CN111126329A - 一种自动识别多能干细胞群的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种自动识别多能干细胞群的方法，该方法包括：对培养中的干细胞样品进行拍照，获得电子图像照片，其中，对拍得的图像照片首先进行二值化处理后，然后进行计算机图像分析，从而在照片中划分出多能干细胞和非多能干细胞；通过该方法，可以显著提高区分多能和非多能干细胞的细胞的区域和范围。

Description

一种自动识别多能干细胞群的方法

技术领域

本发明属于细胞培养领域，特别的，涉及一种自动识别多能干细胞的方法和系统。

背景技术

胎干细胞是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，胚胎干细胞细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。

胚胎干细胞具有多能性，特点是具有可以通过细胞分化成多种组织，包括生殖系细胞的能力，但无法独自发育成一个个体。它可以发育成为外胚层、中胚层及内胚层三种胚层的细胞组织。胚胎干细胞在经过多重细胞分裂之后，仍然能保有万能分化性。

胚胎干细胞细胞从理论上讲可以无限传代和增殖，并且不失去其正常的二倍体基因型和表现型，以其作为核供体进行核移植后，在短期内可获得大量基因型和表现型完全相同的个体，胚胎干细胞与胚胎进行嵌合克隆动物，可解决哺乳动物远缘杂交的困难问题，生产珍贵的动物新种，对于保护珍稀野生动物有着重要意义。而且作为一种被称之为“种子细胞”的胚胎干细胞，它可以为临床的组织器官移植提供大量材料。这样就可能解决一直困扰着免疫学界及医学界的同种异型个体间的移植排斥难题。

在日常不断多代培养胚胎干细胞的过程中,单个细胞之间也存在分化的可能,总是希望能够获得各个生物学功能一致性的细胞，这些多能干细胞总是以菌落的形式存在，从外观形态上，细胞群落长的非常密实，细胞和细胞之间间隔小，轮廓边界不清晰。分化的细胞和未分化的细胞尝尝是混合在一起的，特别是，未分化的细胞与已经分化或者具有分化可能性的细胞之间的界限并不明显。在传统技术上，一般都是通过人工肉眼凭借个人经验在培养容器中进行挑选出那些未分化的细胞。挑选出来的未分化的细胞菌落进行下一代的培养，但是人工挑选的缺陷就是效率低，而且不可能实现标准的统一，不能实现大规模的工厂化生产。

这就需要提供一种更加高效、可靠的挑选菌落的方式或者方法。

发明内容

为了客户现有传统技术上的缺陷，本发明提供一种自动识别多能干细胞菌落的方法，通过该方法，可以准确定位多能干细胞菌落的位置，而且也可以准确识别多能干细胞菌落的范围，从而可以高效快速获得大量多能干细胞，而且高效准确，不受个人经验的限制。这里的多能干细胞菌落一般是指未分化的干细胞。

所以，一方面，本发明提供一种自动区分不同细胞的方法，该方法包括对细胞群进行摄像或者拍照，然后对照片或者获得的图像进行处理，从而可以区分不同功能的细胞。

在一些优选的方式中，本发明对聚集有大量干细胞群拍照，然后对照片进行光学处理。这里的细胞群被培养在容器里，例如培养皿，容器里一般具有培养基，而细胞位于培养基中，细胞的分裂和分化以及生长，一般都是贴壁生长的。所以，对容器的贴壁的细胞群进行拍照，获得细胞群的照片，然后对照片或者图像进行处理。

在一些方式中，对拍得的电子图像(一般是电子图像)进行图像二值化处理，让图像呈现两种不同的状态，在不同的状体细下，不同的细胞显示出不同的状态，从而让不同的细胞群之间具有轮廓，从而可以自动进行区分。轮廓的显示也就表明不同细胞在图像中的位置，也就可以对应在容器中不同细胞的位置，从而为实现自动挑选或者筛选提供了可能性。

在一些方式中，进行二值化处理，让细胞群中的多能干细胞与非多能干细胞区分开来，既让多能干细胞与非多能干细胞之间具有比较明显的轮廓或者界限，分界线，这些分界线把具有不同功能的细胞群落之间进行了划分，从而方便在容器中进行自动的筛选或者挑选目的细胞群落。例如，去掉非多能干细胞，保留多能干细胞进行继续培养，或者对保留的多能干细胞进行划分小更小的等分，然后进行再次或者下一代的多能干细胞的培养。这样保证了每次培养的细胞的纯度和连续性。

在一些优选的方式中，图像二值化处理的步骤包括将图像上的像素点的灰度值设置为0或255，从而让图像明显呈现黑白效果的过程。从而让多能干细胞与非多能干细胞进行了划分。

在这里我们可以理解，在拍摄的不同图像或者照片中，不同的细胞群落之间对光学就有不同的表现方式，所以在拍摄的图像中，当采用不同的值进行划分的时候，就可以对一些相同光学性质的细胞进行归类。例如，多能干细胞是一群功能为分化的细胞，类似微生物上的菌落的概念，这些细胞具有相同的光学性质，当采用不同的值进行处理的时候，在每个值之间，多能干细胞表现的形式都一样。但是，在每一个值的时候，功能一致性的细胞或者细胞群落与其它功能的细胞具有区分，但是区分程度并不一样；当选取两个合适值的时候，功能一致性的细胞或者细胞群落与其它功能的细胞的区分程度不同，一旦取值合适，能够达到最大的区分程度，这样，在图像上，功能不同的细胞群就显示出大体明显的轮廓，从而进行了区分。一旦区分出来，就可以在培养容器中的细胞群进行定位或者标记，为了后续的筛选提供了便利性。

可以这样理解，对于区分多能干细胞和非多能干洗细胞，对图像或者照片的二值化处理的时候，灰度值是0或者255最好，可以容易对他们两者之间进行区分，然后可以实现后续的自动定位，划分边界，自动筛选的目的。

在一些优选的方式中，本发明采用大津二值化法对图像进行二值化处理获得处理后的图像。大津二值化法是一种常用的图像处理方法，在计算机视觉和图像处理中，大津二值化法用来自动对基于聚类的图像进行二值化，或者说，将一个灰度图像退化为二值图像。该算法以大津展之命名。算法假定该图像根据双模直方图(前景像素和背景像素)把包含两类像素，于是它要计算能将两类分开的最佳阈值，使得它们的类内方差最小；由于两两平方距离恒定，所以即它们的类间方差最大。因此，大津二值化法粗略的来说就是一维Fisher判别分析的离散化模拟。

在大津算法中，我们穷举搜索能使类内方差最小的阈值，定义为两个类的方差的加权和：

其中,权重ω_i是被阈值t分开的两个类的概率，而

是这两个类的方差。

大津证明了最小化类内方差和最大化类间方差是相同的：

用类概率ω_i和类均值μ_i来表示。类概率ω₁(t)用阈值为t的直方图计算：

而类均值μ₁(t)为：

其中x(i)为第i个直方图面元中心的值。同样的，可以对大于t的面元求出右侧直方图的ω₂(t)，μ₂。类概率和类均值可以迭代计算。这个想法会产生一个有效的算法。

大津算法得出了0:1范围上的一个阈值。这个阈值用于图像中出现的像素强度的动态范围。例如，若图像只包含155到255之间的像素强度，大津阈值0.75会映射到灰度阈值230(而不是192，因为图像包含的像素不是0–255全范围的)。

本发明也惊讶的发现，采用大津二值化法对图像进行二值化处理后，可以准确的区分出未分化的干细胞群和分化的细胞，从而可以准确定位在细胞群中分化的干细胞群的位置和范围，从而为实现自动挑选未分化的干细胞群奠定了基础。

实践时我们不识别单细胞而是鉴定细胞集群的区块是否维持多能的状态，具有多能干细胞的功能。多能干细胞(ES)形态特征：ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。当用碱性磷酸酶染色，E细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色；细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。

当不进行染色的时候，ES细胞与非ES细胞的边界并不清楚和明显，虽然通过肉眼可以进行挑选，但是毕竟人工操作繁琐，而却准确度不高，每一个人的经验不同，所认定的多能干细胞与非多能干细胞的界限也不相同，如果实现工长化生产，不容易获得功能基本一致的细胞群，有杂的细胞出现，从而影响了多能干细胞的连续代培养。

在另一方面，本发明提供一种自动识别多能干细胞群的方法，该方法包括：对培养中的干细胞样品进行拍照，获得电子图像照片，其中，对拍得的图像照片首先进行二值化处理后，然后进行计算机图像分析，从而在照片中划分出多能干细胞和非多能干细胞。在一些方式中，所述的二值化的灰度值为0和255。

在一些方式中，计算机图像分析方法采用大津二值化算法。

在一些方式中，该方法还包括对于图像处理后，对图像中的多能干细胞和非多能干细胞进行界限的划分。

在一些方式中，对于界限的划分后，定位到对应到所拍照片的干细胞的具体样品上。

另一方面，本发明提供图像二值化处理在用于区分多能干细胞和非多能干细胞上的用途，其中，在用途中，对培养中的干细胞样品进行拍照，获得电子图像照片，其中，对拍得的图像照片首先进行二值化处理后，然后进行计算机图像分析，从而在照片中划分出多能干细胞和非多能干细胞。

在一些方式中，所述的二值化的灰度值为0和255。

在一些方式中，，计算机图像分析方法采用大津二值化算法。

在一些方式中，该方法还包括对于图像处理后，对图像中的多能干细胞和非多能干细胞进行界限的划分。

在一些方式中，其中，对于界限的划分后，定位到对应到所拍照片的干细胞的具体样品上。

有益效果

本发明对图像进行二值化处理，特别是采用大津算法对图像进行二值化处理，可以有效的区分多能干细胞群和别的非多能干细胞，从而可以实现后续的自动定位和自动划分范围的自动化识别和筛选过程，而且极大的提高了准确率。

附图说明

图1为一个培养容器中细胞群落的图像，其中，该图像中具有多能干细胞和非多能干细胞。

图2为多个通过人工筛选划分的多能干细胞的图像集合。

图3为多个通过人工筛选划分的非多能干细胞的图像集合。

图4通过本发明的图像二值化处理，划分出的多能和非多能的区域示意图。

具体实施方式

现在以举例的方式来说明本发明是如何实现的，并不构成对本发明的任何限制，本发明的范围以权利要求为准。

实施例子1：自动识别多能干细胞的方法(图像经过了前处理)

ESC培养(胚胎干细胞)(ESC实际上在培养过程中，具有多能干细胞(ES)，同时也存在非ES细胞)

1.ESC初始培养

1.1.1细胞解冻之前，先打开水浴锅开关，调节温度至37℃。

1.1.2将包被有基质胶(Matrigel)的6孔板带到生物安全柜里，吸出包被的DMEM-HG培养基(购买自那里Stem cell technology(加拿大公司)，然后往孔里加入新制备的500uL多能干细胞培养基(mTeSR1)

1.1.3将约3mL mTeSR1加入15ml管中并放置。

1.1.4从液氮取出需要解冻的ESC放入-20度预冷的梯度降温盒内，转移至细胞房内。

1.1.5在镊子的帮助下从梯度降温盒中取出冻存管，将其放入水浴锅，摇晃直至冻存管内细胞解冻，注意不要让水浴锅的水浸过冻存管盖子。

1.1.6对着冻存管喷洒一些酒精后将其带入生物安全柜，用5mL移液管从15ml管中吸出1mL mTeSR1，然后将其缓慢地加入冻存管中。

1.1.7取出冻存管中的所有液体，缓慢地加入含有剩余2ml mTeSR1的试管中，然后将所有物质加入15ml离心管中。

1.1.8从15ml离心管中取出所有培养基，然后慢慢加入含有500uL mTeSR1的一孔里。

1.1.9加入培养基细胞后，向孔中加入抑制剂(Rock，https://www.biomart.cn/infosupply/68159453.htm？from＝search_1)至终浓度为10uM。

1.1.10轻轻地将平板带到显微镜下看看细胞密度。

1.1.11将6孔板来回摇动3-4次，然后将平板放入培养箱中，再来回移动3-4次，24小时之内不要移动培养板。

2.hESC细胞的维持

4.3.1传代或复苏接种24小时后，在显微镜下检查平板并观察附着的ESC。

4.3.2将装有多能干细胞培养基(mTeSR1-Stem cell technology)培养基的50ml离心管从4度冰箱拿出，放在室温的离心管架上静置30分钟以上，使培养液温度恢复至室温。将培养液和一个空的50ml离心管放入生物安全柜内。

4.3.3将培养板带到生物安全柜内，小心地打开盖板盖，将其放在一边，然后将板向前倾斜，轻轻吸走旧培养液，将旧培养液加入空的50ml离心管中回收，旧培养液命名为胚胎干细胞条件性培养基(ESC-CM)。

4.3.4从壁的两侧轻轻加入2毫升室温的mTeSR1到6孔板的1孔(培养液数量取决于孔的类型)，这样细胞不会受到干扰。不要将开盖的6孔板暴露在空气中较长时间，否则可能会造成污染。

4.3.5然后将平板拿到显微镜上观察细胞。

4.3.6然后将平板轻轻放入培养箱中。确保培养箱门正确关闭。

4.3.7每天都要进行换液。

观察

在传代后第二天开始，显微镜上观察细胞，并拍照获得图像照片(一般每次拍照获得2张照片)或者电子照片。图像中标注有细胞系编号，细胞代次的数目，物镜倍数等，传代后的天数等详细信息。这样对不同的细胞培养条件和代数后的进行拍照，获得多张照片。

预处理

首先，为了验证本发明的方法的可靠性，对不同细胞系的不同的代数的细胞(对于培养皿拍照)进行分别拍照，获得100张照片(相当于100张不同培养容器中培养的细胞的照片，其中有不同代数的细胞照片)，同时对被拍照的细胞进行人工划分多能和非多能的范围(在培养皿背后)，然后通过细胞染色验证人工划分范围的准确性分析,细胞染色是现有常规方法进行。

将拍的照片，100张1600X1200(像素)的图片，其中每一张分解为多张80X80的图片；既：对每一张图像分解成80X80(像素)的图像的照片，然后对分解后的图片进行大津二值化处理，处理的灰度值选择是0和255下成像(既形成黑白效果的图像)，从而形成不同灰度值下的图像结果，再把两种灰度值下的图像结果进行图像拟合形成最终的区域划分，从而就可以在图像中显示出多能干细胞群和非多能干细胞群的界限，例如图4所示，在图像中，黑色线条划分的区域就是多能和非多能干细胞的区分界限，在黑色线条内的区域就是非多能干细胞区域，黑色线条外的就是非多能干细胞。对同一个照片的多个图像进行划分后进行二值化处理，然后再重新进行拟合形成最终与拍摄原始照片一致的图像，形成原始的100张的区域图像，也就在拍照的区域内划分出了多能和非多能的范围区域。既可以在拍照的区域内反映出该图像区域内多能和非多能的区域划分。

所谓图像二值化，将256个亮度等级的灰度图像通过适当的阈值选取而获得仍然可以反映图像整体和局部特征的二值化图像。在数字图像处理中，二值图像占有非常重要的地位，首先，图像的二值化有利于图像的进一步处理，使图像变得简单，而且数据量减小，能凸显出感兴趣的目标的轮廓。其次，要进行二值图像的处理与分析，首先要把灰度图像二值化，得到二值化图像。所有灰度大于或等于阈值的像素被判定为属于特定物体，其灰度值为255表示，否则这些像素点被排除在物体区域以外，灰度值为0，表示背景或者例外的物体区域。本发明发现，采用这样的二值化处理，可以明显区分出细胞培养中多能干细胞与非多能干细胞之间的界限。对于二值化处理后的具体分析方案可以采用现有技术的任何处理方法。在优选的方式中，采用大津二值化法进行处理。

二值化处理的具体方法是大津二值化法。大津二值化法是一种常用的图像处理方法，在计算机视觉和图像处理中，大津二值化法用来自动对基于聚类的图像进行二值化，或者说，将一个灰度图像退化为二值图像。该算法以大津展之命名。算法假定该图像根据双模直方图(前景像素和背景像素)把包含两类像素，于是它要计算能将两类分开的最佳阈值，使得它们的类内方差最小；由于两两平方距离恒定，所以即它们的类间方差最大。因此，大津二值化法粗略的来说就是一维Fisher判别分析的离散化模拟。

在大津算法中，我们穷举搜索能使类内方差最小的阈值，定义为两个类的方差的加权和：

其中,权重ω_i是被阈值t分开的两个类的概率，而

是这两个类的方差。

大津证明了最小化类内方差和最大化类间方差是相同的：

用类概率ω_i和类均值μ_i来表示。类概率ω₁(t)用阈值为t的直方图计算：

而类均值μ₁(t)为：

其中x(i)为第i个直方图面元中心的值。同样的，可以对大于t的面元求出右侧直方图的ω₂(t)，μ₂。类概率和类均值可以迭代计算。这个算法会产生一个有效的算法。

大津算法得出了0:1范围上的一个阈值。这个阈值用于图像中出现的像素强度的动态范围。例如，若图像只包含155到255之间的像素强度，大津阈值0.75会映射到灰度阈值230(而不是192，因为图像包含的像素不是0–255全范围的)。

这样，采用大津算法对拍摄的图像进行二值化处理，分别在灰度值0和255下成像，然后经过处理或者最终的图像。

对于拍照的一百分样品的拍照区域同时进行人工区域划分，然后把人工处理的样品上划分的区域与该样品拍照的图形经过二值化处理的照片相比，比较区域划分的一致性，发现，通过拍照处理出来的区域划分准确性与人工区域划分的区域一致性保持为98％的符合度，人工对一百分样品所花费的时间大约为1000分钟时间(平均每一份样品为10分钟)，而拍照处理的划分区域的时间大约为10秒钟时间，每个图片处理的时间是0.1秒钟。

符合度的计算规则是：图像处理划分的范围与人工处理划分的范围的吻合度如果是100％，表示完全吻合，如果图像处理划分的范围与人工的范围吻合度为95％，表示其中有95张照片与人工划分区域重合，仅有5张区域和人工划分的区域不完全重合。不完全重合中，有部分是重合的，有部分是不重合的。

对人工进行区域划分的细胞群落在进行染色处理，染色后的区域与图像处理后划分的区域的符合度为95％。这可能是染色过程引起的误差造成的。

学习

我们将人工划分区域的照片进行拍照，并提取多能干细胞的菌落图像(图2)，同时也提取非多能干细胞的图像(图3)，然后让计算机进行CNN网络进行学习。在学习100轮后我们停止训练。所谓卷积神经网络(Convolutional Neural Networks,CNN)是一类包含卷积计算且具有深度结构的前馈神经网络(Feedforward Neural Networks)。

卷积神经网络在监督学习中使用BP框架进行学习，其计算流程在LeCun(1989)中就已经确定，是最早在BP框架进行学习的深度算法之一。卷积神经网络中的BP分为三部分，即全连接层与卷积核的反向传播和池化层的反向通路(backward pass)。全连接层的BP计算与传统的前馈神经网络相同，卷积层的反向传播是一个与前向传播类似的交叉相关计算：

式中E为代价函数(cost function)计算的误差、f′为激励函数的导数、α

是学习速率(learning rate)，若卷积核的前向传播使用卷积计算，则反向传播也对卷积核翻转以进行卷积运算。卷积神经网络的误差函数可以有多种选择，常见的包括Softmax损失函数(softmax loss)、铰链损失函数(hinge loss)、三重损失函数(tripletloss)等。

池化层在反向传播中没有参数更新，因此只需要根据池化方法将误差分配到特征图的合适位置即可，对极大池化，所有误差会被赋予到极大值所在位置；对均值池化，误差会平均分配到整个池化区域。

卷积神经网络通常使用BP框架内的随机梯度下降(Stochastic GradientDescent,SGD)和其变体，例如Adam算法(Adaptive moment estimation)。SGD在每次迭代中随机选择样本计算梯度，在大量学习样本的情形下有利于信息筛选，在迭代初期能快速收敛，且计算复杂度更小。

通过CNN学习，在计算机里存储了多能干细胞和非多能干细胞的特征和特点，实现自动分析和学习，然后进行其它多能干细胞区域的检测和验证。

验证试验结果：

我们将采用二值化的图片让我们的CNN网络进行自动识别，结果达到95％的准确率，表示采用CNN学习后的模型对采用二值化处理后的图像，可以自动准确的划分多能和非多能干细胞的之间的大致区域，与实际人工划分结果接近。表示我们采用二值化处理的图片获取的多能干细胞区域与CNN网络识别的多能干细胞的符合度或者准确率有95％。

实施例子2：自动识别多能干细胞的方法(图像未提前经过处理)

与上述实施例子1相比，获取的图像没有进行二值化处理，而直接进行与CNN学习的结果进行处理，发现符合度只有60％。表示虽然不经过二值化处理，是能够区分出多能干细胞群落和非多能干细胞群落，但是划分区域并不准确，有些把非多能干细胞当成了多能干细胞，有些是把多能干细胞当成了非多能干细胞，从而造成了很多所谓的假阳性或者假阴性的结果。

同时，与人工的划分区域进行比较，有人工划分区域的符合度仅仅只有50％，所以，采用自动化图像识别多能干细胞区域的时候，进行图像二值化处理可以显著提高多能干细胞区域与非多能干细胞区域划分的准确性，同时也提高了处理的效率，可以进行后续的标准化生产。

在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。

本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。

Claims (10)

1.一种自动识别多能干细胞群的方法，该方法包括：对培养中的干细胞样品进行拍照，获得电子图像照片，其中，对拍得的图像照片首先进行二值化处理后，然后进行计算机图像分析，从而在照片中划分出多能干细胞和非多能干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，所述的二值化的灰度值为0和255。

3.根据权利要求2所述的方法，计算机图像分析方法采用大津二值化算法。

4.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括对于图像处理后，对图像中的多能干细胞和非多能干细胞进行界限的划分。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，对于界限的划分后，定位到对应到所拍照片的干细胞的具体样品上。

6.图像二值化处理在用于区分多能干细胞和非多能干细胞上的用途，其中，在用途中，对培养中的干细胞样品进行拍照，获得电子图像照片，其中，对拍得的图像照片首先进行二值化处理后，然后进行计算机图像分析，从而在照片中划分出多能干细胞和非多能干细胞。

7.根据权利要求6所述的用途，所述的二值化的灰度值为0和255。

8.根据权利要求7所述的用途，计算机图像分析方法采用大津二值化算法。

9.根据权利要求8所述的用途，该方法还包括对于图像处理后，对图像中的多能干细胞和非多能干细胞进行界限的划分。

10.根据权利要求9所述的用途，其中，对于界限的划分后，定位到对应到所拍照片的干细胞的具体样品上。

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