CN111133116A - 洋葱的判别方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于高精度地判别洋葱是否为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的方案。本发明涉及一种洋葱的性状的判别方法，其特征在于，包括：第一检测工序，在来自洋葱的核酸中，检测与蒜氨酸酶基因1对应的序列号1的碱基序列；以及第二检测工序，检测与蒜氨酸酶基因2对应的序列号2的碱基序列，当在第一检测工序中未检测到序列号1的碱基序列且在第二检测工序中检测到序列号2的碱基序列时，判别洋葱为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱。

Description

洋葱的判别方法

技术领域

本发明涉及判别洋葱是否为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的方法、用于该方法的引物、引物组和试剂盒以及利用该方法的洋葱的育种方法。

背景技术

专利文献1中记载了如下内容：在洋葱中，作为与辛辣味相关的原因成分的LF(催泪成分)的生成的酶的蒜氨酸酶表达29种蒜氨酸酶；其中，由专利文献1中序列号5所示的氨基酸序列构成的特定的蒜氨酸酶是与洋葱的辛辣味、催泪性相关的主要的蒜氨酸酶；制作出了抑制所述特定的蒜氨酸酶的活性的不流眼泪、没有辛辣味的两个系统的洋葱。

非专利文献1中记载了与专利文献1同样地制作出了抑制蒜氨酸酶的活性的不流眼泪、没有辛辣味的洋葱。

非专利文献2中记载了与专利文献1中记载的所述特定的蒜氨酸酶的氨基酸序列具有高序列同源性的蒜氨酸酶的氨基酸序列。然而，在非专利文献2中没有暗示该蒜氨酸酶对辛辣味、催泪性的相关程度、其他的蒜氨酸酶的存在。

非专利文献3～6中，暗示与非专利文献2中记载的所述特定的蒜氨酸酶不同的蒜氨酸酶作为洋葱的蒜氨酸酶的存在。然而，完全没有记载所述其他的蒜氨酸酶的序列信息、是否与辛辣味、催泪性相关。

专利文献1：日本专利第5671657号公报

非专利文献1：Kato et al.“Production and characterization of tearlessand non-pungent onion”DOI:10.1038/srep23779

非专利文献2：GenBank Accession No.AAA32639.1

非专利文献3：King et al.“A low-density genetic map of onion reveals arole for tandem duplication in the evolution of an extremely large diploidgenome.”Theor Appl Genet 96,52-62(1998)

非专利文献4：Van Heusden,A.W.,Shigyo,M.,Tashiro,Y.,Vrielink-vanGinkel,R.&Kik,C.AFLP linkage group assignment to the chromosomes of Alliumcepa L.via monosomic addition lines.Theor Appl Genet 100,480-486(2000)非专利文献5：Martin,W.J.et al.Genetic mapping of expressed sequences in onion and insilico comparisons with rice show scant colinearity.Mol Genet Genom 274,197-204(2005)

非专利文献6：Khrustaleva,L.et al.The chromosome organization of genesand some types of extragenic DNA in Allium.Acta Hort 969,43-52(2012)

发明内容

专利文献1中记载的抑制了由专利文献1中序列号5所示的氨基酸序列构成的特定的蒜氨酸酶的表达的洋葱是没有辛辣味、没有催泪性的洋葱。然而，专利文献1中没有记载所述特定的蒜氨酸酶的基因序列、未表达的原因(调节区域、转录因子、基因本身的破坏等)。另外，专利文献1中也没有记载未表达的蒜氨酸酶基因的信息。非专利文献1中记载了与专利文献1同样地制作出了抑制蒜氨酸酶的活性的不流眼泪、没有辛辣味的洋葱，但没有记载抑制表达的蒜氨酸酶的总序列、抑制表达的原因。

另一方面，洋葱的蒜氨酸酶基因是多拷贝基因，如专利文献1所述，仅表达的就有29种，如果也包括未表达的就有更多种的蒜氨酸酶基因存在于洋葱中。另外，非专利文献2～6中也公开了与专利文献1中记载的所述特定的蒜氨酸酶基因不同的蒜氨酸酶基因的存在。因此，在洋葱中，即使想要通过检测编码专利文献1中记载的所述特定的蒜氨酸酶的基因的不存在/存在来判别是否为没有辛辣味的洋葱，也有可能误检测为其他的蒜氨酸酶基因，难以实现。

本发明提供了一种通过在洋葱中与其他的基因区分地特异性检测与辛辣味及催泪性相关的蒜氨酸酶基因来判别是否为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的方法。

在本说明书中，作为解决所述课题的方案公开以下发明。

(1)一种洋葱的性状的判别方法，其特征在于，包括：第一检测工序，在来自洋葱的核酸中，进行序列号1的碱基序列的检测；以及第二检测工序，在来自洋葱的核酸中，进行序列号2的碱基序列的检测，当在第一检测工序中未检测到序列号1的碱基序列且在第二检测工序中检测到序列号2的碱基序列时，判别所述洋葱为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱，当在第一检测工序中检测到序列号1的碱基序列且在第二检测工序中检测到序列号2的碱基序列时，判别所述洋葱为具有辛辣味和/或催泪性的洋葱。

(2)根据(1)所述的方法，第一检测工序包括在所述核酸中进行第一变异部位的检测，所述第一变异部位包含选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的一个以上的碱基，第二检测工序包括在所述核酸中进行第二变异部位的检测，所述第二变异部位包含选自序列号2的碱基序列的第34位、第70位、第1667位、第1703位、第127位、第409位、第943位及第1822位的一个以上的碱基。

(3)根据(2)所述的方法，其特征在于，第一检测工序包括使用包含第一引物和/或第二引物的第一引物组，以所述洋葱的基因组DNA或cDNA为模板进行第一核酸扩增反应，以及确认通过第一核酸扩增反应得到的扩增产物，其中，所述第一引物包含含有与序列号1的碱基序列的包含第一变异部位的部分碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸，所述第二引物包含含有与序列号1的碱基序列的包含第一变异部位的部分碱基序列的互补碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸，第二检测工序包括使用包含第三引物和/或第四引物的第二引物组，以所述洋葱的基因组DNA为模板进行第二核酸扩增反应，以及确认通过第二核酸扩增反应得到的扩增产物，其中，所述第三引物包含含有与序列号2的碱基序列的包含第二变异部位的部分碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸，所述第四引物包含含有与序列号2的碱基序列的包含第二变异部位的部分碱基序列的互补碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸。

(4)一种洋葱的性状的判别方法，其特征在于，包括：第一检测工序，在来自洋葱的核酸中，进行序列号1的碱基序列的检测，第一检测工序包括在所述核酸中进行第一变异部位的检测，所述第一变异部位包含选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的一个以上的碱基，当在第一检测工序中未检测到序列号1的碱基序列时，判别所述洋葱为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱，当在第一检测工序中检测到序列号1的碱基序列时，判别所述洋葱为具有辛辣味和/或催泪性的洋葱。

(5)根据(4)所述的方法，第一检测工序包括使用包含第一引物和/或第二引物的第一引物组，以所述洋葱的基因组DNA或cDNA为模板进行第一核酸扩增反应，以及确认通过第一核酸扩增反应得到的扩增产物，其中，所述第一引物包含含有与序列号1的碱基序列的包含第一变异部位的部分碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸，所述第二引物包含含有与序列号1的碱基序列的包含第一变异部位的部分碱基序列的互补碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸。

(6)一种洋葱的性状的判别方法，包括：利用(1)至(5)中任一项所述的方法判别洋葱是否为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱；以及以a)与现有品种相比，洋葱细胞破碎时丙酮酸的生成减少；b)与现有品种相比，洋葱细胞破碎后的残留丙烯基半胱氨酸亚砜(PRENCSO)量多；以及c)与现有品种相比，洋葱细胞破碎时催泪因子(LF)的生成减少中的一个以上的性状为指标，判别洋葱是否为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱。

(7)一种育种没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的方法，其特征在于，包括：利用(1)至(6)中任一项所述的方法判别洋葱是否为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱；以及将被判别为是没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的洋葱用于育种。

(8)一种引物，其特征在于，包含在3’末端包含与第一部分碱基序列相同或同源的第一碱基序列的第一多核苷酸，所述第一部分碱基序列是序列号1的碱基序列所含的10个碱基以上连续的第一部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的第一碱基。

(9)一种引物，其特征在于，包含在3’末端包含与第二部分碱基序列相同或同源的第二碱基序列的第二多核苷酸，所述第二部分碱基序列是序列号1的碱基序列的互补碱基序列所含的10个碱基以上连续的第二部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含与选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的第二碱基互补的碱基。

(10)一种引物组，其特征在于，包括：(8)所述的引物；以及(9)所述的引物，第一碱基和第二碱基相同，或者第一碱基在序列号1的碱基序列中比第二碱基更靠近5’末端侧。

(11)一种引物，其特征在于，包含在3’末端包含与第三部分碱基序列相同或同源的第三碱基序列的第三多核苷酸，所述第三部分碱基序列是序列号2的碱基序列所含的10个碱基以上连续的第三部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含选自序列号2的碱基序列的第34位、第70位、第1667位、第1703位、第127位、第409位、第943位及第1822位的第三碱基。

(12)一种引物，其特征在于，包含在3’末端包含与第四部分碱基序列相同或同源的第四碱基序列的第四多核苷酸，所述第四部分碱基序列是序列号2的碱基序列的互补碱基序列所含的10个碱基以上连续的第四部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含与选自序列号2的碱基序列的第34位、第70位、第1667位、第1703位、第127位、第409位、第943位及第1822位的第四碱基互补的碱基。

(13)一种引物组，其特征在于，包括：(11)所述的引物；以及(12)所述的引物，第三碱基和第四碱基相同，或者第三碱基在序列号2的碱基序列中比第四碱基更靠近5’末端侧。

(14)一种用于判别洋葱的性状的试剂盒，包括：选自(8)所述的引物、(9)所述的引物及(10)所述的引物组中的一种；以及选自(11)所述的引物、(12)所述的引物及(13)所述的引物组中的一种。

(15)一种用于检测洋葱的辛辣味和/或催泪性的标记基因，其中cDNA碱基序列包含序列号1的碱基序列。

本说明书包含基于本申请的优先权的日本专利申请号2017-184019号的公开内容。

根据本发明的洋葱的判别方法，能够正确地判别外观上无法判别的没有辛辣味和/或催泪性的洋葱。

根据本发明的育种方法，在以没有辛辣味和/或催泪性的洋葱为原材料之一育种新品种的情况下，能够正确地筛选所需的没有辛辣味和/或催泪性的洋葱。

本发明涉及的引物、引物组和试剂盒可用于分别特异性扩增蒜氨酸酶基因1或蒜氨酸酶基因2。

本发明涉及的标记基因可用于检测洋葱的辛辣味和/或催泪性。

附图说明

图1-1是示出序列号1的碱基序列、序列号2的碱基序列、以及基因银行登记号(GenBank Accession No.)AAA32639.1的蒜氨酸酶基因的碱基序列的比对结果和各引物的位置的图。

图1-2是图1-1的续图。

图1-3是图1-1的续图。

图1-4是图1-1的续图。

图2示出以没有辛辣味的洋葱#6及对照品种的基因组DNA为模板，使用序列号3及4的碱基序列的引物组的PCR的扩增产物的检测结果。

图3-1示出以没有辛辣味的洋葱#6及对照品种的基因组DNA为模板，使用各种引物组的PCR的扩增产物中的蒜氨酸酶基因1或蒜氨酸酶基因2的检测结果。

图3-2是图3-1的续图。

图4示出以来自市售的洋葱14个品种、对照品种及洋葱#6的基因组DNA为模板，使用各种引物组的PCR的扩增产物中的蒜氨酸酶基因1或蒜氨酸酶基因2的检测结果。

图5示出以来自没有辛辣味的洋葱#6的多个F2洋葱的叶子的基因组DNA为模板并使用SF2-SR1作为引物组的PCR产生的扩增产物中的蒜氨酸酶基因1的检测结果。

图6示出来自没有辛辣味的洋葱#6的F2洋葱中，在基因组DNA中检测到蒜氨酸酶基因1的洋葱球(筛选球)和未检测到的洋葱球(非筛选球)的丙酮酸生成量的测定结果。

图7-1示出序列号1的碱基序列中的各引物的位置。

图7-2是图7-1的续图。

图8-1示出序列号2的碱基序列中的各引物的位置。

图8-2是图8-1的续图。

具体实施方式

＜1.用语＞

在本说明书中，将编码基因组DNA所含的蒜氨酸酶的基因，即与从该基因转录的mRNA对应的cDNA的碱基序列包含序列号1的碱基序列的基因称为“基因1”。

在本说明书中，另外，将编码蒜氨酸酶的基因，即基因组DNA的碱基序列包含序列号2的碱基序列的基因称为“基因2”。

在本说明书中，“cDNA碱基序列包含序列号1的碱基序列的基因”是指，与从该基因转录的mRNA对应的cDNA的碱基序列包含序列号1的碱基序列的基因。

在本说明书中，mRNA(信使RNA)是指成熟mRNA，其中在洋葱的细胞内，由RNA聚合酶使用基因组DNA作为模板生物合成的mRNA前体进一步剪接，从而连结外显子区域。从基因组DNA生成mRNA(成熟mRNA)的过程是“转录”。

在本说明书中，cDNA(互补DNA)是指，与以mRNA为模板通过逆转录酶合成的mRNA互补的第一DNA和与第一DNA互补的(即由在mRNA的碱基序列中u被t取代的碱基序列构成的)第二DNA的双链DNA、单链的所述第一DNA或单链的所述第二DNA中的任一个。在本说明书中，与“mDNA对应的cDNA的碱基序列”是指所述第二DNA的碱基序列。

在本发明中，“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，典型地是指DNA。在RNA中，胸腺嘧啶(T)能够替换为尿嘧啶(U)。作为DNA，也能够使用包含将任意位置的T取代为U而合成的U的DNA。多核苷酸可以部分包含肌苷(I)等修饰核苷酸。

多核苷酸可以作为单链存在，也可以作为双链存在。当多核苷酸作为双链存在时，至少一条链可以是具备以下规定的规定特征的多核苷酸。

多核苷酸的制造方法没有特别限定，能够利用多核苷酸合成装置制造。

在本发明中，“来自洋葱的核酸”是指，来自要判别性状的洋葱(对象洋葱)的基因组DNA、mRNA或cDNA。基因组DNA、mRNA、cDNA分别也包含基因组DNA的扩增片段、mRNA的扩增片段、cDNA的扩增片段。

在本发明中，所谓“与碱基序列X同源的碱基序列Y”、或者“碱基序列X和碱基序列Y同源”是指，由碱基序列X的互补序列构成的DNA链和由碱基序列Y构成的DNA链能够形成在核酸扩增反应的退火条件下杂交而形成稳定的双链所需的足够的氢键的组合，碱基序列X和Y可以部分不同。例如，由碱基序列X的互补序列构成的多核苷酸和由碱基序列Y构成的多核苷酸可以是在10个核苷酸中存在一个错配、在20个核苷酸中存在一个错配、或在30个核苷酸中存在一个错配等的几个错配。典型地，所谓与碱基序列X“同源的”碱基序列Y是指，碱基序列X和Y满足以下关系中的任一个。

(A)碱基序列Y是在碱基序列X中缺失、取代、附加和/或插入一个或多个碱基而成的碱基序列。

(B)碱基序列Y是与碱基序列X具有90％以上的同源性的碱基序列。

(C)由碱基序列Y构成的多核苷酸能够在严格条件下与由与序列号X互补的碱基序列构成的多核苷酸杂交。

(D)碱基序列X和碱基序列Y中的一个中的任意位置的胸腺嘧啶(T)被另一个中的尿嘧啶(U)取代。

在所述(A)中，“一个或多个”优选为一个或两个，最优选为一个。

在所述(B)中，同源性的值表示使用运算多个碱基序列间的同源性的软件(例如FASTA、DNASIS、以及BLAST)通过缺省的设定而算出的值。算出按照一致度达到最大的方式将一对碱基序列比对时一致的碱基数，然后算出该一致的碱基数与比较的碱基序列的全部碱基数的比例，作为碱基序列的同源性的值。关于同源性的决定方法的详细内容，例如参照Altschul et al,Nuc.Acids.Res.25,3389-3402,1977及Altschul et al,J.Mol.Biol.215,403-410,1990。

在所述(B)中，同源性更优选为95％以上，更优选为96％以上，更优选为97％以上，更优选为98％以上，更优选为99％以上的同源性。

在所述(C)中，“严格条件”是指，形成所谓特异性杂交，而不形成非特异性杂交的条件，例如能够参照Green and Sambrook,Molecular Cloning,4th Ed(2012),ColdSpring Harbor Laboratory Press来适当决定。具体而言，能够根据Southern杂交时的温度、溶液中所含的盐浓度、以及Southern杂交的洗涤工序时的温度、溶液中所含的盐浓度来设定严格条件。

＜2.本发明的第一判别方法＞

本发明的洋葱的性状的判别方法的特征在于，第一，包括：第一检测工序，在来自洋葱的核酸中，进行序列号1的碱基序列的检测；以及第二检测工序，在来自洋葱的核酸中，进行序列号2的碱基序列的检测，当在第一检测工序中未检测到序列号1的碱基序列且在第二检测工序中检测到序列号2的碱基序列时，判别所述洋葱为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱，当在第一检测工序中检测到序列号1的碱基序列且在第二检测工序中检测到序列号2的碱基序列时，判别所述洋葱为具有辛辣味和/或催泪性的洋葱。将该方法作为“第一判别方法”。

本发明人发现，作为编码蒜氨酸酶的基因的碱基序列，在通常的洋葱的基因组DNA中存在基因1的碱基序列和基因2的碱基序列两者，而在没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的基因组DNA中存在基因2的碱基序列而不存在基因1的碱基序列。基因1的碱基序列编码的蒜氨酸酶是由专利文献1中记载的序列号5所示的氨基酸序列构成的特定的蒜氨酸酶，专利文献1中虽然记载了抑制所述特定的蒜氨酸酶的表达的洋葱是没有辛辣味和/或催泪性的洋葱，但没有记载未表达的原因(调节区域、转录因子、基因本身的破坏等)。本发明人惊奇地发现，在没有辛辣味和/或催泪性的洋葱中，编码所述特定的蒜氨酸酶的基因1的碱基序列不存在于基因组DNA上，且与辛辣味无关的与基因1的碱基序列具有高序列同源性的基因2的碱基序列存在于基因组DNA上。这里，作为“没有辛辣味和/或催泪性的洋葱”，代表性地可举出种子被国际保藏并被赋予保藏号NCIMB 42219的洋葱、其后代、以它们为原材料之一育种的没有辛辣味和/或催泪性的洋葱等，但不限于此。

序列号1的碱基序列是蒜氨酸酶基因1的cDNA碱基序列，序列号2的碱基序列是蒜氨酸酶基因2的基因组DNA碱基序列。

第一检测工序中的“序列号1的碱基序列的检测”及“(序列号1的碱基序列的)第一变异部位的检测”分别是指“相当于序列号1的碱基序列的碱基序列的检测”及“相当于(序列号1的碱基序列的)第一变异部位的碱基序列的检测”。同样地，第二检测工序中的“序列号2的碱基序列的检测”及“(序列号2的碱基序列的)第二变异部位的检测”分别是指“相当于序列号2的碱基序列的碱基序列的检测”及“相当于(序列号2的碱基序列的)第二变异部位的碱基序列的检测”。

“相当于序列号1的碱基序列的碱基序列”是指，当来自洋葱的核酸是基因组DNA时，是指cDNA碱基序列为序列号1的碱基序列的蒜氨酸酶基因的基因组DNA的碱基序列或其互补碱基序列，当来自洋葱的核酸是mRNA时，是指序列号1中T被U取代的碱基序列，当来自洋葱的核酸是cDNA时，是指序列号1的碱基序列或其互补碱基序列。

“相当于序列号2的碱基序列的碱基序列”是指，当来自洋葱的核酸是基因组DNA时，是指序列号2的碱基序列或其互补碱基序列，当来自洋葱的核酸是mRNA时，是指从序列号2的碱基序列中除去内含子区域且T被U取代的碱基序列，当来自洋葱的核酸是cDNA时，是指从序列号2的碱基序列中除去内含子区域的碱基序列或其互补碱基序列。

“相当于(序列号1的碱基序列的)第一变异部位的碱基序列”是指，当来自洋葱的核酸是基因组DNA时，是指cDNA碱基序列为序列号1的碱基序列的蒜氨酸酶基因的基因组DNA中的相当于第一变异部位的部位的碱基序列或其互补碱基序列，当来自洋葱的核酸是mRNA时，是指序列号1中T被U取代的碱基序列中的相当于第一变异部位的部位的碱基序列，当来自洋葱的核酸是cDNA时，是指序列号1的碱基序列的第一变异部位或其互补碱基序列。

“相当于(序列号2的碱基序列的)第二变异部位的碱基序列”是指，当来自洋葱的核酸是基因组DNA时，是指序列号2的碱基序列的第二变异部位或其互补碱基序列，当来自洋葱的核酸是mRNA时，是指从序列号2的碱基序列中除去内含子区域且T被U取代的碱基序列中的相当于第二变异部位的部位的碱基序列，当来自洋葱的核酸是cDNA时，是指从序列号2的碱基序列中除去内含子区域的碱基序列中的相当于第二变异部位的部位的碱基序列或其互补碱基序列。

优选分析基因组DNA作为来自洋葱的核酸，因为其量不随对象洋葱的生长阶段、部位而变化。进而，在本发明的第一判别方法中，不仅确认基因1的碱基序列的存在/不存在，而且确认无论洋葱有无辛辣味都存在的基因2的碱基序列的存在，从而能够确认在适当的条件下进行了分析，因此是优选的。

接着，对“第一检测工序”进行详细说明。

第一检测工序是在来自洋葱的核酸中，进行序列号1的碱基序列的检测的工序。在该工序中，优选地，在来自洋葱的核酸中，检测至少一部分包含序列号1的碱基序列或序列号1中T被U取代的碱基序列的部分碱基序列或该部分碱基序列的互补碱基序列的碱基序列。

按照匹配度达到最大的方式将作为基因1的cDNA碱基序列的序列号1的碱基序列和作为基因2的基因组DNA碱基序列的序列号2的碱基序列比对时，如图1-1、1-2、1-3及1-4所示，在同源性高的区域中发现几个错配的碱基。具体而言，作为同源性高的区域中所含的错配的碱基，可举出序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位、第1467位和序列号2的碱基序列的第34位、第70位、第1667位、第1703位、第127位、第409位、第943位、第1822位。

因此，在第一检测工序中，为了不将来自洋葱的核酸所含的序列号1的碱基序列误检测为序列号2的碱基序列而进行特异性检测，优选进行包含选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的一个以上的碱基的第一变异部位的检测。

作为用于在来自洋葱的核酸中检测序列号1的碱基序列的第一变异部位的具体方案，优选包括：使用以下的第一引物组，以来自洋葱的核酸、特别是基因组DNA或cDNA为模板进行第一核酸扩增反应；以及确认通过第一核酸扩增反应得到的扩增产物。

第一引物组优选包括第一引物和第二引物中的至少一方，特别优选包括双方，所述第一引物包含含有与序列号1的碱基序列的包含第一变异部位的部分碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸，所述第二引物包含含有与序列号1的碱基序列的包含第一变异部位的部分碱基序列的互补碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸。

作为第一引物的优选实施方式，可例示如下第一引物，所述第一引物包含在3’末端包含与第一部分碱基序列相同或同源的第一碱基序列的第一多核苷酸，所述第一部分碱基序列是序列号1的碱基序列所含的10个碱基以上连续的第一部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的第一碱基。

作为第二引物的优选实施方式，可例示如下第二引物，所述第二引物包含在3’末端包含与第二部分碱基序列相同或同源的第二碱基序列的第二多核苷酸，所述第二部分碱基序列是序列号1的碱基序列的互补碱基序列所含的10个碱基以上连续的第二部分碱基序且在距3’末端两个碱基以内包含与选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的第二碱基互补的碱基。

对第一引物的优选实施方式进行说明。

关于第一引物所述的第一部分碱基序列是序列号1的碱基序列所含的10个碱基以上、优选15个碱基以上、更优选17个碱基以上、更优选20个碱基以上、更优选23个碱基以上连续的部分碱基序列。此外，为了抑制引物与要扩增的靶核酸的末端区域以外的区域形成非特异性杂交，众所周知，优选将引物设计成引物的碱基数为上述范围，特别是17个碱基以上(例如参照http://www.takara-bio.co.jp/prt/pdfs/prt3-1.pdf)。第一部分碱基序列的碱基数的上限没有特别限定，优选为50个碱基以下，更优选为40个碱基以下，更优选为35个碱基以下，更优选为30个碱基以下。第一部分碱基序列通过包含所述第一碱基作为距3’末端两个碱基以内的碱基，优选作为3’末端的碱基，从而在第一核酸扩增反应中，从第一引物的3’末端起，3’末端侧的区域从模板核酸上的基因1的有义链侧的碱基序列中相当于第一碱基的碱基特异性延长。

第一多核苷酸在3’末端包含与第一部分碱基序列相同或同源的第一碱基序列。这里，“同源”的定义如上所述。更优选地，第一部分碱基序列和第一碱基序列优选从3’末端到三个碱基的区域、更优选从3’末端到五个碱基的区域、更优选从3’末端到八个碱基的区域、更优选从3’末端到10个碱基的区域(当第一部分碱基序列的长度为15个碱基以上时，进一步优选从3’末端到15个碱基的区域；当第一部分碱基序列的长度为17个碱基以上时，进一步优选从3’末端到17个碱基的区域；当第一部分碱基序列的长度为20个碱基以上时，进一步优选从3’末端到20个碱基的区域)相同，剩余的5’末端侧的区域同源。作为第一碱基序列的具体例，可例示序列号5、6、7或8所示的碱基序列、由距序列号5、6、7或8所示的碱基序列的3’末端优选15个碱基以上、更优选17个碱基以上、更优选20个碱基以上连续的部分构成的部分碱基序列。第一多核苷酸“在3’末端包含第一碱基序列”是指，包含第一多核苷酸的碱基序列整体仅由第一碱基序列构成的情况、以及包含第一碱基序列和连接到第一碱基序列的5’末端的另一碱基序列的情况两者。所述另一碱基序列只要实质上不阻碍第一核酸扩增反应即可，作为其碱基数例如为20个碱基以下，优选为10个碱基以下，更优选为五个碱基以下，更优选为一个或两个碱基。

在本说明书中，将包含由序列号5、6、7、8的碱基序列构成的第一多核苷酸的第一引物分别称为SF1、SF2、SF3、SF4，序列号1的碱基序列中的位置如图7-1、7-2所示。

第一引物可以是由第一多核苷酸构成的，也可以是在第一多核苷酸中附加用于检测扩增产物的标记用标签、标记物质、固定化用标签等有用的化学结构而成的。

当第一引物组包含第一引物时，另一引物优选为包含在3’末端包含与部分碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸的引物，所述部分碱基序列是序列号1的碱基序列的互补碱基序列所含的10～50个碱基、优选15～30个碱基连续的部分碱基序列，与在序列号1的碱基序列中比第一碱基更靠近3’末端侧的区域互补，另一引物更优选为第二引物。

接着，对第二引物的优选实施方式进行说明。

关于第二引物所述的第二部分碱基序列是序列号1的碱基序列的互补碱基序列所含的10个碱基以上、优选15个碱基以上、更优选17个碱基以上、更优选20个碱基以上、更优选23个碱基以上连续的部分碱基序列。第二部分碱基序列的碱基数的上限没有特别限定，优选为50个碱基以下，更优选为40个碱基以下，更优选为35个碱基以下，更优选为30个碱基以下。第二部分碱基序列通过包含所述第二碱基的互补碱基作为距3’末端两个碱基以内的碱基，优选作为3’末端的碱基，从而在第一核酸扩增反应中，从第二引物的3’末端起，3’末端侧的区域从模板核酸上的基因1的反义链侧的碱基序列中相当于第二碱基的互补碱基的碱基特异性延长。

第二多核苷酸在3’末端包含与第二部分碱基序列相同或同源的第二碱基序列。这里，“同源”的定义如上所述。更优选地，第二部分碱基序列和第二碱基序列优选从3’末端到三个碱基的区域、更优选从3’末端到五个碱基的区域、更优选从3’末端到八个碱基的区域、更优选从3’末端到10个碱基的区域(当第二部分碱基序列的长度为15个碱基以上时，进一步优选从3’末端到15个碱基的区域；当第二部分碱基序列的长度为17个碱基以上时，进一步优选从3’末端到17个碱基的区域；当第二部分碱基序列的长度为20个碱基以上时，进一步优选从3’末端到20个碱基的区域)相同，剩余的5’末端侧的区域同源。作为第二碱基序列的具体例，可例示序列号9、10、11或12所示的碱基序列、由距序列号9、10、11或12所示的碱基序列的3’末端优选15个碱基以上、更优选17个碱基以上、更优选20个碱基以上连续的部分构成的部分碱基序列。第二多核苷酸“在3’末端包含第二碱基序列”是指，包含第二多核苷酸的碱基序列整体仅由第二碱基序列构成的情况、以及包含第二碱基序列和连接到第二碱基序列的5’末端的另一碱基序列的情况两者。所述另一碱基序列只要实质上不阻碍第一核酸扩增反应即可，作为其碱基数例如为20个碱基以下，优选为10个碱基以下，更优选为五个碱基以下，更优选为一个或两个碱基。

在本说明书中，将包含由序列号9、10、11、12的碱基序列构成的第二多核苷酸的第二引物分别称为SR1、SR2、SR3、SR4，序列号1的碱基序列中的位置如图7-1、7-2所示。

第二引物可以是由第二多核苷酸构成的，也可以是在第二多核苷酸中附加用于检测扩增产物的标记用标签、标记物质、固定化用标签等有用的化学结构而成的。

当第一引物组包含第二引物时，另一引物优选为包含在3’末端包含与部分碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸的引物，所述部分碱基序列是序列号1的碱基序列所含的10～50个碱基、优选15～30个碱基连续的部分碱基序列，是在序列号1的碱基序列中比第二碱基更靠近5’末端侧的区域的部分碱基序列，另一引物更优选为第一引物。

当第一引物组是第一引物和第二引物的组合时，按照第一碱基和第二碱基相同或者在序列号1的碱基序列中第一碱基比第二碱基更靠近5’末端侧的方式，选择第一引物和第二引物即可。在第一引物组是第一引物和第二引物的组合时的优选方式中，关于第一引物，第一碱基是序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位或第1348位，关于第二引物，第二碱基是序列号1的第187位、第358位、第791位或第1467位，其中，第一碱基与第二碱基相同或者在序列号1的碱基序列中比第二碱基更靠近5’末端侧。

接着，对“第二检测工序”进行详细说明。

第二检测工序是在来自洋葱的核酸中，进行序列号2的碱基序列的检测的工序。在该工序中，优选地，在来自洋葱的核酸中，检测至少一部分包含序列号2的碱基序列或序列号2中T被U取代的碱基序列的部分碱基序列或该部分碱基序列的互补碱基序列的碱基序列。

在第二检测工序中，为了不将来自洋葱的核酸所含的序列号2的碱基序列误检测为序列号1的碱基序列而进行特异性检测，优选进行包含选自序列号2的碱基序列的第34位、第70位、第1667位、第1703位、第127位、第409位、第943位及第1822位的一个以上的碱基的第二变异部位的检测。

作为用于在来自洋葱的核酸中检测序列号2的碱基序列的第二变异部位的具体方案，优选包括：使用以下的第二引物组，以来自洋葱的核酸、特别是基因组DNA为模板进行第二核酸扩增反应；以及确认通过第二核酸扩增反应得到的扩增产物。

第二引物组优选包括第三引物和第四引物中的至少一方，特别优选包括双方，所述第三引物包含含有与序列号2的碱基序列的包含第二变异部位的部分碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸，所述第四引物包含含有与序列号2的碱基序列的包含第二变异部位的部分碱基序列的互补碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸。

作为第三引物的优选实施方式，可例示如下第三引物，所述第三引物包含在3’末端包含与第三部分碱基序列相同或同源的第三碱基序列的第三多核苷酸，所述第三部分碱基序列是序列号2的碱基序列所含的10个碱基以上连续的第三部分碱基序列，在距3’末端两个碱基以内包含选自序列号2的碱基序列的第34位、第70位、第1667位、第1703位、第127位、第409位、第943位及第1822位的第三碱基。

作为第四引物的优选实施方式，可例示如下第四引物，所述第四引物包含在3’末端包含与第四部分碱基序列相同或同源的第四碱基序列的第四多核苷酸，所述第四部分碱基序列是序列号2的碱基序列的互补碱基序列所含的10个碱基以上连续的第四部分碱基序列，在距3’末端两个碱基以内包含与选自序列号2的碱基序列的第34位、第70位、第1667位、第1703位、第127位、第409位、第943位及第1822位的第四碱基互补的碱基。

对第三引物的优选实施方式进行说明。

关于第三引物所述的第三部分碱基序列是序列号2的碱基序列所含的10个碱基以上、优选15个碱基以上、更优选17个碱基以上、更优选20个碱基以上、更优选23个碱基以上连续的部分碱基序列。第三部分碱基序列的碱基数的上限没有特别限定，优选为50个碱基以下，更优选为40个碱基以下，更优选为35个碱基以下，更优选为30个碱基以下。第三部分碱基序列通过包含所述第三碱基作为距3’末端两个碱基以内的碱基，优选作为3’末端的碱基，从而在第二核酸扩增反应中，从第三引物的3’末端起，3’末端侧的区域从模板核酸上的基因2的有义链侧的碱基序列中相当于第三碱基的碱基特异性延长。

第三多核苷酸在3’末端包含与第三部分碱基序列相同或同源的第三碱基序列。这里，“同源”的定义如上所述。更优选地，第三部分碱基序列和第三碱基序列优选从3’末端到三个碱基的区域、更优选从3’末端到五个碱基的区域、更优选从3’末端到八个碱基的区域、更优选从3’末端到10个碱基的区域(当第三部分碱基序列的长度为15个碱基以上时，进一步优选从3’末端到15个碱基的区域，当第三部分碱基序列的长度为17个碱基以上时，进一步优选从3’末端到17个碱基的区域，当第三部分碱基序列的长度为20个碱基以上时，进一步优选从3’末端到20个碱基的区域)相同，剩余的5’末端侧的区域同源。作为第三碱基序列的具体例，可例示序列号13、14、15或16所示的碱基序列、由距序列号13、14、15或16所示的碱基序列的3’末端优选15个碱基以上、更优选17个碱基以上、更优选20个碱基以上连续的部分构成的部分碱基序列。第三多核苷酸“在3’末端包含第三碱基序列”是指，包含第三多核苷酸的碱基序列整体仅由第三碱基序列构成的情况、以及包含第三碱基序列和连接到第三碱基序列的5’末端的另一碱基序列的情况两者。所述另一碱基序列只要实质上不阻碍第二核酸扩增反应即可，作为其碱基数例如为20个碱基以下，优选为10个碱基以下，更优选为五个碱基以下，更优选为一个或两个碱基。

在本说明书中，将包含由序列号13、14、15、16的碱基序列构成的第三多核苷酸的第三引物分别称为UF1、UF2、UF3、UF4，序列号2的碱基序列中的位置如图8-1、8-2所示。

第三引物可以是由第三多核苷酸构成的，也可以是在第三多核苷酸中附加用于检测扩增产物的标记用标签、标记物质、固定化用标签等有用的化学结构而成的。

当第二引物组包含第三引物时，另一引物优选为包含在3’末端包含与部分碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸的引物，所述部分碱基序列是序列号2的碱基序列的互补碱基序列所含的10～50个碱基、优选15～30个碱基连续的部分碱基序列，与在序列号2的碱基序列中比第三碱基更靠近3’末端侧的区域互补，另一引物更优选为第四引物。

接着，对第四引物的优选实施方式进行说明。

关于第四引物所述的第四部分碱基序列是序列号2的碱基序列的互补碱基序列所含的10个碱基以上、优选15个碱基以上、更优选17个碱基以上、更优选20个碱基以上、更优选23个碱基以上连续的部分碱基序列。第四部分碱基序列的碱基数的上限没有特别限定，优选为50个碱基以下，更优选为40个碱基以下，更优选为35个碱基以下，更优选为30个碱基以下。第四部分碱基序列通过包含所述第四碱基的互补碱基作为距3’末端两个碱基以内的碱基，优选作为3’末端的碱基，从而在第二核酸扩增反应中，从第四引物的3’末端起，3’末端侧的区域从模板核酸上的基因2的反义链侧的碱基序列中相当于第四碱基的互补碱基的碱基特异性延长。

第四多核苷酸在3’末端包含与第四部分碱基序列相同或同源的第四碱基序列。这里，“同源”的定义如上所述。更优选地，第四部分碱基序列和第四碱基序列优选从3’末端到三个碱基的区域、更优选从3’末端到五个碱基的区域、更优选从3’末端到八个碱基的区域、更优选从3’末端到10个碱基的区域(当第四部分碱基序列的长度为15个碱基以上时，进一步优选从3’末端到15个碱基的区域；当第四部分碱基序列的长度为17个碱基以上时，进一步优选从3’末端到17个碱基的区域；当第四部分碱基序列的长度为20个碱基以上时，进一步优选从3’末端到20个碱基的区域)相同，剩余的5’末端侧的区域同源。作为第四碱基序列的具体例，可例示序列号17、18、19或20所示的碱基序列、由距序列号17、18、19或20所示的碱基序列的3’末端优选15个碱基以上、更优选17个碱基以上、更优选20个碱基以上连续的部分构成的部分碱基序列。第四多核苷酸“在3’末端包含第四碱基序列”是指，包含第四多核苷酸的碱基序列整体仅由第四碱基序列构成的情况、以及包含第四碱基序列和连接到第四碱基序列的5’末端的另一碱基序列的情况两者。所述另一碱基序列只要实质上不阻碍第二核酸扩增反应即可，作为其碱基数例如为20个碱基以下，优选为10个碱基以下，更优选为五个碱基以下，更优选为一个或两个碱基。

在本说明书中，将包含由序列号17、18、19、20的碱基序列构成的第四多核苷酸的第四引物分别称为UR1、UR2、UR3、UR4，序列号2的碱基序列中的位置如图8-1、8-2所示。

第四引物可以是由第四多核苷酸构成的，也可以是在第四多核苷酸中附加用于检测扩增产物的标记用标签、标记物质、固定化用标签等有用的化学结构而成的。

当第二引物组包含第四引物时，另一引物优选为包含在3’末端包含与部分碱基序列相同或同源的碱基序列的多核苷酸的引物，所述部分碱基序列是序列号2的碱基序列所含的10～50个碱基、优选15～30个碱基连续的部分碱基序列，是在序列号2的碱基序列中比第四碱基更靠近5’末端侧的区域的部分碱基序列，另一引物更优选为第三引物。

当第二引物组是第三引物和第四引物的组合时，按照第三碱基和第四碱基相同或者在序列号2的碱基序列中第三碱基比第四碱基更靠近5’末端侧的方式，选择第三引物和第四引物即可。在第二引物组是第三引物和第四引物的组合时的优选方式中，关于第三引物，第三碱基是序列号2的碱基序列的第34位、第70位、第1667位或第1703位，关于第四引物，第四碱基是序列号2的第127位、第409位、第943位或第1822位，其中，第三碱基与第四碱基相同或者在序列号2的碱基序列中比第四碱基更靠近5’末端侧。

在本发明中，第一核酸扩增反应及第二核酸扩增反应(以下总称为“核酸扩增反应”)能够分别按照一般的PCR(聚合酶链式反应)法进行。

从洋葱制备作为模板的基因组DNA、cDNA等核酸的方法能够按照常规方法进行。

PCR中使用的DNA聚合酶只要是耐热性的DNA聚合酶即可，没有特别限定。在本发明中，能够利用市售的DNA聚合酶。另外，引物浓度、循环数、温度、时间、缓冲液的组成等能够根据所使用的DNA聚合酶、各引物的浓度等适当选择。

在核酸扩增反应中，当来自对象洋葱的核酸中包含要检测的碱基序列时，产生包含规定的靶区域的多核苷酸片段作为扩增产物。

确认通过核酸扩增反应得到的扩增产物的方法没有特别限定。例如，可例示如下方法：在核酸扩增反应结束后，通过凝胶电泳将核酸扩增反应的反应液进行分馏，确认有无相当于包含规定的靶区域的多核苷酸片段的大小的带的方法、标记扩增产物进行检测的方法。另外，也能够一边进行核酸扩增反应一边通过实时PCR法检测扩增产物。

＜3.本发明的第二判别方法＞

本发明的洋葱的性状的判别方法的特征在于，第二，包括：第一检测工序，在来自洋葱的核酸中，进行序列号1的碱基序列的检测，第一检测工序包括在所述核酸中进行第一变异部位的检测，所述第一变异部位包含选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的一个以上的碱基，当在第一检测工序中未检测到序列号1的碱基序列时，判别所述洋葱为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱，当在第一检测工序中检测到序列号1的碱基序列时，判别所述洋葱为具有辛辣味和/或催泪性的洋葱。将该方法称为本发明的“第二判别方法”。

第二判别方法中的第一检测工序与第一判别方法中的第一检测工序相同。第二判别方法中的第一检测工序的具体实施方式与第一判别方法中的第一检测工序的具体实施方式相同。

第二判别方法中的第一检测工序优选地包括：使用包括第一引物及第二引物中的至少一方的第一引物组，以洋葱的核酸为模板进行第一核酸扩增反应；以及确认通过第一核酸扩增反应得到的扩增产物。第二判别方法的该实施方式中的第一引物、第二引物、第一引物组、第一核酸扩增反应、扩增产物的检测方法如对第一判别方法所说明的那样。

＜4.与其他判别方法的组合＞

本发明的第一或第二判别方法可以与没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的其他判别方法组合使用。通过组合多种判别方法，能够正确地判别没有辛辣味和/或催泪性的洋葱。

作为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的其他判别方法，可举出以a)与现有品种相比，洋葱细胞破碎时丙酮酸的生成减少；b)与现有品种相比，洋葱细胞破碎后的残留丙烯基半胱氨酸亚砜(PRENCSO)量多；以及c)与现有品种相比，洋葱细胞破碎时催泪因子(LF)的生成减少中的一个以上的性状为指标，判别洋葱是否为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱。能够判别具有上述一个以上的性状的洋葱为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱。

＜5.育种方法＞

本发明还提供一种育种没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的方法，其特征在于，利用本发明的第一或第二判别方法判别洋葱是否为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱；以及将被判别为是没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的洋葱用于育种。

在以没有辛辣味和/或催泪性的洋葱为原材料之一育种新品种的情况下，使用本发明的第一或第二判别方法，能够从通过杂交培育出的洋葱中正确地筛选没有辛辣味和/或催泪性的洋葱。筛选出的没有辛辣味和/或催泪性的洋葱能够用于进一步的育种。

＜6.引物、引物组、试剂盒＞

第一引物及第二引物分别作为用于特异性扩增来自洋葱的核酸中包含相当于序列号1的碱基序列的碱基序列的部分的引物是有用的。

第一引物组作为用于特异性扩增来自洋葱的核酸中包含相当于序列号1的碱基序列的碱基序列的部分的引物组是有用的，其特征在于，包含第一引物和第二引物，第一碱基和第二碱基相同，或者在序列号1的碱基序列中第一碱基比第二碱基更靠近5’末端侧。

第三引物及第四引物分别作为用于特异性扩增来自洋葱的核酸中包含相当于序列号2的碱基序列的碱基序列的部分的引物是有用的。

第二引物组作为用于特异性扩增来自洋葱的核酸中包含相当于序列号2的碱基序列的碱基序列的部分的引物组是有用的，其特征在于，包含第三引物和第四引物，第三碱基和第四碱基相同，或者在序列号2的碱基序列中第三碱基比第四碱基更靠近5’末端侧。

包含这些引物或引物组中的一种以上的试剂盒作为用于判别洋葱的性状的试剂盒是有用的。该试剂盒还能够包含用于核酸扩增反应、扩增产物的确认的各种要素(例如DNA聚合酶、各种缓冲液、dNTPs等)。

＜7.标记基因＞

cDNA碱基序列包含序列号1的碱基序列的蒜氨酸酶基因1在没有辛辣味和/或催泪性的洋葱中不存在，而在具有辛辣味和/或催泪性的通常的洋葱中存在。因此，蒜氨酸酶基因1作为用于检测洋葱的辛辣味和/或催泪性的标记基因是有用的。当在来自洋葱的核酸中检测到蒜氨酸酶基因1时，能够判别该洋葱具有辛辣味和/或催泪性，当在来自洋葱的核酸中未检测到蒜氨酸酶基因1时，能够判断该洋葱不具有辛辣味和/或催泪性。

＜8.其他发明＞

本发明还包括以下的A～C的发明。

A.一种没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的植物体、或其后代、或其部分，利用本发明的第一或第二判别方法，被判别为是没有辛辣味和/或催泪性的洋葱。

B.一种没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的植物体、或其后代、或其部分的制造方法，包括以下工序：

(i)对洋葱种子进行突变诱发处理的工序；

(ii)栽培突变诱发处理后的洋葱种子，得到洋葱的植物体或其部分的工序；以及

(iii)利用本发明的第一或第二判别方法，从得到的洋葱的植物体或其部分中判别、筛选没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的植物体或其部分的工序。

C.一种没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的植物体、或其后代、或其部分的制造方法，包括：将利用本发明的第一或第二判别方法被判别为是没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的第一洋葱的植物体和第二洋葱的植物体杂交。

A～C的发明的具体形式参照专利文献1的记载即可。

实施例

实施例1：与洋葱的辛辣味、催泪性相关的蒜氨酸酶的基因序列的获取

将专利文献1中记载的不流眼泪、没有辛辣味的洋葱#6(洋葱#6的种子以NCIMB42219被国际保藏。以下称为“洋葱#6”)三个球、以及作为对照球的与洋葱#6品种相同(以下称为“对照品种”)且反复进行相同次数的自花受精的具有辛辣味的洋葱球(三个球)用液氮快速冻结后，在-80℃下冻结保存。剥去冻结后的各洋葱球的皮，称取100mg的洋葱组织，使用RNeasy Plant Mini kit(Qiagen公司制)，按照随附手册采集总RNA(total RNA)。进而使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司制)、以及RNase-Free DNase Set(Qiagen公司制)对采集的total RNA进行DNase处理。处理后的total RNA通过Nanodrop(NanodropTechnologies公司制)、以及Agilent 2100Bioanalyzer(Aglent Technologies公司制)进行浓度测定、品质的确认。在品质确认过程中，确认样品的A260/A280为1.8以上，且RNA Integrity Number为8.0以上，使用TruSeq RNA Sample Prep Kit(illumina公司制)按照随附手册，制备序列文库。制得的序列文库使用下一代定序器HiSeq(illumina公司制)，在下述条件下进行序列解析。

(序列条件)

解析方法：双端(Paired End)、检体数：6、泳道数：3、读取碱基长：100个碱基/读取

(数据处理)

对得到的数据实施下述所举的信息处理。

·使用称为Chastity的计算式，去除低荧光纯度数据。“Chastity”是指，在来自四种碱基的信号值中，将最大的设为I1，其次的设为I2时，由“I1/(I1+I2)”所示的式子表示，在本实施例中，在“I1/(I1+I2)>0.6”的条件下进行数据的筛选。

·根据各检体固有Index信息对每个检体分配筛选出的数据。

·去除包含衔接子序列的读取，进一步提取包含90％以上的Quality Value20以上的碱基的读取对。使用所有这些各检体的数据，利用Trinity(URL:http://trinityrnaseq.sourceforge.net/index.html version 2013-02-25)进行De novo汇编。

·针对汇编数据(推定Transcript序列)，通过BLAST检索赋予注释。注释的程序使用BLASTX，数据库使用整合了NCBI的RefSeq-Fungi、RefSeq-Microbial、RefSeq-Plant的氨基酸序列、以及NCBI的分类中登记在蒜科(Allieae)中的氨基酸序列与将基因序列转换为氨基酸序列的序列的数据库。BLASTX的参数使用evalue 1E-5/num_alignments 100/outfmt"6qseqid sseqid pident length mismatch gapopen qstart qend sstart sendevalue bitscore qlen slen stitle qcovs qcovhsp"/其他使用默认条件。

结果，获取到编码包含专利文献1所示的“氨基酸序列5”的蒜氨酸酶的cDNA碱基序列。编码由“氨基酸序列5”构成的蒜氨酸酶的cDNA碱基序列如序列表的序列号1所示。

实施例2：与序列号1的碱基序列编码的蒜氨酸酶具有高同源性的其他蒜氨酸酶的序列获取

制作与编码蒜氨酸酶的序列号1所示的碱基序列的包含起始密码子的末端部分对应的正向引物、和与所述碱基序列的包含终止密码子的末端部分对应的反向引物，从实施例1中使用的洋葱#6及对照品种中分别采集100mg试样，使用DNeasy Plant mini kit(Qiagen公司制)按照随附手册制备基因组DNA，以制得的基因组DNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。使用MultiNA电泳装置(株式会社岛津制作所)进行扩增产物的解析。引物碱基序列如下所述，引物的位置如图1-1、图1-2、图1-3及图1-4所示。

正向引物1：5’-ATGGAGTCTTACCACAAAGTTGGCAGT-3’(序列号3)

反向引物2：5’-GTAGCCCATACATGATCACAAACATGAAC-3’(序列号4)

扩增产物的电泳分析结果如图2所示。洋葱#6、对照品种均确认到相同大小的扩增产物(图2)。对扩增产物进行直接测序的结果，确认了以下内容：以洋葱#6的基因组DNA为模板时的扩增产物包含在外显子部分与序列号1的碱基序列显示约95％的一致度的与序列号1不同的序列号2所示的基因组DNA碱基序列(表1)。此外，在序列号1的碱基序列中，第一外显子为第50位～第339位，第二外显子为第340位～第651位，第三外显子为第652位～第935位，第四外显子为第936位～第1235位，第五外显子为第1236位～第1621位。另外，在序列号2的碱基序列中，与序列号1的第一外显子对应的部分为第1位～第279位，与序列号1的第二外显子对应的部分为第391位～第702位，与序列号1的第三外显子对应的部分为第804位～第1087位，与序列号1的第四外显子对应的部分为第1188位～第1487位，与序列号1的第五外显子对应的部分为第1591位～第1975位。另一方面，以对照品种的洋葱的基因组DNA为模板时的扩增产物中，包含cDNA碱基序列为序列号1的碱基序列的基因的基因组DNA的片段的扩增产物、和含有包含序列号2的碱基序列的基因组DNA的片段的扩增产物混合存在，通过直接测序未得到明确的结果。从该结果，暗示出对照品种的洋葱具有cDNA碱基序列包含序列号1的碱基序列的蒜氨酸酶基因(以下称为“蒜氨酸酶基因1”)和基因组DNA碱基序列包含序列号2的碱基序列的蒜氨酸酶基因(以下称为“蒜氨酸酶基因2”)双方作为蒜氨酸酶基因，洋葱#6具有蒜氨酸酶基因2而不具有蒜氨酸酶基因1作为蒜氨酸酶基因。此外，由于在实施例1的RNA-seq解析中未检测到相应的RNA，因此可以认为蒜氨酸酶基因2是未表达的假基因。

[表1]

实施例3：能够判别不流眼泪、没有辛辣味的洋葱和一般的洋葱的引物的制作

为了制作分别特异性检测蒜氨酸酶基因1及蒜氨酸酶基因2的引物，比较序列号1、序列号2及基因银行登记号即GenBank Accession No.AAA32639.1的蒜氨酸酶基因的碱基序列，在对应的位置制作各引物的3’末端的一个碱基以上仅与序列号1的碱基序列及序列号2的碱基序列中的一方一致的、仅特异性扩增蒜氨酸酶基因1及蒜氨酸酶基因2中的一方的引物。另外，作为控制引物，在与序列号1的碱基序列和序列号2的碱基序列共同的部分制作引物。各引物的碱基序列如表2所示，引物位置记载于图7-1、7-2、8-1、8-2。

[表2]

作为UF3引物(序列号15)，使用Y的位置为T和Y的位置为C的混合物。

使用制作的各引物，以洋葱#6及对照品种的实施例2中制备的基因组DNA为模板进行PCR，使用MultiNA电泳装置(株式会社岛津制作所)进行扩增产物的解析。结果如图3-1及3-2所示。示出图3-1及3-2中使用的正向引物和反向引物的组合。

当以洋葱#6的基因组DNA为模板时，仅得到与序列号2的碱基序列对应的扩增产物，当以对照品种的基因组DNA为模板时，得到与序列号1的碱基序列对应的扩增产物和与序列号2的碱基序列对应的扩增产物两者。从该结果，判断出能够制作如下引物：能够实现根据能否检测出包含序列号1的碱基序列的蒜氨酸酶基因1，来判别是不流眼泪的洋葱还是对照品种。

进而，为了确认上述引物的通用性，以来自表2所示的市售的洋葱14个品种、上述对照品种及洋葱#6的基因组DNA为模板，进行上述引物的性能确认。PCR的条件与上述相同。

结果如图4所示。图4中的各泳道的序号与表3的各序号的洋葱品种对应。泳道1～14是市售品种、泳道15是上述对照品种、泳道16是洋葱#6的分析结果。从图4所示的结果，确认了以下内容：市售品种14个品种和对照品种均具有蒜氨酸酶基因1和蒜氨酸酶基因2，洋葱#6具有蒜氨酸酶基因2且不具有蒜氨酸酶基因1。该结果证实，使用上述引物的洋葱#6的判别方法能够不依赖于品种而广泛应用。

[表3]

实施例4：检测方法的利用

上述引物可用于从后代中筛选不流眼泪、没有辛辣味且包含有用性状的洋葱，所述后代是用常规杂交方法将不流眼泪、没有辛辣味的洋葱#6与具有有用性状的第二洋葱杂交而成的。

将洋葱#6和肥大性良好的长日照性洋葱杂交。具体而言，用北海道的常规方法将洋葱#6和具有肥大性良好的性状的雄性不育长日照性洋葱(非市售品种的HTA)杂交，得到F1种子。播种该F1种子，用北海道的常规栽培法收获F1洋葱的球(F1球)。从收获的F1球自花受精采种，得到F2种子。用常规法栽培得到的F2种子，得到F2洋葱的球(F2球)。筛选是在栽培F2球的过程中，对4249个球的叶子进行采样，提取基因组DNA作为模板，实施使用上述引物中的SF2-SR1、SF1-SR1、UF2-UR1这三对的PCR。然后，筛选得到与蒜氨酸酶基因2对应的扩增产物且未得到与蒜氨酸酶基因1对应的扩增产物的F2球。按这个基准筛选的F2球被推定为不流眼泪、没有辛辣味的洋葱球。其结果，从4249个球筛选出866个球的洋葱。图5中示出通过以来自多个F2洋葱的叶子的基因组DNA为模板，使用SF2-SR1作为引物组的PCR得到的扩增产物的检测结果的一例。图5的上部是F2洋葱的样品名。

为了确认PCR中的筛选结果与表达系统的一致性，在上述检测中，对得到蒜氨酸酶基因2的扩增产物且未得到蒜氨酸酶基因1的扩增产物的F2洋葱的F2球(称为“筛选球”)的94个球、和得到这两种扩增产物的F2洋葱的F2球(称为“非筛选球”)的30个球，测定感官评价、及作为催泪性、辛辣味的指标的丙酮酸量。丙酮酸生成量的测定使用专利文献1中记载的方法进行。丙酮酸生成量的测定结果如图6所示。感官评价的结果，筛选球均未感觉到催泪性、辛辣味。另外，筛选球的丙酮酸生成量为1umol/g左右，与专利第5671657号记载的不流眼泪、没有辛辣味的洋葱的丙酮酸生成量为相同程度。另一方面，非筛选球在感官评价中感觉到催泪性和辛辣味，丙酮酸生成量为高于6umol/g的值。

以上的结果证实，本发明的检测法为能够正确地筛选不流眼泪、没有辛辣味这一性状的方法。

产业上的利用可能性

本发明能够用于在农业、食品制造等领域中判别没有辛辣味的洋葱。

将本说明书中引用的全部刊行物、专利及专利申请直接作为参考引用于本说明书中。

以上详细地说明了本发明，但在不脱离本发明的范围的情况下能够进行各种变更，这对于本领域技术人员是显而易见的，并且本发明不限于说明书的记载。

序列表

<110> 好侍食品集团本社株式会社（House Foods Group Inc.）

<120> 洋葱的判别方法

<130> PH-7587-PCT

<150> JP 2017-184019

<151> 2017-09-25

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1663

<212> DNA

<213> 洋葱（Allium cepa）

<400> 1

ccgagattac aagtggagca ttaaatatcc atagcagagc taattagcta tggagtctta 60

ccacaaagtt ggcagtaata aaatgccaag ccttcttatt ttgatatgca taatcatgtc 120

ttcatttgtt aacaataata tagctcaagc gaaggtgaca tggagtttga aggcagcaga 180

agaggcagaa gcagtggcta atataaactg ttcagggcat gggagagctt ttttggacgg 240

aattctttca gatggatctc ctaaatgcga gtgcaatact tgctacactg gtgcagactg 300

ctctgaaaag attacaggtt gctctgctga tgttgccagt ggtgatggac tgtttctaga 360

agaatactgg cagcagcaca aggaaaacag tgcagtgctg gtttcaggat ggcacagaat 420

gagctacttt ttcaacccag ttagcaattt catatctttc gagcttgaaa aaacaattaa 480

agaactacat gagatagtcg gaaatgctgc tgcaaaggac aggtacattg tgtttggagt 540

aggggtgact caactcatcc atggattggt catctctctt tcaccaaata tgactgccac 600

tccttgtgca ccacaatcta aagttgttgc tcatgcccct tattatccgg tgtttagaga 660

acaaacaaag tactttgaca agaaagggta cgagtggaaa ggaaatgcag cggattacgt 720

gaacacttca actccagagc aattcattga gatggttact tcacctaata acccagaagg 780

tctgcttcgc catgaagtaa taaagggatg caaatccatc tacgatatgg tttactactg 840

gcctcattac accccaatca agtacaaagc cgatgaagat atcatgttgt ttacaatgtc 900

taaatacact ggacactctg gtagtcgatt tgggtgggca ctgataaagg atgaaactgt 960

gtataataaa ttgttgaatt acatgacaaa gaacacggag ggcacttccc gagaaacaca 1020

gctacgatcg ctcaaaattc taaaagaagt tatagcaatg gttaaaacac agaaaggcac 1080

catgcgcgac ctcaacacat ttggttttca gaaactaaga gagaggtggg taaatatcac 1140

ttcattgctc gataaatccg acagattctc ctatcaaaag cttccacaaa gtgaatattg 1200

caattacttc aggagaatga gacctccatc cccatcttat gcatgggtga agtgtgaatg 1260

ggaagaagac aaagattgct accagacatt tcaaaatggg cgtatcaata cgcaaagtgg 1320

agagggtttc gaagcaggta gtcgttatgt gcgtttgagt ttgatcaaga caaaagatga 1380

ttttgatcaa ctaatgtact atttgaagaa tatggttgaa gcaaagagga agactcctct 1440

catcaaacaa ctttccaatg atcagatctc ccgccgtcct ttcatttaag tactcatgtt 1500

atgtattgct ctgctgtttt gttagtgtat gactatgttc atacatccta atgctatggt 1560

agtaaggagt atctttctat gcaataaata aagttcatgt ttgtgatcat gtatgggcta 1620

ctatgatttt ataataaaat caattttcat ataaaaaaaa aaa 1663

<210> 2

<211> 1975

<212> DNA

<213> 洋葱（Allium cepa）

<400> 2

ccacaaagtt ggcagtagta aaatgccaag cctacttatt ttgatatgca taatcatgtc 60

ttcatttgtc aacaataata tagctcaagg gaaggtgaca tggagtttga aggcagcaga 120

agaggcggag gcagtggcca atataaactg ttcagggcat ggaagagctt ttttggatgg 180

aattctttca gatggctctc ctaaatgcga gtgcaatact tgctacactg gtgcagattg 240

ctctcaaaag attacaggtt gctctgcgga tgttgccagg ttaatatttc tctgttcttc 300

acaatacatg gtagtttaac tttatatcaa acacactgga caatatttaa tgacatgctt 360

aaggaattga atgatatatt gtatacacag tgstgatgga ctgwttcttg aggaatattg 420

gcagcascac maggaaaaca gtgcagtgct cgtttcagga tggcacagaa tgagctactt 480

tttcaaccca gytagcaatt tcatatcgtt cgagcttgaa aaaacaatta aggaactaca 540

tgagatagtc ggaaatgctg ctgcaaagga caggtacatt gtgtttggag tcggggtgac 600

tcaactcatc catggattgg tcatctytct ttcaccaaat atgactgcca ctccttgtgc 660

accacaatct aaagttgttg ctcatgcccc tttttatccg gtaactctac gcatgtttct 720

aagttgaact acctagagat aactgtttat ttcttatgta ctcgtgtgac tgacttaatt 780

tgaacaaatt aaatgataca ggtgttcaga gaacaaacaa aatattttga caagaaaggg 840

tacgagtgga aaggaaatgc agcgaattac gtgaacactt caactcctga gcagttcatt 900

gagatggtta cttcacctaa taacccagaa ggtctgcttc gcaaggaagt aatcaaggga 960

tgcaaatcca tttacgatat ggtttactac tggcctcatt acaccccaat caagtacaaa 1020

gccgacgaag atatcatgtt gtttacaatg tctaaataca ctggacactc tggtagtcga 1080

tttgggtatg tccacatatt attacctcac atctttctct acctataatt aacatattta 1140

agttggttag ttagtaactc atactttaat atcttattaa attaggtggg cgttgataaa 1200

ggatgaaacc gtgtataata agttgtwaaa ttacatgaca aaaaacacgg aaggcactcc 1260

tcgggaaaca cagctacgat cgctcaaaat tmtaaaagaa gtcatagcaa tggttaaaac 1320

acagaaaggc accatgcgtg acctcaacac atttggtttt aagaaactaa gagagaggtg 1380

ggtaaatatc actgcattgc tggataaatc agacagattc tcctatcaaa agcttccaca 1440

aagtgaatat tgcaattact tccgaagaat gagacctcca tccccatgta tgtataccag 1500

tatattatca tttattgaaa gatataatat tatagattat aaacataaca atgyagcatt 1560

aatcaatgat atatatatac acgatgacag cttatgcatg ggtgaagtgt gaatgggaag 1620

aagacaaaga ttgctaccag acatttcaaa atggacgyat caacacacaa agtggagagg 1680

gtttcgaagc gggcagtcgt tacgtgcgty tgagtttgat caagacaaag gatgattttg 1740

atcaactcat gtactatttg aagactatgg ttgaagcaaa gaggaagact cctctcatca 1800

aacaactttc caatgatcag acatcccgcc gtcctttcat ttaagtactc atgttatgta 1860

tcgctcgctg ttttgttagt gtatgactat gttcatacat cctaatgcta tggtcgtaag 1920

gagttcctat ctttgtaata aataaagttc atgtttgtga tcatgtatgg rctac 1975

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 3

atggagtctt accacaaagt tggcagt 27

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 4

gtagcccata catgatcaca aacatgaac 29

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 5

tggcagtaat aaaatgccaa gcctt 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 6

atgcataatc atgtcttcat ttgtt 25

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 7

cagacatttc aaaatgggcg tatcaatacg 30

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 8

gagagggttt cgaagcaggt agtcgttat 29

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 9

acagtttata ttagccactg cttct 25

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 10

tgtgctgctg ccagtattct tct 23

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 11

atttgcatcc ctttattact tcatg 25

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 12

gtacttaaat gaaaggacgg cgggaga 27

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 13

tggcagtagt aaaatgccaa gccta 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 14

atgcataatc atgtcttcat ttgtc 25

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 15

cagacatttc aaaatggacg yatcaacaca 30

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 16

gagagggttt cgaagcgggcag tcgttac 29

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 17

acagtttata ttggccactg cctcc 25

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 18

ggtggtgctg ccaatattcc tca 23

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 19

atggatttgc atcccttgat tacttcctt 29

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 20

gtacttaaat gaaaggacgg cgggatg 27

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 21

atatggttta ctactggcct cattacac 28

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 22

ccattcacac ttcacccatg cataag 26

Claims (11)

1.一种洋葱的性状的判别方法，其特征在于，包括：

第一检测工序，在来自洋葱的核酸中，进行序列号1的碱基序列的检测；以及

第二检测工序，在来自洋葱的核酸中，进行序列号2的碱基序列的检测，

当在第一检测工序中未检测到序列号1的碱基序列且在第二检测工序中检测到序列号2的碱基序列时，判别所述洋葱为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱，

当在第一检测工序中检测到序列号1的碱基序列且在第二检测工序中检测到序列号2的碱基序列时，判别所述洋葱为具有辛辣味和/或催泪性的洋葱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

第一检测工序包括在所述核酸中进行第一变异部位的检测，所述第一变异部位包含选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的一个以上的碱基，

第二检测工序包括在所述核酸中进行第二变异部位的检测，所述第二变异部位包含选自序列号2的碱基序列的第34位、第70位、第1667位、第1703位、第127位、第409位、第943位及第1822位的一个以上的碱基。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

第一检测工序包括：使用包含第一引物和/或第二引物的第一引物组，以所述洋葱的基因组DNA或cDNA为模板进行第一核酸扩增反应，以及确认通过第一核酸扩增反应得到的扩增产物，所述第一引物包含在3’末端包含第一碱基序列的多核苷酸，所述第一碱基序列与第一部分碱基序列相同或与第一部分碱基序列从3’末端到三个碱基的区域相同且剩余的5’末端侧的区域相同，所述第一部分碱基序列是序列号1的碱基序列所含的17个碱基以上连续的第一部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含选自第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的一个以上的第一碱基，所述第二引物包含在3’末端包含第二碱基序列的多核苷酸，所述第二碱基序列与第二部分碱基序列相同或与第二部分碱基序列从3’末端到三个碱基的区域相同且剩余的5’末端侧的区域相同，所述第二部分碱基序列是序列号1的碱基序列的互补碱基序列所含的17个碱基以上连续的第二部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含与选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的一个以上的第二碱基互补的碱基，

第二检测工序包括：使用包含第三引物和/或第四引物的第二引物组，以所述洋葱的基因组DNA为模板进行第二核酸扩增反应，以及确认通过第二核酸扩增反应得到的扩增产物，其中，所述第三引物包含在3’末端包含第三碱基序列的多核苷酸，所述第三碱基序列与第三部分碱基序列相同或与第三部分碱基序列从3’末端到三个碱基的区域相同且剩余的5’末端侧的区域相同，所述第三部分碱基序列是序列号2的碱基序列所含的17个碱基以上连续的第三部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含选自第34位、第70位、第1667位、第1703位、第127位、第409位、第943位及第1822位的一个以上的第三碱基，所述第四引物包含在3’末端包含第四碱基序列的多核苷酸，所述第四碱基序列与第四部分碱基序列相同或与第四部分碱基序列从3’末端到三个碱基的区域相同且剩余的5’末端侧的区域相同，所述第四部分碱基序列是序列号2的碱基序列的互补碱基序列所含的17个碱基以上连续的第四部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含与选自序列号2的碱基序列的第34位、第70位、第1667位、第1703位、第127位、第409位、第943位及第1822位的一个以上的第四碱基互补的碱基。

4.一种洋葱的性状的判别方法，其特征在于，

包括第一检测工序，在来自洋葱的核酸中，进行序列号1的碱基序列的检测，

第一检测工序包括在所述核酸中进行第一变异部位的检测，所述第一变异部位包含选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的一个以上的碱基，

当在第一检测工序中未检测到序列号1的碱基序列时，判别所述洋葱为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱，

当在第一检测工序中检测到序列号1的碱基序列时，判别所述洋葱为具有辛辣味和/或催泪性的洋葱，

第一检测工序包括：使用包含第一引物和第二引物的第一引物组，以所述洋葱的基因组DNA或cDNA为模板进行第一核酸扩增反应，以及确认通过第一核酸扩增反应得到的扩增产物，所述第一引物包含第一多核苷酸，所述第一多核苷酸在3’末端包含第一碱基序列，所述第一碱基序列与第一部分碱基序列相同或与第一部分碱基序列从3’末端到三个碱基的区域相同且剩余的5’末端侧的区域相同，所述第一部分碱基序列是序列号1的碱基序列所含的17个碱基以上连续的第一部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的第一碱基，所述第二引物包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸在3’末端包含第二碱基序列，所述第二碱基序列与第二部分碱基序列相同或与第二部分碱基序列从3’末端到三个碱基的区域相同且剩余的5’末端侧的区域相同，所述第二部分碱基序列是序列号1的碱基序列的互补碱基序列所含的17个碱基以上连续的第二部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含与选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的第二碱基互补的碱基，所述第一引物组中，第一碱基在序列号1的碱基序列中比第二碱基更靠近5’末端侧。

5.一种洋葱的性状的判别方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1至4中任一项所述的方法判别洋葱是否为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱；以及

以a)至c)中的一个以上的性状为指标，判别洋葱是否为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱，

a)与现有品种相比，洋葱细胞破碎时丙酮酸的生成减少；

b)与现有品种相比，洋葱细胞破碎后的残留丙烯基半胱氨酸亚砜PRENCSO量多；以及

c)与现有品种相比，洋葱细胞破碎时催泪因子LF的生成减少。

6.一种育种没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1至5中任一项所述的方法判别洋葱是否为没有辛辣味和/或催泪性的洋葱；以及

将被判别为是没有辛辣味和/或催泪性的洋葱的洋葱用于育种。

7.一种引物组，其特征在于，包括：

包含第一多核苷酸的引物，所述第一多核苷酸在3’末端包含第一碱基序列，所述第一碱基序列与第一部分碱基序列相同或与第一部分碱基序列从3’末端到三个碱基的区域相同且剩余的5’末端侧的区域相同，所述第一部分碱基序列是序列号1的碱基序列所含的17个碱基以上连续的第一部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的第一碱基；以及

包含第二多核苷酸的引物，所述第二多核苷酸在3’末端包含第二碱基序列，所述第二碱基序列与第二部分碱基序列相同或与第二部分碱基序列从3’末端到三个碱基的区域相同且剩余的5’末端侧的区域相同，所述第二部分碱基序列是序列号1的碱基序列的互补碱基序列所含的17个碱基以上连续的第二部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含与选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的第二碱基互补的碱基，

所述引物组中，第一碱基在序列号1的碱基序列中比第二碱基更靠近5’末端侧。

8.一种引物，其特征在于，包含：

第三多核苷酸，该第三多核苷酸在3’末端包含第三碱基序列，所述第三碱基序列与第三部分碱基序列相同或与第三部分碱基序列从3’末端到三个碱基的区域相同且剩余的5’末端侧的区域相同，所述第三部分碱基序列是序列号2的碱基序列所含的17个碱基以上连续的第三部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含选自序列号2的碱基序列的第34位、第70位、第1667位、第1703位、第127位、第409位、第943位及第1822位的第三碱基。

9.一种引物，其特征在于，包括：

第四多核苷酸，该第四多核苷酸在3’末端包含第四碱基序列，所述第四碱基序列与第四部分碱基序列相同或与第四部分碱基序列从3’末端到三个碱基的区域相同且剩余的5’末端侧的区域相同，所述第四部分碱基序列是序列号2的碱基序列的互补碱基序列所含的17个碱基以上连续的第四部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含与选自序列号2的碱基序列的第34位、第70位、第1667位、第1703位、第127位、第409位、第943位及第1822位的第四碱基互补的碱基。

10.一种引物组，其特征在于，包括：

权利要求8所述的引物；以及

权利要求9所述的引物，

第三碱基在序列号2的碱基序列中比第四碱基更靠近5’末端侧。

11.一种用于判别洋葱的性状的试剂盒，其特征在于，包括：

选自包含第一多核苷酸的引物、包含第二多核苷酸的引物及权利要求7所述的引物组中的一种，所述第一多核苷酸在3’末端包含第一碱基序列，所述第一碱基序列与第一部分碱基序列相同或与第一部分碱基序列从3’末端到三个碱基的区域相同且剩余的5’末端侧的区域相同，所述第一部分碱基序列是序列号1的碱基序列所含的17个碱基以上连续的第一部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的第一碱基，所述第二多核苷酸在3’末端包含第二碱基序列，所述第二碱基序列与第二部分碱基序列相同或与第二部分碱基序列从3’末端到三个碱基的区域相同且剩余的5’末端侧的区域相同，所述第二部分碱基序列是序列号1的碱基序列的互补碱基序列所含的17个碱基以上连续的第二部分碱基序列且在距3’末端两个碱基以内包含与选自序列号1的碱基序列的第94位、第130位、第1312位、第1348位、第187位、第358位、第791位及第1467位的第二碱基互补的碱基；以及

选自权利要求8所述的引物、权利要求9所述的引物及权利要求10所述的引物组中的一种。

Images