CN111094562A - 具有海藻糖酶活性的多肽及其在产生发酵产物的方法中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及瘤孢毁丝霉GH37海藻糖酶的海藻糖酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

具有海藻糖酶活性的多肽及其在产生发酵产物的方法中的 用途

序列表的引用

本申请包含计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及具有海藻糖酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生这些多肽的方法。本发明还涉及使用本发明的海藻糖酶生产发酵产物的方法。

背景技术

本发明提供了与其亲本相比具有改进的特性的海藻糖酶变体。海藻糖是由两个糖单体(葡萄糖)组成的稳定的二糖。海藻糖以多至10％-15％的细胞干重作为对应激的响应积累于酵母中(GrBa等人,(1975)Eur.J.Appl.Microbiol.[欧洲应用生理学杂志]2:29-37)。海藻糖不能被酵母代谢。海藻糖酶将海藻糖切割成两个葡萄糖单元。

将海藻糖酶分类于EC 3.2.1.28(α,α-海藻糖酶)和EC 3.2.1.93(α,α-磷酸海藻糖酶)。EC类别基于国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的命名委员会(NomenclatureCommittee)的推荐。EC类别的描述可见于互联网，例如，在“http://www.expasy.org/ enzyme/”上。两个酶类别均被称作“海藻糖酶”。中性海藻糖的实例包括来自如下的海藻糖酶：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Londesborouh等人,(1984)Characterizationof two trehalases from baker’s yeast[面包酵母两种海藻糖酶的表征]Biochem J[生物化学杂志]219,511-518；洛氏毛霉(Mucor roxii)(Dewerchin等人,(1984),“Trehalaseactivity and cyclic AMP content during early development of Mucor rouxiispores”[洛氏毛霉孢子早期发育过程中的海藻糖酶活性和环状AMP含量],J.Bacteriol.[细菌学杂志],158,575-579)；布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus)(Thevelein等人,(1983),“Glucose-induced trehalase activation and trehalose mobilizationduring early germination of Phycomyces blakesleeanus spores”[布拉克须霉孢子早期萌发过程中葡萄糖诱导的海藻糖酶活化和海藻糖动员]J.Gen Microbiol.[通用与应用微生物学杂志]129,719-726)；尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporium)(Amaral等人,(1996),“Comparative study of two trehalase activities from Fusarium oxysporium varLinii”[尖孢镰孢菌林氏变种的两种海藻糖酶活性的比较研究]Can.J.Microbiol[加拿大微生物学杂志].41,1057-1062)。中性海藻糖酶的实例包括，但不限于，来自如下的海藻糖酶：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Parvaeh等人,(1996)Purification andbiochemical characterization of the ATH1 gene product,vacuolar acid trehalasefrom Saccharomyces cerevisae”[酿酒酵母ATH1基因产物液泡酸海藻糖酶的纯化及生化特性]FEBS Lett[欧洲生化学会联合会快报].391,273-278)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)(Hecker等人,(1973),“Location of trehalase in the ascospores ofNeurospora:Relation to ascospore dormancy and germination”[海藻糖酶在脉孢菌子囊孢子中的定位：与子囊孢子休眠和萌发的关系].J.Bacteriol.[细菌学杂志]115,592-599)；金黄毛壳菌(Chaetomium aureum)(Sumida等人,(1989),“Purification and someproperties of trehalase from Chaetomium aureum MS-27”.[金黄毛壳菌MS-27海藻糖酶的纯化及某些性质的研究]J.Ferment.Bioeng.[发酵生物工程杂志]67,83-86)；构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(d’Enfert等人,(1997),“Molecular characterization ofthe Aspergillus nidulans treA gene encoding an acid trehalase required forgrowth on trehalose.[编码在海藻糖上生长所需的酸性海藻糖酶的构巢曲霉treA基因的分子表征]Mol.Microbiol.[分子微生物学]24,203-216)；灰腐质霉(Humicola grisea)(Zimmermann等人,(1990)”；“Purification and properties of an extracellularconidial trehalase from Humicola grisea var.thermoidea[来自灰腐质霉高温变种胞外分生孢子海藻糖酶的纯化及特性]”,Biochim.Acta[生物化学与生物物理学报]1036,41-46)；灰腐质霉(Cardello等人(1994),“A cytosolic trehalase from thethermophilhilic fungus Humicola grisea var.thermoidea”[来自嗜热真菌灰腐质霉高温变种的胞液型海藻糖酶],Microbiology UK[英国微生物学]140,1671-1677；嗜热柱顶孢霉(Scytalidium thermophilum)(Kadowaki等人,(1996),“Characterization of thetrehalose system from the thermophilic fungus Scytalidium thermophilum[来自嗜热真菌嗜热柱顶孢霉的海藻糖系统的表征]”Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1291,199-205)；和尖孢镰孢菌(Amaral等人,(1996),“Comparative study of twotrehalase activities from Fusarium oxysporium var Linii”[尖孢镰孢菌林氏变种的两种海藻糖酶活性的比较研究]Can.J.Microbiol[加拿大微生物学杂志].41,1057-1062)。

还已知海藻糖酶来自大豆(Aeschbachet等人,(1999),“Purification of thetrehalase GmTRE1 from soybean nodules and cloning of its cDNA”[纯化来自大豆根瘤的海藻糖酶GmTRE1并克隆其cDNA],Plant Physiol[植物生理学杂志]119,489-496)。

海藻糖酶也存在于哺乳动物的小肠和肾中。

WO 2009/121058(诺维信公司(Novozymes))涉及使用发酵生物通过将一种或多种海藻糖酶添加入发酵培养基而将源自植物材料的糖发酵成发酵产物(如乙醇)的方法。

WO 2012/027374(并矢公司(Dyadic))披露了来自嗜热毁丝霉的海藻糖酶，其可在酶混合物中使用，该酶混合物用来将木质纤维素生物质降解成可发酵糖。

WO 2013/148993(诺维信公司)披露了通过液化、糖化和发酵含淀粉材料从所述含淀粉材料产生发酵产物(如乙醇)的方法，其中糖源生成酶、纤维素水解组合物和海藻糖酶存在于发酵中。披露了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的海藻糖酶。

WO 2015/065978(丹尼斯科美国公司(Danisco US Inc.))披露了在发酵反应中增加从液化物(liquefact)产生乙醇的方法，该方法包括用葡糖淀粉酶、发酵生物和海藻糖酶发酵所述液化物和在发酵结束时回收所述乙醇和其他发酵产物。

WO 2016/205127(诺维信公司)披露了属于家族37糖苷水解酶(“GH37”)(如由CAZY(参见www.cazy.org)所定义的)来自瘤孢毁丝霉的海藻糖酶，该海藻糖酶具有高热稳定性和宽pH范围。还发现在乙醇方法中当将海藻糖酶添加在发酵中时可获得增加的乙醇产率。

对于提供适于以增加的产率产生发酵产物如乙醇的方法中使用的改进的海藻糖酶或酶组合物，仍然存在需要。

发明内容

本发明涉及一种具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性的海藻糖酶变体多肽，该海藻糖酶变体多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的位置152、182、185或583处的一个或多个位置处的替换，其中该变体具有与SEQ ID NO:1的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％，至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性且其中该变体具有海藻糖酶活性。

本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生所述变体的方法。本发明还涉及包含本发明的变体多肽的组合物。

本发明还涉及一种生产发酵产物的方法，包括

(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；

任选地在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；

(b)使所液化的材料糖化；

(c)使用发酵生物进行发酵；

其中

i)葡糖淀粉酶；

ii)本发明的海藻糖酶；

iii)任选的纤维素分解酶组合物和/或蛋白酶；

在以下步骤的过程中存在和/或添加：

-糖化步骤(b)；

-发酵步骤(c)；

-同时的糖化和发酵；

-任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。

因此，本发明还涉及从含淀粉材料生产发酵产物的工艺，该工艺包括以下步骤：

(i)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；以及

(ii)使用发酵生物进行发酵；

其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：本发明的葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、变体海藻糖酶，以及任选的蛋白酶和/或纤维素分解酶组合物。

本发明还涉及从预处理的纤维素材料生产发酵产物的工艺，该工艺包括以下步骤：

(a)用纤维素分解酶组合物使所述预处理的纤维素材料水解；

(b)使用发酵生物进行发酵；以及

(c)任选地回收该发酵产物，

其中本发明的变体海藻糖酶被添加至和/或存在于水解步骤(a)和/或发酵步骤(b)中。

定义

海藻糖酶：术语“海藻糖酶”意指将海藻糖降解成其单元单糖(即，葡萄糖)的酶。将海藻糖酶分类于EC 3.2.1.28(α,α-海藻糖酶)和EC。3.2.1.93(α,α-磷酸海藻糖酶)。EC类别基于国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的命名委员会(Nomenclature Committee)的推荐。EC类别的描述可见于互联网，例如，在“http://www.expasy.org/enzyme/”上。海藻糖酶是催化如下反应的酶：

EC 3.2.1.28：

EC 3.2.1.93：

出于本发明的目的，海藻糖酶活性可根据在“材料与方法”部分中所描述的“海藻糖酶测定”方法测定的。在一个方面，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:1的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的海藻糖酶活性。在一个优选的实施例中，本发明的海藻糖酶是家族37糖苷水解酶(“GH37海藻糖酶”)。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

催化结构域：术语“催化结构域”意指酶的含有该酶的催化机构的区域。在一个实施例，催化结构域是SEQ ID NO:1的氨基酸105至608。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。在一个实施例中，该cDNA为本文中的SEQ ID NO:3。

编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。

表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，所述分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

片段：术语“片段”意指具有在成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有海藻糖酶活性。在一个方面，一个片段包含至少504个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸105至608)。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。具体地，宿主细胞是重组宿主细胞。特别地，重组宿主细胞包括编码本发明变体的多核苷酸，其中所述多核苷酸与宿主细胞是异源的(不同来源/物种)。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。

改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本有所改进的变体相关的特征。这种改进的特性包括但不限于增加的热稳定性和增加的抗蛋白酶降解稳定性，特别是通过黑曲霉蛋白酶混合物的降解。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，所述物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，该成熟多肽是SEQID NO:1的氨基酸1至674。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有海藻糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:2的核苷酸61至2022。

突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。

亲本或亲本海藻糖酶：术语“亲本”或“亲本海藻糖酶”意指对其作出改变以产生本发明的酶变体的具有海藻糖酶活性的任何多肽。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：

(同一的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

子序列：术语“子序列”意指具有从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有海藻糖酶活性的片段。

变体：术语“变体”意指具有海藻糖酶活性的、在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；插入意指在占据某一位置的氨基酸附近和紧随其后添加氨基酸本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:1的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的海藻糖酶活性。

野生型海藻糖酶：术语“野生型”海藻糖酶意指由见于自然界中的天然存在的微生物(如细菌、酵母或丝状真菌)表达的海藻糖酶。

变体命名惯例

出于本发明的目的，将如SEQ ID NO:1披露的成熟多肽用以确定另一种海藻糖酶中的对应的氨基酸残基。另一种海藻糖酶的氨基酸序列与在SEQ ID NO:1中披露的多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定如SEQ ID NO:1披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

可以通过使用若干计算机程序，使用他们各自的默认参数比对多个多肽序列来确定在海藻糖酶中的对应氨基酸残基的鉴定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)，以及使用ClustalW(1.83或更新的；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。

当其他酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽相背离，这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序例如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法例如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有目的结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。

在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的命名法进行了改编。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。

取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。

缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：

<u>亲本：</u>	<u>变体：</u>
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

不同改变。在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变由逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

具体实施方式

本发明涉及分离的海藻糖酶变体，这些分离的变体包含在与SEQ ID NO:1的多肽的位置152、182、185、以及583相对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代，其中变体具有海藻糖酶活性。具体地，与SEQ ID NO:1的海藻糖酶相比，本发明的变体海藻糖酶具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性。

变体

本发明提供了多种海藻糖酶变体，这些海藻糖酶变体在与位置152、182、185、和583相对应的一个或多个(例如，若干个)位置包含一个取代，其中该变体具有蛋白酶活性。

在一个实施例中，该变体与亲本海藻糖酶的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少75％，至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在一方面，在本发明的变体中的改变数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。

在另一方面，一个变体包含在与位置152、182、185、以及583相对应的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代。在另一方面，变体包含在与位置152、182、185、以及583中的任一个相对应的两个位置处的取代。在另一方面，变体包括在与位置152、182、185、以及583中的任一个相对应的三个位置处的取代。在另一个方面，一种变体在对应于位置152、182、185以及583的每个位置处包括一个取代。

在另一方面，该变体包括在对应于位置152的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置152的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ala、Glu、Gly取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:1的多肽的取代物P152G、P152E、P152A，或由其组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置182的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在与位置182相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Val取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:1的多肽的取代F182V，或由其组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置185的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在与位置185相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Arg取代。在另一方面，该变体包括SEQ ID NO:1的多肽的取代F185R，或由其组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置583的位置处的取代，或由其组成。在另一方面，在对应于位置583的位置的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Thr取代。在另一方面，该变体包括SEQID NO:1的多肽的取代G583T，或由其组成。

在另一方面，该变体包括在对应于位置152和182的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置152和185的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置152和583的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置182和185的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置182和583的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置185和583的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置152、182、和185的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置152、182、和583的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置152、185、和583的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置182、185、和583的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置152、182、185、以及583的位置处的取代(如以上所描述的那些)或由这些取代组成。

在另一方面，该变体包括选自下组的一个或多个(例如，若干个)取代或由其组成，该组由P152G、P152E、P152A、F182V、F185R和G583T组成。

在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代P152G,E,A+F182V或由其组成，或包含与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有海藻糖酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ ID NO:1的海藻糖酶相比，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性。

在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代P152G,E,A+F185R或由其组成，或包含与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有海藻糖酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ ID NO:1的海藻糖酶相比，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性。

在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代P152G,E,A+G583T或由其组成，或包含与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有海藻糖酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ ID NO:1的海藻糖酶相比，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性。

在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代F182V+F185R或由其组成，或包含与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有海藻糖酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ ID NO:1的海藻糖酶相比，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性。

在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代F182V+G583T或由其组成，或包含与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有海藻糖酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ ID NO:1的海藻糖酶相比，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性。

在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代F185R+G583T或由其组成，或包含与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有海藻糖酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ ID NO:1的海藻糖酶相比，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性。

在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代P152G,E,A+F182V+F185R或由其组成，或包含与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有海藻糖酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQID NO:1的海藻糖酶相比，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性。

在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代P152G,E,A+F182V+G583T或由其组成，或包含与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有海藻糖酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQID NO:1的海藻糖酶相比，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性。

在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代P152G,E,A+F185R+G583T或由其组成，或包含与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有海藻糖酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQID NO:1的海藻糖酶相比，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性。

在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代F182V+F185R+G583T或由其组成，或包含与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有海藻糖酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ IDNO:1的海藻糖酶相比，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性。

在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的多肽的取代P152G,E,A+F182V+F185R+G583T或由其组成，或包含与SEQ ID NO:1的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有海藻糖酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ ID NO:1的海藻糖酶相比，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性。

在另一个方面，该海藻糖酶变体多肽具有增加的抗蛋白酶降解稳定性，其包含选自下组的取代或取代的组合，该组由以下组成：

G583T；

P152G；

P152E；

P152A；

F182V；

F185R；

P152G+G583T；

F185R+G583T；

P152A+F182V+G583T；

F182V+F185R+G583T；

并且其中该变体具有与SEQ ID NO:3的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有海藻糖酶活性，并且其中在30℃，pH 4.0下与黑曲霉蛋白酶混合物孵育3天后的残留活性为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％。

在另一个方面，该海藻糖酶变体多肽具有增加的热稳定性，其包含选自下组的取代或取代的组合，该组由以下组成：

P152G；

P152E；

P152A；

F182V；

F185R；

P152G+G583T；

F185R+G583T；

P152A+F182V+G583T；

F182V+F185R+G583T；

并且其中该变体具有与SEQ ID NO:3的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性且其中该变体具有海藻糖酶活性，其中通过TSA分析测量的热变性温度至少为65.7℃。

在另一个方面，该海藻糖酶变体多肽具有增加的热稳定性，其包含选自下组的取代或取代的组合，该组由以下组成：

P152G；

P152E；

P152A；

F182V；

F185R；

P152G+G583T；

F185R+G583T；

F182V+F185R+G583T；

并且其中该变体具有与SEQ ID NO:3的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性且其中该变体具有海藻糖酶活性，其中通过TSA分析测量的热变性温度至少为65.8℃。

在另一个方面，该海藻糖酶变体多肽具有增加的热稳定性，其包含选自下组的取代或取代的组合，该组由以下组成：

P152G；

P152E；

F182V；

F185R；

P152G+G583T；

F185R+G583T；

F182V+F185R+G583T；

并且其中该变体具有与SEQ ID NO:3的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性且其中该变体具有海藻糖酶活性，其中通过TSA分析测量的热变性温度至少为66.0℃。

这些变体在一个或多个(例如，若干个)其他位置上可进一步包括一个或多个另外的改变。

这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单一丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的海藻糖酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。

在一个实施例中，该变体与亲本酶相比具有增加的抗蛋白酶降解稳定性。

在一个实施例中，如本文所述的通过TSA分析测量的，该变体与亲本酶(例如SEQID NO:1)相比具有增加的热稳定性。具体地热变性温度Td2至少为65.7℃，更具体地至少为65.8℃，更具体地为66.0℃。

亲本海藻糖酶

该亲本海藻糖酶可以是(a)与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％序列同一性的多肽；(b)由一种多核苷酸所编码的一种多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列或其cDNA、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；或(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列同一性。

cDNA序列作为SEQ ID NO:3被包括于此。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，具有海藻糖酶活性。在一方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的多肽相差多达10个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个。

在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。

在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:1的多肽的等位基因变体。

可以使用SEQ ID NO:2的多核苷酸或其子序列来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或物种的菌株的亲本进行编码的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与目的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15，如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应的基因。此类探针涵盖于本发明中。

可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:2或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该运载体材料。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:2；(ii)SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列；(iii)其cDNA序列；(iv)其全长互补序列；或(v)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域中已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下与该核酸探针杂交的分子。

在一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:2的核苷酸61至2022。在另一个方面，核酸探针是编码以下的多核苷酸：SEQ ID NO:1的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，该核酸探针是SEQ ID NO:2或SEQID NO:3。

在另一个实施例中，由某个多核苷酸编码的亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。

该亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。

融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。

该亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此与给出的来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面，该亲本是胞外分泌的。

在另一方面，该亲本是瘤孢毁丝霉的海藻糖酶，属于CAZY定义的家族37糖苷水解酶(“GH37”)，例如SEQ ID NO:1的海藻糖酶。

这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。

可以使用以上探针，鉴定亲本并从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物获得该亲本，或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接获得DNA样品。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人，1989，同上)。

变体的制备

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过涉及使用包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。

还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公布号2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16)。

可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码目的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，该相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。在一个实施例中，该多核苷酸是分离的。

核酸构建体

本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。在一个具体实施例中，至少一种控制序列与编码本发明的变体的多核苷酸是异源的(不同来源/物种)。

可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维素二糖水解酶I、里氏木霉纤维素二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自以下的基因：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人,1992,同上描述。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。

控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

该控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加到转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。

丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化从针对以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。

酵母宿主细胞的有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。

控制序列还可以是信号肽编码区，该信号肽编码区编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导变体进入细胞的分泌通路。该多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，该编码序列的5’末端可以包含对于该编码序列来说是外来的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人,1992,同上描述。

所述控制序列还可以是编码位于变体的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻变体的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。

还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。

该重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起该多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。

载体优选地包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，该载体可包含用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当包含足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。在一个具体实施例中，重组宿主细胞包含编码本发明的变体的多核苷酸，其中所述多核苷酸与宿主细胞是异源的(不同来源/物种)。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[安斯沃思和拜斯比真菌字典],第8版,1995,CAB International[国际应用生物科学中心],University Press[大学出版社],Cambridge，UK[英国剑桥]中定义的)。

真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母及属于半知菌纲(芽孢纲)的酵母。由于对酵母的分类将来可能变化，出于本发明的目的，酵母应当按照Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编辑，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)细胞、汉逊酵母属(Hansenula)细胞、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞、酵母菌属(Saccharomyces)细胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶罗维亚酵母属(Yarrowia)细胞、例如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)细胞、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)细胞、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)细胞、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)细胞、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞或解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。在一个具体实施例中，所述宿主细胞是酿酒酵母细胞。在另一个具体的实施例中，根据本发明，所述宿主细胞，尤其是酿酒酵母，被用作表达海藻糖酶的发酵生物。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门和卵菌门的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995(同上)所定义的)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(例如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢菌、谷类镰孢菌、库威镰孢菌、大刀镰孢菌、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢菌、异孢镰孢菌、合欢木镰孢菌、尖孢镰孢菌、多枝镰孢菌、粉红镰孢菌、接骨木镰孢菌、肤色镰孢菌、拟分枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢菌、拟丝孢镰孢菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序描述于以下文献中：EP 238023,Yelton等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人,1988,Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的合适方法由Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente,在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,AcademicPress,Inc.[学术出版社有限公司],纽约)；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收该变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据所公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果变体被分泌到营养介质中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。

可以使用本领域已知的对所述变体特异的方法检测所述变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该变体的活性。

可以使用本领域已知的方法回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从营养介质中回收该变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑，VCH出版社(VCH Publishers),纽约,1989)。

在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。在一个具体实施例中，通过本发明的重组宿主细胞的发酵产生全培养液配制品。该发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，该发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在一个特定实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。

在一方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所述的方法来产生。

酶组合物

本发明还涉及包含本发明的具有海藻糖酶活性的多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富含”指示，该组合物的海藻糖酶活性已经增加，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，如选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶以及葡糖淀粉酶。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶和源自埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的葡糖淀粉酶(例如SEQ ID NO:4)。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶和源自粘褶菌属(Gloeophyllum)，如篱边粘褶菌(G.sepiarium)(例如SEQ ID NO:5)或密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum)(例如SEQ ID NO:6)的葡糖淀粉酶。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶以及α-淀粉酶。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶以及源自根毛霉属(Rhizomucor)，优选微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)的菌株，如具有接头(例如，来自黑曲霉)和淀粉结合域(例如，来自黑曲霉)的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体的α-淀粉酶。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及纤维素分解酶组合物。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及纤维素分解酶组合物，其中该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及蛋白酶。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶以及蛋白酶。所述蛋白酶可源自桔橙嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、纤维素分解酶组合物以及蛋白酶。在实施例中，该组合物包含本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶(例如源自埃默森篮状菌、篱边粘褶菌或密粘褶菌的葡糖淀粉酶)、α-淀粉酶(例如源自微小根毛霉的，特别是具有接头和淀粉结合域(特别是源自黑曲霉)的，特别是具有如下取代的：G128D+D143N(使用SEQ ID NO:7进行编号))；源自里氏木霉的纤维素分解酶组合物，和蛋白酶(例如源自桔橙嗜热子囊菌或大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus))。

具体涵盖的次要的酶的实例，例如，本文的SEQ ID NO:4中所示的源自埃默森篮状菌的葡糖淀粉酶或与本文SEQ ID NO:4具有例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的葡糖淀粉酶，可见于下文的“酶”一节中。

可以根据本领域已知的方法来制备组合物，并且这些组合物可以处于液体或干组合物的形式。可以根据本领域已知的方法将组合物稳定化。

下面给出了本发明的组合物的优选的用途的实例。该组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。

用途

本发明的方法

使用本发明的海藻糖酶从糊化的淀粉材料产生发酵产物

在此方面，本发明涉及从糊化的和/或未糊化的含淀粉材料或纤维素材料产生发酵产物，特别是乙醇。在糖化/水解过程中生成的可发酵糖在通过发酵生物(特别是酵母)的发酵过程中转化为所述的所希望的发酵(产物)，特别是乙醇。

在实施例中，本发明涉及生产发酵产物(特别是乙醇)的方法，该方法包括：

(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；

任选地在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；

(b)使所液化的材料糖化；

(c)使用发酵生物进行发酵；

其中

i)葡糖淀粉酶；

ii)本发明的海藻糖酶；

iii)任选的纤维素分解酶组合物和/或蛋白酶；

在以下步骤的过程中存在和/或添加：

-糖化步骤(b)；

-发酵步骤(c)；

-同时的糖化和发酵；

-任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。

在另一个实施例中，本发明涉及生产发酵产物(特别是乙醇)的方法，该方法包括：

(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；

(b)使所液化的材料糖化；

(c)使用发酵生物进行发酵；

其中本发明的葡糖淀粉酶和海藻糖酶存在和/或添加于

-糖化步骤(b)；

-发酵步骤(c)；

-同时糖化和发酵。

液化步骤(a)

根据本发明的方法，步骤(a)中的液化通过如下进行：将含淀粉材料在起始糊化温度以上的温度(特别是在80℃-90℃的温度)用α-淀粉酶和任选的蛋白酶和其他酶(如葡糖淀粉酶、普鲁兰酶和/或肌醇六磷酸酶)处理。

术语“起始糊化温度”意指含淀粉材料糊化开始的最低温度。通常，在水中加热的淀粉在约50℃与75℃之间开始糊化；糊化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始糊化温度可以根据植物物种、植物物种的具体品种、以及生长条件而变化。在本发明的上下文中，给定的含淀粉材料的初始糊化温度是使用Gorinstein和Lii，1992，

[淀粉]44(12):461-466所描述的方法，使5％的淀粉颗粒丧失双折射的温度。

根据本发明，步骤(a)中的液化典型地在从70℃-100℃范围的温度进行。在实施例中，液化中的温度为75℃-95℃，如在75℃-90℃，优选80℃-90℃，如82℃-88℃，如约85℃。

液化中的pH可在3-7，优选4-6，或更优选4.5-5.5范围。

根据本发明，在步骤(a)中的液化之前，可进行喷射蒸煮(jet-cooking)步骤。该喷射蒸煮可在110℃-145℃，优选120℃-140℃，如125℃-135℃，优选约130℃的温度进行约1-15分钟，优选进行约3-10分钟，尤其是大约5分钟。

在实施例中，本发明的方法在液化步骤(a)之前进一步包括以下步骤：

x)减小含淀粉材料的粒度，优选通过干磨进行；

z)形成包含该含淀粉材料和水的浆料。

根据本发明，液化中的干固体含量(DS)在20-55wt.-％，优选25-45wt.-％，更优选30-40wt.-％或30-45wt-％的范围。

该含淀粉起始材料(如全谷物)可(例如通过磨制)减少粒度以打开结构、增大表面积并且允许进一步加工。通常存在两种类型的方法：湿磨和干磨。在干磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)良好分离。湿磨常常应用于使用淀粉水解物产生例如糖浆的场合(location)。干磨和湿磨在淀粉加工领域中都是众所周知的。根据本发明，优选干磨。

在实施例中，将粒度减小至0.05至3.0mm、优选0.1-0.5mm，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过具有0.05至3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。在另一个实施例中，至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，尤其是至少90％的含淀粉材料适合通过具有#6筛网的筛子。

步骤(a)中的液化可进行0.5-5小时，如1-3小时，如典型地约2小时。

起初可将α-淀粉酶和其他任选的酶如蛋白酶添加到水性浆料中来开始液化(稀化)。在实施例中，这些酶中仅有一部分(例如，约1/3)被添加到该水性浆料中，而这些酶中的剩余部分(例如，约2/3)在液化步骤(a)中添加。

α-淀粉酶的实例的非穷尽列表可见于下文“液化中存在和/或添加的α-淀粉酶”一节中。在一个优选实施例中，该α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶。细菌α-淀粉酶典型地是热稳定的。在一个优选实施例中，该α-淀粉酶源自芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:8中所示的。

在实施例中，液化步骤(a)中使用的α-淀粉酶是本文的SEQ ID NO:8中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，特别是具有I181*+G182*中的双缺失，和任选地具有N193F取代，并被截短以成为长度约491个氨基酸，例如长度为480-495个氨基酸。

合适的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的实例可见于下文“热稳定的α-淀粉酶”一节，并包括来自具有双缺失I181*+G182*，和任选的N193F取代，和另外的以下取代的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的下组中的一种：

-E129V+K177L+R179E；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及

-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用SEQ ID NO:8进行编号)。

根据本发明的方法，步骤(a)中的液化可使用α-淀粉酶(例如，SEQ ID NO:8中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶)和蛋白酶(例如，SEQ ID NO:9中所示的激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(pfu蛋白酶))的组合进行。也可以存在葡糖淀粉酶，如本文SEQ IDNO:10中所示源自草酸青霉(Penicillium oxalicum)的(参见下文“液化步骤(a)中存在和/或添加的葡糖淀粉酶”一节。

糖化与发酵

本发明的海藻糖酶、葡糖淀粉酶和任选的蛋白酶和/或纤维素分解酶组合物可在以下步骤中存在和/或添加：糖化步骤(b)；发酵步骤(c)；同时的糖化和发酵(SSF)；任选的在步骤(b)之前的预糖化步骤。

在一个优选实施例中，葡糖淀粉酶是与真菌α-淀粉酶，特别是酸性真菌α-淀粉酶一起添加的。葡糖淀粉酶的实例可见于下文“糖化和/或发酵中存在和/或添加的葡糖淀粉酶”一节。

当进行顺序的糖化和发酵时，糖化步骤(b)可在本领域中已知的条件下(即，适于酶糖化)进行。例如，糖化步骤(b)可持续多至约24至约72小时。

在实施例中，在步骤(b)中的糖化之前进行预糖化。预糖化在30℃-65℃，典型地约60℃的温度典型地进行40-90分钟。在实施例中，在同时糖化和发酵(SSF)中，预糖化之后是发酵过程中的糖化。糖化典型地在20℃-75℃，优选40℃-70℃，典型地约60℃的温度和在4-5的pH、一般在约pH 4.5进行。

同时糖化和发酵(“SSF”)广泛地用于工业规模的发酵产物生产方法中，尤其是乙醇生产方法中。当进行SSF时，同时进行糖化步骤(b)和发酵步骤(c)。不存在针对糖化的保持阶段，意指发酵生物(特别是酵母)和酶可一起添加。然而，还涵盖分开添加发酵生物和酶。根据本发明，SSF可典型地在25℃至40℃，如28℃至35℃，如30℃至34℃、优选大约32℃的温度进行。在实施例中，发酵进行6至120小时，尤其是24至96小时。在实施例中，pH是在4-5之间。

在本发明的一个实施例中，在糖化步骤(b)、发酵步骤(c)或同时糖化发酵(SSF)或步骤(b)之前的预糖化中存在和/或添加纤维素分解组合物。此类纤维素分解组合物的实例可见于下文“糖化和/或发酵期间存在和/或添加的纤维素分解组合物”一节。任选的纤维素分解组合物可与葡糖淀粉酶和本发明的海藻糖酶一起存在和/或添加。蛋白酶的实例可见于下文“糖化和/或发酵中存在和/或添加的蛋白酶”一节。

在一个优选实施例中，海藻糖酶以0.01-20ug EP海藻糖酶/g DS，如0.05-15ug EP海藻糖酶/g DS，如0.5-10ug EP海藻糖酶/g DS的量存在和/或添加。

含淀粉材料

根据本发明，可使用任何合适的含淀粉材料。通常基于期望的发酵产物(特别是乙醇)来选择起始材料。适用于本发明的方法的含淀粉起始材料的实例包括谷类、块茎或谷物。具体地，含淀粉材料可为玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯(cassava)、树薯(tapioca)、高粱、燕麦、水稻、豌豆、豆类、或甘薯、或它们的混合物。还考虑了糯型(waxytype)与非糯型(non-waxy type)的玉米与大麦。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是玉米。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是小麦。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是大麦。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是黑麦。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是买罗高粱。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是西米。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是木薯。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是树薯。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是高粱。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是水稻，

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是豌豆。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是豆类。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是甘薯。

在一个优选实施例中，含淀粉起始材料是燕麦。

使用本发明的海藻糖酶从未糊化的淀粉材料产生发酵产物

本发明的海藻糖酶可合适地用于生淀粉水解(RSH)方法用于产生所希望的发酵产物，特别是乙醇。在RSH方法中，因为该方法是在低于所述淀粉的起始糊化温度(上文定义的)的温度进行，淀粉不糊化。

在实施例中，所希望发酵产物可为从未糊化的(即未蒸煮的)、优选研磨的谷物(如玉米)或小粒谷物(例如小麦、燕麦、大麦、黑麦、水稻)或谷类(例如高粱)生产的乙醇。合适的含淀粉起始材料的实例在上文“含淀粉材料”一节中列出。

因此，在此方面，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，该方法包括：

(a)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；以及

(b)使用发酵生物进行发酵；以及

(c)任选地回收所述发酵产物；

其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：本发明的葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、海藻糖酶，和任选的纤维素分解酶组合物和/或蛋白酶。

在步骤(a)之前，可制备具有含淀粉材料的10-55wt.％干固体(DS)、优选25-45wt.％干固体、更优选30-40％干固体的含淀粉材料(如颗粒状淀粉)的水性浆料。该浆料可以包括水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧流汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水。因为本发明的生淀粉水解方法是在低于该起始糊化温度进行的，而因此不发生显著的粘度增加，如果希望的话，可使用高水平的釜馏物。在实施例中，水性浆料含有约1vol.％至约70vol.％、优选15vol.％-60vol.％、尤其是约30vol.％至50vol.％的水和/或工艺用水，如釜馏物(逆流)、洗涤器水、蒸发器冷凝物或馏出物、由蒸馏得到的侧线汽提器水，或来自其他发酵产物设备的工艺用水，或其组合等。

在实施例中，在步骤(a)之前，将逆流或另一再循环流添加至浆料，或添加至糖化(步骤(a))，或添加至同时糖化和发酵步骤(组合的步骤(a)和步骤(b))。

本发明的RSH方法是在起始糊化温度以下的温度进行的，这意指进行单独的步骤(a)的温度典型地在25℃-75℃、例如30℃-70℃、或45℃-60℃的范围。

在一个优选实施例中，在步骤(b)中的发酵或步骤(a)和(b)中的同时糖化和发酵期间的温度为25℃-40℃、优选28℃-36℃、如在28℃-35℃、如28℃-34℃、如约32℃。

在本发明的一个实施例中，发酵进行30至150小时，优选48至96小时。66.

在实施例中，进行发酵使得糖水平(如葡萄糖水平)保持在低水平，如6wt.-％以下、如约3wt.-％以下、如约2wt.-％以下、如约1wt.-％以下、如约0.5％以下、或0.25％wt.-％以下、如约0.1wt.-％以下。通过简单地采用调整量的酶和发酵生物可实现这样的低水平的糖。本领域的普通技术人员可容易地确定有待使用的酶和发酵生物的剂量/数量。还可以选择酶和发酵生物的所采用的量以在发酵液中维持低麦芽糖浓度。例如，麦芽糖水平可保持在低于约0.5wt.-％，例如低于约0.2wt.-％。

本发明的方法可以在从3与7之间、优选从3至6、或更优选从3.5至5.0的pH下进行。

术语“颗粒状淀粉”意思指未蒸煮的生淀粉，即，例如在谷类、块茎或谷物中发现的呈其天然形式的淀粉。淀粉是在植物细胞内作为不溶于水的微小颗粒形成。当放入冷水中时，这些淀粉颗粒可吸收少量的液体并膨胀。在高至约50℃至75℃的温度，膨胀可为可逆的。然而，在更高温度下，开始称为“糊化”的不可逆膨胀。颗粒状淀粉可为高度精制的淀粉，优选至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯，或它可为含更粗制的淀粉的材料，其包括(例如，磨制的)全谷物，所述全谷物包含非淀粉级分，例如胚残余物和纤维。

该原材料(如全谷物)可例如通过磨制减小粒度，以打开结构并且允许进一步加工。合适的粒度的实例在US 4514496和WO 2004/081193(两篇文件通过引用由此并入)中披露。根据本发明，两种方法是优选的：湿磨和干磨。在干磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨给出胚与粗粉(淀粉颗粒和蛋白)的良好分离，并且常常应用于使用淀粉水解产物生产例如糖浆的场合(location)。干磨和湿磨两者都是淀粉加工领域中熟知的。

在实施例中，将粒度减小至0.05至3.0mm、优选0.1-0.5mm，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过具有0.05至3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。在一个优选实施例中，通过减小含淀粉材料的粒度(优选通过磨制)使得至少50％的含淀粉材料具有0.1-0.5mm的粒度，来制备含淀粉材料。

在一个优选实施例中，海藻糖酶以0.01-20ug EP海藻糖酶/g DS，如0.05-15ug EP海藻糖酶/g DS，如0.5-10ug EP海藻糖酶/g DS的量存在和/或添加。

根据本发明，添加酶使得葡糖淀粉酶以0.001至10AGU/g DS、优选0.01至5AGU/gDS、尤其是0.1至0.5AGU/g DS的量存在。

根据本发明，添加酶使得α-淀粉酶以0.001至10AFAU/g DS，优选地从0.01至5AFAU/g DS，尤其是0.3至2AFAU/g DS或0.001至1FAU-F/g DS，优选0.01至1FAU-F/g DS的量存在或添加。

根据本发明，添加酶使得纤维素分解酶组合物以1-10,000微克EP/g DS，如2-5,000，如3和1,000，如4和500微克EP/g DS的量存在或添加。

根据本发明，添加酶使得纤维素分解酶组合物以0.1-100FPU/克总固体(TS)、优选0.5-50FPU/克TS、尤其是1-20FPU/克TS的量存在或添加。

在本发明的一个实施例中，添加酶使得蛋白酶以0.0001-1mg酶蛋白/g DS，优选0.001至0.1mg酶蛋白/g DS的量存在。可替代地，将蛋白酶以0.0001至1LAPU/g DS，优选0.001至0.1LAPU/g DS和/或0.0001至1mAU-RH/g DS，优选0.001至0.1mAU-RH/g DS的量存在和/或添加。

在本发明的一个实施例中，添加酶使得蛋白酶以1-1,000μg EP/g DS，如2-500μgEP/g DS，如3-250μg EP/g DS范围的量存在或添加。

在一个优选实施例中，葡糖淀粉酶和α-淀粉酶之间的比率为99:1与1:2之间，如98:2与1:1之间，如在97:3与2:1之间，如在96:4与3:1之间，如97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、90:10、85:15、83:17或65:35(mg EP葡糖淀粉酶:mg EPα-淀粉酶)。

在一个优选实施例中，根据本发明，葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的总剂量是从10-1,000μg/g DS，例如从50-500μg/g DS，例如75-250μg/g DS。

在一个优选实施例中，添加的纤维素分解酶组合物的总剂量是从10-500μg/g DS，例如从20-400μg/g DS，例如20-300μg/g DS。

在实施例中，发酵或SSF中使用的葡糖淀粉酶(如源自瓣环栓菌(Trametescingulata)的葡糖淀粉酶)与SEQ ID NO:11的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。

在实施例中，发酵或SSF中使用的葡糖淀粉酶(如源自血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)的葡糖淀粉酶)与SEQ ID NO:12的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。

在实施例中，发酵或SSF中使用的α-淀粉酶与SEQ ID NO:7的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。

在一个优选实施例中，本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产物的方法，这些方法包括：

(a)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；以及

(b)使用发酵生物进行发酵；

其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：

i)葡糖淀粉酶；

ii)α-淀粉酶；

iii)本发明的海藻糖酶；

iii)任选的纤维素分解酶组合物和/或蛋白酶。

在一个优选实施例中，可以作为本发明的酶组合物来添加酶。在一个优选实施例中，同时进行步骤(a)和步骤(b)(即，一步发酵)。然而，也可以顺序地进行步骤(a)和(b)。

发酵

在发酵培养基中进行发酵。发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物代谢的碳水化合物源。根据本发明，发酵培养基可以包含用于一种或多种发酵生物的一种或多种营养素和生长刺激剂。营养素和生长刺激剂在发酵领域中广泛使用，且包括氮源如氨；尿素、维生素和矿物质或其组合。

用于基于淀粉的发酵的发酵生物

术语“发酵生物”是指适用于发酵过程中并且能够生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，尤其是酵母。尤其合适的发酵生物能够使糖(如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵(即，转化)成所希望的发酵产物(如特别是乙醇)。发酵生物的实例包括真菌生物，如特别是酵母。优选的酵母包括酵母属物种的菌株，特别是酿酒酵母。在一个特定实施例中，变体海藻糖酶与发酵生物，特别是酵母生物，更特别是干酵母共同配制。

在发酵(如SSF)期间，有活力的发酵生物的合适的浓度在本领域是熟知的，或可以由本领域的技术人员容易地确定。在一个实施例中，将发酵生物(如乙醇发酵酵母(例如，酿酒酵母))添加至发酵培养基中，使得每mL的发酵培养基的有活力的发酵生物(如酵母)计数在从10⁵至10¹²，优选从10⁷至10¹⁰的范围内，尤其是约5 x 10⁷个。

可商购的酵母的实例包括例如RED STAR^TM和ETHANOL RED^TM酵母(可获得自富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentis/Lesaffre)，美国)、FALI(可获得自弗莱希曼酵母公司(Fleischmann’s Yeast)，美国)、SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可获得自乙醇技术公司(Ethanol Technology)，威斯康星州，美国)、BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物制品公司(North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国)、GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德公司(Gert Strand AB)，瑞典)以及FERMIOL(可获得自帝斯曼特殊产品公司(DSM Specialties))。

回收

在发酵(例如，SSF)后，可将发酵产物(特别是乙醇)从发酵培养基中分离。可蒸馏该浆料以回收/提取所希望的发酵产物(即，乙醇)。可替代地，可通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物(即，乙醇)。还可通过汽提或本领域中熟知的其他方法来回收发酵产物(即，乙醇)。

液化中存在和/或添加的α-淀粉酶

根据本发明，α-淀粉酶，任选地与其他酶如蛋白酶、葡糖淀粉酶、肌醇六磷酸酶和/或普鲁兰酶一起，在液化中存在和/或添加。

在液化步骤(a)中添加的α-淀粉酶可为任何α-淀粉酶。优选的是细菌α-淀粉酶，其在液化过程中使用的温度通常是稳定的。

细菌α-淀粉酶

术语“细菌α-淀粉酶”意指在EC 3.2.1.1项下分类的任何细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可例如源自芽孢杆菌属(有时也称作地芽孢杆菌属)的菌株。在实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可源自其他芽孢杆菌属菌种。

细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:8的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，以及WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列都通过引用由此并入)。在实施例中，该α-淀粉酶可为分别与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。

在实施例中，该α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或本文的SEQID NO:8所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。

在优选实施例中，该α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为成熟野生型或其成熟变体。该成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为在重组产生过程中天然地截短的。例如，该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为截短的，因此它具有约491个氨基酸，例如，使得它长度为480-495个之间氨基酸，因而它缺乏功能性淀粉结合结构域(相较于WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:8)。

该芽孢杆菌α-淀粉酶还可为变体和/或杂合体。这样的变体的实例可见于以下任一者中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、以及WO 02/10355(所有文件都通过引用由此并入)。具体的α-淀粉酶变体在美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723中披露(通过引用由此并入)并包括具有以下改变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(常常称作BSGα-淀粉酶)变体，这些变体在位置R179、G180、I181和/或G182处具有一个或两个氨基酸的缺失，优选WO 96/23873中披露的双缺失-参见例如第20页，第1-10行(通过引用由此并入)，优选与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQID NO:8所述的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置I181和G182的缺失，或使用WO 99/19467(该参考文件通过引用由此并入)中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:8用于编号的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:8所述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于位置181和182的缺失的双缺失并进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中的S239、或WO 99/19467中的SEQID NO:3或本文的SEQ ID NO:8的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242和/或E188P变体的位置处具有取代。

在实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，优选S242Q变体(使用本文的SEQ ID NO:8进行编号)。

在实施例中，该变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的位置E188变体，优选E188P变体(使用本文的SEQ ID NO:8进行编号)。

在实施例中，细菌α-淀粉酶可为截短的芽孢杆菌属α-淀粉酶。尤其地，截短是这样的，例如，使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:8中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是约491个氨基酸长，如从480至495个氨基酸长，或者因此其缺乏功能性淀粉结合结构域。

细菌杂合α-淀粉酶

该细菌α-淀粉酶也可为杂合细菌α-淀粉酶，例如包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO99/19467的SEQ ID NO:4中所示)的445个C-末端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(WO 99/19467的SEQ ID NO:5中所示)的37个N-末端氨基酸残基的α-淀粉酶。在优选的实施例中，该杂合体具有下列取代中的一个或多个，尤其是全部：

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌编号方式)。还优选的是具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5进行位置编号)。

在实施例中，该细菌α-淀粉酶是嵌合α-淀粉酶的成熟部分，其披露于Richardson等人(2002),The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],277卷,29期,7月19日发表,267501-26507页中，称作BD5088或其变体。此α-淀粉酶与WO 2007134207中的SEQID NO:2所示的相同。成熟酶序列在位置1处的起始“Met”氨基酸之后开始。

热稳定的α-淀粉酶

α-淀粉酶可为热稳定的α-淀粉酶，如热稳定的细菌α-淀粉酶，优选来自嗜热脂肪芽孢杆菌。

在本发明的一个实施例中，α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选源自芽孢杆菌属，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是如WO 99/019467中作为SEQ ID NO:3(本文的SEQ IDNO:8)披露的嗜热脂肪芽孢杆菌，其在位置R179、G180、I181和/或G182处缺失一个或两个氨基酸，特别是R179和G180缺失、或I181和G182缺失，具有以下突变列表中的突变。

在优选实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有双缺失I181+G182，以及任选的取代N193F，进一步包括选自以下列表的突变：

关于上面的α-淀粉酶变体的热稳定性的具体信息可见于WO 12/088303(诺维信公司)，其通过引用由此并入。

在一个优选实施例中，α-淀粉酶选自下组：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，这些变体具有I181+G182中的双缺失，和任选的N193F中的取代，以及选自以下列表的取代：

-E129V+K177L+R179E；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；

-V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；

-V59A+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及

-E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:8进行编号)。

应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式产生。特别地，截短可为这样使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:8中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端截短并且典型地为约491个氨基酸长，如480至495个氨基酸长，或使得其缺乏功能性淀粉结合结构域。

在一个优选实施例中，该α-淀粉酶变体可为与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或本文的SEQ ID NO:8所示的序列具有至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％同一性程度的酶。

在实施例中，将该细菌α-淀粉酶，例如，芽孢杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，或其变体，以在0.01-10KNU-A/g Ds之间，例如，0.02-5KNU-A/g Ds，如0.03和3KNU-A，优选0.04和2KNU-A/g Ds，如尤其是0.01和2KNU-A/g DS之间的浓度剂量添加至液化。在实施例中，将细菌α-淀粉酶，例如芽孢杆菌属α-淀粉酶，如尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、或其变体，以在0.0001-1mg EP(酶蛋白)/g DS、例如0.0005-0.5mg EP/gDS、如0.001-0.1mg EP/g DS之间的浓度投加到液化中。

液化中存在和/或添加的蛋白酶

根据本发明，蛋白酶可任选地与α-淀粉酶、和任选的葡糖淀粉酶、肌醇六磷酸酶和/或普鲁兰酶一起存在和/或添加至液化。

蛋白酶根据其催化机制分为以下几类：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。

在一个优选实施例中，根据本发明使用的热稳定的蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)的蛋白酶。

为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。

可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。

蛋白酶底物的实例为酪蛋白，如Azurine-Crosslinked Casein(天青精-交联的酪蛋白，AZCL-酪蛋白)。在下文“材料与方法”部分中描述了两种蛋白酶测定，其中所谓的“AZCL-酪蛋白测定”是优选的测定。

对于在本发明的方法中使用的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。

在一个实施例中，该蛋白酶是真菌来源的。

该蛋白酶可为，例如，野生型蛋白酶的变体，只要该蛋白酶是热稳定的。在一个优选实施例中，该热稳定的蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在实施例中，在本发明的方法中使用的热稳定的蛋白酶是真菌来源的，如真菌金属蛋白酶，如源自嗜热子囊菌属的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌的菌株，尤其是桔橙嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC3.4.24.39)。

在实施例中，该热稳定的蛋白酶是披露于以下的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2中所示的金属蛋白酶的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分以及本文作为SEQ ID NO:13所示的，进一步具有选自以下列表的突变：

-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；

-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；

-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；

-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；

-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；

-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D142L。

关于上述的蛋白酶变体的热稳定性的具体信息可见于WO 12/088303(诺维信公司)，其通过引用由此并入。

在一个优选实施例中，该热稳定的蛋白酶是披露于以下的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2中所示的金属蛋白酶的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分以及本文的SEQ ID NO:13中所示的，进一步具有选自以下列表的突变：

D79L+S87P+A112P+D142L；

D79L+S87P+D142L；或

A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。

在实施例中，蛋白酶变体与披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分或本文的SEQ ID NO:13具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的同一性。

该热稳定性蛋白酶还可源自任何细菌，只要该蛋白酶具有根据本发明定义的热稳定性特性。

在实施例中，该热稳定的蛋白酶源自细菌火球菌属的菌株，如激烈火球菌的菌株(pfu蛋白酶)。

在实施例中，该蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(Takara ShuzoCompany))中的SEQ ID NO:1、或本文的SEQ ID NO:9所示的一种。

在另一个实施例中，热稳定的蛋白酶是披露于本文的SEQ ID NO:9中的蛋白酶或是与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:9具有至少80％同一性，如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的蛋白酶。激烈火球菌蛋白酶可购买自日本宝酒造生物公司(Takara Bio,Japan)。

液化中存在和/或添加的葡糖淀粉酶

根据本发明，葡糖淀粉酶可任选地存在和/或添加到液化步骤(a)中。在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶与α-淀粉酶和任选的蛋白酶、肌醇六磷酸酶和/或普鲁兰酶一起添加或与其分开添加。

在一个具体且优选的实施例中，该葡糖淀粉酶，优选真菌来源的，优选丝状真菌，来自青霉属的菌株，尤其是草酸青霉的菌株，特别是WO2011/127802(其通过引用由此并入)中作为SEQ ID NO:2披露的以及本文的SEQ ID NO:10中所示的草酸青霉葡糖淀粉酶。

在实施例中，该葡糖淀粉酶与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽或本文的SEQ ID NO:10具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中作为SEQ ID NO:2披露的以及本文的SEQ ID NO:10中所示的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，具有K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:10中所示的成熟序列进行编号)。如WO 2013/036526(其通过引用由此并入)中披露的，该K79V葡糖淀粉酶变体相对于亲本对蛋白酶降解具有降低的敏感度。

在实施例中，该葡糖淀粉酶源自草酸青霉。

在实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中作为SEQ ID NO:2披露的以及本文的SEQ ID NO:10中所示的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体。在一个优选实施例中，该草酸青霉葡糖淀粉酶是WO 2011/127802中作为SEQ ID NO:2披露的以及本文的SEQ ID NO:10中所示的，在位置79处具有Val(V)(使用本文的SEQ ID NO:10进行编号)。

涵盖的草酸青霉葡糖淀粉酶变体披露于WO 2013/053801(其通过引用由此并入)中。

在实施例中，这些变体具有对蛋白酶降解的降低的敏感度。

在实施例中，这些变体与亲本相比具有改进的热稳定性。

更具体地，在实施例中，该葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:10用于编号)，(PE001变体)，并进一步包括以下取代或取代的组合中的至少一个：

T65A；或

Q327F；或

E501V；或

Y504T；或

Y504*；或

T65A+Q327F；或

T65A+E501V；或

T65A+Y504T；或

T65A+Y504*；或

Q327F+E501V；或

Q327F+Y504T；或

Q327F+Y504*；或

E501V+Y504T；或

E501V+Y504*；或

T65A+Q327F+E501V；或

T65A+Q327F+Y504T；或

T65A+E501V+Y504T；或

Q327F+E501V+Y504T；或

T65A+Q327F+Y504*；或

T65A+E501V+Y504*；或

Q327F+E501V+Y504*；或

T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

T65A+Q327F+E501V+Y504*；

E501V+Y504T；或

T65A+K161S；或

T65A+Q405T；或

T65A+Q327W；或

T65A+Q327F；或

T65A+Q327Y；或

P11F+T65A+Q327F；或

R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；或

P11F+T65A+Q327W；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

T65A+S105P+Q327W；或

T65A+S105P+Q327F；或

T65A+Q327W+S364P；或

T65A+Q327F+S364P；或

T65A+S103N+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；或

P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；或

P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；或

P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或

K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；或

S255N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。

在一个优选实施例中，该草酸青霉葡糖淀粉酶变体具有对应于PE001变体的K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:10用于编号)，并进一步包括以下突变中的一种：

P11F+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。

该葡糖淀粉酶能以0.1-100微克EP/g，如0.5-50微克EP/g，如1-25微克EP/g，如2-12微克EP/g DS的量添加。

糖化和/或发酵中存在和/或添加的海藻糖酶

根据本发明的方法，本发明的海藻糖酶在如下步骤过程中存在和/或添加：

-糖化步骤(b)；

-发酵步骤(c)；

-同时的糖化和发酵；

-任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。

在一个优选实施例中，海藻糖酶以0.01-20ug EP(酶蛋白)之间海藻糖酶/g DS，如0.05-15ug EP海藻糖酶/g DS之间，如0.5-10ug EP海藻糖酶/g DS之间的量存在和/或添加。

糖化和/或发酵中存在和/或添加的葡糖淀粉酶

在如下步骤过程中存在和/或添加的葡糖淀粉酶：糖化步骤(b)；发酵步骤(c)；同时的糖化和发酵；或步骤(b)之前的预糖化步骤，可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组，该组由以下组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人,1984,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3(5),第1097-1102页)，或其变体，如WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中披露的那些(来自丹麦诺维信公司，(Novozymes，Denmark))；WO 84/02921中披露的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.[农业与生物化学](1991),55(4),第941-949页)，或它们的变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人(1996),Prot.Eng.[蛋白质工程]9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人(1995),Prot.Eng.[蛋白质工程]8,575-582)；N182(Chen等人(1994),Biochem.J.301[生物化学杂志],275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等人,1996,Biochemistry[生物化学],35:8698-8704)；和在A435和S436位置引入Pro残基(Li等人,1997,Protein Engng.[蛋白质工程]10,1199-1204)。

其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(以前命名为罗尔伏革菌)葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等人，(1998)，“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii[来自罗尔伏革菌的生淀粉降解葡糖淀粉酶的纯化和特性]”)Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森篮状菌(WO 99/28448)、嗜热篮状菌(美国专利登记号32,153)、Talaromyces duponti、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。在一个优选实施例中，糖化和/或发酵过程中使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。

涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。

涵盖的真菌葡糖淀粉酶包括均WO 2006/069289中披露的瓣环栓菌(SEQ ID NO:11)、纸质大纹饰孢(Pachykytospora papyracea)和大白桩蘑(Leucopaxillusgiganteus)；或WO 2007/124285中披露的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)；或其混合物。根据本发明还涵盖杂合葡糖淀粉酶。实例包括WO 2005/045018中披露的杂合葡糖淀粉酶。具体实例包括实例1的表1和4中披露的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用由此并入)。

在实施例中，该葡糖淀粉酶源自密孔菌属(Pycnoporus)的菌株，特别是如WO2011/066576中所述的血红密孔菌的菌株(SEQ ID NO 2、4或6)，特别是作为本文的SEQ IDNO:12所示的(对应于WO 2011/066576中的SEQ ID NO:4)，或来自粘褶菌属(Gloeophyllum)的菌株，如篱边粘褶菌(Gloeophyllum sepiarium)或密粘褶菌(Gloeophyllum trabeum)的菌株，特别是如WO 2011/068803中所述的粘褶菌属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)。在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶是WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:5(即，篱边粘褶菌葡糖淀粉酶)。在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶是本文的SEQ ID NO:6(即，WO 2014/177546中作为SEQ ID NO:3披露的密粘褶菌葡糖淀粉酶)(所有参考文件通过引用由此并入)。

还涵盖葡糖淀粉酶，这些葡糖淀粉酶与上述葡糖淀粉酶中的任一种显示高同一性，即，分别与上述酶序列的成熟部分中的任一个，如本文的SEQ ID NO:4、11、5、6或12中的任一个显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。

在实施例中，发酵或SSF中使用的葡糖淀粉酶与本文的SEQ ID NO:6的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。

在实施例中，发酵或SSF中使用的葡糖淀粉酶与本文的SEQ ID NO:12的成熟部分显示至少60％，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或甚至100％同一性。

在实施例中，葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/gDS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，如0.1-2AGU/g DS。

在实施例中，可将葡糖淀粉酶以1-1,000μg EP/g DS，优选地10-500μg/gDS，尤其是25-250μg/g DS的量添加至糖化和/或发酵中。

在实施例中，该葡糖淀粉酶作为进一步包含α-淀粉酶的共混物添加。在一个优选实施例中，该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，尤其是酸性真菌α-淀粉酶。该α-淀粉酶典型地是副活性。

在实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含WO 99/28448中作为SEQ IDNO:34或本文的SEQ ID NO:4披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶和在WO 06/069289中作为SEQID NO:2和/或本文的SEQ ID NO:11披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶。

在实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含本文的SEQ ID NO:4中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、本文中作为SEQ ID NO:11披露的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及WO2006/069290的表5中作为V039或本文的SEQ ID NO:7披露的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶。

在实施例中，该葡糖淀粉酶是共混物，该共混物包含本文中作为SEQ ID NO:5所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶以及本文中作为SEQ ID NO:7披露的、具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，具有以下取代：G128D+D143N。

在实施例中，该α-淀粉酶可为源自根毛霉属的菌株，优选微小根毛霉的菌株，如WO2013/006756中的SEQ ID NO:3中所示的，或亚灰树花菌属(Meripilus)，优选大型亚灰树花菌的菌株。在一个优选实施例中，该α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的微小根毛霉，WO 2006/069290的表5中作为V039或本文的SEQ ID NO:7披露的。

在实施例中，微小根毛霉α-淀粉酶或具有接头和淀粉结合结构域(SBD)，优选黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶具有以下取代或取代组合中的至少一种：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:7进行编号)。在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶共混物包含篱边粘褶菌葡糖淀粉酶(例如，WO 2011/068803中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:5)和微小根毛霉α-淀粉酶。

在一个优选实施例中，该葡糖淀粉酶共混物包含WO 2011/068803中作为SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:5所示的篱边粘褶菌葡糖淀粉酶，以及WO 2013/006756中的SEQID NO:3和本文的SEQ ID NO:7披露的、具有接头和淀粉结合结构域(SBD)，优选黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉，具有以下取代：G128D+D143N。

包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SAN^TM SUPER、SAN^TMEXTRA L、SPIRIZYME^TM PLUS、SPIRIZYME^TM FUEL、SPIRIZYME^TM B4U、SPIRIZYME^TM ULTRA、SPIRIZYME^TM EXCEL、SPIRIZYME ACHIEVE^TM、和AMG^TM E(来自诺维信公司)；OPTIDEX^TM 300、GC480、GC417(来自杜邦-丹尼斯科公司(DuPont-Danisco))；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(来自帝斯曼公司(DSM))；G-ZYME^TM G900、G-ZYME^TM和G990 ZR(来自杜邦-丹尼斯科公司)。

糖化和/或发酵中存在和/或添加的纤维素分解酶组合物

根据本发明，纤维素分解酶组合物可存在于糖化、发酵或同时糖化发酵(SSF)中。

该纤维素分解酶组合物包含β-葡糖苷酶、纤维素二糖水解酶和内切葡聚糖酶。

合适的纤维素分解组合物的实例可见于WO 2008/151079和WO 2013/028928中，其通过引用由此并入。

在优选的实施例中，纤维素分解酶组合物源自木霉属、腐质霉属、或金孢子菌属的菌株。

在实施例中，该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉、特异腐质霉、和/或卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)。

在实施例中，该纤维素分解酶组合物包含β-葡糖苷酶，优选源自曲霉属菌株的β-葡糖苷酶，该曲霉属菌株如米曲霉(如WO 2002/095014中披露的或WO 2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白(特别是WO 2008/057637中的SEQ ID NO:73和74中分别所示的米曲霉β-葡糖苷酶变体融合蛋白，或WO 2008/057637中的SEQ ID NO:75和76中分别所示的米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白-两者均通过引用由此并入))、或者烟曲霉(如WO 2005/047499中或本文的SEQ ID NO:14中披露的或WO 2012/044915(诺维信公司)中披露的烟曲霉β-葡糖苷酶变体)，如具有如下取代中的一个或多个(如所有)的β-葡糖苷酶：F100D、S283G、N456E、F512Y；或源自青霉属(Penicillium)的菌株，如WO 2007/019442中披露的巴西青霉(Penicillium brasilianum)的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。

在实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，如源自嗜热子囊菌属，如桔橙嗜热子囊菌的菌株，如WO 2005/074656中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:15所述的；或源自梭孢壳属，如土生梭孢霉的菌株的多肽，如WO 2005/074647中作为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8描述的多肽；或源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的多肽，如WO 2010/138754中作为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2描述的多肽；或源自青霉属的菌株如埃默森青霉的菌株的多肽，如WO 2011/041397中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16披露的多肽。

在实施例中，该纤维素分解组合物包含纤维素二糖水解酶I(CBH I)，如源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的，如WO 2011/057140中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:17中披露的Cel7a CBH I，或源自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。

在实施例中，该纤维素分解组合物包含纤维素二糖水解酶II(CBH II)，如源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株作为本文的SEQ ID NO:18披露的；或源自木霉属的菌株，如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株，如土生梭孢壳霉的菌株，如来自土生梭孢壳霉的纤维素二糖水解酶II CEL6A。

在实施例中，该纤维素分解酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及β-葡糖苷酶。

在实施例中，该纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、以及CBH I。

在实施例中，该纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I、以及CBH II。

在实施例中，纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:15)、以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。

在实施例中，纤维素分解酶组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:15)、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:14)。

在另一个实施例中，纤维素分解组合物是里氏木霉纤维素分解酶组合物，其进一步包含WO 2011/041397中作为SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16披露的、具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉GH61A多肽、以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:14)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用本文的SEQ ID NO:14用于编号)。

在一个优选实施例中，该纤维素分解酶组合物包含一种或多种以下组分：

(i)烟曲霉纤维素二糖水解酶I；

(ii)烟曲霉纤维素二糖水解酶II；

(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；以及

(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉属物种GH61多肽；或其同系物。

在一个优选实施例中，该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉，其包含源自埃默森青霉的菌株的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽(WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:16)、烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文的SEQID NO:14)具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(WO 2012/044915中披露的)；WO 2011/057140中作为SEQ ID NO:6或本文中作为SEQ ID NO:6披露的烟曲霉Cel7A CBH I以及WO 2011/057140中作为SEQ ID NO:17或本文中作为SEQ ID NO:18披露的烟曲霉CBHII。

在实施例中，该纤维素分解组合物以0.0001-3mg EP/g DS，优选0.0005-2mg EP/gDS，优选0.001-1mg/g DS，更优选0.005-0.5mg EP/g DS，并且甚至更优选0.01-0.1mg EP/gDS剂量添加。

糖化和/或发酵中存在和/或添加的蛋白酶

可将任何合适的蛋白酶添加至糖化和/或发酵，如SSF中。

在一个优选实施例中，蛋白酶是金属蛋白酶或丝氨酸蛋白酶。在实施例中，酶组合物包含金属蛋白酶，优选源自嗜热子嚢菌属的菌株，优选桔橙嗜热子囊菌的菌株(尤其是桔橙嗜热子囊菌CGMCC编号0670)，如作为WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2的成熟部分或本文的SEQ ID NO:13的成熟多肽披露的金属蛋白酶。

在实施例中，蛋白酶与本文的SEQ ID NO:13的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％同一性。

在实施例中，蛋白酶源自火球菌属的菌株，例如激烈火球菌的菌株，如US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:9中所示的蛋白酶。

在实施例中，蛋白酶是WO 2014/037438(通过引用由此并入)的实例2中涉及的、来自大型亚灰树花菌蛋白酶3(肽酶家族S53蛋白酶)的成熟序列。在实施例中，蛋白酶是来自亚灰树花菌属，特别是大型亚灰树花菌的菌株的、WO 2014/037438(通过引用由此并入)中作为SEQ ID NO:5和本文的SEQ ID NO:19所示的成熟蛋白酶3序列。

在实施例中，该蛋白酶与本文的SEQ ID NO:19作为氨基酸1-547所示的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如100％同一性。

糖化和/或发酵中存在和/或添加的α-淀粉酶

任何合适的α-淀粉酶，如真菌酸性α-淀粉酶，可存在和/或添加至糖化和/或发酵中。

在一个实施例中，该α-淀粉酶是真菌α-淀粉酶，特别是与SEQ ID NO:7的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但100％同一性。在一个优选实施例中，α-淀粉酶具有一种或多种以下取代：G128D、D143N，特别是G128D+D143N。

使用本发明的海藻糖酶从纤维素材料产生发酵产物的方法

在实施例中，本发明涉及从预处理的纤维素材料产生发酵产物的方法，该方法包括：

(a)用纤维素分解酶组合物使所述预处理的纤维素材料水解；

(b)使用发酵生物进行发酵；以及

(c)任选地回收该发酵产物，

其中本发明的海藻糖酶被添加至和/或存在于水解步骤(a)和/或发酵步骤(b)中。

根据本发明的方法，水解和发酵可分别或同时进行。在实施例中，本发明的方法作为以下进行：分开的水解和发酵(SHF)；同时的糖化和发酵(SSF)；同时的糖化和共发酵(SSCF)；混合的水解和发酵(HHF)；分离的水解和共发酵(SHCF)；混合的水解和共发酵(HHCF)；或直接的微生物转化(DMC)，有时也称为合并的生物加工(CBP)。SHF使用分开的处理步骤，以首先将纤维素材料酶促水解为可发酵糖(例如，葡萄糖、纤维二糖、以及戊糖单体)，并且然后将可发酵糖发酵为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶促水解和糖变为乙醇的发酵被组合在一个步骤中。SSCF包括多种糖的共发酵(Sheehan J.和Himmel M.,1999,Enzymes,energy and the environment:A strategic perspective on theU.S.Department of Energy’s research and development activities for bioethanol[酶、能源和环境：美国能源部对生物乙醇的研究和发展活动的战略角度],Biotechnol[生物技术进展].Prog.15:817-827)。HHF涉及分离的水解步骤并且另外涉及同时的糖化和水解步骤，其可在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可在不同的温度进行，即高温酶水解，然后是在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个(例如几个)步骤中组合了所有三个过程(酶产生、水解和发酵)，其中使用相同的生物以产生用于将纤维素材料转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶。

根据本发明，所述纤维素材料是植物材料碎片(chip)，植物茎段(stem segment)和/或整个植物茎。在实施例中，所述纤维素材料选自下组：芦竹、甘蔗渣、竹、玉米穗轴、玉米纤维、玉米秸秆、芒属(miscanthus)、橙皮、稻秆、柳枝稷(switchgrass)、麦秆。在一个优选实施例中，纤维素材料的来源是玉米秸秆、玉米穗轴和/或麦秆。

根据本发明，可使用任何预处理。在一个优选实施例中，使用化学预处理、物理预处理或者化学和物理预处理。在一个优选实施例中，用酸预处理该纤维素材料，如稀酸预处理。在实施例中，所述纤维素材料通过在高温、高压下用酸预处理纤维素材料来制备。

在实施例中，水解在20℃-70℃，如30℃-60℃，优选45℃-55℃的温度，在范围4-6，如4.5-5.5的pH进行。

在实施例中，所述纤维素材料在水解过程中以1-20(w/w)％的TS，如2-10(w/w)％TS(总固形物)，如约5(w/w)％TS存在。

在实施例中，水解进行1-20日，优选5-15日之间。

在实施例中，该纤维素分解酶组合物源自里氏木霉、特异腐质霉、或卢克诺文思金孢子菌。

纤维素分解酶组合物：术语“纤维素分解酶组合物”意指水解纤维素材料的一种或多种(例如，若干种)酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维素二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维素二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等人,Outlook for cellulase improvement:Screening andselection strategies[纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略],2006,BiotechnologyAdvances[生物技术进展]24:452-481中综述。通常使用不溶性底物，包括Whatman №1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解活性。最常见的总纤维素分解活性测定法是将Whatman №1滤纸用作底物的滤纸测定法。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulaseactivities[纤维素酶活性的测量],Pure Appl.Chem.[纯粹与应用化学]59:257-68)确立的。

就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素(或其它经预处理的纤维素材料)在合适的温度(例如50℃、55℃或60℃)进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO₄，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过

HPX-87H柱(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯(Bio-Rad Laboratories,Inc.))进行糖分析。

此类组合物的实例可见于上文“糖化和/或发酵中存在和/或添加的纤维素分解酶组合物”一节中。

纤维素材料：术语“纤维素材料”意指含有纤维素的任何材料。纤维素材料的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。细胞停止生长后产生的次生细胞壁也含有多糖，并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是线性β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如具有一系列取代基以复杂支链结构的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多形态的，但发现其在植物组织中主要作为平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键结合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。

纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树的叶、枝和木材(wood)中。纤维素材料可为，但不限于：农业残余物、草本材料(包括能量作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸和木材(包括林业残余物)(参见，例如，Wiselogel等人，1995，于Handbookon Bioethanol[生物乙醇手册](Charles E.Wyman编辑),第105-118页,Taylor和Francis,华盛顿；Wyman,1994,Bioresource Technology[生物资源技术]50:3-16；Lynd,1990,Applied Biochemistry and Biotechnology[应用生物化学与生物技术]24/25:695-719；Mosier等人,1999,Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics[木质纤维素生物转化的最新进展]，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生化工程/生物技术进展]，T.Scheper主编,第65卷,第23-40页,Springer-Verlag[施普林格出版社],纽约)。在本文中应理解的是，纤维素可为任何形式的木质纤维素，在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选方面中，该纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选方面中，该纤维素材料是木质纤维素，其包含纤维素、半纤维素、以及木质素。

在一方面中，该纤维素材料是农业残余物。在另一方面中，该纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一方面中，该纤维素材料是城市固体废物。在另一方面中，该纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。在另一方面中，该纤维素材料是废纸。在另一方面中，该纤维素材料是木材(包括林业废弃物)。

在另一方面中，该纤维素材料是芦竹。在另一方面中，该纤维素材料是甘蔗渣。在另一方面中，该纤维素材料是竹。在另一方面中，该纤维素材料是玉米穗轴。在另一方面中，该纤维素材料是玉米纤维。在另一方面中，该纤维素材料是玉米秸秆。在另一方面中，该纤维素材料是芒属。在另一方面中，该纤维素材料是橙皮。在另一方面中，该纤维素材料是稻杆。在另一方面中，该纤维素材料是柳枝稷。在另一方面中，该纤维素材料是麦秆。

在另一方面中，该纤维素材料是白杨(aspen)。在另一方面中，该纤维素材料是桉树(eucalyptus)。在另一方面中，该纤维素材料是冷杉(fir)。在另一方面中，该纤维素材料是松树(pine)。在另一个方面中，纤维素材料是杨树(poplar)。在另一个方面中，纤维素材料是云杉(spruce)。在另一方面中，该纤维素材料是柳树。

在另一方面中，该纤维素材料是海藻纤维素。在另一方面中，该纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是棉短绒(cotton linter)。在另一个方面中，纤维素材料是滤纸。在另一个方面中，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是磷酸处理的纤维素。

在另一方面中，该纤维素材料是水生生物质。如在此使用，术语“水生生物质”意指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。水生生物质可以是藻类、挺水植物、浮叶植物、或沉水植物。

纤维素材料可按原样使用或可使用本领域已知的常规方法进行预处理，如本文所述。在优选的方面，对该纤维素材料进行预处理。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。出于本发明的目的，根据Venturi等人,2002,Extracellular beta-D-glucosidasefrom Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and somebiochemical properties[来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶：产生、纯化以及一些生物化学特性]，J.Basic Microbiol.[基础微生物学杂志]42:55-66的程序使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH 4.8下，在含有0.01％

20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。

β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D-木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-低聚木糖的外切水解，以将连续的D-木糖残基从非还原端移除。出于本发明的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH5、在含有0.01％

20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。

纤维素二糖水解酶：术语“纤维素二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维素二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从该链的还原端或非还原端释放纤维二糖(Teeri，1997，Crystalline cellulose degradation:New insight into the function ofcellobiohydrolases[结晶纤维素降解：对纤维素二糖水解酶的功能的新认识]，Trends inBiotechnology[生物技术趋势]15:160-167；Teeri等人,1998,Trichoderma reeseicellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose？[里氏木霉纤维素二糖水解酶：为何对晶态纤维素如此有效？],Biochem.Soc.Trans[生物化学学会学报].26:173-178)。根据以下文献描述的程序测定纤维素二糖水解酶活性：Lever等人,1972,Anal.Biochem.[分析生物化学]47:273-279；van Tilbeurgh等人,1982,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]187:283-288；和Tomme等人,1988,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]170:575-581。在本发明中，Tomme等人的方法可以用于确定纤维素二糖水解酶活性。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物黏度的降低或通过还原糖测量所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(Zhang等人，2006，Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481)。出于本发明的目的，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem[纯粹与应用化学]59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，确定内切葡聚糖酶活性。

家族61糖苷水解酶：术语“家族61的糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指属于根据Henrissat,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities[基于氨基酸序列的相似之的糖基水解酶的分类],Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316，以及Henrissat和Bairoch,1996,Updating thesequence-based classification of glycosyl hydrolases[基于序列的糖基水解酶的分类的更新],Biochem.J.[生物化学杂志]316:695-696的糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中的非常弱的内切-1,4-β-D-葡聚糖酶活性的测量值而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于当与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时，其增强纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。

半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指可对半纤维素材料进行水解的一种或多种(例如，若干种)酶。参见例如，Shallom和Shoham,2003,Microbial hemicellulases.[微生物半纤维素酶].Current Opinion InMicrobiology[微生物学当前观点]6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。这些酶的底物(半纤维素)是支链和线性多糖的异质群体，这些多糖经由氢与植物细胞壁中的纤维素微纤维键合，从而将它们交联成稳固网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基团的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于其一级序列的同源性可以分配到GH和CE家族。一些家族(具有总体上类似的折叠)可以进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中可得到这些以及其他碳水化合物活性酶的最翔实和更新的分类。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem[纯粹与应用化学].59:1739-1752在合适的温度(例如50℃、55℃或60℃)和pH(例如5.0或5.5)下测量。

具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。出于本发明的目的，通过在以下条件下测量来自由纤维素分解酶水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中的纤维素，其中总蛋白包括50-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白和0.5-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白，在合适的温度(例如50℃、55℃或60℃)以及pH(例如5.0或5.5)下，持续1-7天，与不具有纤维素分解增强活性的相等总蛋白装载的对照水解(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)相比较。在一个方面中，将在2％-3％的总蛋白重量米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014，重组产生于米曲霉中)或2％-3％的总蛋白重量烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所描述中，重组产生于米曲霉中)的纤维素酶蛋白负载的存在下的

1.5L(诺维信公司，

丹麦)的混合物用作纤维素分解活性的来源。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是在37℃在0.01％

X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH 6中用0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下在200mM磷酸钠pH 6缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青精。

用于基于纤维素的发酵的发酵生物

“发酵生物”或“发酵微生物”指适合用于所希望的发酵过程以产生发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物。发酵生物可为己糖和/或戊糖发酵生物，或它们的组合。己糖和戊糖发酵生物两者均是本领域中所熟知的。适合的发酵微生物能够将糖(例如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成所希望的发酵产物。由Lin等人,2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]69:627-642描述了产生乙醇的细菌和真菌发酵生物的实例。

能够发酵己糖类的发酵生物的实例包括细菌生物和真菌生物，如酵母。优选的酵母包括假丝酵母属、克鲁维酵母菌属、以及酿酒酵母属的菌株，例如萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、以及酿酒酵母。

可以发酵处于其天然状态的戊糖的发酵微生物的实例包括细菌生物和真菌生物，例如一些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母属的菌株，优选休哈塔假丝酵母(C.sheatae)或萨纳瑞西斯假丝酵母(C.sonorensis)；以及毕赤酵母属的菌株，优选是树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS 5773。优选的戊糖发酵酵母包括管囊酵母属(Pachysolen)，优选嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)的菌株。不能发酵戊糖类(如木糖和阿拉伯糖)的生物可通过本领域已知方法来进行遗传修饰而发酵戊糖。

可以将己糖和戊糖有效地发酵为乙醇的细菌的实例包括例如凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭杆菌、热纤维梭菌、弗陶菲尔门塔斯梭菌(Clostridium phytofermentans)、土芽孢杆菌属、嗜热厌氧糖分解菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)、以及运动发酵单胞菌(菲利普斯(Philippidis)，1996，同上)。

其他发酵生物包括以下的菌株：芽孢杆菌属，如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，如萨纳瑞西斯假丝酵母、C.methanosorbosa、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、C.naedodendra、布朗克假丝酵母(C.blankii)、嗜虫假丝酵母(C.entomophilia)、芸薹假丝酵母(C.brassicae)、假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、产朊假丝酵母(Candidautilis)和休哈塔假丝酵母(C.scehatae)；梭菌属，如丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌和植物发酵梭菌；大肠杆菌，特别是经遗传修饰促进乙醇产率的大肠杆菌菌株；地芽孢杆菌属菌种；汉逊酵母属，例如异常汉森酵母；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)；克鲁维酵母属，如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；热厌氧杆菌属，例如解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobactersaccharolyticum)；以及发酵单胞菌属，例如运动发酵单胞菌。

在一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在一个更优选方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。在另一个优选方面，酵母是假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是萨纳瑞西斯假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是布朗克假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是嗜虫假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)。在另一个更优选方面，酵母是仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一个优选方面，酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个更优选方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选方面，酵母是耐热克鲁维酵母。在另一个优选方面，酵母是管囊酵母属。在另一个更优选方面，酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一个优选方面，酵母是毕赤酵母属。在另一个优选方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选方面，酵母是酵母属菌种。在一个更优选方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。

在一个优选方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一个优选方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一个更优选方面，细菌是植物发酵梭菌。在另一个更优选方面，细菌是热纤维梭菌。在另一个更优选方面，细菌是地芽孢杆菌属菌种。在另一个更优选方面，细菌是热厌氧杆菌属。在另一个更优选的方面，细菌是解糖热厌氧杆菌。在另一个优选方面，细菌是发酵单胞菌属。在另一个更优选方面，细菌是运动发酵单胞菌。

可商购的适合乙醇生产的酵母包括例如，BIOFERM^TM AFT和XR(NABC-北美生物制品公司(North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国)、ETHANOL RED^TM酵母(ermentis/Lesaffre公司，美国)、FALI^TM(Fleischmann’s Yeast公司，美国)、FERMIOL^TM(DSM Specialties公司)、GERT STRAND^TM(Gert Strand AB公司，瑞典)以及SUPERSTART^TM和THERMOSACC^TM新鲜酵母(Ethanol Technology公司，威斯康星州，美国)。

在一个优选的方面，发酵微生物已经过遗传修饰以提供发酵戊糖类的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。

通过将异源基因克隆进不同发酵微生物已经构建了能够将己糖和戊糖转化为乙醇(共发酵)的生物(Chen和Ho,1993,Cloning and improving the expression of Pichiastipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae[在酿酒酵母中克隆和改进树干毕赤酵母木糖还原酶基因的表达],Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]39-40:135-147；Ho等人,1998,Genetically engineered Saccharomyces yeastcapable of effectively cofermenting glucose and xylose[能够有效共发酵葡萄糖和木糖的遗传工程化的酵母菌属酵母],Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]64:1852-1859；Kotter和Ciriacy,1993,Xylose fermentation by Saccharomycescerevisiae[酿酒酵母发酵木糖],Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]38:776-783；Walfridsson等人,1995,Xylose-metabolizing Saccharomycescerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding thepentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase[过表达编码戊糖磷酸途径酶转酮醇酶和转醛醇酶的TKL1和TAL1基因的木糖代谢酿酒酵母菌株],Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]61:4184-4190；Kuyper等人,2004,Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficientanaerobic xylose fermentation:a proof of principle[用于有效厌氧性木糖发酵的酿酒酵母的最小代谢工程：原理的证明],FEMS Yeast Research[欧洲微生物学会联合会酵母研究]4:655-664；Beall等人,1991,Parametric studies of ethanol production fromxylose and other sugars by recombinant Escherichia coli[通过重组大肠杆菌从木糖和其他糖产生乙醇的参数研究],Biotech.Bioeng[生物技术与生物工程].38:296-303；Ingram等人,1998,Metabolic engineering of bacteria for ethanol production[用于乙醇产生的细菌的代谢工程化],Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]58:204-214；Zhang等人,1995,Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway inethanologenic Zymomonas mobilis[产生乙醇的运动发酵单胞菌中戊糖代谢途径的代谢工程化],Science[科学]267:240-243；Deanda等人,1996,Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering[通过代谢途径工程化开发发酵阿拉伯糖的运动发酵单胞菌菌株],Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]62:4465-4470；WO 2003/062430，木糖异构酶)。

在一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是萨纳瑞西斯假丝酵母。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是马克斯克鲁维酵母。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。

本领域中熟知的是，以上所述的生物还可以用于产生其他物质，如本文所述。

典型地向降解的纤维素材料或水解物中添加发酵微生物，并且发酵进行约8小时至约96小时，例如，约24小时至约60小时。温度典型地为约26℃至约60℃(例如约32℃或50℃)，并且约pH 3至约pH 8(例如pH 4-5、6、或7)。

在一方面，将酵母和/或另一种微生物施加至降解的纤维素材料并且发酵进行约12至约96小时，如典型地24-60小时。在另一方面，温度优选地为约20℃至约60℃，例如约25℃至约50℃、约32℃至约50℃、或约32℃至约50℃，并且pH通常为约pH 3至约pH 7，例如约pH 4至约pH 7。然而，一些发酵生物(例如细菌)具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以每ml发酵液大约10⁵至10¹²，优选从大约10⁷至10¹⁰，特别是大约2×10⁸个活细胞计数的量应用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可见于，例如，“The AlcoholTextbook[醇教材]”(K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall编辑，Nottingham UniversityPress[诺丁汉大学出版社]，英国1999)，其通过引用由此并入。

对于乙醇产生，在发酵之后，蒸馏经发酵的浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可用作例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的中性酒精饮料，或工业乙醇。

发酵刺激剂可与本申请中所述的任何方法组合使用，以进一步改善发酵方法，而且特别地，改善发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇产率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别地，酵母)生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、B、C、D和E。例如，参见Alfenore等人，Improving ethanolproduction and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitamin feedingstrategy during fed-batch process[通过在进料分批方法过程中的一种维生素进料策略改进乙醇产生和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的存活力]，Springer-Verlag[施普林格出版社](2002)，将其通过引用由此并入。矿物质的实例包括可以供应包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn、和Cu营养素的矿物质和矿物盐。

发酵产物

根据本发明，术语“发酵产物”可为由发酵得到的任何物质。发酵产物可以是，不限于：醇(例如，阿拉伯糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇[丙二醇]、丁二醇、丙三醇、山梨醇和木糖醇)；烷烃(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)、环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)、烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)、以及一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如，丙酮)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；和聚酮化合物。发酵产物还可为作为高价值产品的蛋白质。

在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”涵盖包含一个或多个(例如几个)羟基基团的物质。在更优选的方面，该醇是正丁醇。在另一个更优选的方面，该醇是异丁醇。在另一个更优选方面，该醇是乙醇。在另一个更优选方面，该醇是甲醇。在另一个更优选方面，该醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选方面，该醇是丁二醇。在另一个更优选方面，该醇是乙二醇。在另一个更优选方面，该醇是丙三醇。在另一个更优选方面，该醇是甘油。在另一个更优选方面，该醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选方面，该醇是山梨醇。在另一个更优选方面，该醇是木糖醇。参见，例如，C.S.,Cao,N.J.,Du,J.以及Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources[利用可再生资源生产乙醇],于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生化工程/生物技术进展],Scheper,T.编,海德堡,德国，65:207-241；Silveira,M.M.和Jonas,R.,2002,Thebiotechnological production of sorbitol[山梨醇的生物技术生产],Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]59:400-408；Nigam和Singh,1995,Processes for fermentative production of xylitol-a sugar substitute[木糖醇-糖的替代品-的发酵生产方法],Process Biochemistry[过程生物化学]30(2):117-124；Ezeji等人,2003,Production of acetone,butanol and ethanol by Clostridiumbeijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping[由拜氏梭菌BA101生产丙酮，丁醇和乙醇并通过气提进行原位回收]，World Journal of Microbiology andBiotechnology[微生物与生物技术世界杂志]19(6):595-603。

在另一个优选的方面，该发酵产物是烷烃。该烷烃可以是非支链或支链烷烃。在另一个更优选方面，该烷烃是戊烷。在另一个更优选方面，该烷烃是己烷。在另一个更优选方面，该烷烃是庚烷。在另一个更优选方面，该烷烃是辛烷。在另一个更优选方面，该烷烃是壬烷。在另一个更优选方面，该烷烃是癸烷。在另一个更优选方面，该烷烃是十一烷。在另一个更优选方面，该烷烃是十二烷。

在另一个优选方面，发酵产物是环烷烃。在另一个更优选方面，该环烷烃是环戊烷。在另一个更优选方面，该环烷烃是环己烷。在另一个更优选方面，该环烷烃是环庚烷。在另一个更优选方面，该环烷烃是环辛烷。

在另一个优选方面，发酵产物是烯烃。该烯烃可以是非支链或支链烯烃。在另一个更优选方面，该烯烃是戊烯。在另一个更优选方面，该烯烃是己烯。在另一个更优选方面，该烯烃是庚烯。在另一个更优选方面，该烯烃是辛烯。

在另一个优选方面，发酵产物是氨基酸。在另一个更优选方面，该有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是苏氨酸。参见例如Richard and Margaritis,2004,Empiricalmodeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production andother microbial biopolymers[用于聚(谷氨酸)生产和其他微生物生物聚合物的分批发酵动力学的实验建模],Biotechnology and Bioengineering[生物技术与生物工程]87(4):501-515。

在另一个优选的方面，该发酵产物是气体。在另一个更优选方面，该气体是甲烷。在另一个更优选方面，该气体是H₂。在另一个更优选方面，该气体是CO₂。在另一个更优选方面，该气体是CO。参见例如Kataoka,Miya以及Kiriyama,1997,Studies on hydrogenproduction by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobicbacteria[关于通过产氢厌氧细菌连续培养系统产生氢气的研究],Water Science andTechnology[水科学与技术]36(6-7):41-47；和Gunaseelan,1997,Anaerobic digestionof biomass for methane production:A review[生物质厌氧消化制甲烷研究进展],Biomass and Bioenergy[生物质与生物能源],13(1-2),83-114。

在另一个优选方面，该发酵产物是异戊二烯。

在另一个优选方面，发酵产物是酮。应理解的是，术语“酮”涵盖含有一个或多个(例如几个)酮模块的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如，Qureshi和Blaschek，2003，见上文。

在另一个优选方面，发酵产物是有机酸。在另一个更优选方面，该有机酸是乙酸。在另一个更优选方面，该有机酸是醋酮酸。在另一个更优选方面，该有机酸是己二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选方面，该有机酸是柠檬酸。在另一个更优选方面，该有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选方面，该有机酸是甲酸。在另一个更优选方面，该有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选方面，该有机酸是戊二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是3-二羟基丙酸。在另一个更优选方面，该有机酸是衣康酸。在另一个更优选方面，该有机酸是乳酸。在另一个更优选方面，该有机酸是苹果酸。在另一个更优选方面，该有机酸是丙二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是草酸。在另一个更优选方面，该有机酸是丙酸。在另一个更优选方面，该有机酸是琥珀酸。在另一个更优选方面，该有机酸是木糖酸。参见例如Chen和Lee,1997,Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production fromcellulosic biomass[用于从纤维素生物质生产乳酸的膜介导的萃取发酵]Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术],63-65:435-448。

回收

在发酵之后，任选地使用本领域已知的任何方法回收发酵产物，该方法包括但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的材料分离并纯化醇，如乙醇。可以获得纯度高达约96vol.％的乙醇，其能用作例如燃料乙醇、饮用乙醇(即，可饮用的中性含酒精饮料)，或工业乙醇。

在以下编号的实施例中进一步披露本发明：

实施例1.一种具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性的海藻糖酶变体多肽，该海藻糖酶变体多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的位置152、182、185或583处的一个或多个位置处的替换，其中该变体具有与SEQ ID NO:1的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％，至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有海藻糖酶活性。

实施例2.如实施例1所述的变体，其中取代的数目是1-20，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个取代。

实施例3.如实施例1-2中任一项所述的变体，该变体包含对应于位置152的位置处的取代。

实施例4.如实施例3所述的变体，其中该取代是用Gly、Glu或Ala取代。

实施例5.如实施例1-4中任一项所述的变体，该变体包含对应于位置F182的位置处的取代。

实施例6.如实施例5所述的变体，其中该取代是用Val取代。

实施例7.如实施例1-6中任一项所述的变体，该变体包含对应于位置F185的位置处的取代。

实施例8.如实施例7所述的变体，其中该取代是用Arg取代。

实施例9.如实施例1-8中任一项所述的变体，该变体包含对应于位置G583的位置处的取代。

实施例10.如实施例9所述的变体，其中该取代是用Thr取代。

实施例11.如实施例1-10中任一项所述的变体，该变体包含与位置152、182、185或583中的任一个相对应的两个位置处的取代。

实施例12.如实施例1-10中任一项所述的变体，该变体包含与位置152、182、185或583中的任一个相对应的三个位置处的取代。

实施例13.如实施例1-10中任一项所述的变体，该变体包含与位置152、182、185或583中的每一个相对应的取代。

实施例14.如实施例1-13中任一项所述的变体，该变体包含一个或多个取代，该一个或多个取代选自于由以下组成的组：P152G、P152E、P152A、F182V、F185R或G583T。

实施例15.如实施例1-14中任一项所述的变体，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性，该变体包含选自下组的取代或取代的组合，该组由以下组成：

G583T；

P152G；

P152E；

P152A；

F182V；

F185R；

P152G+G583T；

F185R+G583T；

P152A+F182V+G583T；

F182V+F185R+G583T；

并且其中该变体具有与SEQ ID NO:1的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有海藻糖酶活性，并且其中在30℃，pH 4.0下与黑曲霉蛋白酶混合物孵育3天后的残留活性为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％。

实施例16.如实施例1-14中任一项所述的变体，该变体具有增加的热稳定性，该变体包含选自下组的取代或取代的组合，该组由以下组成：

P152G；

P152E；

P152A；

F182V；

F185R；

P152G+G583T；

F185R+G583T；

P152A+F182V+G583T；

F182V+F185R+G583T；

并且其中该变体具有与SEQ ID NO:1的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有海藻糖酶活性，其中通过TSA分析测量的热变性温度至少为65.7℃。

实施例17.如实施例16所述的变体，其中该热变性温度为至少65.8℃、至少65.9℃、至少66.0℃、至少66.1℃、至少66.2℃、至少66.3℃、至少66.4℃、至少66.5℃、至少66.6℃、至少66.6℃、至少66.8℃、至少66.9℃、至少67.0℃、至少67.1℃、至少67.2℃、至少67.3℃、至少67.4℃、至少67.5℃。

实施例18.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如实施例1-17中任一项所述的变体。

实施例19.一种核酸构建体，该核酸构建体包含如实施例18所述的多核苷酸。

实施例20.一种表达载体，该表达载体包含如实施例18所述的多核苷酸。

实施例21.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如实施例18所述的多核苷酸、或如实施例19所述的核酸构建体。

实施例22.如实施例21所述的宿主细胞，该宿主细胞选自酵母宿主细胞，特别是酵母属，更特别是酿酒酵母。

实施例23.一种组合物，该组合物包含如实施例1-17中任一项所述的多肽。

实施例24.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，该全培养液配制品或细胞培养组合物包含如实施例1-17所述的多肽。

实施例25.一种产生海藻糖酶变体的方法，该方法包括：

在适合于表达该变体的条件下培养如实施例21所述的宿主细胞；以及

回收该变体。

实施例26.如实施例25所述的方法，其中该宿主细胞是酵母宿主细胞，特别是选自下组的酵母，该组由以下组成：假丝酵母属细胞、汉逊酵母属细胞、克鲁维酵母属细胞、毕赤酵母属细胞、酵母菌属细胞、裂殖酵母或耶罗维亚酵母属细胞、如乳酸克鲁维酵母细胞、卡尔酵母细胞、酿酒酵母细胞、糖化酵母细胞、道格拉氏酵母细胞、克鲁弗酵母细胞、诺地酵母细胞、卵形酵母细胞或解脂耶罗维亚酵母细胞，最特别是酿酒酵母。

实施例27.一种生产发酵产物的方法，该方法包括

(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；

任选地在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；

(b)使所液化的材料糖化；

(c)使用发酵生物进行发酵；

其中

i)葡糖淀粉酶；

ii)如实施例1所述的海藻糖酶；

iii)任选的纤维素分解酶组合物和/或蛋白酶；

在以下步骤的过程中存在和/或添加：

糖化步骤(b)；

发酵步骤(c)；

同时的糖化和发酵；

任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。

实施例28.一种从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：

(i)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；以及

(ii)使用发酵生物进行发酵；

其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、如实施例1所述的变体海藻糖酶，以及任选的蛋白酶和/或纤维素分解酶组合物。

实施例29.一种从预处理的纤维素材料产生发酵产物的方法，该方法包括：

(a)用纤维素分解酶组合物使所述预处理的纤维素材料水解；

(b)使用发酵生物进行发酵；以及

(c)任选地回收该发酵产物，

其中如实施例1所述的变体海藻糖酶被添加至和/或存在于水解步骤(a)和/或发酵步骤(b)中。

实施例30.如实施例27-29中任一项所述的方法，其中该发酵生物为如实施例21任一项所述的宿主细胞，特别是酵母宿主细胞，特别是选自下组的酵母，该组由以下组成：假丝酵母属细胞、汉逊酵母属细胞、克鲁维酵母属细胞、毕赤酵母属细胞、酵母菌属细胞、裂殖酵母或耶罗维亚酵母属细胞、如乳酸克鲁维酵母细胞、卡尔酵母细胞、酿酒酵母细胞、糖化酵母细胞、道格拉氏酵母细胞、克鲁弗酵母细胞、诺地酵母细胞、卵形酵母细胞或解脂耶罗维亚酵母细胞，最特别是酿酒酵母。

实施例31.如实施例27-29中任一项所述的方法，其中该变体海藻糖酶与发酵生物，特别是酵母生物，更特别是干酵母共同配制。

实施例32.如实施例27-31中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，特别是乙醇。

本发明进一步通过以下实例进行描述。

实例

材料与方法

海藻糖酶活性：

原理：

海藻糖+H₂O^海藻糖酶>2葡萄糖

T＝37℃，pH＝5.7，A340nm，光路＝1cm

光度法停止率测定(Spectrophotometric Stop Rate Determination)

单位定义：

在pH 5.7，在37℃，一个单位每分钟将1.0毫摩尔的海藻糖转化为2.0毫摩尔的葡萄糖(在pH 7.5，测定的释放的葡萄糖)。

(参见Dahlqvist,A.(1968)Analytical Biochemistry 22,99-107)

实例1：

鉴定了适于改善野生型瘤孢毁丝霉GH37海藻糖酶的热稳定性和蛋白酶稳定性的位置并且构建了特定变体。测定了特定单取代变体及其组合物增加的热变性温度Td，该热变性温度Td通过热迁移实验(TSA)来确定，并且用增加的在三种不同温度和蛋白酶混合物的存在下孵育3天后的残余活性作为对增加的蛋白酶降解稳定性(蛋白酶稳定性分析)的一种测量。构建和测试的特定变体示于表1中，并且由此产生的增加的变性温度和蛋白酶稳定性示于表2中。

表1.M-海藻糖酶PE变体

纯化

通过两个步骤(脱盐柱和阳离子交换柱色谱法)对野生型海藻糖酶和海藻糖酶变体进行纯化。最后，使用12k-14k MWCO(截留分子量)透析膜用10L的20mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)透析样品并且然后使用30k MWCO离心过滤装置浓缩。

TSA热稳定性测定(TSA)

将纯化的酶用50mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)稀释至0.5mg/ml并与等体积的用Milli-Q水稀释的SYPRO Orange(英杰公司(Invitrogen))混合。将十八微升的混合物溶液转移至LightCycler 480多孔板384(罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))中并将板密封。

TSA的设备参数：

仪器：LightCycler 480实时PCR系统(罗氏应用科学部(Roche AppliedScience))

扫描速率：0.02℃/sec

扫描范围：37℃-96℃

积分时间：1.0sec

激发波长465nm

发射波长580nm

将获得的荧光信号标准化到0和1的范围内。变性温度(Td)定义为标准化值最接近0.5时的温度。将最大信号强度(标准化值为1)的温度定义为Td2，并将其用作瘤孢毁丝霉GH37海藻糖酶变体的热稳定性指数。

海藻糖酶测定

将10μl样品与190μl底物溶液(1％海藻糖的50mM乙酸钠溶液，pH 4.3)混合，并在32℃下孵育1小时。然后取出10μl溶液并加入200μl葡萄糖CII测试WAKO(和光纯药工业株式会社，大阪，日本)。在室温下孵育15min后测量A505。

SF培养法制备蛋白酶混合物

用于制备蛋白酶混合物的黑曲霉菌株是NN059095的衍生物，其是由诺维信公司分离并经过基因修饰以破坏从土壤中分离的黑曲霉NN049184的淀粉葡萄糖苷酶活性的表达。

将黑曲霉菌株的孢子接种进100ml的MLC培养基，并且在30℃下培养2天。将10ml的MLC接种至100ml的MU-1培养基，并在30℃培养7天。通过离心获得上清液。

MLC由以下构成：40g葡萄糖、50g大豆粉、4g柠檬酸(pH 5)以及水补足至1升。

MU-1-glu由以下构成：260g的葡萄糖、3g的MgSO₄·7H₂O、5g KH₂PO₄、6g K₂SO₄、0.5ml的淀粉糖苷酶痕量金属溶液和2g尿素(pH 4.5)以及水补足至1升。

痕量金属溶液由以下构成：6.8g的ZnCl₂·7H₂O、2.5g的CuSO₄·5H₂O、0.24g的NiCl₂·6H₂O、13.9g的FeSO₄·7H₂O、13.5g的MnSO₄·H₂O和3g的柠檬酸以及水补足至1升。

蛋白酶稳定性测定

用pH 4.0的50mM乙酸钠缓冲液将纯化的酶稀释至2mg/ml，并将100□l的样品与100μl制备的蛋白酶混合物混合。然后将该溶液在-20℃、4℃、30℃和40℃下孵育3天并将通过海藻糖酶测定测量残留活性。

已进行的测试的结果在表2中给出。

结果

表2.Ms-海藻糖酶变体

*在与蛋白酶混合物的掺和物孵育3天后的残余活性(-20℃，100％)。

序列表

<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）

<120> 具有海藻糖酶活性的多肽及其在产生发酵产物的方法中的用途

<130> 14456-WO-PCT

<160> 19

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 674

<212> PRT

<213> 瘤孢毁丝霉

<400> 1

Leu Tyr Ile Asn Gly Ser Val Thr Ala Pro Cys Asp Ser Pro Ile Tyr

1 5 10 15

Cys Gln Gly Glu Leu Leu Lys Ala Val Glu Leu Ala Arg Pro Phe Val

20 25 30

Asp Ser Lys Thr Phe Val Asp Met Pro Thr Ile Lys Pro Val Asp Glu

35 40 45

Val Leu Ala Ala Phe Ser Lys Leu Ser Leu Pro Leu Ser Asn Asn Ser

50 55 60

Glu Leu Asn Ala Phe Leu Tyr Glu Asn Phe Ala Gln Ala Gly His Glu

65 70 75 80

Leu Glu Glu Val Pro Asp Ser Glu Leu Glu Thr Asp Ala Lys Phe Leu

85 90 95

Asp Lys Leu Glu Asp Arg Thr Ile Lys Glu Phe Val Gly Lys Val Ile

100 105 110

Asp Ile Trp Pro Asp Leu Thr Arg Arg Tyr Ala Gly Pro Ser Asn Cys

115 120 125

Thr Glu Cys Ala Asn Ser Phe Ile Pro Val Asn Arg Thr Phe Val Val

130 135 140

Ala Gly Gly Arg Phe Arg Glu Pro Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Ile

145 150 155 160

Val Glu Gly Leu Leu Arg Thr Gly Gly Ala Phe Thr His Ile Ser Lys

165 170 175

Asn Ile Ile Glu Asn Phe Leu Asp Phe Val Asp Thr Ile Gly Phe Ile

180 185 190

Pro Asn Gly Ala Arg Ile Tyr Tyr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Pro Leu

195 200 205

Leu Thr Leu Met Val Lys Ser Tyr Val Asp Tyr Thr Asn Asp Thr Ser

210 215 220

Ile Leu Asp Arg Ala Leu Pro Leu Leu Ile Lys Glu His Glu Phe Phe

225 230 235 240

Met Asn Asn Arg Thr Val Ser Ile Thr Gly Ser Asn Gly Lys Glu Tyr

245 250 255

Thr Leu Asn Arg Tyr His Val Glu Asn Asn Gln Pro Arg Pro Glu Ser

260 265 270

Phe Arg Glu Asp Tyr Ile Thr Ala Asn Asn Gly Ser Tyr Tyr Ala Ser

275 280 285

Ser Gly Ile Ile Tyr Pro Val Lys Thr Pro Leu Asn Glu Thr Glu Lys

290 295 300

Ala Ala Leu Tyr Ser Asn Leu Ala Thr Gly Ala Glu Ser Gly Trp Asp

305 310 315 320

Tyr Thr Ser Arg Trp Leu Gly Val Pro Ser Asp Ala Ala Arg Asp Val

325 330 335

Tyr Phe Pro Leu Arg Ser Leu Asn Val Arg Asp Ile Val Pro Val Asp

340 345 350

Leu Asn Ser Ile Leu Tyr Gln Asn Glu Val Ile Ile Ala Glu Tyr Leu

355 360 365

Glu Lys Ala Gly Asn Ser Ser Ala Ala Lys Arg Phe Ala Thr Ala Ala

370 375 380

Glu Gln Arg Ser Glu Ala Met Tyr Ser Leu Met Trp Asn Ala Thr His

385 390 395 400

Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Asn Leu Thr Asp Asn Thr Gln His Ile Phe

405 410 415

Val Pro Ala Asp Glu Asp Thr Ala Pro Gln Asp Arg Ile Glu Ala Pro

420 425 430

Pro Gly Gln Gln Val Phe Phe His Ile Ala Gln Leu Tyr Pro Phe Trp

435 440 445

Thr Gly Ala Ala Pro Ala Ser Leu Lys Ala Asn Pro Leu Ala Val Gln

450 455 460

Gln Ala Tyr Ala Arg Val Ala Arg Met Leu Asp Ile Lys Lys Gly Ala

465 470 475 480

Ile Pro Ala Thr Asn Tyr Arg Thr Gly Gln Gln Trp Asp Gln Pro Asn

485 490 495

Val Trp Pro Pro Leu Gln His Ile Leu Met Lys Gly Leu Leu Asn Thr

500 505 510

Pro Ala Thr Phe Gly Lys Ser Asp Pro Ala Tyr Gln Ser Val Gln Asn

515 520 525

Leu Ala Leu Arg Leu Ala Gln Arg Tyr Leu Asp Ser Thr Phe Cys Thr

530 535 540

Trp Tyr Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ser Asp Phe Pro Gln Leu Glu Gly

545 550 555 560

Val Thr Pro Gly Ala Thr Gly Val Met Phe Glu Lys Tyr Ala Asp Asn

565 570 575

Ala Thr Asn Val Ala Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Glu Val Val Glu Gly

580 585 590

Phe Gly Trp Thr Asn Gly Val Leu Ile Trp Ala Ala Asp Val Phe Gly

595 600 605

Asn Lys Leu Lys Arg Pro Asp Cys Gly Asn Ile Thr Ala Ala His Thr

610 615 620

His Ser Ser Ala Lys Arg Gly Leu Glu Glu Asn Lys Leu Pro Arg Arg

625 630 635 640

Ala Val Glu Leu Asp Pro Trp Asp Ala Ala Trp Thr Lys Met Phe Gly

645 650 655

Arg Ser Lys Leu Arg Arg Arg Glu Ala Glu Asp Val Arg Lys Arg Trp

660 665 670

Met Ser

<210> 2

<211> 2229

<212> DNA

<213> 瘤孢毁丝霉

<400> 2

atggcgctac gacacatcgc ggcggcggcg atcgccggtc ttgcctcaag gactgcagcg 60

ctgtacatca atggctcagt cacagcgccg tgcgactcgc ccatttactg ccaaggcgag 120

cttctaaaag cggttgaact ggcgcgtcct ttcgttgaca gcaagacatt tgtggacatg 180

taagtcatga tcggccagcc aggtgggaat gcagccggcg ggcagattcg tggtgacaca 240

ctgactgact tggattcccg cccaggccca cgatcaagcc agtggatgaa gtgcttgcag 300

cattcagcaa gcttagccta ccactttcca ataactcaga gctcaacgcc ttcttgtatg 360

agaacttcgc ccaggctggc cacgagctcg aagaagtgcc cgacagtgag ctagagacgg 420

acgcaaagtt cctcgacaag ctcgaggatc gcaccatcaa ggagttcgtc ggcaaggtga 480

tcgacatctg gcccgacttg accaggcgct atgccggccc cagcaactgc accgagtgcg 540

ccaacagctt cattcccgtg aaccgcacgt tcgtcgtggc tggcggtcgc ttccgagagc 600

cctactattg ggattcgtac tggatcgtcg aaggtctcct gcgcactggc ggtgccttca 660

cccatatctc caagaacatc attgagaact tcctggactt tgtcgacacg attggcttca 720

ttcccaatgg cgccaggatc tactacctga acaggtcaca gccccctctc ctgacattga 780

tggtgaagag ctacgtcgac tacaccaacg acacgagcat cctggacagg gccttgccgc 840

tgctgatcaa ggagcacgag ttcttcatga ataaccggac ggtgtccatc acgggatcga 900

acggcaagga gtacactctg aacaggtaag cgaggtggac aggcaggcct cggcgaccat 960

gcgcttattg ttgtatctgg caggtatcac gttgaaaaca accaaccacg cccagagtcg 1020

ttccgggagg attacattac cgctaacaac ggctcctact acgcgtcttc gggcataata 1080

tatcccgtta agacgcccct caacgagacg gaaaaggccg cgctctactc gaacctagca 1140

accggcgccg agtccggctg ggactacacc tcccgatggc ttggggtccc cagcgacgct 1200

gcgagggacg tctatttccc gctccgctcg cttaatgtcc gcgacatagt ccccgtcgat 1260

ctcaactcca tcctctacca gaacgaggtg atcattgccg agtacctcga gaaggccggt 1320

aactcctccg cggccaagcg cttcgccact gctgccgaac agcgcagcga ggccatgtac 1380

tccctcatgt ggaacgccac gcactggtct tactttgact acaatctgac cgataacacg 1440

caacacatct tcgtcccagc cgacgaggac accgcccccc aggaccggat cgaggccccc 1500

cccggtcaac aagtcttctt ccacattgcg cagctctatc cattctggac gggcgcggcc 1560

cccgccagcc ttaaggctaa ccccctcgcg gtgcagcaag cctacgcccg tgtggcgcgc 1620

atgctcgata tcaagaaggg cgccatcccc gccaccaact accgcaccgg ccaacaatgg 1680

gaccagccca acgtctggcc gccgctgcaa catatcctga tgaagggcct gcttaacacc 1740

ccggcaacct ttggcaagtc cgaccctgcg taccagagcg tgcaaaacct cgccctgcgt 1800

ctcgcccagc gctacctcga ttccaccttt tgtacctggt acgccacggg cggttcaacc 1860

agcgacttcc cgcagctgga gggtgttacc ccgggcgcta cgggcgtcat gtttgagaag 1920

tacgccgaca atgctaccaa cgttgccggc ggcggcggcg aatacgaggt cgtcgagggt 1980

ttcgggtgga ccaatggcgt actgatctgg gcggccgacg tctttggtaa caagctcaag 2040

cgcccggact gcggcaacat cacggccgca catacccact ctagtgccaa gagaggtctg 2100

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aagatgtttg ggcggagtaa gctccggaga agagaggcag aagatgtgcg gaagcggtgg 2220

atgagctaa 2229

<210> 3

<211> 2085

<212> DNA

<213> 瘤孢毁丝霉

<400> 3

atggcgctac gacacatcgc ggcggcggcg atcgccggtc ttgcctcaag gactgcagcg 60

ctgtacatca atggctcagt cacagcgccg tgcgactcgc ccatttactg ccaaggcgag 120

cttctaaaag cggttgaact ggcgcgtcct ttcgttgaca gcaagacatt tgtggacatg 180

cccacgatca agccagtgga tgaagtgctt gcagcattca gcaagcttag cctaccactt 240

tccaataact cagagctcaa cgccttcttg tatgagaact tcgcccaggc tggccacgag 300

ctcgaagaag tgcccgacag tgagctagag acggacgcaa agttcctcga caagctcgag 360

gatcgcacca tcaaggagtt cgtcggcaag gtgatcgaca tctggcccga cttgaccagg 420

cgctatgccg gccccagcaa ctgcaccgag tgcgccaaca gcttcattcc cgtgaaccgc 480

acgttcgtcg tggctggcgg tcgcttccga gagccctact attgggattc gtactggatc 540

gtcgaaggtc tcctgcgcac tggcggtgcc ttcacccata tctccaagaa catcattgag 600

aacttcctgg actttgtcga cacgattggc ttcattccca atggcgccag gatctactac 660

ctgaacaggt cacagccccc tctcctgaca ttgatggtga agagctacgt cgactacacc 720

aacgacacga gcatcctgga cagggccttg ccgctgctga tcaaggagca cgagttcttc 780

atgaataacc ggacggtgtc catcacggga tcgaacggca aggagtacac tctgaacagg 840

tatcacgttg aaaacaacca accacgccca gagtcgttcc gggaggatta cattaccgct 900

aacaacggct cctactacgc gtcttcgggc ataatatatc ccgttaagac gcccctcaac 960

gagacggaaa aggccgcgct ctactcgaac ctagcaaccg gcgccgagtc cggctgggac 1020

tacacctccc gatggcttgg ggtccccagc gacgctgcga gggacgtcta tttcccgctc 1080

cgctcgctta atgtccgcga catagtcccc gtcgatctca actccatcct ctaccagaac 1140

gaggtgatca ttgccgagta cctcgagaag gccggtaact cctccgcggc caagcgcttc 1200

gccactgctg ccgaacagcg cagcgaggcc atgtactccc tcatgtggaa cgccacgcac 1260

tggtcttact ttgactacaa tctgaccgat aacacgcaac acatcttcgt cccagccgac 1320

gaggacaccg ccccccagga ccggatcgag gccccccccg gtcaacaagt cttcttccac 1380

attgcgcagc tctatccatt ctggacgggc gcggcccccg ccagccttaa ggctaacccc 1440

ctcgcggtgc agcaagccta cgcccgtgtg gcgcgcatgc tcgatatcaa gaagggcgcc 1500

atccccgcca ccaactaccg caccggccaa caatgggacc agcccaacgt ctggccgccg 1560

ctgcaacata tcctgatgaa gggcctgctt aacaccccgg caacctttgg caagtccgac 1620

cctgcgtacc agagcgtgca aaacctcgcc ctgcgtctcg cccagcgcta cctcgattcc 1680

accttttgta cctggtacgc cacgggcggt tcaaccagcg acttcccgca gctggagggt 1740

gttaccccgg gcgctacggg cgtcatgttt gagaagtacg ccgacaatgc taccaacgtt 1800

gccggcggcg gcggcgaata cgaggtcgtc gagggtttcg ggtggaccaa tggcgtactg 1860

atctgggcgg ccgacgtctt tggtaacaag ctcaagcgcc cggactgcgg caacatcacg 1920

gccgcacata cccactctag tgccaagaga ggtctggaag agaataagct gccgaggagg 1980

gcggtggagc tcgacccgtg ggatgccgcg tggaccaaga tgtttgggcg gagtaagctc 2040

cggagaagag aggcagaaga tgtgcggaag cggtggatga gctaa 2085

<210> 4

<211> 598

<212> PRT

<213> 埃默森篮状菌

<400> 4

Arg Ala Pro Val Ala Ala Arg Ala Thr Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu

1 5 10 15

Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly

20 25 30

Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ile Val Val Ala

35 40 45

Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp

50 55 60

Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ala Phe Ile Ala Gly Asn

65 70 75 80

Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile Gln Gln Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Lys

85 90 95

Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu

100 105 110

Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Trp

115 120 125

Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile

130 135 140

Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Asp Asn Gly Glu Ala Ser Thr Ala Asp

145 150 155 160

Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Gln Asn Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Gln

165 170 175

Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Glu Gly Ser

180 185 190

Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Asn

195 200 205

Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn His Thr Cys Ser Asn Cys Val Ser Gln

210 215 220

Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr

225 230 235 240

Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ser Gly Arg Ser Gly Lys Asp Val Asn

245 250 255

Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Gly Gly Cys Asp

260 265 270

Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys

275 280 285

Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Ile

290 295 300

Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr

305 310 315 320

Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Glu Gln

325 330 335

Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys Lys Ile Gly Ser Ile Ser Ile

340 345 350

Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe Phe Gln Asp Ile Tyr Pro Ser Ala Ala

355 360 365

Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asn Asp Ile Ile Ser

370 375 380

Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ile Val Glu Lys Tyr

385 390 395 400

Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu Thr Glu Gln Phe Ser Arg Thr Asp Gly

405 410 415

Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Leu Leu

420 425 430

Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu

435 440 445

Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala Val Cys Ser Ala Thr Ser Ala Thr

450 455 460

Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Asn Thr Val Trp Pro Ser Ser Gly Ser

465 470 475 480

Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Cys Thr Thr Pro Thr Ser

485 490 495

Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Val Ser Thr Ser Tyr Gly Glu Thr

500 505 510

Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile Pro Glu Leu Gly Asn Trp Ser Thr Ala

515 520 525

Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala Asp Ala Tyr Thr Asn Ser Asn Pro Leu

530 535 540

Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu Pro Pro Gly Thr Ser Phe Glu Tyr Lys

545 550 555 560

Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro

565 570 575

Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile

580 585 590

Leu Asp Asp Ser Trp Gln

595

<210> 5

<211> 556

<212> PRT

<213> 篱边粘褶菌

<400> 5

Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys Ala

1 5 10 15

Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly Ala

20 25 30

Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp Tyr

35 40 45

Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu Ile

50 55 60

Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr Leu

65 70 75 80

Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser Asn

85 90 95

Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn

100 105 110

Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp

115 120 125

Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp Leu

130 135 140

Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro Ile

145 150 155 160

Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser Thr

165 170 175

Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala

180 185 190

Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala Ile

195 200 205

Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn Leu

210 215 220

Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile Thr

225 230 235 240

Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu

245 250 255

Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala Thr

260 265 270

Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val

275 280 285

Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Val Ala Ser Asn

290 295 300

Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly Gly

305 310 315 320

Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp

325 330 335

Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser Thr

340 345 350

Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly Thr

355 360 365

Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys

370 375 380

Asn Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro Ser

385 390 395 400

Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro Leu

405 410 415

Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala Phe

420 425 430

Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly Leu

435 440 445

Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val Ala

450 455 460

Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile Tyr

465 470 475 480

Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn Ala

485 490 495

Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val Asn

500 505 510

Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn Asn

515 520 525

Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr Pro

530 535 540

Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

545 550 555

<210> 6

<211> 559

<212> PRT

<213> 密粘褶菌

<400> 6

Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Gly Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys Ala

1 5 10 15

Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly Ala

20 25 30

Ala Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp Tyr

35 40 45

Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu Ile

50 55 60

Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser Leu

65 70 75 80

Ile Asp Ser Phe Val Ile Ala Glu Ala Asn Ile Gln Gln Val Ser Asn

85 90 95

Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn

100 105 110

Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp

115 120 125

Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp Leu

130 135 140

Leu Ser Asn Gly Asn Thr Thr Trp Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro Ile

145 150 155 160

Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Val Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Thr

165 170 175

Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala

180 185 190

Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Lys Ile

195 200 205

Gly Gln Thr Ser Ser Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Ala Asn Leu

210 215 220

Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ile Thr

225 230 235 240

Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu

245 250 255

Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr Thr

260 265 270

Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val

275 280 285

Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser Asn

290 295 300

Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly Gly

305 310 315 320

Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp

325 330 335

Ala Leu Asn Val Trp Ala Ala Gln Gly Ser Leu Asn Val Thr Ser Ile

340 345 350

Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Val Thr Ala Gly Thr

355 360 365

Tyr Ala Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys

370 375 380

Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Gln Tyr Thr Pro Ser

385 390 395 400

Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ser Asn Gly Ala Pro Val

405 410 415

Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala Phe

420 425 430

Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Val Gly Leu

435 440 445

Thr Val Pro Thr Ser Cys Ser Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Thr Val Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Gln Thr Val Trp Gly Glu

465 470 475 480

Asn Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Ser Asn Trp Ser Pro

485 490 495

Asp Asn Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile

500 505 510

Thr Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Gln Tyr Lys Tyr Ile Arg

515 520 525

Lys Asn Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile

530 535 540

Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

545 550 555

<210> 7

<211> 583

<212> PRT

<213> 微小根毛霉

<400> 7

Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Gly Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu Thr

1 5 10 15

Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn Leu

20 25 30

Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu Asp

35 40 45

Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro

50 55 60

Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe Tyr

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val Ala

100 105 110

Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Gly

115 120 125

Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asp Gln

130 135 140

Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile Asp

145 150 155 160

Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser Gly

165 170 175

Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val Lys

180 185 190

His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Val

195 200 205

Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly Pro

210 215 220

Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ala

225 230 235 240

Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile Ser

245 250 255

Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val Leu

260 265 270

Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser Gln

275 280 285

Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu Gly

290 295 300

Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser Gly

305 310 315 320

Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr Asp

325 330 335

Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val Arg

340 345 350

Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp Asn

355 360 365

Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn Tyr

370 375 380

Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys Phe

385 390 395 400

Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr Thr

405 410 415

Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu Pro

420 425 430

Ala Ile Phe Thr Ser Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro

435 440 445

Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala

450 455 460

Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr

465 470 475 480

Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu

485 490 495

Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr

500 505 510

Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro

515 520 525

Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr

530 535 540

Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp

545 550 555 560

Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala

565 570 575

Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg

580

<210> 8

<211> 515

<212> PRT

<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌

<400> 8

Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu

1 5 10 15

Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn

20 25 30

Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys

35 40 45

Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp

50 55 60

Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met

85 90 95

Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly

100 105 110

Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln

115 120 125

Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe

130 135 140

Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His

145 150 155 160

Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr

165 170 175

Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu

180 185 190

Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His

195 200 205

Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn

210 215 220

Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys

225 230 235 240

Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly

245 250 255

Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys

260 265 270

Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp

275 280 285

Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala

290 295 300

Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro

305 310 315 320

Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln

325 330 335

Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala

340 345 350

Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp

355 360 365

Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile

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Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His

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Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val

405 410 415

Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

420 425 430

Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val

435 440 445

Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser

450 455 460

Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp

465 470 475 480

Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Arg Pro Ile Thr Thr

485 490 495

Arg Pro Trp Thr Gly Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val

500 505 510

Ala Trp Pro

515

<210> 9

<211> 413

<212> PRT

<213> 激烈火球菌

<400> 9

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1 5 10 15

Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Ile Thr Ile Gly Ile

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Ile Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp Asp

50 55 60

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65 70 75 80

Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala Lys Leu Ala

85 90 95

Gly Ile Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Thr Ile

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Ile Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly Ile

115 120 125

Lys Val Ile Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser Gln Ser Ser Asp Gly Thr

130 135 140

Asp Ala Leu Ser Gln Ala Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val

145 150 155 160

Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr Ile Gly

165 170 175

Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys Val Ile Thr Val Gly Ala Val Asp Lys

180 185 190

Tyr Asp Val Ile Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly

195 200 205

Arg Leu Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp Ile Ile Ala Ala

210 215 220

Arg Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gln Pro Ile Asn Asp Tyr Tyr Thr

225 230 235 240

Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ile Ala

245 250 255

Ala Leu Leu Leu Gln Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys

260 265 270

Thr Ala Leu Ile Glu Thr Ala Asp Ile Val Lys Pro Asp Glu Ile Ala

275 280 285

Asp Ile Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala Ile Asn

290 295 300

Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly Tyr Val Ala Asn Lys

305 310 315 320

Gly Ser Gln Thr His Gln Phe Val Ile Ser Gly Ala Ser Phe Val Thr

325 330 335

Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu

340 345 350

Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gln Val Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr

355 360 365

Asp Phe Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr

370 375 380

Ile Lys Val Val Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gln Val Asp Val

385 390 395 400

Val Ser Asp Gly Ser Leu Ser Gln Pro Gly Ser Ser Pro

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<210> 10

<211> 595

<212> PRT

<213> 草酸青霉

<400> 10

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1 5 10 15

Gly Glu Arg Ser Leu Gln Gly Ile Leu Asp Asn Leu Gly Gly Arg Gly

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50 55 60

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65 70 75 80

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Ser Gln Ala Ile Leu Gln Ser Val Ser Asn Pro Ser Gly Thr Leu Lys

100 105 110

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115 120 125

Phe Ser Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg

130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

Glu Val Asp Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala

195 200 205

Leu Val Glu Gly Ser Gln Leu Ala Lys Lys Leu Gly Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Ala Cys Asp Ser Gln Pro Pro Gln Ile Leu Cys Phe Leu Gln Ser Phe

225 230 235 240

Trp Asn Gly Lys Tyr Ile Thr Ser Asn Ile Asn Thr Gln Ala Ser Arg

245 250 255

Ser Gly Ile Asp Leu Asp Ser Val Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp

260 265 270

Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ala Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg

275 280 285

Ala Leu Ala Asn His Lys Val Tyr Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr

290 295 300

Lys Ile Asn Ala Gly Leu Ala Glu Gly Ser Ala Ala Asn Val Gly Arg

305 310 315 320

Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr

325 330 335

Leu Gly Ala Ser Glu Leu Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Arg

340 345 350

Leu Gly Lys Leu Glu Val Ser Glu Thr Ser Leu Ser Phe Phe Lys Asp

355 360 365

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370 375 380

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405 410 415

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580 585 590

Trp Gln Phe

595

<210> 11

<211> 556

<212> PRT

<213> 瓣环栓菌

<400> 11

Gln Ser Ser Ala Ala Asp Ala Tyr Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ala

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Lys Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Ser Gly Ser Lys Ser Asn

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Gly Ala Lys Ala Gly Ile Val Ile Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asn Pro

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Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Gly Gly Tyr Ile Thr

225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val

275 280 285

Asp Ala Phe Arg Ser Ile Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser Asn

290 295 300

Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Met Gly Gly

305 310 315 320

Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Ser Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp

325 330 335

Ala Leu Ile Val Trp Asn Lys Leu Gly Ala Leu Asn Val Thr Ser Thr

340 345 350

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370 375 380

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515 520 525

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545 550 555

<210> 12

<211> 555

<212> PRT

<213> 血红密孔菌

<400> 12

Gln Ser Ser Ala Val Asp Ala Tyr Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ala

1 5 10 15

Lys Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala His

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Gly Ala Lys Ala Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Glu Asn Pro

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Leu Ile Asp Gln Phe Thr Ser Gly Asp Asp Thr Ser Leu Arg Gly Leu

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100 105 110

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115 120 125

Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ser Ile Ile Arg Tyr Ala Asn Trp Leu

130 135 140

Leu Asp Asn Gly Asn Thr Thr Tyr Val Ser Asn Thr Leu Trp Pro Val

145 150 155 160

Ile Gln Leu Asp Leu Asp Tyr Val Ala Asp Asn Trp Asn Gln Ser Thr

165 170 175

Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala

180 185 190

Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Thr Phe Ala Ser Arg Ile

195 200 205

Gly Gln Ser Ser Val Val Ser Gly Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn Leu

210 215 220

Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Val Thr

225 230 235 240

Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ser Asn Thr Val Leu

245 250 255

Thr Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Ala Gly Cys Asp Ala Ala Thr

260 265 270

Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val

275 280 285

Asp Ala Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Ile Asn Asn Gly Ile Ala Ser Asn

290 295 300

Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Met Gly Gly

305 310 315 320

Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Ser Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp

325 330 335

Ala Leu Tyr Val Trp Asp Gln Leu Gly Gly Leu Asn Val Thr Ser Thr

340 345 350

Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ala Ser Gly Leu Ser Thr Gly Thr

355 360 365

Tyr Ser Ala Ser Ser Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Thr Ser Ala Ile Arg

370 375 380

Ser Phe Ala Asp Gly Phe Leu Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro Ala

385 390 395 400

Asp Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Arg Asn Asp Gly Thr Pro Leu

405 410 415

Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Ala Phe

420 425 430

Ala Ala Arg Glu Gly Lys Thr Tyr Gly Ser Trp Gly Ala Ala Gly Leu

435 440 445

Thr Val Pro Ala Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ala Thr Val Ala Val

450 455 460

Thr Phe Asn Val Gln Ala Thr Thr Val Phe Gly Glu Asn Ile Tyr Ile

465 470 475 480

Thr Gly Ser Val Ala Ala Leu Gln Asn Trp Ser Pro Asp Asn Ala Leu

485 490 495

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500 505 510

Pro Ala Asn Thr Val Val Gln Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Phe Asn Gly

515 520 525

Gln Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Gln Ile Thr Thr Pro Ser

530 535 540

Gly Gly Ser Phe Thr Gln Asn Asp Val Trp Arg

545 550 555

<210> 13

<211> 177

<212> PRT

<213> 桔橙嗜热子囊菌

<400> 13

Thr Arg Ile Ser Ser Cys Ser Gly Ser Arg Gln Ser Ala Leu Thr Thr

1 5 10 15

Ala Leu Arg Asn Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala Ala Ala Asp Ala Ala

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Gln Ser Gly Ser Ala Ser Lys Phe Ser Glu Tyr Phe Lys Thr Thr Ser

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Ser Ser Thr Arg Gln Thr Val Ala Ala Arg Leu Arg Ala Val Ala Arg

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Met Asn Ala Asp Thr Tyr Ala Leu Tyr Ala Asn Ala Ile Tyr Leu Gly

165 170 175

Cys

<210> 14

<211> 844

<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 14

Gln Glu Leu Ala Phe Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro Trp Ala Asp

1 5 10 15

Gly Gln Gly Glu Trp Ala Asp Ala His Arg Arg Ala Val Glu Ile Val

20 25 30

Ser Gln Met Thr Leu Ala Glu Lys Val Asn Leu Thr Thr Gly Thr Gly

35 40 45

Trp Glu Met Asp Arg Cys Val Gly Gln Thr Gly Ser Val Pro Arg Leu

50 55 60

Gly Ile Asn Trp Gly Leu Cys Gly Gln Asp Ser Pro Leu Gly Ile Arg

65 70 75 80

Phe Ser Asp Leu Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Thr Asn Val Ala Ala

85 90 95

Thr Trp Asp Lys Thr Leu Ala Tyr Leu Arg Gly Lys Ala Met Gly Glu

100 105 110

Glu Phe Asn Asp Lys Gly Val Asp Ile Leu Leu Gly Pro Ala Ala Gly

115 120 125

Pro Leu Gly Lys Tyr Pro Asp Gly Gly Arg Ile Trp Glu Gly Phe Ser

130 135 140

Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr Ile Lys Gly

145 150 155 160

Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr Ile Leu Asn

165 170 175

Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Val Gly Glu Ala Gln Gly Tyr Gly Tyr

180 185 190

Asn Ile Thr Glu Thr Ile Ser Ser Asn Val Asp Asp Lys Thr Met His

195 200 205

Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala Gly Val Gly

210 215 220

Ala Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr Gly Cys Gln

225 230 235 240

Asn Ser Gln Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu Gly Phe Gln

245 250 255

Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Ser Ala His His Ser Gly Val Gly Ala

260 265 270

Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Ile Ser Phe Asp

275 280 285

Asp Gly Leu Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser Val Leu Asn

290 295 300

Gly Thr Val Pro Ala Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val Arg Ile Met

305 310 315 320

Thr Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Arg Ile Pro Pro Asn

325 330 335

Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Trp Glu His Ser Ala Val

340 345 350

Ser Glu Gly Ala Trp Thr Lys Val Asn Asp Phe Val Asn Val Gln Arg

355 360 365

Ser His Ser Gln Ile Ile Arg Glu Ile Gly Ala Ala Ser Thr Val Leu

370 375 380

Leu Lys Asn Thr Gly Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu Val Lys Val

385 390 395 400

Gly Val Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Trp Gly Ala Asn Gly

405 410 415

Cys Pro Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met Ala Trp Gly

420 425 430

Ser Gly Thr Ala Asn Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu Gln Ala Ile

435 440 445

Gln Arg Glu Val Ile Ser Asn Gly Gly Asn Val Phe Ala Val Thr Asp

450 455 460

Asn Gly Ala Leu Ser Gln Met Ala Asp Val Ala Ser Gln Ser Ser Val

465 470 475 480

Ser Leu Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Phe Ile Ser Val

485 490 495

Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp Lys Asn Gly

500 505 510

Glu Ala Val Ile Asp Thr Val Val Ser His Cys Asn Asn Thr Ile Val

515 520 525

Val Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Ile Asp Arg Trp Tyr Asp Asn

530 535 540

Pro Asn Val Thr Ala Ile Ile Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln Glu Ser

545 550 555 560

Gly Asn Ser Leu Val Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn Pro Ser Ala

565 570 575

Lys Thr Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ser Tyr Gly Ala Pro

580 585 590

Leu Leu Thr Glu Pro Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Asp Asp Phe

595 600 605

Asn Glu Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg His Phe Asp Lys Arg Asn Glu

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Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Gly

625 630 635 640

Tyr Ser His Leu Arg Val Gln Ala Leu Asn Ser Ser Ser Ser Ala Tyr

645 650 655

Val Pro Thr Ser Gly Glu Thr Lys Pro Ala Pro Thr Tyr Gly Glu Ile

660 665 670

Gly Ser Ala Ala Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gly Leu Lys Arg Ile Thr

675 680 685

Lys Phe Ile Tyr Pro Trp Leu Asn Ser Thr Asp Leu Glu Asp Ser Ser

690 695 700

Asp Asp Pro Asn Tyr Gly Trp Glu Asp Ser Glu Tyr Ile Pro Glu Gly

705 710 715 720

Ala Arg Asp Gly Ser Pro Gln Pro Leu Leu Lys Ala Gly Gly Ala Pro

725 730 735

Gly Gly Asn Pro Thr Leu Tyr Gln Asp Leu Val Arg Val Ser Ala Thr

740 745 750

Ile Thr Asn Thr Gly Asn Val Ala Gly Tyr Glu Val Pro Gln Leu Tyr

755 760 765

Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Arg Val Val Leu Arg Lys Phe

770 775 780

Asp Arg Ile Phe Leu Ala Pro Gly Glu Gln Lys Val Trp Thr Thr Thr

785 790 795 800

Leu Asn Arg Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asp Val Glu Ala Gln Asp Trp

805 810 815

Val Ile Thr Lys Tyr Pro Lys Lys Val His Val Gly Ser Ser Ser Arg

820 825 830

Lys Leu Pro Leu Arg Ala Pro Leu Pro Arg Val Tyr

835 840

<210> 15

<211> 227

<212> PRT

<213> 桔橙嗜热子囊菌

<400> 15

Phe Val Gln Asn Ile Val Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Tyr

1 5 10 15

Leu Val Asn Gln Tyr Pro Tyr Met Ser Asn Pro Pro Glu Val Ile Ala

20 25 30

Trp Ser Thr Thr Ala Thr Asp Leu Gly Phe Val Asp Gly Thr Gly Tyr

35 40 45

Gln Thr Pro Asp Ile Ile Cys His Arg Gly Ala Lys Pro Gly Ala Leu

50 55 60

Thr Ala Pro Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Glu Leu Gln Trp Thr Pro

65 70 75 80

Trp Pro Asp Ser His His Gly Pro Val Ile Asn Tyr Leu Ala Pro Cys

85 90 95

Asn Gly Asp Cys Ser Thr Val Asp Lys Thr Gln Leu Glu Phe Phe Lys

100 105 110

Ile Ala Glu Ser Gly Leu Ile Asn Asp Asp Asn Pro Pro Gly Ile Trp

115 120 125

Ala Ser Asp Asn Leu Ile Ala Ala Asn Asn Ser Trp Thr Val Thr Ile

130 135 140

Pro Thr Thr Ile Ala Pro Gly Asn Tyr Val Leu Arg His Glu Ile Ile

145 150 155 160

Ala Leu His Ser Ala Gln Asn Gln Asp Gly Ala Gln Asn Tyr Pro Gln

165 170 175

Cys Ile Asn Leu Gln Val Thr Gly Gly Gly Ser Asp Asn Pro Ala Gly

180 185 190

Thr Leu Gly Thr Ala Leu Tyr His Asp Thr Asp Pro Gly Ile Leu Ile

195 200 205

Asn Ile Tyr Gln Lys Leu Ser Ser Tyr Ile Ile Pro Gly Pro Pro Leu

210 215 220

Tyr Thr Gly

225

<210> 16

<211> 228

<212> PRT

<213> 埃默森青霉

<400> 16

His Gly Phe Val Gln Gly Ile Val Ile Gly Asp Gln Phe Tyr Ser Gly

1 5 10 15

Tyr Ile Val Asn Ser Phe Pro Tyr Glu Ser Asn Pro Pro Pro Val Ile

20 25 30

Gly Trp Ala Thr Thr Ala Thr Asp Leu Gly Phe Val Asp Gly Thr Gly

35 40 45

Tyr Gln Gly Pro Asp Ile Ile Cys His Arg Asn Ala Thr Pro Ala Pro

50 55 60

Leu Thr Ala Pro Val Ala Ala Gly Gly Thr Val Glu Leu Gln Trp Thr

65 70 75 80

Pro Trp Pro Asp Ser His His Gly Pro Val Ile Thr Tyr Leu Ala Pro

85 90 95

Cys Asn Gly Asn Cys Ser Thr Val Asp Lys Thr Thr Leu Glu Phe Phe

100 105 110

Lys Ile Asp Gln Gln Gly Leu Ile Asp Asp Thr Ser Pro Pro Gly Thr

115 120 125

Trp Ala Ser Asp Asn Leu Ile Ala Asn Asn Asn Ser Trp Thr Val Thr

130 135 140

Ile Pro Asn Ser Val Ala Pro Gly Asn Tyr Val Leu Arg His Glu Ile

145 150 155 160

Ile Ala Leu His Ser Ala Asn Asn Lys Asp Gly Ala Gln Asn Tyr Pro

165 170 175

Gln Cys Ile Asn Ile Glu Val Thr Gly Gly Gly Ser Asp Ala Pro Glu

180 185 190

Gly Thr Leu Gly Glu Asp Leu Tyr His Asp Thr Asp Pro Gly Ile Leu

195 200 205

Val Asp Ile Tyr Glu Pro Ile Ala Thr Tyr Thr Ile Pro Gly Pro Pro

210 215 220

Glu Pro Thr Phe

225

<210> 17

<211> 506

<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 17

Gln Gln Val Gly Thr Ser Gln Ala Glu Val His Pro Ser Met Thr Trp

1 5 10 15

Gln Ser Cys Thr Ala Gly Gly Ser Cys Thr Thr Asn Asn Gly Lys Val

20 25 30

Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Lys Val Gly Asp Tyr Thr

35 40 45

Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Thr Thr Ile Cys Pro Asp Asp

50 55 60

Ala Thr Cys Ala Ser Asn Cys Ala Leu Glu Gly Ala Asn Tyr Glu Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Val Thr Ala Ser Gly Asn Ser Leu Arg Leu Asn Phe Val

85 90 95

Thr Thr Ser Gln Gln Lys Asn Ile Gly Ser Arg Leu Tyr Met Met Lys

100 105 110

Asp Asp Ser Thr Tyr Glu Met Phe Lys Leu Leu Asn Gln Glu Phe Thr

115 120 125

Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu

130 135 140

Tyr Phe Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Met Ser Lys Tyr Pro Thr

145 150 155 160

Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys

165 170 175

Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp

180 185 190

Gln Pro Ser Ser Asn Asp Ala Asn Ala Gly Thr Gly Asn His Gly Ser

195 200 205

Cys Cys Ala Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Thr Ala

210 215 220

Phe Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Val Met Cys Thr Gly

225 230 235 240

Asp Ala Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Ser Asp Arg Tyr Gly Gly Thr Cys

245 250 255

Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ser Phe Arg Gln Gly Asn Lys Thr

260 265 270

Phe Tyr Gly Pro Gly Met Thr Val Asp Thr Lys Ser Lys Phe Thr Val

275 280 285

Val Thr Gln Phe Ile Thr Asp Asp Gly Thr Ser Ser Gly Thr Leu Lys

290 295 300

Glu Ile Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn Ser

305 310 315 320

Glu Ser Thr Trp Thr Gly Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr Thr Glu Tyr

325 330 335

Cys Thr Ala Gln Lys Ser Leu Phe Gln Asp Gln Asn Val Phe Glu Lys

340 345 350

His Gly Gly Leu Glu Gly Met Gly Ala Ala Leu Ala Gln Gly Met Val

355 360 365

Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ser Ala Asn Met Leu Trp Leu

370 375 380

Asp Ser Asn Tyr Pro Thr Thr Ala Ser Ser Thr Thr Pro Gly Val Ala

385 390 395 400

Arg Gly Thr Cys Asp Ile Ser Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu Ala

405 410 415

Asn His Pro Asp Ala Tyr Val Val Tyr Ser Asn Ile Lys Val Gly Pro

420 425 430

Ile Gly Ser Thr Phe Asn Ser Gly Gly Ser Asn Pro Gly Gly Gly Thr

435 440 445

Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gln Pro Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Gly

450 455 460

Asn Pro Gly Gly Thr Gly Val Ala Gln His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly

465 470 475 480

Ile Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Ala Ser Pro Tyr Thr Cys Gln

485 490 495

Lys Leu Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu

500 505

<210> 18

<211> 435

<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 18

Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Ser Gly Pro

1 5 10 15

Thr Ser Cys Val Ala Gly Ala Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr

20 25 30

Ala Gln Cys Ile Pro Gly Ala Thr Ala Thr Ser Thr Thr Leu Thr Thr

35 40 45

Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ser Gln Thr Thr Thr Lys Pro Thr Thr

50 55 60

Thr Gly Pro Thr Thr Ser Ala Pro Thr Val Thr Ala Ser Gly Asn Pro

65 70 75 80

Phe Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Ala Asn Pro Tyr Tyr Ser Ser Glu Val

85 90 95

His Thr Leu Ala Met Pro Ser Leu Pro Ser Ser Leu Gln Pro Lys Ala

100 105 110

Ser Ala Val Ala Glu Val Pro Ser Phe Val Trp Leu Asp Val Ala Ala

115 120 125

Lys Val Pro Thr Met Gly Thr Tyr Leu Ala Asp Ile Gln Ala Lys Asn

130 135 140

Lys Ala Gly Ala Asn Pro Pro Ile Ala Gly Ile Phe Val Val Tyr Asp

145 150 155 160

Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Leu Ala Ser Asn Gly Glu Tyr Ser

165 170 175

Ile Ala Asn Asn Gly Val Ala Asn Tyr Lys Ala Tyr Ile Asp Ala Ile

180 185 190

Arg Ala Gln Leu Val Lys Tyr Ser Asp Val His Thr Ile Leu Val Ile

195 200 205

Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn Leu Asn Val Ala Lys

210 215 220

Cys Ala Asn Ala Gln Ser Ala Tyr Leu Glu Cys Val Asp Tyr Ala Leu

225 230 235 240

Lys Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala Gly His

245 250 255

Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu

260 265 270

Phe Ala Lys Val Tyr Thr Asp Ala Gly Ser Pro Ala Ala Val Arg Gly

275 280 285

Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Ala Trp Ser Leu Ser Thr Cys

290 295 300

Pro Ser Tyr Thr Gln Gly Asp Pro Asn Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ile

305 310 315 320

Asn Ala Met Ala Pro Leu Leu Lys Glu Ala Gly Phe Asp Ala His Phe

325 330 335

Ile Met Asp Thr Ser Arg Asn Gly Val Gln Pro Thr Lys Gln Asn Ala

340 345 350

Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val Ile Gly Thr Gly Phe Gly Val Arg Pro

355 360 365

Ser Thr Asn Thr Gly Asp Pro Leu Gln Asp Ala Phe Val Trp Ile Lys

370 375 380

Pro Gly Gly Glu Ser Asp Gly Thr Ser Asn Ser Thr Ser Pro Arg Tyr

385 390 395 400

Asp Ala His Cys Gly Tyr Ser Asp Ala Leu Gln Pro Ala Pro Glu Ala

405 410 415

Gly Thr Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Thr Asn Ala Asn

420 425 430

Pro Ser Phe

435

<210> 19

<211> 547

<212> PRT

<213> 大型亚灰树花菌

<400> 19

Thr Pro Thr Gly Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Ala Arg Glu Asp Leu

1 5 10 15

Pro Ala Gly Phe Ser Leu Arg Gly Ala Ala Ser Pro Asp Thr Thr Leu

20 25 30

Lys Leu Arg Ile Ala Leu Val Gln Asn Asn Phe Ala Glu Leu Glu Asp

35 40 45

Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser Ala Asn Tyr Gly Asn His

50 55 60

Leu Ser Lys Glu Glu Val Glu Gln Tyr Ile Ala Pro Ala Pro Glu Ser

65 70 75 80

Val Lys Ala Val Asn Ala Trp Leu Thr Glu Asn Gly Leu Asp Ala His

85 90 95

Thr Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu Ala Phe Glu Val Pro Val Ser

100 105 110

Lys Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp Phe Ser Val Phe Thr His Asp

115 120 125

Glu Ser Gly Leu Glu Ala Ile Arg Thr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Ala

130 135 140

Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val His Pro Thr Val Thr Phe Pro

145 150 155 160

Asn Pro Asn Ala His Leu Pro Val Val Arg Ser Thr Gln Pro Ile Arg

165 170 175

Asn Leu Thr Gly Arg Ala Ile Pro Ala Ser Cys Ala Ser Thr Ile Thr

180 185 190

Pro Ala Cys Leu Gln Ala Ile Tyr Gly Ile Pro Thr Thr Lys Ala Thr

195 200 205

Gln Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val Ser Gly Phe Ile Asp Gln Phe Ala

210 215 220

Asn Lys Ala Asp Leu Lys Ser Phe Leu Ala Gln Phe Arg Lys Asp Ile

225 230 235 240

Ser Ser Ser Thr Thr Phe Ser Leu Gln Thr Leu Asp Gly Gly Glu Asn

245 250 255

Asp Gln Ser Pro Ser Glu Ala Gly Ile Glu Ala Asn Leu Asp Ile Gln

260 265 270

Tyr Thr Val Gly Leu Ala Thr Gly Val Pro Thr Thr Phe Ile Ser Val

275 280 285

Gly Asp Asp Phe Gln Asp Gly Asn Leu Glu Gly Phe Leu Asp Ile Ile

290 295 300

Asn Phe Leu Leu Gly Glu Ser Asn Pro Pro Gln Val Leu Thr Thr Ser

305 310 315 320

Tyr Gly Gln Asn Glu Asn Thr Ile Ser Ala Lys Leu Ala Asn Gln Leu

325 330 335

Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala Arg Gly Thr Ser Ile Leu Phe

340 345 350

Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ser Gly Ser Gln Ser Ala His Cys Ser

355 360 365

Asn Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly Cys Pro Phe Met Thr Ser Val

370 375 380

Gly Ala Thr Gln Gly Val Ser Pro Glu Thr Ala Ala Ala Phe Ser Ser

385 390 395 400

Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe Gly Ile Pro Ser Tyr Gln Ala Ser Ala

405 410 415

Val Ser Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Gly Ser Thr Asn Ser Gly Lys Phe

420 425 430

Asn Arg Ser Gly Arg Gly Phe Pro Asp Val Ser Thr Gln Gly Val Asp

435 440 445

Phe Gln Ile Val Ser Gly Gly Gln Thr Ile Gly Val Asp Gly Thr Ser

450 455 460

Cys Ala Ser Pro Thr Phe Ala Ser Val Ile Ser Leu Val Asn Asp Arg

465 470 475 480

Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu

485 490 495

Tyr Ser Ser Ala Gly Lys Ala Ala Leu Asn Asp Val Thr Ser Gly Ser

500 505 510

Asn Pro Gly Cys Ser Thr Asn Gly Phe Pro Ala Lys Ala Gly Trp Asp

515 520 525

Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asn Phe Ala Lys Leu Leu Thr Ala

530 535 540

Val Gly Leu

545

Claims (17)

1.一种具有增加的抗蛋白酶降解稳定性和/或增加的热稳定性的海藻糖酶变体多肽，该海藻糖酶变体多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的位置152、182、185或583处的一个或多个位置处的替换，其中该变体具有与SEQ ID NO:1的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％，至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有海藻糖酶活性。

2.如权利要求1所述的变体，该变体包含一个或多个取代，该一个或多个取代选自于由以下组成的组：P152G、P152E、P152A、F182V、F185R或G583T。

3.如权利要求1-2中任一项所述的变体，该变体具有增加的抗蛋白酶降解稳定性，该变体包含选自下组的取代或取代的组合，该组由以下组成：

G583T；

P152G；

P152E；

P152A；

F182V；

F185R；

P152G+G583T；

F185R+G583T；

P152A+F182V+G583T；

F182V+F185R+G583T；

并且其中该变体具有与SEQ ID NO:1的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有海藻糖酶活性，并且其中在30℃，pH 4.0下与黑曲霉蛋白酶混合物孵育3天后的残留活性为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％。

4.如权利要求1-2中任一项所述的变体，该变体具有增加的热稳定性，该变体包含选自下组的取代或取代的组合，该组由以下组成：

P152G；

P152E；

P152A；

F182V；

F185R；

P152G+G583T；

F185R+G583T；

P152A+F182V+G583T；

F182V+F185R+G583T；

并且其中该变体具有与SEQ ID NO:1的氨基酸1至674至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性，并且其中该变体具有海藻糖酶活性，其中通过TSA分析测量的热变性温度至少为65.7℃。

5.如权利要求4所述的变体，其中该热变性温度为至少65.8℃、至少65.9℃、至少66.0℃、至少66.1℃、至少66.2℃、至少66.3℃、至少66.4℃、至少66.5℃、至少66.6℃、至少66.6℃、至少66.8℃、至少66.9℃、至少67.0℃、至少67.1℃、至少67.2℃、至少67.3℃、至少67.4℃、至少67.5℃。

6.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-5中任一项所述的变体。

7.一种核酸构建体，该核酸构建体包含如权利要求6所述的多核苷酸。

8.一种表达载体，该表达载体包含如权利要求6所述的多核苷酸。

9.一种宿主细胞，该宿主细胞包含如权利要求6所述的多核苷酸或如权利要求7所述的核酸构建体。

10.一种组合物，该组合物包含如权利要求1-5中任一项所述的多肽。

11.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，该全培养液配制品或细胞培养组合物包含如权利要求1-5所述的多肽。

12.一种产生海藻糖酶变体的方法，该方法包括：

在适合于表达该变体的条件下培养如权利要求9所述的宿主细胞；以及

回收该变体。

13.一种生产发酵产物的方法，该方法包括

(a)用α-淀粉酶使含淀粉材料液化；

任选地在步骤(b)之前使所液化的材料预糖化；

(b)使所液化的材料糖化；

(c)使用发酵生物进行发酵；

其中

i)葡糖淀粉酶；

ii)如权利要求1所述的海藻糖酶；

iii)任选的纤维素分解酶组合物和/或蛋白酶；

在以下步骤的过程中存在和/或添加：

-糖化步骤(b)；

-发酵步骤(c)；

-同时的糖化和发酵；

-任选地在步骤(b)之前的预糖化步骤。

14.一种从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：

(i)在低于起始糊化温度的温度下使含淀粉的材料糖化；以及

(ii)使用发酵生物进行发酵；

其中在以下酶的存在下进行糖化和/或发酵：葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、如权利要求1所述的变体海藻糖酶，以及任选的蛋白酶和/或纤维素分解酶组合物。

15.一种从预处理的纤维素材料产生发酵产物的方法，该方法包括：

(a)用纤维素分解酶组合物使所述预处理的纤维素材料水解；

(b)使用发酵生物进行发酵；以及

(c)任选地回收该发酵产物，

其中如权利要求1所述的变体海藻糖酶被添加至和/或存在于水解步骤(a)和/或发酵步骤(b)中。

16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中该发酵生物为如权利要求9所述的宿主细胞，特别是酵母宿主细胞，特别是选自下组的酵母，该组由以下组成：假丝酵母属细胞、汉逊酵母属细胞、克鲁维酵母属细胞、毕赤酵母属细胞、酵母菌属细胞、裂殖酵母或耶罗维亚酵母属细胞、如乳酸克鲁维酵母细胞、卡尔酵母细胞、酿酒酵母细胞、糖化酵母细胞、道格拉氏酵母细胞、克鲁弗酵母细胞、诺地酵母细胞、卵形酵母细胞或解脂耶罗维亚酵母细胞，最特别是酿酒酵母。

17.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中该变体海藻糖酶与发酵生物，特别是酵母生物，更特别是干酵母共同配制。