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CN111094984A - 克罗恩氏病患者的粘膜愈合评估方法 - Google Patents

克罗恩氏病患者的粘膜愈合评估方法 Download PDF

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CN111094984A CN201880048991.7A CN201880048991A CN111094984A CN 111094984 A CN111094984 A CN 111094984A CN 201880048991 A CN201880048991 A CN 201880048991A CN 111094984 A CN111094984 A CN 111094984A
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mhi
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V·孔德拉贡塔
M·黑尔
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Prometheus Biosciences Inc
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Abstract

本公开提供用于评估克罗恩氏病患者的粘膜愈合的方法。所述方法包括：检测来自患者的血清样品中分析物的表达水平，并对表达水平应用数学算法，从而产生患者的粘膜愈合指数得分。本公开还提供了试剂盒，其包括两种或更多种结合配偶体，其每种分别能够结合在公开的粘膜愈合评估方法中测量的不同分析物。

Description

克罗恩氏病患者的粘膜愈合评估方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年5月31日提交的美国临时申请号62/512,947和2017年9月21日提交的美国临时申请号62/561,459的优先权，其公开内容出于所有目的通过引用合并于此。
背景技术
克罗恩氏病(Crohn’s disease,CD)在肠切除术后的大多数患者中复发，在手术后1年内 有70-90％的患者在吻合处出现新的病灶。粘膜愈合(MH)通常定义为在可视内窥镜检查中 不存在溃疡，是期望的临床终点，已成为CD的主要治疗目标。然而，回结肠镜检查目前是 评估MH的金标准，但它是一种侵入性且耗时的过程，患者接受度差。这限制了对响应于治 疗的粘膜疾病活动和MH状况进行连续监测的实际可行性。术后疾病复发的非侵入性监测在 此类患者的临床管理中将是有用的，但是由于宏观上受累肠道去除后疾病负担低，这是特别 具有挑战性的。特别是，非侵入性替代检查可以提供一种有吸引力的可选方案，作为内窥镜 检查的辅助或替代方法用于炎性肠病(IBD)患者管理，其中鉴于CD的透壁性和小肠缺乏最 佳内窥镜检可及性，这在CD患者中尤其有用。本公开解决了这个和其他需求并提供了相关 的优点。
发明概述
在一方面，本公开提供了一种用于评估患有克罗恩氏病(CD)的患者的粘膜愈合的方法。 该方法包括提供来自患者的血清样品。该方法进一步包括在血清样品中检测选自以下的两种 或更多种生物标志物中的每一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。该方法进一步包括 将数学算法应用于该两种或更多种生物标志物的表达水平，从而产生患者的粘膜愈合指数 (MHI)得分。在某些方面，MHI得分具有0到100的标度(scale)。
在一些实施方案中，检测包括：使血清样品与针对所述两种或更多种生物标记物中的每 一种的结合配偶体(binding partner)接触，并检测每种生物标记与其各自的结合配偶体之间的 结合。在某些方面，每个结合配偶体是抗体。在一些实施方案中，所述检测包括：测量下组 中的每个生物标志物的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1， MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该方法进一步包括： 当MHI得分小于或等于40时，确定患者有高可能性在缓解中或患有轻度内窥镜疾病。在某 些实施方案中，缓解或患有轻度内窥镜疾病的高可能性为大于或等于92％。在某些方面，缓解对应于克罗恩氏病内镜严重度指数(CDEIS)小于3(CDEIS<3)。在一些实施方案中，轻 度内窥镜疾病对应于3-8之间的CDEIS(CDEIS 3-8)。在某些方面，该方法进一步包括：当 MHI得分大于或等于50时，确定患者有高可能性患有内镜活动性疾病。在某些实施方案中， 患有内镜活动性疾病的高可能性大于或等于87％。在某些方面，内镜活动性疾病对应于CDEIS大于或等于3(CDEIS≥3)。在一些方面，该方法进一步包括：当MHI得分在40和50之间 时，确定患者有中等可能性患有内镜活动性疾病。在一些实施方案中，患有内镜活动性疾病 的中等可能性为大于或等于78％。
在某些方面，数学算法包括将生物标志物的表达水平与内窥镜评分相关联的两个或更多 个模型。在某些实施方案中，两个或更多个模型中的一个或多个通过使用分类和回归树得出， 并且/或者两个或更多个模型中的一个或多个通过使用普通最小二乘回归(Ordinary Least Squares Regression)得出。在某些实施方案中，通过使用分类和回归树得出两个或更多个模型 中的一个或多个，和/或通过使用普通最小二乘回归对诊断灵敏度进行建模来得出两个或更多 个模型中的一个或多个。在某些实施方案中，通过使用分类和回归树得出两个或更多个模型 中的一个或多个，和/或通过使用普通最小二乘回归对诊断特异性进行建模来得出两个或更多 个模型中的一个或多个。在某些实施方案中，通过使用分类和回归树得出两个或更多个模型 中的一个或多个，和/或通过使用普通最小二乘回归对诊断特异性进行建模来得出两个或更多 个模型中的一个或多个。在某些实施方案中，通过使用分类和回归树对诊断特异性进行建模 来得出两个或更多个模型中的一个或多个，和/或通过使用普通最小二乘回归来得出两个或更 多个模型中的一个或多个。在某些实施方案中，通过使用分类和回归树对诊断灵敏度进行建 模来得出两个或更多个模型中的一个或多个，和/或通过使用普通最小二乘回归来得出两个或 更多个模型中的一个或多个。在某些实施方案中，通过使用分类和回归树对诊断特异性进行 建模来得出两个或更多个模型中的一个或多个，和/或通过使用普通最小二乘回归对诊断灵敏 度进行建模来得出两个或更多个模型中的一个或多个。
在某些实施方案中，通过使用随机森林学习分类(random forest learningclassification)得出 两个或更多个模型中的一个或多个，和/或通过使用分位数分类(quantile classification)得出两 个或更多个模型中的一个或多个。在某些实施方案中，通过使用随机森林学习分类对诊断灵 敏度进行建模，得出两个或更多个模型中的一个或多个，和/或通过使用分位数分类得出两个 或更多个模型中的一个或多个。在某些实施方案中，通过使用随机森林学习分类对诊断特异 性进行建模，得出两个或更多个模型中的一个或多个，和/或通过使用分位数分类得出两个或 更多个模型中的一个或多个。在某些实施方案中，通过使用随机森林学习分类得出两个或更 多个模型中的一个或多个，和/或通过使用分位数分类对诊断灵敏度进行建模，得出两个或更 多个模型中的一个或多个。在某些实施方案中，通过使用随机森林学习分类得出两个或更多 个模型中的一个或多个，和/或通过使用分位数分类对诊断特异性进行建模，得出两个或更多 个模型中的一个或多个。在某些实施方案中，通过使用随机森林学习分类对诊断特异性进行 建模，得出两个或更多个模型中的一个或多个，和/或通过使用分位数分类对诊断灵敏度进行 建模，得出两个或更多个模型中的一个或多个。在某些实施方案中，通过使用随机森林学习 分类对诊断特异性进行建模，得出两个或更多个模型中的一个或多个，和/或通过使用分位数 分类对诊断灵敏度进行建模，得出两个或更多个模型中的一个或多个。在某些实施方案中， 通过使用逻辑回归(logistic regression)对诊断灵敏度进行建模，得出两个或更多个模型中的一 个或多个，和/或通过使用逻辑回归对诊断特异性进行建模，得出两个或更多个模型中的一个 或多个。
在某些方面，患者正在接受生物或非生物疗法。在一些实施方案中，该方法通过确定治 疗的功效来评估粘膜愈合。在某些方面，该方法评估患者结肠，回结肠和/或回肠疾病位置处 的粘膜愈合。在某些实施方案中，该方法评估手术后患者的粘膜愈合。在一些实施方案中， 该方法通过鉴定患者的手术后内窥镜复发来评估粘膜愈合。在某些方面，该方法通过预测或 监测患者的粘膜状态来评估粘膜愈合。
在另一方面，本公开提供了一种用于评估患有CD的患者的粘膜愈合的方法。该方法包 括：(a)在患者的血清样品中检测以下生物标志物的表达：Ang1；Ang2；CEACAM1；VCAM1；TGFα；CRP；SAA1；MMP-1；MMP-2；MMP-3；MMP-9；EMMPRIN；和IL-7。 该方法进一步包括：(b)对步骤(a)中生物标志物的表达应用数学算法以产生患者的MHI， 其中MHI为0-100的标度，其中当MHI在0至40之间时，患者在缓解中或患有轻度内窥镜 疾病，其中当MHI在50至100之间时，患者患有内镜活动性疾病。
在一些实施方案中，患者正在接受生物或非生物疗法。在某些方面，该方法通过确定治 疗的功效来评估粘膜愈合。在某些实施方案中，该方法评估患者中结肠，回结肠和/或回肠疾 病位置处的粘膜愈合。在一些方面，该方法通过鉴定患者的手术后内窥镜复发来评估粘膜愈 合。在一些实施方案中，缓解对应于小于3的CDEIS(CDEIS＜3)。在某些方面，轻度内窥镜疾病对应于3-8之间的CDEIS(CDEIS 3-8)。在一些实施方案中，内窥镜活动性疾 病对应于大于或等于3的CDEIS(CDEIS≥3)。在某些方面，该方法通过预测或监测患者的 粘膜状态来评估粘膜愈合。
在另一方面，本公开涉及一种评估施用于患有CD的患者的疗法的功效的方法。该方法 包括提供来自患者的血清样品。该方法进一步包括在血清样品中检测选自下组的两种或更多 种生物标志物中的每一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。该方法还包括将数学算法 应用于该两种或更多种生物标志物的表达水平，从而产生患者的MHI评分。该方法进一步 包括响应于MHI评分来调整治疗。
在一些实施方案中，检测包括：使血清样品与针对两种或更多种生物标志物的每一种的 结合配偶体接触，并检测每种生物标志物与其各自的结合配偶体之间的结合。在某些方面， 每个结合配偶体是抗体。在一些实施方案中，调整包括：当MHI得分在0至100的标度上 小于或等于40时，减少治疗。在某些方面，调整包括：当MHI得分在0至100的标度上大于或等于50时，增加治疗。在某些实施方案中，所述治疗包括一种或多种生物制剂，常规药物，营养补充剂或其组合。
在另一方面，本公开涉及一种在克罗恩氏病患者中检测选自以下的两种或更多种生物标 志物的表达水平的方法：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP- 1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。该方法包括从患者获得血清样品。该 方法进一步包括：通过使血清样品与针对两种或更多种生物标记的每一种的结合配偶体接触 并检测每种生物标记与其各自的结合配偶之间的结合，来检测血清样品中所述两种或更多种 生物标记的每一种的表达水平。在一些实施方案中，每个结合配偶体是抗体。
在另一方面，本发明涉及一种用于评估克罗恩氏病患者的粘膜愈合的方法。该方法包括 从患者获得血清样品。该方法进一步包括：通过使血清样品与针对两种或更多种生物标记的 每一种的结合配偶体接触并检测每种生物标记与其各自的结合配偶之间的结合，来检测血清 样品中所述两种或更多种生物标记的每一种的表达水平。所述两种或更多种生物标志物中的 每一种可以独立地是Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1， MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN或IL-7。该方法还包括将数学算法应用于所述两种 或更多种生物标志物的表达水平，从而产生患者的MHI评分.
在一些实施方案中，每个结合配偶体是抗体。在某些方面，该方法进一步包括：当MHI 得分在0至100的标度上小于或等于40时，确定该患者有高可能性在缓解中或患有轻度内窥 镜疾病。在某些实施方式中，该方法还包括：当MHI评分在0到100的标度上大于或等于50 时，确定患者有高可能性患有内镜活动性疾病。
在另一方面，本公开涉及一种用于评估克罗恩氏病患者中的粘膜愈合和治疗该患者的克 罗恩氏病的方法。该方法包括从患者获得血清样品。该方法进一步包括在血清样品中检测选 自以下的两种或更多种生物标志物中的每一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1， TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。该方法还包括将数学算法应用于所述两种或更多种生物标志物的表达水平，从而产生患者的MHI评分。该方法进一步包括：当MHI得分在0至100的标度上大于或等于50时，诊断患者有高可能 性患有内窥镜活动性疾病。该方法进一步包括：对经诊断的患者施用有效量的治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂包括一种或多种生物制剂，常规药物，营养补充剂或其组合。
在另一方面，本发明涉及一种治疗克罗恩氏病患者的方法。该方法包括：向根据本公开 的方法诊断为具有内窥镜活动性疾病的高可能性的患者，施用有效量的治疗剂。在一些实施 方案中，治疗剂包括一种或多种生物制剂，常规药物，营养补充剂或其组合。
在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包括两种或更多种结合配偶体，所述两种或 更多种结合配偶体中的每一种附接在一个或更多个固体支持物上。所述两种或更多种结合配 偶体中的每一种分别能够结合选自Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7的不同分析物。
在一些实施方案中，两种或更多种结合配偶体的每一种共价附接到一个或更多个固体支 持物。在某些方面，两种或更多种结合配偶体中的每一种附接到不同的固体支持物。在一 些实施方案中，试剂盒进一步包括用于使一种或多种固体支持物与来自患者的血清样品接触 的说明书。说明书还可以用于检测血清样品中与所述一个或多个结合配偶体结合的每种分析 物的表达水平。该说明书可以进一步用于将数学算法应用于分析物的表达水平，从而产生患 者的MHI评分。在某些方面，MHI得分具有0到100的标度。
在一些实施方案中，说明书还可以用于：当MHI得分小于或等于40时，确定患者有高 可能性在缓解中或患有轻度内窥镜疾病。在某些实施方案中，缓解或患有轻度内窥镜疾病的 高可能性为大于或等于92％。在某些实施方案中，缓解对应于小于3的CDEIS(CDEIS<3)。 在一些方面，轻度内窥镜疾病对应于3-8之间的CDEIS(CDEIS 3-8)。在某些方面，该说明 书还可用于：当MHI得分大于或等于50时，确定患者有高可能性患有内镜活动性疾病。在一些实施方案中，患有内镜活动性疾病的高可能性为大于或等于87％。在某些方面，内镜活动性疾病对应大于或等于3的CDEIS(CDEIS≥3)。在某些实施方案中，该说明书还可以用于：当MHI得分在40和50之间时，确定患者有中等可能性患有内镜活动性疾病。在某些方面，患有内镜活动性疾病的中等可能性为大于或等于至78％。
在一些实施方式中，患者正在接受生物或非生物疗法。在某些方面，该试剂盒通过确定 治疗的功效来评估粘膜愈合。在某些实施方案中，试剂盒评估患者的结肠，回结肠和/或回肠 疾病位置处的粘膜愈合。在某些方面，该试剂盒评估手术后患者的粘膜愈合。在一些实施 方案中，该试剂盒通过鉴定患者的手术后内窥镜复发来评估粘膜愈合。在某些方面，该试剂 盒通过预测或监测患者的粘膜状态来评估粘膜愈合。
根据以下详细描述和附图，本公开的其他目的，特征和优点对于本领域技术人员将是显 而易见的。
附图简述
图1显示，用于粘膜愈合(MH)检测的标志物选择是一个迭代过程，涉及将标志物表达 与可视化内镜疾病严重程度相关联。考虑了来自多个信号通路的标志物。最终模型包括13个 标志物，代表了已知参与粘膜稳态维持的6个广泛生物学类别。注意，最终模型包括的标志 物不仅限于炎症标志物。Ang1,2，血管紧张素1，2；TGFα，转化生长因子α；MMP 1，2，3 &9，基质金属蛋白酶1，2，3，&9；EMMPRIN，细胞外基质金属蛋白酶诱导物；VCAM， 血管细胞粘附分子；CEACAM，癌胚抗原相关细胞粘附分子；IL-7，白介素7；CRP，C反 应蛋白；SAA1，血清淀粉样蛋白A1。
图2A-2D显示了MHI的开发和验证。观察到与粘膜疾病活性的内窥镜评估的90％一致 性。图2A：将396名CD患者的血清样本分为训练组(队列1-4)和验证组(队列5)。使 用多个逻辑回归方程来形成针对内镜疾病活性的13种生物标记物模型，称为MHI，并在独 立的纵向队列中验证。图2B：MHI 0-40和MHI 50-100得分范围的描述。显示了在整个验证 队列(图2C)中以及根据疾病位置(图2D)的MHI诊断性能。
图3A-3C显示，来自验证队列的代表性病例研究，证明了MHI作为监测工具的实用性。 MHI可以监测克罗恩氏病患者的粘膜健康状况。图3A：病例研究#1；图3B：病例研究#2；图3C：病例研究#3。
图4显示，粘膜愈合检测标志物。Ang1,2，血管紧张素1、2；TGFα，转化生长因子α；MMP 1，2，3&9，基质金属蛋白酶1，2，3，&9；EMMPRIN，细胞外基质金属蛋白酶诱导 物；VCAM，血管细胞粘附分子；CEACAM，癌胚抗原相关细胞粘附分子；IL-7，白介素 7；CRP，C反应蛋白；SAA1，血清淀粉样蛋白A1。
图5显示，MHI和测试性能。不管治疗选项，MH检查都具有高的准确性。
图6显示，MHI评分和内镜疾病严重程度。MH指数随内镜疾病活性而增加。
图7显示，TAILORIX研究中CDEIS得分vs.SES-CD得分。内镜疾病严重程度分组在CDEIS和SES-CD指数之间不匹配。在TAILORIX临床试验中，同时从相同患者采集了集中 读取的CDEIS和SES-CD得分。与先前的报道(Daperno等，胃肠内窥镜检查(2004)60(4)： 505-512；Sipponen等，内镜评价克罗恩氏病活性:比较CDEIS和SES-CD,Inflamm Bowel Dis，2010，16：2131-2136)一致，这两个分数表现出总体相关性为92％(Pearson r＝0.92)。然而，根据CDEIS和SES-CD得分的标准定义，41％(170/411)的内镜疾病严重程度分组在CDEIS和SES-CD之间不吻合(由彩色阴影区域表示)。使用CDEIS被认为具有内镜缓解的33％(58/175)样品，通过SES-CD表明患有活动性疾病(图8A)。
图8A-8B示出，CDEIS和SES-CD评分标化前后的列联表。即使在标化之后，CDEIS和SES-CD的内镜疾病严重程度分组之间的一致性也仅提高到80％。图8A：在调整之前，CDEIS和SES-CD疾病严重程度分组之间的一致性为59％(241/411)。图8B：应用线性回归方程 后CDEIS和SES-CD疾病严重程度分组之间的一致性增加到80％(328/411)。2个表中的椭 圆区域表示一致的样本。右侧的表显示了用于将SES-CD分数转换为CDEIS的线性回归方 程。
发明详述
I.介绍
一般地，本文提供了用于CD患者的非侵入性和准确血清学诊断检查的方法和试剂盒。 已经惊奇地并且有利地发现，所开发的该基于蛋白质组学的检查是用于评估CD患者的肠粘 膜状况的有效替代方案。可以使用该诊断检查而不管所使用的治疗类型如何，并且可以通过 以良好的准确性预测内镜外观和MH来满足日常临床患者管理的需求。所提供的方法和试剂 盒涉及基于血清的多分析物MH算法，该算法整合了一系列生物标志物，这些标志物与维持 CD患者粘膜稳态重要的生物途径相关。使用这些算法，已经开发出一种基于外周血的检查， 可以用作通过回结肠镜检评估CD患者粘膜内镜活动的一种非侵入性替代方法。将该检查纳 入当前实践可以帮助CD患者的管理，并有助于在达标治疗模式中确定疗效。以这种方式， 所提供的方法和试剂盒可以有利地改善与患者有关的结果和对处方疗法的依从性。
II.定义
如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有赋予它们的含义。
如本文所用，术语“粘膜愈合”是指，先前的发炎区域恢复正常的粘膜外观，并且在内窥 镜和显微镜水平上完全或基本上不存在溃疡和炎症。粘膜愈合包括粘膜、粘膜下层和肌层的 修复和恢复。粘膜愈合还可以包括肠壁的神经元和淋巴管生成元件。
如本文所用，术语“粘膜愈合指数”和“MHI”是指经验得出的指数，其根据相关生物标志 物的分析而得出。一方面，通过驻留在计算机上的算法，将测得的生物标志物浓度转化为该 指数。在某些方面，该指数是合成的或来自人的输出、得分或截断值，其以数值形式表达生 物学数据。该指数可用于确定或做出或帮助做出临床决定。粘膜愈合指数可以在一段时间内 多次测量。一方面，可以用已知样本训练算法，然后用已知身份的样本进行验证。
本文所用的术语“标志物”和“生物标志物”包括可以在样品中测量的任何生化标志物，血 清学标志物，蛋白质标志物，遗传标志物，分析物，和/或其他临床的或回波描记的特征。在 某些实施方案中，标记物可用于在来自患有疾病的个体的样品中检测粘膜愈合，所述疾病为 例如IBD包括CD和溃疡性结肠炎。
如本文所用，术语“分析物”包括其存在、量和/或身份被确定的任何目的分子，通常是大 分子，例如多肽。在某些情况下，分析物，单独或与一种或多种其他分析物组合，是疾病状 态的标志物。
如本文所用，术语“样品”包括获自受试者或患者的任何生物学样本。样品包括但不限于 全血，血浆，血清，红细胞，白细胞(例如外周血单核细胞(PBMC)，多形核(PMN)细胞)，导管灌洗液，乳头抽吸液，淋巴(例如淋巴结的播散肿瘤细胞)，骨髓抽吸液，唾液， 尿液，粪(即粪便)，痰，支气管灌洗液，眼泪，细针抽吸液(例如，通过随机的乳晕周围细 针抽吸采集)，任何其他体液，组织样品，例如炎症部位的活检物(例如，针活检物)及其细 胞提取物。
如本文所用，术语“受试者”，“患者”或“个体”是指人类，但也指其他动物，包括例如其他 灵长类动物，啮齿动物，犬科动物，猫科动物，马科动物，绵羊，猪等等。
本文所使用的术语“统计学分析”，“统计学算法”和“统计学过程”包括，用于确定变量之间 的关系的各种方法和模型中的任何一种。
III.示例性实施方案的描述
在一个实施方案中，公开了一种用于评估CD患者的粘膜愈合的方法。该方法包括提供 来自患者的样品。在一些实施方案中，样品是血清样品。该方法进一步包括在样品中检测生 物标志物的表达水平，其中所述生物标志物与本领域通常已知的对CD患者中粘膜体内稳态 的维持重要的生物途径有关。在一些实施方案中，生物标志物包括一种或多种血管生成素， 例如Ang1或Ang2。在一些实施方案中，生物标志物包括一种或多种粘附蛋白，例如 CEACAM1或VCAM1。在一些实施方案中，生物标志物包括一种或多种生长因子，例如TGFα。在一些实施方案中，生物标志物包括一种或多种炎症反应蛋白，例如CRP。在一些实施方案中，生物标志物包括一种或多种载脂蛋白，例如SAA1。在一些实施方案中，生物标志物包括一种或多种基质金属蛋白酶和相关诱导物，例如MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9或 EMMPRIN。在一些实施方案中，生物标志物包括一种或多种细胞因子，例如IL-7。
在某些方面，该方法包括在血清样品中检测选自以下的两种或更多种生物标志物中的每 一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1， MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。所述两种或更多种生物标志物可以包括例 如Ang1和Ang2，Ang1和CEACAM1，Ang1和VCAM1，Ang1和TGFα，Ang1和CRP， Ang1和SAA1，Ang1和MMP-1，Ang1和MMP-2，Ang1和MMP-3，Ang1和MMP-9， Ang1和EMMPRIN，或Ang1和IL-7。两种或更多种生物标志物可以包括Ang2和CEACAM1， Ang2和VCAM1，Ang2和TGFα，Ang2和CRP，Ang2和SAA1，Ang2和MMP-1，Ang2和 MMP-2，Ang2和MMP-3，Ang2和MMP-9，Ang2和EMMPRIN，或Ang2和IL-7。两种 或更多种生物标志物可以包括CEACAM1和VCAM1，CEACAM1和TGFα，CEACAM1和 CRP，CEACAM1和SAA1，CEACAM1和MMP-1，CEACAM1和MMP-2，CEACAM1和 MMP-3，CEACAM1和MMP-9，CEACAM1和EMMPRIN，或CEACAM1和IL-7。两种或 更多种生物标记可以包括VCAM1和TGFα，VCAM1和CRP，VCAM1和SAA1，VCAM1 和MMP-1，VCAM1和MMP-2，VCAM1和MMP-3，VCAM1和MMP-9，VCAM1和EMMPRIN，或VCAM1和IL-7。两种或更多种生物标志物可以包括TGFα和CRP，TGFα 和SAA1，TGFα和MMP-1，TGFα和MMP-2，TGFα和MMP-3，TGFα和MMP-9，TGFα 和EMMPRIN，或TGFα和IL-7。两种或更多种生物标志物可以包括CRP和SAA1，CRP和 MMP-1，CRP和MMP-2，CRP和MMP-3，CRP和MMP-9，CRP和EMMPRIN，或CRP和 IL-7。两种或更多种生物标志物可以包括SAA1和MMP-1，SAA1和MMP-2，SAA1和 MMP-3，SAA1和MMP-9，SAA1和EMMPRIN，或SAA1和IL-7。两种或更多种生物标志 物可以包括MMP-1和MMP-2，MMP-1和MMP-3，MMP-1和MMP-9，MMP-1和EMMPRIN， 或MMP-1和IL-7。两种或更多种生物标志物可以包括MMP-2和MMP-3，MMP-2和MMP- 9，MMP-2和EMMPRIN，或MMP-2和IL-7。两种或更多种生物标志物可以包括MMP-3和 MMP-9，MMP-3和EMMPRIN，或MMP-3和IL-7。两种或更多种生物标志物可以包括 MMP-9和EMMPRIN，或MMP-9和IL-7。两种或更多种生物标志物可以包括EMMPRIN和 IL-7。
在某些方面，该方法包括在血清样品中检测选自以下的三种或更多种生物标记物中的每 一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1， MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该方法包括在血清样品中检 测选自以下的四种或更多种生物标记物中的每一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1， VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。 在某些方面，该方法包括在血清样品中检测选自以下的五种或更多种生物标记物中的每一种 的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2， MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该方法包括在血清样品中检测选自以下 的六种或更多种生物标记物中的每一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1， TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方 面，该方法包括在血清样品中检测选自以下的七种或更多种生物标记物中的每一种的表达水 平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3， MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该方法包括在血清样品中检测选自以下的八种或 更多种生物标记物中的每一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα， CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该方 法包括在血清样品中检测选自以下的九种或更多种生物标记物中的每一种的表达水平：Ang1， Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9， EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该方法包括在血清样品中检测选自以下的10种或更多种 生物标记物中的每一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP， SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该方法包括 在血清样品中检测选自以下的11种或更多种生物标记物中的每一种的表达水平：Ang1， Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该方法包括在血清样品中检测选自以下的12种或更多种 生物标记物中的每一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP， SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该方法包括 在血清样品中检测以下生物标记物中的每一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1， VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。 在某些方面，该方法包括在血清样品中检测一种或多种其他生物标记，所述其它生物标记物 在本领域中通常已知与CD患者中对粘膜稳态的维持重要的生物途径有关。
在某些方面，一种或多种生物标志物或分析物的表达水平通过mRNA表达来量度，其中 使用测定试验例如杂交测定或基于扩增的测定。在一些实施方案中，一种或多种生物标志物 或分析物的表达水平通过蛋白质表达来量度，其中使用例如免疫测定法(例如，酶联免疫吸 附测定法(ELISA)或协同酶增强反应性免疫测定法(CEER))，均相迁移率变动试验(HMSA) 或免疫组织化学测定试验。用于确定血清、血浆、唾液或尿液样品中生长因子、炎性标志物 或抗炎标志物的存在或水平的合适ELISA试剂盒，可从例如Antigenix AmericaInc.(Huntington Station,NY),Promega(Madison,WI),R&D Systems,Inc.(Minneapolis,MN),Invitrogen (Camarillo,CA),CHEMICON International,Inc.(Temecula,CA),NeogenCorp.(Lexington,KY), PeproTech(Rocky Hill,NJ),Alpco Diagnostics(Salem,NH),Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford, IL),和/或Abazyme(Needham,MA)获得。在以下专利文献中描述了CEER，出于所有目的将 其全文引入作为参考：国际专利申请公开号WO2008/036802，WO 2009/012140， WO2009/108637，WO 2010/132723，WO 2011/008990，WO2011/050069，WO 2012/088337， WO 2012/119113和WO 2013/033623。
提供的方法还包括将数学算法应用于生物标志物的表达水平，从而产生患者的粘膜愈合 指数(MHI)得分。在一些实施方案中，MHI得分的标度为0至100。在某些方面，数学算法包括一个或多个公式，其将生物标志物的测量表达水平与内窥镜评分指数相关联。该数学 算法可以包括例如两个或更多个公式，三个或更多个公式，四个或更多个公式，五个或更多 个公式，六个或更多个公式，七个或更多个公式，八个或更多个公式，九个或更多个公式， 或者十个或更多公式。这些公式可以涉及生物标志物表达水平的原始数据，或者涉及表达水 平的转化数据。在一些实施方案中，公式涉及生物标志物表达水平的自然对数。
生物标志物表达水平可以与内镜评分指数例如克罗恩氏病内镜严重度指数(CDEIS)或 克罗恩氏病简化内镜评分(SES-CD)相关联。CDEIS和SES-CD两者都是公认的内镜评分 指标，常规作为标准用于评估CD患者粘膜疾病状态、对粘膜状况进行评分、和确定以粘膜 愈合为终点的临床试验的结果。在某些方面，数学算法的公式将测量的患者生物标志物表达 水平与预测的患者CDEIS相关联。在某些方面，公式将测量的患者生物标志物表达水平与预 测的患者SES-CD相关联。在一些实施方案中，CDEIS值转换为SES-CD值。在一些实施方 案中，SES-CD值转换为CDEIS值。尽管CDEIS和SES-CD之间的线性偏移已被广泛接受， 但是提供的方法可以使用各种统计学过程将一个指数的分数转换为另一个指数。
生物标志物表达水平与内镜评分指数、粘膜愈合指数和诊断预测之间的关系，可以通过 多种统计学过程或统计学分析技术中的任一种来推导。在一些实施方案中，使用逻辑回归来 推导数学算法的一个或多个公式。在一些实施方案中，使用线性回归来推导算法的一个或多 个公式。在一些实施方案中，使用普通最小二乘回归或非条件逻辑回归(unconditional logistic regression)来推导算法的一个或多个公式。
在一些实施方案中，统计学分析包括一种或多种生物标志物的分位数测量。分位数是一 组“分割点”，它们将数据样本分为包含(尽可能)相等数量的观察值的组。例如，四分位数是 将数据样本分为包含(尽可能)相等数量的观察值的四个组的值。下四分位数是在排序的数 据集中向上排在四分之一的数据值；上四分位数是在排序的数据集中向下排在四分之一的数 据值。五分位数是将数据样本分为包含(尽可能)相等数量的观察值的五个组的值。该算法 还可以包括使用标志物水平的百分位数范围(例如，三分位数，四分位数，五分位数等)、 或它们的累积指数(例如，标志物水平的四分位数总和，以获得四分位数总分(QSS)等)作 为统计学分析中的变量(与连续变量一样)。
在一些实施方案中，统计学分析包括一个或多个学习统计分类器系统。如本文所使用的， 术语“学习统计分类器系统”包括，能够适应复杂数据集(例如，感兴趣的一组标志物)并基于 这样的数据集做出决策的机器学习算法技术。在一些实施方案中，使用单个学习统计分类器 系统，例如决策/分类树(例如，随机森林(RF)或分类和回归树(C&RT))。在一些实施 方案中，使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个学习统计分类器系统的组合，优选地串联地使用。学习统计分类器系统的示例包括但不限于，使用归纳学习(例如，决策/分类树，例如RF，C&RT，提升树(boosted tree)等)，概率近似正确学习(PAC)学习，联结学习(connectionist learning)(例如，神经网络(NN)，人工神经网络(ANN)，神经模糊网络(NFN)， 网络结构，Cox比例风险模型(CPHM)，感知器(例如多层感知器，多层前馈网络，神经网 络的应用，贝叶斯信念网络学习等)，强化学习(reinforcement learning)(例如，在已知环境中 的被动学习诸如朴素学习(
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learning)，自适应动态学习和时间差异学习(temporal difference learning)等，在未知环境中的被动学习，在未知的环境中的主动学习，学习动作-价值函数， 强化学习的应用等)，以及遗传算法和进化规划(evolutionaryprogramming)。其他学习统计分 类器系统包括支持向量机(例如内核方法)，多元自适应回归样条(multivariate adaptive regression splines,MARS)，Levenberg-Marquardt算法，Gauss-Newton算法，高斯混合算法， 梯度下降算法(gradient descent algorithms),和学习矢量量化(LVQ)。
随机森林是学习统计分类器系统，该系统使用由Leo Breiman和Adele Cutler开发的算法 构建。随机森林使用大数量的单个决策树，并通过选择由单个树确定的分类的模式(即最频 繁出现)来决定分类。可以例如使用可从Salford Systems(加利福尼亚州圣地亚哥)获得的RandomForests软件来执行随机森林分析。参见例如Breiman，MachineLearning，45：5-32 (2001)；和http://stat-www.berkeley.edu/users/breiman/RandomForests/cc_home.htm，以获取有 关随机森林的描述。
分类和回归树代表了拟合经典回归模型的计算机密集型替代方案，并且典型地基于一个 或多个预测器用于确定感兴趣的分类反应或连续反应的最佳可能模型。可以例如，使用可获 自Salford Systems的C&RT软件或可获自StatSoft，Inc.(Tulsa,OK)的Statistica数据分析 软件，进行分类和回归树分析。分类和回归树的描述可以参见例如，Breiman等“Classification and Regression Trees,”Chapman and Hall,New York(1984)；和Steinberg等,“CART:Tree- Structured Non-Parametric Data Analysis,”Salford Systems,San Diego,(1995)。
神经网络是人工神经元的互连组，其基于联结主义方法(connectionistapproach)计算，使 用数学或计算模型用于信息加工。典型地，神经网络是自适应系统，会根据流过网络的外部 或内部信息来更改其结构。神经网络的具体示例包括前馈神经网络，例如感知器，单层感知 器，多层感知器，反向传播网络，ADALINE网络，MADALINE网络，Learnmatrix网络，径 向基函数(RBF)网络，以及自组织地图或Kohonen自组织网络；递归神经网络(recurrent neural network)，例如简单递归网络和Hopfield网络；随机神经网络(stochastic neural network)，例如 玻尔兹曼机；模块化神经网络，例如委员会机器(committee of machines)和联想神经网络 (associative neural network)；以及其他类型的网络，例如即时训练的神经网络，脉冲神经网络， 动态神经网络和级联神经网络。可以使用例如可以从StatSoft，Inc获得的Statistica数据分析 软件来执行神经网络分析。神经网络描述可以参见，例如，Freeman等,“Neural Networks: Algorithms,Applicationsand Programming Techniques,”Addison-Wesley Publishing Company (1991)；Zadeh,Information and Control,8:338-353(1965)；Zadeh,“IEEE Trans.on Systems,Man andCybernetics,”3:28-44(1973)；Gersho等,“Vector Quantization and SignalCompression,” Kluywer Academic Publishers,Boston,Dordrecht,London(1992)；和Hassoun,“Fundamentals of Artificial Neural Networks,”MIT Press,Cambridge,Massachusetts,London(1995)。
支持向量机是用于分类和回归的一组相关的监督学习技术，并且描述在例如Cristianini 等,“An Introduction to Support Vector Machines and Other Kernel-Based Learning Methods,” Cambridge University Press(2000)。支持向量机分析可以例如使用Thorsten Joachims(康奈尔 大学)开发的SVMlight软件或使用Chih-Chung Chang和Chih-Jen Lin(台湾大学)开发的 LIBSVM软件进行。
本文所述的各种统计方法和模型可以使用来自健康，IBD或非IBD个体的队列样品(例 如血清学样品)来训练和检查。可以使用例如来自一项或多项横断面研究(cross-sectional studies)的临床数据来训练数学算法的公式，所述研究例如是在每个调查时间点包括不同患者 样品的研究。可以使用来自一项或多项纵向研究(longitudinalstudies)的临床数据来训练数学算 法的公式，所述研究为例如在多个调查时间点上包括相同患者样本的研究。在某些方面，使 用横断面数据训练数学算法的一个或多个公式，并且使用纵向数据训练数学算法的一个或多 个公式。可以使用例如来自一项或多项横断面研究的临床数据，来验证数学算法的公式。可 以使用来自一项或多项纵向研究的临床数据来验证数学算法的公式。在某些方面，使用横断 面数据来验证数学算法的一个或多个公式，并且使用纵向数据来验证数学算法的一个或多个 公式。
在某些方面，推导数学算法的一个或多个公式以对诊断灵敏度(例如，被正确地识别出的 真阳性的比例)建模。例如，可以使用数据来训练一个或多个公式，以利用测量的生物标志物 表达水平预测活动性疾病诊断与缓解诊断。在某些方面，推导数学算法的一个或多个公式,以 对诊断特异性(例如，被正确地识别出的真阴性的比例)进行建模。例如，可以使用数据来训 练一个或多个公式，以利用测量的生物标志物表达水平预测轻度疾病或缓解诊断与重度疾病 或中度疾病诊断。在一些实施方案中，数学算法包括两个或更多个公式，其中一个或多个公 式被推导出来以对诊断灵敏度建模，且其中一个或多个公式被推导出来以对诊断特异性建模。 在某些方面，数学算法顺序地在应用一个或多个诊断特异性公式前应用一个或多个诊断灵敏 度公式以产生MHI分数或值。在某些方面，数学算法按顺序地在应用一个或多个诊断灵敏度 公式前应用一个或多个诊断特异性公式以产生MHI得分或值。
在某些方面，该方法进一步包括：当MHI得分小于或等于40时，确定患者具有高可能 性在缓解中或患有轻度内窥镜疾病。在一些实施方案中，缓解的诊断对应于小于3的CDEIS。 在一些实施方案中，轻度内窥镜疾病的诊断对应于3到8之间的CDEIS。MHI得分小于或等 于40的患者在缓解中或患有轻度内窥镜疾病(例如，CDEIS小于8)的高可能性，可以介于 例如83％和98％之间，例如介于83％和92％之间，介于84.5％和93.5％之间，介于86％和 95％之间，介于87.5％和96.5％之间，或介于89％和98％之间。就下限而言，MHI得分小于 或等于40的患者在缓解中或患有轻度内窥镜疾病的高可能性，可以大于或等于83％，例如 大于或等于84.5％，大于或等于86％，大于或等于87.5％，大于或等于89％，大于或等于90.5％，大于或等于92％，大于或等于93.5％，大于或等于95％，或大于或等于96.5％。也考虑更高的可能性，例如大于或等于98％。
在某些方面，该方法还包括：当MHI得分大于或等于50时，确定该患者有高可能性患 有内镜活动性疾病。在一些实施方案中，内镜活动性疾病的诊断对应于CDEIS大于或等于3。 MHI评分大于或等于50的患者患有内镜活动性疾病的高可能性，可以是，例如，在80％至 95％之间，例如在80％至89％之间，81.5％至90.5％，83％至92％，84.5％至93.5％，或86％至95％。就下限而言，MHI得分大于或等于50的患者患有内镜活动性疾病的高可能性，可以大于或等于80％，例如，大于或等于81.5％，大于或等于至83％，大于或等于84.5％，大于或等于86％，大于或等于87.5％，大于或等于89％，大于或等于90.5％，大于或等于92％，或大于或等于93.5％。也考虑更高的可能性，例如大于或等于95％。
在某些方面，该方法还包括：当MHI得分在40至50之间时，确定该患者具有中等可能 性患有内镜活动性疾病。MHI得分在40至50之间的患者具有内镜活动性疾病的中等可能性， 可以例如在70％至85％之间，例如在70％至79％之间，在71.5％至80.5％之间，在73％至 82％之间，在74.5％至83.5％之间，或在76％至85％之间。就下限而言，MHI评分在40到50之间的患者具有内镜活动性疾病的中度可能性，可以大于或等于70％，例如，大于或等于71.5％，大于或等于73％，大于或等于74.5％，大于或等于76％，大于或等于77.5％，大于或等于79％，大于或等于80.5％，大于或等于82％，或大于或等于83.5％。也考虑更高的可能性，例如大于或等于85％。
所公开的方法提供了非侵入性工具，可以用于预测患者，诸如接受生物或非生物疗法的 患者中的粘膜愈合的可能性和/或监测粘膜愈合。另外，本公开提供了基于受试者的粘膜愈合 的进展来确定或评估治疗的功效、和预测患者的治疗反应，复发风险和手术风险的方法。特 别地，本公开的方法可以应用于选择用于持续治疗的疗法，用于确定何时或如何调整或改变 (例如，增加或减少)后续治疗剂剂量以优化治疗功效和/或降低毒性，以及/或用于确定何时 或如何更改当前疗法(例如，切换至其他药物或靶向不同机制的药物)。所公开的方法还可 以用于评估患者结肠、回结肠和/或回肠疾病位置处的粘膜愈合，以及用于评估手术后患者中 的粘膜愈合，例如通过鉴定患者的手术后内镜复发来评估。
治疗可以包括根据需要与合适的药物赋形剂一起给予治疗剂，并且可以通过任何可接受 的施用方式进行。用于所公开方法的合适治疗剂包括但不限于生物制剂，例如抗体，常规药 物，营养补充剂及其组合。施用可以是例如静脉内，局部，皮下，经皮，透皮，肌内，口服， 颊，舌下，齿龈，腭面，关节内，肠胃外，小动脉内，皮内，心室内，颅内，腹膜内，病变 内，鼻内，直肠，阴道，或通过吸入。一种治疗剂可以在第二药物(例如第二治疗剂，可用于 减少第一治疗剂的副作用的药物)同时、仅之前、或仅之后施用。
可以重复施用治疗有效量的治疗剂，例如至少2、3、4、5、6、7、8或更多次，或者可以通过连续输注来施用剂量。剂量可以采取固体，半固体，冻干粉剂或液体剂型的形式，例如片剂，丸剂，微丸，胶囊剂，粉末，溶液剂，混悬剂，乳剂，栓剂，灌肠剂，乳膏剂，软膏 剂，洗剂，凝胶剂，气雾剂，泡沫剂等，优选以适合简单给药精确剂量的单位剂型。
可以以适合于人类受试者和其他哺乳动物的单位剂量的物理离散单位，施用治疗剂，每 个单位包含预定量的治疗剂，所述预定量的治疗剂经计算可产生所需的作用、耐受性和/或治 疗效果，与合适的药物赋形剂结合(例如安瓿)。另外，可以制备更浓缩的剂型，然后可以 从中制备较稀释的单位剂型。因此，更浓缩的剂型将包含基本上大于，例如至少1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10或更多倍于，治疗剂的量。
制备此类剂型的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences,18th Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990))。剂型通常包括常规的药物载体或 赋形剂，并且可以另外包括其他药物，载体，助剂，稀释剂，组织渗透促进剂，增溶剂等。可 以通过本领域公知的方法，对合适的赋形剂进行调整以适应特定的剂型和给药途径(参见， 例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，同上引文)。
合适的赋形剂的实例包括但不限于乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，淀粉，阿 拉伯胶，磷酸钙，藻酸盐，黄蓍胶，明胶，硅酸钙，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，水，盐水，糖浆，甲基纤维素，乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，和聚丙烯酸，例如Carbopols，例如Carbopol 941，Carbopol 980，Carbopol 981等。剂型还可以包括润滑剂，例如滑石，硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，例如甲基，乙基和丙基-羟基苯甲酸酯(即对羟基苯甲酸酯)；pH调节剂，例如无机和有机酸和碱；甜味剂；和调味剂。剂型还 可以包含可生物降解的聚合物珠，葡聚糖和环糊精包合物。
对于口服给药，治疗有效剂量可以是片剂，胶囊剂，乳剂，混悬剂，溶液剂，糖浆剂，喷 雾剂，锭剂，粉剂和缓释制剂的形式。口服给药的合适赋形剂包括药用级的甘露醇，乳糖， 淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石粉，纤维素，葡萄糖，明胶，蔗糖，碳酸镁等。
在一些实施方案中，治疗有效剂量采取丸剂，片剂或胶囊剂的形式，因此，剂型可以包 含治疗剂和以下任意一种：稀释剂，例如乳糖，蔗糖，磷酸氢钙等；崩解剂，例如淀粉或其 衍生物；润滑剂，例如硬脂酸镁等；粘合剂，例如淀粉，阿拉伯树胶，聚乙烯吡咯烷酮，明胶，纤维素及其衍生物。还可以将治疗剂配制成栓剂，所述栓剂例如置于聚乙二醇(PEG)载体中。
液体剂型可以通过将治疗剂和任选地一种或多种药学上可接受的助剂溶解或分散在载体 中来制备，所述载体例如为盐水(例如0.9％w/v氯化钠)，葡萄糖水溶液，甘油，乙醇等， 以形成溶液或混悬液，例如用于口服，局部或静脉内给药。治疗剂也可配制成保留灌肠剂。
对于局部给药，治疗有效剂量可以是乳剂，洗剂，凝胶，泡沫，乳膏，胶冻，溶液，悬浮 液，软膏和透皮贴剂的形式。为了通过吸入给药，治疗剂可以通过雾化器以干燥粉末或液体 形式递送。对于肠胃外给药，治疗有效剂量可以是无菌注射溶液和无菌包装粉末的形式。优 选地，可注射溶液在约4.5至约7.5的pH下配制。
治疗有效剂量也可以冻干形式提供。这样的剂型可以包括用于在给药前重构的缓冲剂， 例如碳酸氢盐，或者该缓冲剂可以被包括在冻干剂型中以便用例如水重构。冻干剂型可进一 步包含合适的血管收缩剂，例如肾上腺素。冻干剂型可以在注射器中提供，任选地与缓冲液 一起包装以用于重构，这样重构的剂型可以立即施用于个体。
如本文所用，术语“治疗剂”包括，可用于治疗与CD相关的一种或多种症状的药物的所 有药学上可接受的形式。例如，治疗剂可以是外消旋或异构体混合物，结合到离子交换树脂 上的固体复合物等。另外，治疗剂可以是溶剂化形式。该术语还意图包括所描述的治疗剂的 所有药学上可接受的盐，衍生物和类似物，以及它们的组合。例如，治疗剂的药学上可接受 的盐包括但不限于，其酒石酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，酒石酸氢盐，二盐酸盐，水杨酸盐， 半琥珀酸盐，柠檬酸盐，马来酸盐，盐酸盐，氨基甲酸盐，硫酸盐，硝酸盐和苯甲酸盐的形 式，以及它们的组合等。任何形式的治疗剂均适用于本发明的方法，例如，治疗剂的药学上 可接受的盐，治疗剂的游离碱，或其混合物。
生物制剂包括例如抗细胞因子和趋化因子抗体，例如抗肿瘤坏死因子α(TNFα)抗体。 抗TNFα抗体的非限制性实例包括：嵌合单克隆抗体，例如英夫利昔单抗(Centocor，Inc.； Horsham，PA)，它是嵌合IgG1抗TNFα单克隆抗体；人源化单克隆抗体，例如CDP571和PEG化CDP870；完全人单克隆抗体，例如adalimumab
Figure BDA0002377108150000161
(Abbott Laboratories；Abbott Park，IL)；p75融合蛋白，例如etanercept
Figure BDA0002377108150000162
(Amgen；Thousand Oaks,CA；Wyeth Pharmaceuticals Inc.；Collegeville,PA)；小分子(例如MAP激酶抑制剂)；及其组合。参见，Ghosh,Novartis Found Symp.,263:193-205(2004)。
其他生物制剂包括，例如，抗细胞粘附抗体，例如那他珠单抗
Figure BDA0002377108150000163
(ElanPharmaceuticals,Inc.；Dublin,Ireland；Biogen Idec；Cambridge,MA)，其是针对细胞粘附分子α4- 整联蛋白的人源化单克隆抗体；MLN-02(Millennium Pharmaceuticals；Cambridge，MA)，其 是人源化IgG1抗α4β7-整联蛋白单克隆抗体；抗T细胞药；抗CD3抗体，例如visilizumab
Figure BDA0002377108150000164
(PDL BioPharma；Incline Village,NV)，其是人源化IgG2M3抗CD3单克隆抗体； 抗CD4抗体，例如priliximab(cM-T412)(Centocor，Inc.；Horsham，PA)，其是嵌合的抗 CD4单克隆抗体；抗IL-2受体α(CD25)抗体，例如daclizumab
Figure BDA0002377108150000165
(PDLBioPharma； Incline Village，NV；Roche；Nutley，NJ)，其是一种人源化IgG1抗CD25单克隆抗体； basiliximab
Figure BDA0002377108150000166
(Novartis；瑞士巴塞尔)，其是一种嵌合IgG1抗CD25单克隆抗 体；vedolizumab
Figure BDA0002377108150000167
(Millennium Pharmaceuticals)，其是一种针对整合素α4β7的 人源化抗体；ustekinumab
Figure BDA0002377108150000168
(Centocor)，其是针对IL-12和IL-23的人源化抗体； 及其组合。
常规药物的实例包括但不限于，氨基水杨酸盐(例如，美沙拉嗪，柳氮磺吡啶等)，皮 质类固醇(例如，泼尼松)，硫嘌呤(例如，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤等)，甲氨蝶呤，其游离碱，其药学上可接受的盐，其衍生物，其类似物，及其组合。
本文还公开了包括两种或更多种结合配偶体的试剂盒。两种或更多种结合配偶体中的每 一个均附接在一个或多个固相支持物上，并且两种或更多种结合配偶体中的每一种都能够结 合选自以下的不同分析物：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。所述两种或更多种结合配偶体可以结合， 例如，Ang1和Ang2，Ang1和CEACAM1，Ang1和VCAM1，Ang1和TGFα，Ang1和CRP， Ang1和SAA1，Ang1和MMP-1，Ang1和MMP-2，Ang1和MMP-3，Ang1和MMP-9，Ang1 和EMMPRIN，或Ang1和IL-7。所述两种或更多种结合配偶体可以结合Ang2和CEACAM1， Ang2和VCAM1，Ang2和TGFα，Ang2和CRP，Ang2和SAA1，Ang2和MMP-1，Ang2和 MMP-2，Ang2和MMP-3，Ang2和MMP-9，Ang2和EMMPRIN，或Ang2和IL-7。所述两 种或更多种结合配偶体可以结合CEACAM1和VCAM1，CEACAM1和TGFα，CEACAM1和 CRP，CEACAM1和SAA1，CEACAM1和MMP-1，CEACAM1和MMP-2，CEACAM1和 MMP-3，CEACAM1和MMP-9，CEACAM1和EMMPRIN，或CEACAM1和IL-7。所述两 种或更多种结合配偶体可以结合VCAM1和TGFα，VCAM1和CRP，VCAM1和SAA1， VCAM1和MMP-1，VCAM1和MMP-2，VCAM1和MMP-3，VCAM1和MMP-9，VCAM1 和EMMPRIN，或VCAM1和IL-7。所述两种或更多种结合配偶体可以结合TGFα和CRP， TGFα和SAA1，TGFα和MMP-1，TGFα和MMP-2，TGFα和MMP-3，TGFα和MMP-9，TGFα和EMMPRIN，或TGFα和IL-7。所述两种或更多种结合配偶体可以结合CRP和SAA1， CRP和MMP-1，CRP和MMP-2，CRP和MMP-3，CRP和MMP-9，CRP和EMMPRIN，或 CRP和IL-7。所述两种或更多种结合配偶体可以结合SAA1和MMP-1，SAA1和MMP-2， SAA1和MMP-3，SAA1和MMP-9，SAA1和EMMPRIN，或SAA1和IL-7。所述两种或更 多种结合配偶体可以结合MMP-1和MMP-2，MMP-1和MMP-3，MMP-1和MMP-9，MMP- 1和EMMPRIN，或MMP-1和IL-7。所述两种或更多种结合配偶体可以结合MMP-2和MMP- 3，MMP-2和MMP-9，MMP-2和EMMPRIN，或MMP-2和IL-7。所述两种或更多种结合配 偶体可以结合MMP-3和MMP-9，MMP-3和EMMPRIN，或MMP-3和IL-7。所述两种或更多种结合配偶体可以结合MMP-9和EMMPRIN，或MMP-9和IL-7。所述两种或更多种结合 配偶体可以结合EMMPRIN和IL-7。
在某些方面，所述试剂盒包括针对选自以下的三种或更多种分析物中的每一种的结合配 偶体：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP- 3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该试剂盒包括针对选自以下的4种或更多种 分析物中的每一种的结合配偶体：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1， MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该试剂盒包括针对 选自以下的5种或更多种分析物中的每一种的结合配偶体：Ang1，Ang2，CEACAM1， VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。 在某些方面，该试剂盒包括针对选自以下的6种或更多种分析物中的每一种的结合配偶体： Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3， MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该试剂盒包括针对选自以下的7种或更多种分析物中的每一种的结合配偶体：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1， MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该试剂盒包括针对 选自以下的8种或更多种分析物中的每一种的结合配偶体：Ang1，Ang2，CEACAM1， VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。 在某些方面，该试剂盒包括针对选自以下的9种或更多种分析物中的每一种的结合配偶体： Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3， MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该试剂盒包括针对选自以下的10种或更多种分 析物中的每一种的结合配偶体：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该试剂盒包括针对 选自以下的11种或更多种分析物中的每一种的结合配偶体：Ang1，Ang2，CEACAM1， VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。 在某些方面，该试剂盒包括针对选自以下的12种或更多种分析物中的每一种的结合配偶体： Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3， MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该试剂盒包括针对以下分析物中的每一种的结合 配偶体：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2， MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。在某些方面，该试剂盒包括一种或多种其他分析物的 结合配偶体，本领域通常已知该其他分析物与对于维持CD患者的粘膜体内稳态重要的生物 途径有关。
在一些实施方案中，一种或多种结合配偶体是抗体。在某些方面，抗体可以用于在多重、 高通量单检测(即，两抗体)测定中，检测感兴趣的分析物。作为非限制性实例，测定中使 用的两种抗体可包括：(1)对分析物具有特异性的捕获抗体；(2)对分析物的活化形式具 有特异性的检测抗体(即活化状态依赖性抗体)。活化状态依赖性抗体能够检测例如分析物 的磷酸化，泛素化和/或络合状态。或者，检测抗体包括活化状态非依赖性抗体，其检测样品 中分析物的总量。活化状态非依赖性抗体通常能够检测活化和非活化形式的分析物两者。
在某些方面，一种或多种结合配偶体是抗体，其可以用于在多重、高通量邻近(即三抗 体)测定中检测目标分析物。作为非限制性实例，在邻近测定法中使用的三种抗体可以包括： (1)对分析物具有特异性的捕获抗体；(2)对分析物的活化形式具有特异性的检测抗体(即 活化状态依赖性抗体)；(3)检测被分析物的总量的检测抗体(即，活化状态非依赖性抗 体)。活化状态依赖性抗体能够检测例如分析物的磷酸化，泛素化和/或络合状态。活化状态 依赖性抗体通常能够检测分析物的活化形式和非活化形式。
本领域技术人员将理解，抗体以外的其它结合配偶体可以与提供的试剂盒一起使用，以 固定和/或检测患者样品中的一种或多种分析物。此类结合配偶体的非限制性实例包括分析物 的配体或受体，分析物的底物，结合结构域(例如，PTB，SH2等)，适体(aptamer)等。
在某些方面，结合配偶体对分析物的结合可以包括离子相互作用。在某些方面，结合配 偶体对分析物的结合可以包括非离子相互作用。在某些方面，结合配偶体对分析物的结合可 以包括共价相互作用。
试剂盒的一个或多个固体支持物可包括，例如，玻璃(例如，载玻片)，塑料，芯片，别 针，过滤器，珠(例如，磁性珠，聚苯乙烯珠等)，纸，膜(例如尼龙，硝酸纤维素，PVDF 等)，纤维束，凝胶，金属，陶瓷，或任何其他合适的基材。在一些实施方案中，两种或更多 种结合配偶体共价附于一个或多个固体支持物。
在一些实施方案中，结合配偶体附着于珠子。在某些方面，试剂盒中包括的每种类别的 结合配偶体分别附着于不同的珠子类型以使得可以进行多重测定。例如，每个结合配偶体类 别都可以附于具有不同属性(例如颜色)的珠子上，这些不同属性可以使用激光，发光二极 管(LED)，数字信号处理器，光检测器，电荷耦合器件(CCD)成像器、或其他设备，进行 区分。适用于所提供的试剂盒和方法的固体支持物的实例包括可从LuminexCorporation (Austin，TX)获得的
Figure BDA0002377108150000191
珠。
在某些方面，试剂盒还包括使用所述试剂盒评估CD患者的粘膜愈合的方法的说明书。 该说明书可以用于上述任何方法步骤。例如，试剂盒说明书可以用于使一个或多个固体支持 物与来自患者的血清样品接触。试剂盒说明书可用于检测血清样品中被一种或多种结合配偶 体结合的每种分析物的表达水平。试剂盒说明书可用于将数学算法应用于分析物的表达水平， 从而提供患者的MHI得分。在某些方面，MHI得分的标度为0到100。试剂盒说明书可用于： 当MHI得分小于或等于40时，确定患者有高可能性处于缓解中或患有轻度内窥镜疾病。试 剂盒说明书可用于：当MHI得分大于或等于50时，确定患者具有高可能性患有内镜活动性 疾病。试剂盒说明书可用于：当MHI得分在40到50之间时，确定患者具有中度可能性患有 内镜活动性疾病。
试剂盒可以进一步包括用于执行本公开的具体方法的另外试剂。试剂盒可包括例如测定 底物，标准品，稀释剂，生物素-抗体，洗涤缓冲液，捕获/释放试剂，或其组合。
IV.实施例
提供以下实施例用于举例说明性目的，并且不旨在以任何方式限制本公开。本领域技术 人员将容易认识到各种非关键参数，可以对其进行改变或修改以基本上产生相同的结果。
实施例1：开发将血清分析物水平与诊断性评估相关联的数学算法
提供临床数据集，包括血清分析物表达水平和SES-CD评分。将自然对数转换应用于两 种或更多种血清分析物(例如生物标志物)的表达水平，以减少数据偏度(skewness)并生成高 斯分布。最大似然估计(MLE)用于生成转化的血清分析物表达水平之间的相关性矩阵。线 性回归用于将SES-CD值转换为CDEIS值，简单线性/逻辑回归分析用于检查CDEIS二元终 点与生物标志物表达水平之间的关联性。然后使用Akaike信息准则(AIC)，使用后向消除 进行逐步线性/逻辑回归，以将生物标志物拟合到CDEIS二元结果上。
提供的临床数据被分为模型算法训练集和模型算法验证集。模型训练集包括横断面样本， 以最小化重复测量的偏差，而验证集包括纵向样本，以探索算法作为患者监测工具的使用。 一种模型使用活动性疾病相对于缓解的数据作为CDEIS二元结果进行训练，而一种模型使用 中度/重度疾病相对缓解/轻度疾病的数据作为CDEIS二元结果进行训练。依次应用这些模型 以在0到100的连续范围内创建MHI得分。
实施例2：开发和验证用于克罗恩氏病患者的粘膜愈合评估的多标志物血清检查
相对于由CDEIS或SES-CD评分确定的可视化内镜疾病严重程度，使用在回结肠镜检时 或接近时从成年CD患者中获得的回顾性血清样品和一组血清蛋白质组学生物标志物来训练 逻辑回归模型。MH定义为内镜下无溃疡。该模型在来自TAILORIX临床试验的前瞻性收集 的、围绕中心读取的118名患者的纵向队列中进行了独立验证。最终模型利用了13种生物标 志物来产生0-100的标度，称为粘膜愈合指数(MHI)。这些标志物代表据认为参与MH过 程的多种生物途径，包括血管生成(Ang1，Ang2)，细胞粘附(CEACAM1，VCAM1)，生 长因子信号传导(TGFα)，炎症(CRP，SAA1)，基质重塑(mmp-1，-2，-3，-9和EMMPRIN) 和免疫调节(IL7)。
来自396名患者的748份样品(平均年龄：34岁，男性49％，回肠疾病26％，回结肠疾病52％，结肠疾病22％)，用于MH检查的训练和验证。检查的总体准确性为90％，其中 对于识别缓解(CDEIS<3)或轻度(CDEIS 3-8)内镜疾病(MHI范围0-40)的患者，阴性 预测值(NPV)为92％；对于识别具有活动性疾病内镜迹象的患者(CDEIS≥3；MHI范围为 50-100)，阳性预测值(PPV)为87％。14％的样本落入中间区域(MHI 41-49)，观察到的 活动性疾病可能性为78％。检查的性能见表1。
表1
准确性 90％(95％CI:87％到93％)
灵敏度 82％(95％CI:75％到89％)
特异性 94％(95％CI:91％到97％)
PPV 87％(95％CI:80％到93％)
NPV 92％(95％CI:88％到95％)
实施例3：验证非侵入性血清学检查以评估生物或非生物疗法对克罗恩氏病患者粘膜健 康的功效
该检查在用英夫利昔单抗治疗的患者的CD队列中验证。该研究旨在验证在用生物学或 非生物学治疗可选方案治疗的CD患者队列中该检查的性能(治疗种类无关的,therapeutic agnostic)。在内镜检查时或接近内镜检查时收集CD患者的横断面样本，这些患者在不同的 中心入选并用不同疗法治疗。使用血清检查，对样品进行评估，该检查利用13种蛋白质生物 标志物的表达，所述13种蛋白质生物标志物建模在数学算法中，产生0-100标度，称为粘膜 愈合指数(MHI)。代表参与维持肠道粘膜健康的生物学途径的这些生物标志物是：Ang1， Ang2，CEACAM1，CRP，EMMPRIN，IL7，mmp-1，-2，-3，-9，SAA1，TGFα和VCAM1。通过CDEIS或SES-CD确定内镜疾病严重程度的数据。MH定义为内镜下无溃疡。
表2中显示了患者特征。队列中百分之五十由接受生物疗法治疗的患者组成。剩余的患 者中有42％是抗TNFα幼稚的(naive)或正在接受硫嘌呤或美沙拉敏(meslamine)治疗的患者。 22/278名患者(8％)无可得治疗信息，被排除在分析之外。在此CD患者人群中确定MH存 在(即药物疗效)的总体检查准确性为90％(表3)。用于识别缓解或轻度内窥镜疾病的患 者的阴性预测值(NPV)为89％。用于识别内镜活动性疾病(CDEIS>3)患者的阳性预测值(PPV)为90％。16％的样本在中间区域，显示了79％的活动性疾病可能性。
表2患者特征
年龄[平均值，年(SD)] 38(15)
男性[n(％)] 122(43.9)
阿达木单抗治疗[n(％)] 51(18.3)
英夫利昔单抗治疗[n(％)] 42(15)
维多珠单抗治疗[n(％)] 27(9.7)
乌斯替单抗治疗[n(％)] 18(6.5)
塞妥珠单抗治疗[n(％)] 1(0.4)
那他珠单抗治疗[n(％)] 1(0.4)
非生物制剂治疗[n(％)] 116(41.7)
内镜疾病严重度
重度[n(％)],(CDEIS:>12或SES-CD:>15) 49(17.6)
中度[n(％)],(CDEIS:9-12或SES-CD:7-15) 33(11.9)
轻度[n(％)],(CDEIS:3-8或SES-CD:3-6) 109(39.2)
缓解[n(％)],(CDEIS:<3或SES-CD:<3) 87(31.3)
表3用于检测内窥镜可视化CD的总体MHI检查性能
准确度 90％(95％CI:85％到94％)
灵敏度 89％(95％CI:81％到94％)
特异性 91％(95％CI:84％到96％)
PPV 90％(95％CI:84％到94％)
NPV 89％(95％CI:83％到93％)
这些结果表明，不管采用哪种治疗方法，该检查的性能都是相似的。该检查可以用作监 测和管理CD患者护理的非侵入性工具。
实施例4：通过在克罗恩氏病患者中的位置来描述粘膜愈合状态的新血清检查
本研究的目的是，比较这种新颖的血清学检查在CD患者的特定亚型中的诊断性能，以 了解其临床用途，其中这些患者根据疾病的位置进行分类。
在本研究中，在TAILORIX临床试验期间收集的118例CD患者的412个纵向样本中，根据疾病位置评估了MHI的验证性能。样本是在内镜检查时或接近内镜检查时从患者收集的。集中读取内镜评分，将MH定义为不存在内镜下溃疡。就灵敏度、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)，在该组合的组中以及就每个疾病位置，评估MHI检查的测 定性能。
患者特征示于表4。疾病位置根据Montreal分类进行分类。结肠、回结肠和回肠疾病的 检查准确度分别为87％，90％和95％。在表5中显示了疾病位置的详细性能。
表4患者特征
Figure BDA0002377108150000221
表5.根据疾病位置的性能
Figure BDA0002377108150000222
这些结果表明，用于粘膜健康的非侵入性评估的新型血清检查在CD患者的回肠、回结 肠和结肠解剖疾病部位显示出可比的性能。这些结果进一步验证了该检查的临床实用性，无 论疾病位置如何，该检查在评估CD患者的肠粘膜状态方面都是有益的辅助。
实施例5：不同评分指数对克罗恩疾病活动性评估的影响
在TAILORIX临床试验中，在118位CD患者的集中读取的、前瞻性收集的纵向队列研究中，由相同医师同时收集了CDEIS和SES-CD评分。在1年的时间里每位患者可获得最多 3个回结肠镜检评分。将标准的内镜疾病严重程度定义应用于每次内镜检查时获得的CDEIS和SES-CD评分，CDEIS评分分为缓解<3，轻度3-8，中度9-12和重度>12。对于SES-CD， 相同的组分别定义为<3、3-6、7-15和>15。使用线性回归对两个指数进行标化，并针对这些 终点的分类结果产生标化前和标化后的列联表。
使用原始的CDEIS和SES-CD分数，列联表(表7；未调整的一致性)显示，内镜疾病严重程度状态(缓解，轻度，中度和重度)的总体一致性仅为59％(242/411)。通过CDEIS 视为疾病缓解的评分中33％(58/175)被SES-CD归类为活动性疾病。由CDEIS确定的轻度 疾病病例中81/146
Figure BDA0002377108150000232
使用SES-CD，被提议为严重程度较高的疾病，即中度疾病。
表6：CDEIS和SES-CD分数在标化前后的列联表
Figure BDA0002377108150000231
在应用观察到的线性回归公式(CDEIS＝0.25+0.69*SESCD；r＝0.92)对两个分数进行 标化后，总体一致性提高到80％(表6；标化的一致性)。
尽管CDEIS和SES-CD得分相关性很好并且常被认为是评估粘膜疾病状态的内镜金标准 终点，但是我们的数据表明，这两者并不等同，因为它们的“内镜分类calls”仅59％时间是一 致的。数据还显示，即使在考虑了它们已知的偏移后，它们的一致性也仍然只有80％。这些 结果凸显了当前公认的两种金标准之间的差异，并阐明了使用主观金标准的不完善之处。
实施例6：开发和验证用于评估克罗恩氏病患者粘膜愈合的多标志物血清检查
回顾性分析了在回结肠镜检查时或30天之内从396名成年CD患者中获得的748个血清 样品(表7-9)。使用多个逻辑回归公式对一组血清蛋白生物标志物的表达水平进行数学建模(图1)，所述标志物从更大的一组标志物中选择，其中相对于CDEIS评分确定的可视化内 镜疾病严重程度进行建模(SIPPONEN等人，《克罗恩氏病活动性的内镜评估：CDEIS和SES- CD的比较》，INFLAMM BOWEL DIS，2010年，16：2131-2136；SIPPONEN等人，通过 粪钙卫蛋白和乳铁蛋白评估了克罗恩氏病活动性：与克罗恩氏病活动指数和内镜检查结果的 相关性，INFLAMM BOWEL DIS，2008，14：40-46)。MH模型输出是0-100标度，称为粘 膜愈合指数(MHI)。该模型已在TAILORIX临床试验的118名患者(N＝412个样本)的前 瞻性收集的，集中读取的纵向队列中进行了独立验证(表8)。最终模型使用了13种生物标 志物，这些生物标志物代表被认为参与MH过程的生物途径，包括血管生成(ANG1，ANG2)， 生长因子信号传导(TGFα)，基质重塑(MMP-1，-2，-3，-9和EMMPRIN)，细胞粘附 (CEACAM1，VCAM1)，免疫调节(IL7)和炎症(CRP，SAA1)(图1)。
表7.
队列1 队列2 队列3 队列4 队列5
临床队列 (U Padua,Italy) (UCSD) (MSH,Toronto) (STORI) (TAILORIX)
内镜评分 CDEIS SES-CD SES-CD CDEIS CDEIS
患者(N) 18 31 146 83 118
血清样品(N) 50 45 157 83 412
表8.
Figure BDA0002377108150000241
表9.
Figure BDA0002377108150000251
使用来自396名患者的总共748个样本(平均年龄：34岁，男性49％)开发MH检查。表7-9描述了训练和验证队列中所用患者和样品的特征。MH检查包括代表参与维持粘膜稳态的多种生物学途径的13种生物标志物(图1)。MH检查的输出为0-100之间的粘膜愈合 指数(MHI)评分(图2A-2D)。MHI的总体准确度为90％(图2A-2D)，用于识别缓解 (CDEIS<3)或轻度(CDEIS 3-8)内镜疾病(MHI范围0-40)的患者的阴性预测值(NPV) 为92％，用于识别内镜下活动性疾病迹象的患者(CDEIS≥3；MHI范围50-100)的阳性预测 值(PPV)为87％。14％的样本落在中间区域(MHI 41-49)，其中观察到的活动性疾病的可 能性为78％。MHI可用于所有CD患者，无论疾病位置和所用治疗方案如何。MHI是一种监 测工具，可用于在临床诊断的克罗恩氏病患者中纵向跟踪肠道粘膜的疾病状态(图3A-3C)。
实施例7：非侵入性血清学检查以评估生物和非生物疗法对克罗恩氏病患者粘膜健康的 功效
本研究的目的是，在已经用生物学或非生物学治疗可选方案治疗的CD患者的独立队列 中进一步验证MH检查的性能(即，治疗种类无关的)。验证集由来自欧洲、加拿大和美国 不同地理区域的五项独立研究的样品组成(n＝278名患者；表10)。可获得n＝256名患者的 治疗数据，这些数据用于分析。
表10收集地点和患者
Figure BDA0002377108150000261
CD患者的独立多中心横断面队列研究。使用CDEIS对内镜严重度进行分类，将活动性 内镜疾病定义为CDEIS≥3(将SES-CD评分转换为CDEIS；参见下面实施例8)。MH检查 由13种生物标志物组成，代表MH过程中的多种生物途径(图4)。对数据进行逻辑回归， 得出0-100的标度，称为粘膜愈合指数(MHI)(图5)。使用单向方差分析确定内镜疾病严 重程度类别之间MHI的平均差异。*p<0.05被认为是显著的。
患者的中位年龄为34岁(范围：18-88；男性：43.9％)。患者人群包括所有疾病部位： 回肠，回结肠和结肠。等同地在所有CD中进行MH检查，不论疾病位置或治疗选择如何。队列中约50％由接受了生物制剂治疗的患者组成：ADA：18.3％，IFX：15％，抗整合蛋白：10.9％，UST：6.5％(表11)。其余的42％是抗TNFα幼稚的、或在接受硫代嘌呤治疗，在 接受美沙拉敏治疗、或未使用药物治疗。该CD患者人群的总体检查准确度为90％。用于识 别缓解或轻度内窥镜疾病患者的阴性预测值(NPV)为89％。用于鉴定患有内镜活动性疾病(CDEIS>3)的患者的阳性预测值(PPV)为90％(图5)。平均MHI值显示与内镜疾病严 重程度的增加有显著相关性(图6；表12)。接受生物制剂vs.非生物制剂治疗的患者中，检 查准确度无显著变化。
表11.患者数据与治疗
年龄[平均值(范围)] 34(18-88)
N(％)
男性 122(43.9)
阿达木单抗治疗 51(18.3)
英夫利昔单抗治疗 42(15)
维多珠单抗治疗 27(9.7)
乌斯替单抗治疗 18(6.5)
塞妥珠单抗治疗 1(0.4)
那他珠单抗治疗 1(0.4)
非生物制剂治疗 116(41.7)
表12.内镜疾病严重度定义
N(％)
重度(CDEIS:>12或SES-CD:>15) 49(17.6)
中度(CDEIS:9-12或SES-CD:7-15) 33(11.9)
轻度(CDEIS:3-8或SES-CD:3-6) 109(39.2)
缓解(CDEIS:<3或SES-CD:<3) 87(31.3)
MH检查提供客观的指数评分，其在几种不同类型的治疗类别的CD患者中准确评估MH， 而与疾病位置无关。该检查可以用作非侵入性工具，测量、监测和帮助管理所有CD患者的 护理，无论治疗如何。
实施例8：评估用于评价克罗恩氏病活动性的内镜评分指标之间的变异性
克罗恩氏病内镜严重度指数(CDEIS)和克罗恩氏病简化内镜评分(SES-CD)是两种常 用的经验证的内镜指数，用于评估CD患者粘膜疾病状态、和确定以粘膜愈合为终点的临床 试验的结果。尽管CDEIS和SES-CD指数显示出高度相关性(Daperno等，Gastrointestinal Endoscopy(2004)60(4)：505-512；Sipponen等人，对克罗恩氏病活动性的内镜评估：CDEIS 和SES-CD的比较，Inflamm Bowel Dis，2010，16：2131-2136)，这两个指数之间存在显著 差异(表13)。此外，它们之间的疾病严重度分组并不充分吻合，这会影响内镜疾病活动性 结果的解释(Sipponen等人，Inflamm Bowel Dis，2010,16：2131-2136)。CDEIS和SES-CD 之间的线性偏移已被广泛接受(Daperno等人，GastrointestinalEndoscopy(2004)60(4):505-512)， 但对于使用这两个评分指数的准确度和影响的更仔细审视，尚未得到充分研究。
表13.
Figure BDA0002377108150000281
这项研究的目的是，比较在TAILORIX临床队列中由CDEIS和SES-CD指数确定的内镜 疾病严重度(G.D’Haens,S.Vermiere,D.Laharie et.al.Drug-concentration versessymptom-driven dose adaptation of Infliximab in patients with active Crohn’sdisease:a prospective,randomized multicenter trial(TAILORIX)OralPresentation,ECCO 2016)。
在TAILORIX临床试验中，在118名CD患者的集中读取的、前瞻性收集的纵向队列中， 同时收集了CDEIS和SES-CD评分(图7)。在一年的时间里可从每位患者获得最多三个内镜评分。CDEIS和SES-CD评分均采用标准疾病严重度定义。CDEIS评分(Sipponen等，Inflamm Bowel Dis，2010,16：2131-2136；Sipponen等，Crohn’s disease activityassessed by fecal calprotectin and lactoferrin:correlation with Crohn’sdisease activity index and endoscopic findings. Inflamm Bowel Dis,2008,14:40-46)分为缓解<3，轻度3-8，中度9-12和重度>12。对于SES- CD(Moskovitz等人，Definingand validating cut-offs for the Simple Endoscopic Score for Crohn’sDisease.Gastroenterology,2007,132:S1097)，相同的组分别定义为<3、3-6，7-15和>15。使 用TAILORIX数据，得出线性回归公式，以根据SES-CD分数预测相应的CDEIS分数。
使用原始的CDEIS和SES-CD分数，列联表(图8A)显示疾病严重性状态(缓解，轻度，中度和重度)的总体一致性仅为59％(241/411)。CDES认为疾病缓解的评分中33％ (58/175)被SES-CD分类为活动性疾病。由CDEIS得出的轻度疾病分类中有81/146
Figure BDA0002377108150000282
Figure BDA0002377108150000291
使用SES-CD被提议为具有中度疾病。在应用观察到的线性回归公式(CDEIS＝0.69 *SES-CD+0.25；r＝0.92)标化两个分数之后，总体一致性提高到80％(328/411)(图8B)。
尽管CDEIS和SES-CD得分相关性很好并且被独立地用作内镜金标准终点，但是数据表 明两者并不等同，因为它们的“内镜分类CALLS”仅在59％的时间是一致的。甚至在考虑到它 们之间的已知偏移，该一致性也仍仅为80％(328/411)(图8B)。这些结果凸显了目前两 个公认的金标准之间的差异，并阐明了建立单一客观评分来评估CD患者的粘膜状态的重要 性和临床未满足的需求。
尽管出于清楚理解的目的已经通过图示和示例的方式详细地描述了前述公开，但是本领 域的技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内进行某些改变和修改。另外，本文提供 的每个参考文献通过引用整体并入本文，其程度与每个参考文献通过引用单独并入的程度相 同。

Claims (55)

1.一种用于评估克罗恩氏病(CD)患者的粘膜愈合的方法，该方法包括：
提供患者的血清样本；
检测血清样品中选自以下的两种或更多种生物标志物中的每一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7；和
将数学算法应用于所述两种或更多种生物标志物的表达水平，从而产生患者的粘膜愈合指数(MHI)得分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括：使血清样品与针对所述两种或更多种生物标志物中的每一种的结合配偶体接触，并检测每种生物标志物与其各自的结合配偶体之间的结合。
3.权利要求2的方法，其中每个结合配偶体是抗体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述检测包括：测量由Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7组成的组中的每个生物标志物的表达水平。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，还包括：
当MHI得分在0到100的标度上小于或等于40时，确定患者有高可能性在缓解中或患有轻度内窥镜疾病。
6.权利要求5的方法，其中缓解或患有轻度内窥镜疾病的高可能性为大于或等于92％。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述缓解对应于小于3的克罗恩氏病内镜严重度指数(CDEIS)(CDEIS＜3)。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述轻度内窥镜疾病对应于3-8之间的CDEIS(CDEIS 3-8)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，还包括：
当MHI得分在0到100的标度上大于或等于50时，确定患者有高可能性患有内镜活动性疾病。
10.根据权利要求9所述的方法，其中患有内镜活动性疾病的高可能性为大于或等于87％。
11.权利要求9或10的方法，其中所述内镜活动性疾病对应于大于或等于3的CDEIS(CDEIS≥3)。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，还包括：
当MHI得分在0到100的标度上为40到50时，确定患者有中等可能性患有内镜活动性疾病。
13.根据权利要求12所述的方法，其中患有内镜活动性疾病的中等可能性为大于或等于78％。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述数学算法包括将所述生物标志物的表达水平与内镜评分相关联的两个或更多个模型。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述两个或更多个模型中的一个或多个通过使用分类和回归树得出，和/或所述两个或更多个模型中的一个或多个通过使用普通最小二乘回归对诊断特异性进行建模而得出。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述两个或更多个模型中的一个或多个通过使用随机森林学习分类得出，和/或所述两个或更多个模型中的一个或多个通过使用分位数分类得出。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述两个或更多个模型中的一个或多个通过使用逻辑回归对诊断灵敏度进行建模而得出，和/或所述两个或更多个模型中的一个或多个通过使用逻辑回归对诊断特异性进行建模而得出。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述患者正在接受生物或非生物治疗。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法通过确定所述治疗的功效来评估粘膜愈合。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，所述方法评估患者中结肠、回结肠、和/或回肠疾病位置处的粘膜愈合。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述方法评估手术后患者的粘膜愈合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法通过鉴定所述患者的手术后内镜复发来评估粘膜愈合。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述方法通过预测或监测患者的粘膜状况来评估粘膜愈合。
24.一种评估CD患者粘膜愈合的方法，该方法包括：
(a)在来自患者的血清样品中检测以下生物标志物的表达：Ang1；Ang2；CEACAM1；VCAM1；TGFα；CRP；SAA1；MMP-1；MMP-2；MMP-3；MMP-9；EMMPRIN；和IL-7；和
(b)将数学算法应用于步骤(a)中的生物标志物表达，以产生患者的MHI，
其中，MHI为0-100标度，
其中当MHI在0至40之间时，患者处于缓解中或患有轻度内窥镜疾病，并且
其中当MHI在50-100之间时，患者患有内镜活动性疾病。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述患者正在接受生物或非生物治疗。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述方法通过确定所述治疗的功效来评估粘膜愈合。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中，所述方法评估患者在结肠、回结肠、和/或回肠疾病位置处的粘膜愈合。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中，所述方法评估手术后患者的粘膜愈合。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述方法通过鉴定所述患者的手术后内镜复发来评估粘膜愈合。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的方法，其中，所述缓解对应于小于3的克罗恩氏病内镜严重度指数(CDEIS)(CDEIS＜3)。
31.根据权利要求24-29中任一项所述的方法，其中所述轻度内窥镜疾病对应于3-8之间的CDEIS(CDEIS 3-8)。
32.根据权利要求24-29中任一项所述的方法，其中所述内镜活动性疾病对应于大于或等于3的CDEIS(CDEIS≥3)。
33.根据权利要求24-32中任一项所述的方法，其中，所述方法通过预测或监测患者的粘膜状况来评估粘膜愈合。
34.一种评估施用给CD患者的治疗的功效的方法，该方法包括：
提供患者的血清样品；
检测血清样品中选自以下的两种或更多种生物标志物中的每一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7；
将数学算法应用于所述两种或更多种生物标志物的表达水平，从而产生患者的MHI得分；和
根据MHI得分调整治疗。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述检测包括：使所述血清样品与针对所述两种或更多种生物标志物的每一种的结合配偶体接触，并且检测每种生物标志物与其各自的结合配偶体之间的结合。
36.根据权利要求35所述的方法，其中每个结合配偶体是抗体。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中，所述调整包括：当MHI得分在0至100的标度上小于或等于40时，降低所述治疗的后续剂量。
38.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中，所述调整包括：当MHI得分在0至100的标度上大于或等于50时，增加所述治疗的后续剂量。
39.根据权利要求34-38中任一项所述的方法，其中所述治疗包括一种或多种生物制剂，常规药物，营养补充剂或其组合。
40.一种在克罗恩氏病患者中检测两种或更多种生物标志物的表达水平的方法，所述生物标志物选自Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7，该方法包括：
从患者获得血清样品；和
通过使血清样品与针对两种或更多种生物标志物中的每一种的结合配偶体接触，并检测每种生物标志物与其各自的结合配体之间的结合，来检测血清样品中所述两种或更多种生物标志物中的每一种的表达水平。
41.权利要求40的方法，其中每个结合配偶体是抗体。
42.一种评估克罗恩氏病患者粘膜愈合的方法，该方法包括：
从患者获得血清样品；
通过使血清样品与针对两种或更多种生物标志物中的每一种的结合配偶体接触并检测每种生物标志物与其各自的结合配体之间的结合来检测血清样品中两种或更多种生物标志物中的每一种的表达水平，其中所述两种或更多种生物标志物种的每一种独立地选自Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7；和
将数学算法应用于所述两种或更多种生物标志物的表达水平，从而产生患者的MHI得分。
43.根据权利要求42所述的方法，其中每个结合配偶体是抗体。
44.根据权利要求42或43所述的方法，还包括：
当MHI得分在0到100标度上小于或等于40时，确定患者有高可能性在缓解中或患有轻度内窥镜疾病。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，还包括：
当MHI得分在0到100的标度上大于或等于50时，确定患者有高可能性患有内镜活动性疾病。
46.一种用于评估克罗恩氏病患者的粘膜愈合并在该患者中治疗克罗恩氏病的方法，该方法包括：
从患者获得血清样品；
检测血清样品中选自以下的两种或更多种生物标志物中的每一种的表达水平：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7；
将数学算法应用于所述两种或更多种生物标志物的表达水平，从而产生患者的MHI得分；
当MHI得分在0到100标度上大于或等于50时，诊断患者有高可能性患有内镜活动性疾病；和
向诊断的患者施用有效量的治疗剂。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述治疗剂包括一种或多种生物制剂，常规药物，营养补充剂或其组合。
48.一种治疗克罗恩氏病患者的方法，该方法包括：向根据权利要求45的方法诊断出有高可能性患有内镜活动性疾病的患者，施用有效量的治疗剂。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述治疗剂包括一种或多种生物制剂，常规药物，营养补剂或其组合。
50.一种试剂盒，其包含两种或更多种结合配偶体，其中所述两种或更多种结合配偶体中的每一种均附接于一个或多个固体支持物上，并且其中所述两种或更多种结合配偶体中的每一种分别能够结合选自以下的不同分析物：Ang1，Ang2，CEACAM1，VCAM1，TGFα，CRP，SAA1，MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，EMMPRIN和IL-7。
51.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述两种或更多种结合配偶体中的每一种分别附接于不同的固体支持物上。
52.根据权利要求50或51所述的试剂盒，还包括用于以下的说明书：
使所述一个或多个固体支持物与患者的血清样品接触；
检测血清样品中被所述一种或多种结合配偶体结合的每种分析物的表达水平；和
将数学算法应用于分析物的表达水平，从而提供患者的粘膜愈合指数(MHI)得分。
53.根据权利要求52所述的试剂盒，还包括用于如下的说明书：当MHI得分在0至100的标度上小于或等于40时，确定所述患者具有高可能性处于缓解中或患有轻度内窥镜疾病。
54.根据权利要求52或53所述的试剂盒，还包括用于如下的说明书：当MHI得分在0至100的标度上大于或等于50时，确定所述患者具有高可能性患有内镜活动性疾病。
55.根据权利要求52-54中任一项所述的试剂盒，还包括用于如下的说明书：当MHI得分在0至100的标度上在40至50之间时，确定所述患者具有中等可能性患有内镜活动性疾病。
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