法对膜分离提取牙髓干细胞进行分离提取。即，以2×10⁴个细胞/100μL接种在膜上部，以最终浓度100ng/mL将趋化因子G-CSF(NEUTROGIN(ノイトロジン)，中外制药)加入在含有10％犬自身血清的DMEM的下部结构体的24孔(well)中，48时间后去除G-CSF，将含有10％犬自身血清的DMEM替换培养基。进一步培养，70％汇合后继代，继代至第6代，冷冻。

对于细胞表面抗原，在第7代中，以1×10⁷个细胞/mL使细胞分散在含有20％血清的PBS中，4℃阻断(Blocking)(FcγIII/II receptor blocking受体阻断剂)，反应20分钟后，将干细胞表面标记(CD31(PE)(JC70A)(Dako)、CD29(PE-Cy7)(HMb1-1)(eBioscience)、CD44(Phycoerythrin-Cy7，PE-Cy7)(IM7)(eBioscience)、CD73(APC)(AD2)(BioLegend)、CD90(PE)(YKIX337.217)(eBioscience)、CD105(PE)(43A3)(BioLegend)、以及CXCR4(FITC)(12G5)(R&D)在4℃暗处反应90分钟。作为阴性对照(negative control)使用小鼠IgG1negative control(AbD Serotec)、小鼠IgG1 negative control(异硫氰酸荧光素：fluorescein isothiocyanate、FITC)(MCA928F)(AbD Serotec)、小鼠IgG1 negativecontrol(藻红蛋白、Phycoerythrin-Cy7、PE-Cy7)(299Arm)(eBioscience)。采用流式细胞仪(FACS Aria II(BD bioscience))比较阳性率。

将冷冻保存的第6代细胞解冻，通过流式细胞术观察表面抗原的表达，CD29、CD44、CD73、CD90以及CD105的阳性率为95％以上，CD31为阴性，认为含有大量的干细胞·前体细胞。另外，CXCR4的阳性率约为18％。

此外，对于犬膜分离提取牙髓干细胞，明确了即使是以DLA(Dog leukocyteantigen：犬白细胞抗原，犬主要组织适合抗原)的单倍型不一致的方式将同种异体移植物移植至根管内的情况下，与单倍型一致的情况下相比，牙髓再生中看不到质和量的差异。

(使用非细胞牙体组织再生促进试剂盒的中龄犬拔髓后的牙髓再生：与干细胞治疗法的比较)

实施全身麻醉后，对中龄(2岁)犬上下颚前牙齿部进行拔髓处置，用#50～55扩大至根尖部后，用5％次氯酸钠溶液和3％过氧化氢水溶液交替清洗，再用生理盐水清洗，采用纸尖法将根管内完全干燥，止血后，用胶合剂和树脂暂时完全密封。拔髓处置4天后，取出临时密封，再次交替清洗，用生理盐水清洗后，用3％EDTA(Smear Clean(スメアクリーン)，日本齿科药品株式会社)在根管内反应2分钟，再用生理盐水清洗并干燥。然后，在右侧根管内用胰蛋白酶制剂(Francetin T粉(フランセチンTパウダー)，每10mg中结晶胰蛋白酶2500USP、持田制药株式会社制造)500μg/mL(0.05％、溶解于纳米微泡水中)浸渍10分钟进行预处理，用生理盐水清洗。然后，将包含作为再生促进化合物的CCR3拮抗剂(SB328437、TOCRISbioscience)200ng及ALK5抑制剂(SB431542、TOCRIS bioscience)200ng、作为趋化因子的G-CSF(NEUTROGIN，中外制药株式会社)150ng、以及细胞外基质胶原蛋白20μL(KOKEN去端肽胶原种植体，株式会社高研)的非细胞根管填料填充在根管内。作为对照，在左侧的根管中不进行根管内的胰蛋白酶预处理，将同种异体的膜分离提取牙髓干细胞5×10⁵个悬浮于20μL的胶原蛋白中，再添加G-CSF(NEUTROGIN)150ng作成根管填料(细胞根管填料)，将该根管填料注入根管内，同时注意不要使气泡进入。另外膜分离提取牙髓干细胞，是采用上述的膜分离提取培养器分离提取的牙髓干细胞。然后，在其上放置止血用明胶海绵(SPONGEL，Astellas制药公司)，用玻璃离子粘固剂(GC Fuji IX EXTRA、GC)以及光聚合树脂(Clearfil Mega Bond以及Clearfil DC core automix，Kurary Noritake Dental公司)将备填洞完全封闭。在移植28天后拔牙，按照常规方法制作纵剖面为5μm石蜡切片，H-E染色后进行形态学观察。各个标本(n＝3)的牙髓再生量是1个试样测定4个切片，以3个试样的平均值表示。血管新生是将30天标本中用Fluorescence Griffonia(Bandeiraea)Simplicifolia Lectin 1/fluorescein-galanthus nivalis(snowdrop)lectin、BS-1lectin、Vector lab.)以20μg/mL进行免疫染色15分钟并施行比较研究。神经突起伸长是将28天标本用PGP9.5(Ultra Clone、1:10000)免疫染色施行比较研究。为了进一步确认牙髓及牙本质细胞分化，分别对28天标本进行牙髓标记TRH-DE(促甲状腺素释放激素降解胞外酶：Thyrotropin-releasing hormone-degrading ectoenzyme)的免疫染色以及牙本质细胞标记enamelysin(釉质溶解素)的原位杂交(in situ hybridization)(参考：Iohara,et al.,2011,Tissue Engineering part A)。此外，TRH-DE免疫染色使用第一抗体(anti-canine TRH-DE,mouse IgM clone#6E5E,1:100,MBL)和第二抗体(Goat anti-mouse IgM,poly-biotin，1:50，Vector)，通过DAB(VECTASTAIN ABC试剂盒、Vector lab.)进行显色。

胰蛋白酶预处理后，将包含再生促进化合物(ALK5抑制剂及CCR3拮抗剂)以及趋化因子G-CSF的非细胞根管填料注入中龄犬的牙齿拔髓后的根管内，28天后未见炎症性细胞浸润或内部吸收，与以往的方法相比，同样的观察到富含血管的疏松结缔组织的牙髓样组织的再生(图1的A至D)，以往的方法是不进行胰蛋白酶预处理，注入含有同种异体膜分离提取牙髓干细胞以及G-CSF的细胞根管填料。另外，两者都观察到牙本质细胞样细胞附着在牙本质侧壁而形成牙本质(图1的C、D)。牙髓再生量未发现统计学的显著差异(图1的E)。当使用非细胞牙体组织再生促进试剂盒时，与细胞根管填料同样地观察到血管新生(图2的A、B)或神经突起伸长(图2的C、D)，血管新生量是在28天后应用非细胞牙体组织再生促进试剂盒与常规的细胞根管填料相比未发现显著差异(图2的E)。神经突起伸长量是在28天后两者也未发现显著差异(图2的F)。另外，在应用非细胞牙体组织再生促进试剂盒的再生组织中，与应用常规的细胞根管填料同样，在一部分细胞中观察到TRH-DE阳性细胞(图3的A、B)。另外，牙本质壁中观察到表达enamelysin的mRNA的细胞(图3的C、D)。

这些结果表明，胰蛋白酶预处理后，如果注入含有再生促进化合物(ALK5抑制剂及CCR3拮抗剂)以及趋化因子G-CSF的非细胞根管填料，与以往的基于牙髓干细胞以及G-CSF移植的牙髓再生同样，再生了伴随着血管新生和神经伸长(神经生长)的牙髓，在牙本质侧壁形成牙本质样硬组织。

实施例2

(基于非细胞牙体组织再生促进试剂盒的幼龄犬拔髓后的牙髓再生)

在实施全身麻醉后，对幼龄(8个月)犬的上下颚左右前牙齿部进行拔髓处置，用#55扩大至根尖部后，用5％次氯酸钠溶液和3％过氧化氢水溶液交替清洗，再用生理盐水清洗，采用纸尖法将根管内完全干燥，止血后，用胶合剂和树脂暂时完全密封。拔髓处置3天后，取出临时密封，再次交替清洗，用生理盐水清洗后，用3％EDTA(Smear Clean)在根管内反应2分钟，再用生理盐水清洗并干燥。然后，在根管内用胰蛋白酶制剂(Francetin T粉(每10mg中结晶胰蛋白酶2500USP))5mg/mL(0.5％、溶解于纳米微泡水中)浸渍10分钟进行预处理，用生理盐水清洗。另外，在右侧上下颚的根管中，将具有作为再生促进化合物的CCR3拮抗剂((SB328437、200ng)及ALK5抑制剂(SB431542、200ng)、以及细胞外基质胶原蛋白20μL(KOKEN去端肽胶原种植体)的非细胞根管填料填充在根管内。另一方面，在左侧上下颚的根管中，将具有作为再生促进化合物的CCR3拮抗剂(SB328437，200ng)以及细胞外基质胶原蛋白20μL(KOKEN去端肽胶原种植体)的非细胞根管填料填充在根管内。然后，在其上放置止血用明胶海绵(SPONGEL)，用玻璃离子粘固剂以及光聚合树脂将备填洞完全封闭。移植13天后拔牙，按照常规方法制作纵剖面为5μm的石蜡切片，H-E染色后进行形态学观察。血管新生用BS-1lectin、神经突起伸长用PGP9.5免疫染色，施行比较研究。再用第13天的标本进行TRH-DE的免疫染色以及enamelysin的原位杂交。

胰蛋白酶预处理后，将包含ALK5抑制剂及CCR3拮抗剂、以及胶原蛋白的非细胞根管填料注入幼犬的牙齿拔髓后的根管内，13天后，未见炎症性细胞浸润或内部吸收，观察到伴随富含血管的疏松结缔组织的牙髓再生(图4的A、C)。另外，胰蛋白酶预处理后，当注入含有CCR3拮抗剂以及胶原蛋白的非细胞根管填料时，与含有ALK5抑制剂及CCR3拮抗剂两者的根管填充剂相比，观察到再生量略有减少的倾向，但是也同样观察到牙髓组织的再生(图4的B、D)。另外，两者都观察到牙本质细胞样细胞附着在牙本质侧壁形成牙本质(图4的C、D)。另外，两者都同样观察到血管新生(图5的A、B)或神经突起伸长(图5的C、D)。在两者的基于非细胞牙体组织再生促进试剂盒的再生组织中，同样在一部分细胞中观察到TRH-DE阳性细胞(图6的A、B)。另外，在牙本质壁中同样观察到表达enamelysin的mRNA的细胞(图6的C、D)。

这些结果表明，胰蛋白酶预处理后，如果注入含有CCR3拮抗剂及胶原蛋白的非细胞根管填料，与含有ALK5抑制剂及CCR3拮抗剂以及胶原蛋白的非细胞根管填料大致相同，再生了伴随着血管新生和神经伸长的牙髓，在牙本质侧壁中附着牙本质细胞样细胞，形成牙本质样硬组织。

实施例3

(基于含有趋化因子bFGF或G-CSF的非细胞牙体组织再生促进试剂盒的幼龄犬拔髓后牙髓再生的比较)

实施全身麻醉后，在幼龄(8个月)犬上下颚左右前牙齿部进行拔髓处置，用#55扩大至根尖部后，用5％次氯酸钠溶液和3％过氧化氢水溶液交替清洗，再用生理盐水清洗，采用纸尖法将根管内完全干燥，止血后，用3％EDTA(Smear Clean)在根管内反应2分钟，再用生理盐水清洗并干燥。然后，在根管内用胰蛋白酶制剂(Francetin T粉(每10mg中结晶胰蛋白酶2500USP)，持田制药株式会社)5mg/mL(0.5％、溶解于纳米微泡水中)浸渍10分钟进行预处理，用生理盐水清洗。另外，在右侧上下颚的根管中，将具有作为再生促进化合物的CCR3拮抗剂((SB328437、200ng)及ALK5抑制剂(SB431542、200ng)、作为趋化因子的bFGF(FIBLASTSpray(フィブラストスプレー)，科研制药株式会社)150ng、以及细胞外基质胶原蛋白20μL(KOKEN去端肽胶原种植体)的非细胞根管填料填充在根管中。另一方面，在左侧上下颚的根管中，将包含作为再生促进化合物的CCR3拮抗剂((SB328437、200ng)及ALK5抑制剂(SB431542、200ng)、作为趋化因子的G-CSF(NEUTROGIN)150ng、以及细胞外基质胶原蛋白20μL(KOKEN去端肽胶原种植体)的非细胞根管填料填充在根管中。然后，在其上放置止血用明胶海绵(SPONGEL)，用玻璃离子粘固剂以及光聚合树脂将备填洞完全封闭。移植13天后拔牙，按照常规方法制作纵剖面为5μm的石蜡切片，H-E染色后进行形态学观察。血管新生用BS-1lectin、神经突起伸长用PGP9.5免疫染色，施行比较研究。再用第13天的标本进行TRH-DE的免疫染色以及enamelysin的原位杂交。

胰蛋白酶预处理后，将包含ALK5抑制剂及CCR3拮抗剂、bFGF、以及胶原蛋白的非细胞根管填料注入幼犬的牙齿拔髓后的根管内，13天后，与含有G-CSF的非细胞根管填料同样，观察到伴随着新生血管的牙髓样组织的再生，但是观察到牙髓再生量略有减少的倾向(图7的A至D)。另外，两者都观察到牙本质细胞样细胞附着在牙本质侧壁形成牙本质(图7的C、D)。观察到对于形成牙本质，G-CSF一方有稍高的倾向。另外，两者都同样观察到血管新生(图8的A、B)或神经突起伸长(图8的C、D)。在两者的基于根管填充剂的再生组织中，同样在一部分细胞中观察到TRH-DE阳性细胞(图9的A、B)。另外，在牙本质壁中同样观察到表达enamelysin的mRNA的细胞(图9的C、D)。

这些结果表明，胰蛋白酶预处理后，如果在ALK5抑制剂及CCR3拮抗剂、以及胶原蛋白中，注入含有作为趋化因子的bFGF或G-CSF的非细胞根管填料，大致相同地再生了伴随着血管新生和神经伸长的牙髓，在牙本质侧壁中形成牙本质样硬组织。

实施例4

(基于有无胰蛋白酶预处理的非细胞根管填料的中龄犬拔髓后牙髓再生的比较)

实施全身麻醉后，在中龄(2岁)犬上颚左右中切牙齿进行拔髓处置，用#50扩大至根尖部后，用5％次氯酸钠溶液和3％过氧化氢水溶液交替清洗，再用生理盐水清洗，采用纸尖法将根管内完全干燥，止血后，用胶合剂和树脂暂时完全密封。拔髓处置后，取出临时密封，再次交替清洗，用生理盐水清洗后，用3％EDTA(Smear Clean)在根管内反应2分钟，再用生理盐水清洗并干燥。然后，在右侧根管内用胰蛋白酶制剂(Francetin T粉(每10mg中结晶胰蛋白酶2500USP))5mg/mL(0.5％)浸渍10分钟进行预处理，用生理盐水清洗。另一方面，在左侧根管不进行胰蛋白酶预处理。另外，在所有的根管中，将包含ALK5抑制剂(SB431542、200ng)及CCR3拮抗剂(SB328437、200ng)、细胞外基质胶原蛋白20μL(KOKEN去端肽胶原种植体)、以及作为趋化因子的G-CSF(NEUTROGIN、150ng)的非细胞根管填料填充在根管中。然后，在其上放置止血用明胶海绵(SPONGEL)，用玻璃离子粘固剂及光聚合树脂将备填洞完全封闭。移植28天后拔牙，按照常规方法制作纵剖面为5μm的石蜡切片，H-E染色后进行形态学观察。血管新生用BS-1lectin、神经突起伸长用PGP9.5免疫染色施行比较研究。再用第28天的标本进行TRH-DE的免疫染色以及enamelysin的原位杂交。

胰蛋白酶预处理后，将包含ALK5抑制剂及CCR3拮抗剂、胶原蛋白、以及G-CSF的非细胞根管填料注入中龄犬的牙齿拔髓后的根管内，28天后观察到与未进行胰蛋白酶预处理大致相同的牙髓组织的再生，牙髓再生量，观察到胰蛋白酶预处理一方略有增加的倾向(图10的A至D)。另外，在进行胰蛋白酶预处理的情况下，观察到牙本质细胞样细胞更加附着在牙本质侧壁，牙本质样硬组织形成量也有略高的倾向(图10的C、D)。另外，两者都同样观察到血管新生(图11A、B)或神经突起伸长(图11的C、D)。在两者的基于根管填充剂的再生组织中，同样在一部分细胞中观察到TRH-DE阳性细胞(图12的A、B)。另外，在牙本质壁中同样观察到表达enamelysin的mRNA的细胞(图12的C、D)。

这些结果表明，如果注入包含ALK5抑制剂及CCR3拮抗剂、胶原蛋白、以及G-CSF的非细胞根管填料，再生了伴随着血管新生和神经伸长的牙髓，但是作为非细胞牙体组织再生促进试剂盒，如果在进行胰蛋白酶预处理后注入非细胞根管填料，细胞更加附着在牙本质侧壁，促进向牙本质细胞的分化，形成牙本质样组织。

实施例5

(人牙髓干细胞培养和CCL11以及CCR3 mRNA表达的分析)

获得同意后，从老年人(60、70岁)以及年轻人(19、26岁)的第3大臼齿取出牙髓，在Hanks液中切碎后，在37℃用0.04mg/mL释放酶溶液(Roche diagnostics公司，美国加利福尼亚州普莱森顿市)进行酶消化1小时，分离牙髓细胞，以2～4×10⁴/mL的细胞浓度接种于35mm dish内的含有10％人血清的DMEM(D6429)(Sigma-Aldrich公司，美国密苏里州圣路易市)中。然后，每2～3天更换培养基，在达到70％汇合时继代。细胞剥离使用TrypLE(注册商标)Select(Life Technologies公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市)。

使用Trizol(Life Technologies)，从各种细胞提取总RNA(total RNA)，用DNase(Roche diagnostics)处理后，通过ReverTra Ace-a(东洋纺株式会社，日本东京都)合成第一链cDNA(First-strand cDNA)。对于实时荧光定量PCR(Real-time RT-PCR)而言，CCL11mRNA使用PowerUp(注册商标)SYBR(注册商标)Green master mix(AppliedBiosystems公司，美国加利福尼亚州福斯特市)，并且b-actin及CCR3 mRNA使用Power SYBR(注册商标)Green master mix(Applied Biosystems公司)，采用Applied Biosystems7500实时荧光定量PCR系统(Real-time PCR system)(Applied Biosystems)进行扩增、检测。Real-time RT-PCR的反应条件是，设定95℃15秒、65℃1分钟作为1个循环，进行40个循环。使用的引物的碱基序列如表1所示。扩增的基因的mRNA表达用b-actinmRNA校正。

表1

在人的幼龄(年轻人)及高龄(老年人)的牙髓干细胞中均观察到在短期继代(6～10代)的情况下，可见有下述趋势：CCR3mRNA的表达非常低，CCL11 mRNA的表达完全见不到或较低。另外，在长期继代(19～21代)的情况下，年轻人及老年人均观察到CCL11mRNA及CCR3 mRNA表达的增加(图13)。另一方面，据报道，在老年人来源的细胞中，由于作为CCL11受体的CCR3表达增加，CCL11的敏感性提高(Wang H et al.Invest Ophthalmol VisSci.2011)。即，揭示出CCL11表达和作为CCL11受体的CCR3表达可能与年龄特别相关。

由此揭示出：在使用了非细胞根管填料的牙髓再生中，与CCL11结合的CCL11中和抗体以及与CCL11的受体CCR3结合的CCR3拮抗剂具有大致相同的作用。

工业实用性

可以用于牙体组织再生。

序列号1～6：引物。

序列表

<110> 日本国立长寿医疗研究中心（National Center for Geriatrics andGerontology）

<120> 非细胞根管填料以及非细胞牙体组织再生促进试剂盒

<130> H18-300WO

<140> JP2017-190744

<141> 2017-09-29

<160> 6

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 1

GGACT TCGAG CAAGA GATGG

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 2

AGCAC TGTGT TGGCG TACAG

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 3

TTCTG TGGCT GCTGC TCATA G

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 4

GCTCT CTAGT CGCTG AAGGG

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 5

CTGTA CTCCC TGGTG TTCAC TG

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物

<400> 6

GGTTG AGCAG GTAGA TGTTG G

Claims

1.一种非细胞根管填料，其特征在于，其包含：含有CCR3拮抗剂、CCL11中和抗体以及ALK5抑制剂中的至少任一种的再生促进化合物，以及细胞外基质。

2.如权利要求1所述的非细胞根管填料，其特征在于，其包含：含有CCR3拮抗剂及ALK5抑制剂的再生促进化合物，以及细胞外基质。

3.如权利要求1或2所述的非细胞根管填料，其特征在于，其包含：含有G-CSF、bFGF以及SDF-1中的至少一种的趋化因子。

4.如权利要求1至3中任一项所述的非细胞根管填料，其特征在于，其用于幼龄个体。

5.一种非细胞牙体组织再生促进试剂盒，其特征在于，

其包含：含有丝氨酸蛋白酶的预处理剂，以及非细胞根管填料；

其中，所述非细胞根管填料包含：含有CCR3拮抗剂、CCL11中和抗体以及ALK5抑制剂中的至少任一种的再生促进化合物，以及细胞外基质。

6.如权利要求5所述的非细胞牙体组织再生促进试剂盒，其特征在于，

其中，所述非细胞根管填料包含：含有CCR3拮抗剂或CCL11中和抗体及ALK5抑制剂的再生促进化合物，以及细胞外基质。

7.如权利要求5或6所述的非细胞牙体组织再生促进试剂盒，其特征在于，所述非细胞根管填料包含：含有G-CSF、bFGF以及SDF-1中的至少一种的趋化因子。

8.如权利要求5至7中任一项所述的非细胞牙体组织再生促进试剂盒，其特征在于，其用于中高龄个体。

9.如权利要求5至8中任一项所述的非细胞牙体组织再生促进试剂盒，其特征在于，所述丝氨酸蛋白酶为糜蛋白酶样(chymotrypsin-like)丝氨酸蛋白酶。

10.权利要求9所述的非细胞牙体组织再生促进试剂盒，其特征在于，所述糜蛋白酶样(chymotrypsin-like)丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶。