CN111094325A

CN111094325A - 用于制备人乳低聚糖的微生物

Info

Publication number: CN111094325A
Application number: CN201880050358.1A
Authority: CN
Inventors: M·佩拉查; S·维姆霍夫; F·迈因哈特
Original assignee: OligoScience Biotechnology GmbH
Current assignee: OligoScience Biotechnology GmbH
Priority date: 2017-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2020-05-01
Also published as: SG11202000900SA; AU2018310663A1; KR102630559B1; JP2020528759A; US20200347366A1; MA51454A; PH12020550040A1; KR20200033320A; JP2023113646A; BR112020001983A2; WO2019025485A1; JP7760551B2; EP3661949A1; US20240067937A1; AU2023229583A1; EP3438122A1; MX2020001326A; CA3071309A1

Abstract

人乳低聚糖(HMO)可用作例如婴儿营养品、医疗营养品、功能性食品和动物饲料中的功能性成分。仍然需要制备HMO的改进方法。本发明提供了用于改进HMO制备的经遗传修饰的微生物和使用其制备HMO的方法。本发明的微生物可以具有一种或多种提高产量的修饰，包括诱导型裂解系统，其允许容易地提取细胞内和细胞外的HMO；乳糖通透酶突变体，其可以增加细胞内乳糖水平；或分子伴侣，其可以增加用于产生HMO的关键酶的细胞内利用度。

Description

用于制备人乳低聚糖的微生物

技术领域

本发明涉及制备人乳低聚糖(HMO)的遗传修饰的微生物和使用所述微生物制备HMO的方法。本发明还涉及培养本发明的微生物的培养基，通过本发明的制备方法制备的纯化HMO，以及所述培养基和所述HMO的用途。

背景技术

人乳低聚糖(HMO)是在人乳中发现的结构多样的非缀合聚糖。迄今为止已经鉴定了超过200种HMO，它们都是由仅五种单糖结构单元，即D-半乳糖(Gal)、D-葡萄糖(Glc)、N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)、L-岩藻糖(Fuc)和唾液酸衍生物N-乙酰基-神经氨酸，与乳糖部分偶联而构建的(Petschacher和Nidetzky，J Biotechnol.2016,235:61-83)。还原端可以是乳糖或由两种结构类型的几个二糖单元延伸的乳糖，这两种结构类型是乳-N-二糖(Gal-β1，3-GlcNAc，I型)或氨基乳糖苷(Gal-β1，4-GlcNAc，II型，LacNAc)。HMO的结构和分类可以在例如Petschacher和Nidetzky，2016(同上)的图1和表1中找到。

在HMO中，2'-岩藻糖基乳糖(2-FL)最丰富，占所有HMO的约30％。另一种突出的HMO是3'-岩藻糖基乳糖(3-FL)。其他的HMO为乳-N-四糖、乳-N-新四糖和乳-N-岩藻戊糖I。除了中性HMO外，酸性HMO也存在于人乳中，如3'-唾液酸乳糖、6'-唾液酸乳糖和3-岩藻糖基-3'-唾液酸乳糖、双唾液酸-乳-N-四糖。已知HMO能保护免受病原体如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肠致病性大肠杆菌和溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)的侵害(Bode，Early Hum Dev.2015；91(11)：619-22)。2-FL被认为具有通过防止毒素和病原体的上皮水平粘附而防御传染病的能力。它刺激某些双歧杆菌和受体类似物的生长，这提供了对毒性和病原性攻击的保护，这在婴儿中是最普遍的。基于这些发现，HMO，尤其是2-FL和3-FL，作为功能成分用于从婴儿营养物到医疗营养物到功能食品和动物饲料的产品中是特别令人感兴趣的。

HMO可从人乳或牛奶中提取。然而，在两种情况下，难以获得大量的和/或达到令人满意的纯度。

HMO也可以是化学合成的，然而，该技术不是稳健的并且化学合成的HMO的成本高。

另一方面，在经遗传修饰的微生物中制备HMO有希望提供低成本的稳定和安全的制备方法。US7,521,212描述了通过遗传修饰的大肠杆菌由前体乳糖制备低聚糖的方法，涉及lacZ基因的失活。EP2675899、EP2877574、EP2440661和EP3191499进一步描述了在遗传修饰的微生物中产生用于2-FL或3-FL的不同岩藻糖基转移酶。Huang等人，2017描述了遗传修饰的大肠杆菌(E.Coli)中2-FL或3-FL的生物合成及其多重模块优化策略(Huang等人，MetaEng.2017；(41)：23-38)。EP2440661描述了大肠杆菌表达糖输出分子以增加2-FL向培养基中的输出。

2-FL由乳糖和海藻糖组成(Pereira&McDonald，Sci Rep.2012；84(1)：637-655)。大肠杆菌中2-(3-)-FL的生物合成途径示意性地示于图1中。大肠杆菌能够通过特定转运蛋白将前体葡萄糖和乳糖吸收入细胞中。葡萄糖通过磷酸转移酶系统吸收并转化为葡萄糖-6-磷酸。后者作为碳源和能量源来驱动生长，并作为GDP-L-岩藻糖的前体，GDP-L-岩藻糖是一种荚膜异多糖酸(colanic acid)生物合成的中间体。GDP-L-岩藻糖的从头生物合成途径源自糖酵解中间体果糖6-磷酸，并且基于酶ManA(甘露糖6-磷酸异构酶)、ManB(磷酸甘露糖变位酶)、GTP依赖的ManC(甘露糖1-磷酸鸟苷酰转移酶)、Gmd(GDP-D-甘露糖4,6-脱水酶)和NADPH依赖的WcaG(GDP-L-岩藻糖合酶)，所有这些酶均源自大肠杆菌(图2)。第二种前体—乳糖通过乳糖通透酶LacY(一种乳糖/H⁺-同向转运体)被吸收到细胞中。用于2-FL制备的关键酶是来自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的α-1,2-岩藻糖基转移酶(FutC)，它将供体GDP-L-岩藻糖的岩藻糖部分转移到受体乳糖，产生2-FL(图2)。通过用编码α-1,3-岩藻糖基转移酶的来自幽门螺杆菌的futA基因替换futC基因，生物合成途径可用于制备3'-岩藻糖基乳糖。

尽管有最新的进展，但是仍然需要在遗传修饰的微生物中按生物技术制备HMO，特别是2-FL和/或3-FL的改进方法。基于大肠杆菌中已知的2-FL生物合成途径，本发明显著改善了HMO的合成及其向培养基中的释放。

发明内容

本发明提供了用于改进HMO制备的微生物和使用其的HMO制备方法。

特别地，本发明提供了包含诱导型裂解系统的微生物，其使得很容易同时提取细胞内和细胞外的HMO，而不需要额外的加工步骤来获得细胞内部分。诱导型裂解系统的优选实例是Mg²⁺调控的自动诱导型裂解系统，其中，细胞在Mg²⁺耗尽的条件下发生裂解，即当细胞外Mg²⁺浓度低于某一阈值时发生裂解。在细胞裂解后，细胞内HMO可释放到培养细胞的培养基中，导致培养基中HMO浓度增加。这可以有利地使HMO的产量得到提高以及时间和成本得到节省。

本发明还提供了包含编码乳糖通透酶的外源基因的微生物。乳糖通透酶优选是LacY的突变体，与野生型LacY相比，其较不易受细胞内乳糖的抑制。这可以有利地使HMO的产量得到提高。

本发明还提供了使用本发明的微生物制备HMO的方法。

本发明还提供了在HMO的制备方法中培养了本发明的微生物的培养基、以及通过本发明的HMO的制备方法得到的纯化的HMO。

优选实施方式：

1.用于制备人乳低聚糖的经遗传修饰的微生物。

2.根据项1所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物是细菌。

3.根据项1或2所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物是大肠杆菌。

4.根据项1至3中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物包含诱导型裂解系统。

5.根据项4所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述诱导型裂解系统是自动诱导型的裂解系统。

6.根据项4或5所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述诱导型裂解系统是Mg²⁺调控的。

7.根据项4至6中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述诱导型裂解系统受所述外源游离Mg²⁺浓度的调控。

8.根据项4至7中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物包含Mg²⁺调控的启动子。

9.根据项8所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述Mg²⁺调控的启动子是来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的mgtB基因的Pmgt启动子或大肠杆菌的PmgtA启动子。

10.根据项8或9所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物还包含另外的Mg²⁺调控元件，优选大肠杆菌的mgtA基因的5'UTR。

11.根据项4至10中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物包含裂解基因。

12.根据项11所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述裂解基因是来自噬菌体的裂解基因。

13.根据项12所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述噬菌体是λ噬菌体。

14.根据项13所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述裂解基因是λ噬菌体裂解基因SRRz或λ噬菌体突变体Sam7裂解基因。

15.根据项11至14中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述裂解基因在游离Mg²⁺耗尽的条件下被诱导表达。

16.根据项4至15中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物包含Mg²⁺调控的启动子和裂解基因，其中，裂解基因的表达受Mg²⁺调控的启动子控制，并且任选地受另外的Mg²⁺调控的元件控制。

17.根据项1至16中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物不能将乳糖切割成葡萄糖和半乳糖。

18.根据项1至17所述的经遗传修饰的微生物，其中，lac操纵子是失活的，优选通过缺失而失活。

19.根据项1至18中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物包含编码乳糖通透酶的外源基因。

20.根据项19所述的经遗传修饰的微生物，其中，乳糖通透酶是大肠杆菌LacY蛋白。

21.根据项19或20所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述乳糖通透酶具有A198V和/或S209I突变。

22.根据项1-20中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，人乳低聚糖为2'-岩藻糖基乳糖和/或3'-岩藻糖基乳糖。

23.根据项1至22中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物包含编码岩藻糖基转移酶的外源基因。

24.根据项23所述的经遗传修饰的微生物，其中，岩藻糖基转移酶是α-1,2-岩藻糖基转移酶和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶。

25.根据项23或24所述的经遗传修饰的微生物，其中，编码岩藻糖基转移酶的基因是异源基因，和/或其中，编码岩藻糖基转移酶的基因由异源启动子驱动。

26.根据项23至25中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，编码岩藻糖基转移酶的基因是针对在微生物中的表达进行密码子优化的。

27.根据项23到26中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，编码岩藻糖基转移酶的基因是来自幽门螺杆菌的futC或来自幽门螺杆菌的futA。

28.根据项1至27中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物包含编码分子伴侣的异源基因。

29.根据项28的经遗传修饰的微生物，其中，所述分子伴侣是人Hsp70。

30.根据项1至29中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物过表达转录调节蛋白，所述转录调节蛋白增加参与GDP-L-岩藻糖从头合成的基因的表达。

31.根据项1至30中任一项的经遗传修饰的微生物，其中，rcsA基因是过表达的。

32.根据30或31所述的经遗传修饰的微生物，其中，rcsA基因来自大肠杆菌。

33.根据项1至32中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，编码Lon蛋白酶家族蛋白的基因是失活的，优选通过缺失失活。

34.根据项33所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述Lon蛋白酶家族蛋白是大肠杆菌Lon蛋白酶。

35.根据项1至34中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，wcaJ基因是失活的，优选通过缺失失活。

36.根据项1至35中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，zwf基因和两个pntAB基因是过表达的。

37.根据项36所述的经遗传修饰的微生物，其中，zwf基因和pntAB基因来自大肠杆菌。

38.根据项1至37中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，gsk基因是过表达的。

39.根据项38所述的经遗传修饰的微生物，其中，gsk基因来自大肠杆菌。

40.根据项1至39中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，trxA基因是过表达的。

41.根据项39所述的经遗传修饰的微生物，其中，trxA基因来自大肠杆菌。

42.根据项1至41中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，trxB基因是失活的，优选通过缺失失活。

43.一种制备人乳低聚糖的方法，该方法包括：

(a)在培养基中培养根据项1至42中任一项所述的经遗传修饰的微生物。

44.根据项43所述的制备人乳低聚糖的方法，其中，所述培养基还含有乳糖。

45.根据项43或44所述的制备人乳低聚糖的方法，其中，所述培养基还含有游离Mg²⁺。

46.根据项45所述的制备人乳低聚糖的方法，其中，培养开始前的培养基中的游离Mg²⁺的浓度为5mM以上。

47.根据项45或46所述的制备人乳低聚糖的方法，其中，培养结束时的培养基中的游离Mg²⁺的浓度为10μM以下。

48.根据项43-47中任一项所述的制备人乳低聚糖的方法，其中，所述培养以分批培养，任选以补料分批培养的方式进行。

49.根据项43-48中任一项所述的制备人乳低聚糖的方法，其中，培养体积是10L以上，优选100L以上。

50.根据项43-49中任一项所述的制备人乳低聚糖的方法，其中，培养结束时培养基中的人乳低聚糖的浓度是15g/L以上，优选是20g/L以上。

51.根据项43-50中任一项所述的制备人乳低聚糖的方法，其中，人乳低聚糖是2'-岩藻糖基乳糖和/或3'-岩藻糖基乳糖。

52.根据项43-51中任一项所述的制备人乳低聚糖的方法，其还包括：

(b)从所述培养基和/或从所述微生物本身纯化人乳低聚糖。

53.根据项52所述的制备人乳低聚糖的方法，其中，在通过诱导型裂解系统诱导裂解后，从培养基中纯化人乳低聚糖。

54.根据项52或53所述的制备人乳低聚糖的方法，其中，在培养基中的游离Mg²⁺浓度为10μM以下时和/或能够直接可视化裂解时，从培养基中纯化人乳低聚糖。

55.根据项54所述的制备人乳低聚糖的方法，其中，所述裂解可以通过培养物OD₆₀₀值的下降而直接可视化。

56.能通过根据项43至51中任一项所述的方法获得的培养基。

57.能通过根据项52至55中任一项所述的方法获得的人乳低聚糖。

58.项56所述的培养基或项57所述的人乳低聚糖在制备动物饲料中的用途。

附图说明

图1：2'-(3')-岩藻糖基乳糖在大肠杆菌中的生物合成。Glc-6-P：葡萄糖6-磷酸；Fru-6-P：果糖6-磷酸；Man-6-P：甘露糖6-磷酸；6-P-Gluc：6-磷酸-葡萄糖酸盐；Ribu-5-P：核糖核苷酸-5-磷酸(ribolusoe-5-phosphate)；Ribo-5-P：核糖-5-磷酸；PPP：磷酸核糖-焦磷酸；gal：半乳糖；glc：葡萄糖；XMP：5'-一磷酸黄苷；IMP：肌苷-5-单磷酸酯；Pgi：磷酸葡萄糖异构酶；ManA：甘露糖6-磷酸异构酶；ManB：磷酸甘露糖变位酶；ManC：α-D-甘露糖1-磷酸鸟苷酰转移酶；Gmd：GDP甘露糖6-脱氢酶；WcaG：GDP-L-岩藻糖合酶；WcaJ：UDP-葡萄糖载体转移酶；Wca A-F，I-M：荚膜异多糖酸生物合成基因；LacA：β-半乳糖苷-转乙酰酶；LacZ：β-半乳糖苷酶；LacY：乳糖通透酶；Lon：蛋白酶；ClpYQ(HslUV)：蛋白酶；RscA：正转录调节因子；guaA：GMP-合成酶；GuaB：IMP-脱氢酶；GuaC：GMP还原酶；DeoD：嘌呤核苷酸磷酸化酶；GPT：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶；Gnd：6-磷酸葡糖酸脱氢酶；Ndk：核苷酸二磷酸-激酶。

图2：pETDuet-1。具有双T7-启动子(P_T7)、T7-终止子(T_T7)、ColE1 ori、氨苄青霉素抗性基因(ampR)、lac阻遏物(lacI)的大肠杆菌表达载体。

图3：pET-manCB-gmd-wcaG。具有双T7-启动子(P_T7)、T7-终止子(T_T7)、pBR322 ori、氨苄青霉素抗性基因(ampR)和lac阻遏物(lacI)的大肠杆菌pETDuet-1，manB：磷酸甘露糖变位酶，ManC：α-D-甘露糖1-磷酸鸟苷酰转移酶，gmd：GDP甘露糖6-脱氢酶；wcaG：GDP-L-岩藻糖合酶。

图4：pCDFDuet-1。具有双T7-启动子(P_T7)、T7-终止子(T_T7)、CloDF13 ori、链霉素抗性基因(SmR)、lac阻遏物(lacI)的大肠杆菌表达载体。

图5：pUC19。具有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、lacZα肽(lacZ')、ori的大肠杆菌克隆载体。

图6：pCDF-futC-lacY*-hHSP70-trxA-SRRz。大肠杆菌pCDFDuet-1双T7启动子(P_T7)、T7终止子(T_T7)、CloDF13 ori、链霉素抗性基因(SmR)和lac阻遏物(lacI)。futC：α-1,2-岩藻糖基转移酶，lacY*：具有S209I的乳糖通透酶，hHSP70：人热休克蛋白70，trxA：硫氧还蛋白、SRRz：在具有5'-UTR和3'-LuxICDABEG终止子的mtgA-启动子控制下的来自λ噬菌体的裂解基因。

图7：pCOLADuet-1。具有双T7-启动子(P_T7)、T7-终止子(T_T7)、ColA ori、卡那霉素抗性基因(KmR)和lac阻遏物(lacI)的大肠杆菌表达载体。

图8：pCOLA-pntAB-rcsA-zwf-gsk。大肠杆菌pCOLADuet-1双T7启动子(P_T7)、T7终止子(T_T7)、ColA ori、卡那霉素抗性基因(KmR)和lac阻遏物(lacI)。pntAB：膜结合转氢酶，rcsA：荚膜异多糖酸生物合成的正转录调节因子，zwf：葡糖-6-磷酸脱氢酶，gsk：鸟苷肌苷激酶。

具体实施方式

定义和普通技术

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

使用如"包含"或"含有"的术语，使得所述术语可以任选地分别被术语"由…组成"和"由…构成"替代。

使用如"包括"或"包含"的术语，使得所述术语可以任选地分别由术语"由…组成"和"由…构成"代替。

术语"经遗传修饰的"是指就细胞的遗传物质而言已经引入所述细胞中的任何修饰。这可以包括引入新的遗传物质、缺失遗传物质、突变遗传物质等。

术语"诱导型裂解系统"是指细胞裂解可以由外部刺激诱导。"自动诱导型"是指外部刺激不必由实施本发明的技术人员主动施加。

术语"外部刺激"或"多个外部刺激"是指从外部施加在细胞上的化学或物理刺激。

术语"Mg²⁺调控的"是指通过存在或不存在游离镁(Mg²⁺)离子调控的。"外源性游离Mg²⁺的浓度"是指从外部，例如从细胞周围的培养基内作用于细胞的游离Mg²⁺离子的浓度。"Mg²⁺耗尽的条件"是指培养基中游离Mg²⁺浓度低或培养基中完全不存在游离Mg²⁺。

"裂解基因"是编码当在细胞中表达时引起细胞裂解的因子(例如蛋白质)的基因。

术语"诱导表达"是指基因不是组成型表达，而是可以由外部刺激诱导表达。

术语"裂解基因受Mg²⁺调控的启动子控制"是指当启动子由于游离Mg²⁺离子的存在或不存在而分别为有活性或无活性时，基因表达或不表达。

"游离Mg²⁺离子"是溶解在例如培养基中的那些Mg²⁺，其没有例如被螯合剂如EDTA络合。因此，例如螯合剂的添加可用于降低培养基中游离Mg²⁺的浓度。如果没有另外说明，"Mg²⁺"在此指"游离Mg²⁺离子"。

术语"外源基因"是指例如通过转化从外部引入细胞的基因。然而，术语"外源基因"不表示所述基因的来源，例如大肠杆菌中的外源基因可以来源于大肠杆菌或来自另一种生物体。外源基因可以是游离的，例如存在于(表达)载体如质粒中，或者它可以整合到细胞的染色体中。

术语"异源基因"是指从外部导入细胞的基因，其来源于与导入该基因的细胞不同的生物，例如大肠杆菌中的异源基因不是来源于大肠杆菌。异源基因可以是游离的，例如存在于(表达)载体如质粒中，或者它可以整合到细胞的染色体中。

当与基因可操作地连接时，"异源启动子"是指不与基因天然相关的启动子。

可以通过本领域公知的技术将外源或异源遗传物质引入微生物。例如，遗传物质可以通过转化被引入细菌。转化可以通过例如化学感受态细菌的热激或电感受态细菌的电穿孔进行(参见例如Hanahan等，Methods Enzymol.1991；204:63-113；Miller和Nickoloff，Methods Mol Biol.1995；47:105-13)。

外源或异源遗传物质可以通过本领域公知的技术整合到细胞的染色体中，例如λRed系统介导的整合或CRISPR/Cas9(参见例如Juhas和Ajioka，Microb Cell Fact.2016；15(1)：172；Reisch和Prather，Sci Rep.2015；5:15096)。

"来源于"特定生物体例如大肠杆菌的基因，可以是(直接获自)来自所述生物体的相应基因(即不通过突变和/或密码子优化修饰)。或者，它也可以包括通过在来自所述生物体的原始序列中引入(例如1至10个，优选1至5个，更优选1至3个)突变而获得的突变体，和/或它也可以包括密码子优化的变体。

术语"针对在微生物中的表达进行密码子优化的"是指基因的开放阅读框(ORF)的核酸序列被优化以在引入基因的生物中翻译成蛋白质。

当本发明的微生物被定义为包含编码特定蛋白质的基因时，意指该微生物也可表达该基因以产生所编码的蛋白质。

在基因的上下文中，术语"过表达的"或"过表达"是指基因在过表达该基因的微生物中的表达水平高于相同基因在不过表达所述基因的相同微生物中的表达水平。基因可以通过本领域公知的技术过表达。例如，可以将另外的外源基因拷贝导入细胞，可以用外源转录激活因子处理细胞，或者可以将编码转录激活因子的外源基因导入细胞。在本发明中优选引入额外的基因拷贝。

基因的"失活"是指该基因不再表达任何功能性蛋白质。这包括几乎完全或完全的表达缺乏或功能障碍蛋白的表达。例如通过缺失控制序列，如启动子，缺失基因的开放阅读框(ORF)(的部分)或缺失包括启动子和ORF的整个基因，可以实现几乎完全或完全的表达缺乏。因此该术语也包括基因的敲除。功能障碍蛋白的表达可以通过例如ORF中的部分缺失、点突变和/或插入来实现，导致例如截短的和/或无催化活性的蛋白的表达。引入缺失、点突变和/或插入的方法是本领域公知的。参见例如Reisch和Prather，2015(同上)或Zerbini等(Microb Cell Fact.2017；16(1)：68)，Jensen等(Sci Rep.2015；5:17874)。

特定的核苷酸序列，例如特定的感兴趣基因的潜在序列或启动子序列等，可以通过聚合酶链反应从生物体例如大肠杆菌的基因组序列扩增，或者它可以通过本领域公知的方法化学合成。

GenBank登录号指GenBank中使用的唯一标识符，例如可从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/获得。基因标识符(GI)是指用于识别特定基因的唯一数字，并且可以在例如https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/中进行查询。

实施方式

用于制备HMO的经遗传修饰的微生物

本发明提供了用于制备HMO的遗传修饰的微生物。

本发明制备的HMO是以二糖乳糖或N-乙酰基乳糖胺(N-acetyllactosamine)为基础的。优选地，HMO是以乳糖为基础的。

在本发明的上下文中优选的人乳低聚糖包括但不限于2'-岩藻糖基乳糖(2-FL)、3'-岩藻糖基乳糖(3-FL)、3'-唾液酸乳糖(3-SL)、6'-唾液酸乳糖(6-SL)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-六糖(LNH)、异-乳-N-八糖、异-乳糖-N-新八糖、对-乳-N-八糖、乳-N-岩藻戊糖I(LNFP I)、乳-N-岩藻戊糖II(LNFP II)、乳-N-岩藻戊糖III(LNFP III)、乳-N-岩藻戊糖V(LNFP V)、LS-四糖a(LST a)、LS-六糖b(LST b)、LS-六糖c(LST c)和双唾液酸乳-N-四糖(DSLNT)。

本发明中优选制备三糖2-FL和/或3-FL，特别优选2-FL。2-FL和3-FL的结构如(Pereira&McDonald，Sci Rep.2012；84(1)：637-655)所示。

本发明更详细地描述了有关在肠杆菌—大肠杆菌K-12中关于2-FL和/或3-FL产生的基因和途径的操作。然而，本发明同样适用于在大肠杆菌或除大肠杆菌以外的微生物中制备其它HMO。除2-FL和/或3-FL以外的HMO的微生物制备先前已有描述。例如，Priem等人指出，利用脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)的β1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶LgtA(例如GI：904226)的表达，乳糖可被糖基化，得到三糖GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc，通过同样来自脑膜炎奈瑟氏球菌的β1,4-半乳糖基转移酶LgtB(例如GI：904227)还可进一步延伸到乳-N-新四糖(LNnT)(Priem等，Glycobiology.2002；12(4)：235-40)。随后LNnT的细胞内岩藻糖基化，由幽门螺杆菌β1,3-岩藻糖基转移酶FutA或FutB催化，可以提供HMO混合物，其具有乳-N-新二岩藻六糖II(LNnDFHII)作为主要产物(Dumon等，BiotechnolProg.2004；20(2)：412-9)。Han等人进一步讨论了不同的制备方法(Han等人，2012，Biotechnol Adv.2012；30(6)：1268-78)。

本发明中使用的微生物没有特别的限制。优选的微生物具有产生HMO的天然能力，或者能够在细胞内产生用于产生HMO的前体分子，或者能够从细胞外空间输入这样的前体。微生物的实例包括细菌或酵母。细菌的例子包括大肠杆菌、草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola，成团泛菌(Pantoea agglomerans))、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、柠檬泛菌(Pantoea citrea)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)或野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。也可使用芽孢杆菌属的细菌，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、嗜热芽孢杆菌(Bacillus thermophilus)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)。类似地，乳杆菌属和乳球菌属的细菌可以使用本发明的方法进行修饰，包括但不限于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)和费氏丙酸杆菌(Proprionibacterium freudenreichii)也是本发明的合适细菌菌种。本发明还包括如本文所述修饰的菌株，其来自肠球菌属(例如粪肠球菌(Enterococcus faecium)和嗜热肠球菌(Enterococcus thermophiles))、双歧杆菌属(例如长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)和两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum))、芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus spp.)、微单胞菌(Micromomospora spp.)、微球菌(Micrococcus spp.)、红球菌(Rhodococcus spp.)和假单胞菌属(例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))。酵母的实例包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。微生物优选是细菌，且特别优选大肠杆菌。使用的大肠杆菌菌株没有特别的限制。

HMO从细菌细胞的释放是工业生产的基本过程。细胞中保留约50％的2-FL产量，而剩余的则排入培养基中(Huang等，2017)。需要在100℃热诱导裂解以获得总的2-FL量。为了改进回收过程，在本发明的微生物中建立自溶系统。因此，本发明的微生物可以包含诱导型裂解系统。裂解系统的类型没有特别的限制，只要其能够由于外部刺激而诱导裂解即可。例如，λ噬菌体的裂解基因(S、R和Rz)可以受Mg²⁺阻遏型P_mgtA-UTR启动子的控制(TamekouLacMata等，Bioengineering.2017；26:1-6))。当消耗游离Mg²⁺时(例如10μM或更低)，诱导裂解基因的合成，通过细胞壁组分肽聚糖的降解而促进2-FL释放到培养基中。有几种可供选择的方法可用于建立自溶系统，其基于Zhang等描述的Mg²⁺调控的启动子(J MicrobiolMethods.2009；79(2)：199-204)，Liu和Curtis描述的镍诱导系统(Proc Natl Acad SciUSA.2009；106(51)：21550-4)，热敏λ阻遏物(Juhas等，PLoS One.2016；11(10)：e0165778)，乳链菌肽诱导型启动子(Visweswaran等，Appl Microbiol Biotechnol.2017Feb；101(3)：1099-1110)，阿拉伯糖诱导型启动子(Masuda等，FEMS Microbiol Lett.2016；363(6))，阿拉伯糖诱导型启动子，其中MgSO₄在系统中起反作用(Li等，Curr Microbiol.2016；72(4)：390-6)或通过加入溶剂诱导裂解(Hajnal等，Appl Microbiol Biotechnol.2016；100(21):9103-9110)。这些系统也总结在表1中。

表1诱导型自溶系统

Mg²⁺调控系统具有的优点是：通过加入例如乙二胺四乙酸(EDTA)，一种螯合金属离子(如Ca²⁺或Mg²⁺)的螯合剂，就可以促进细胞裂解。此外，作为二价金属离子的Mg²⁺是α-1,2-和α-1,3-岩藻糖基转移酶活性所必需的(Zhang等，Glycobiology.2010；20(9)：1077-88；Zhao等，Chem Commun(Camb)2016；52(20)：3899-902)。因此，在Mg²⁺存在的情况下，2'-岩藻糖基乳糖合成由于酶活性增强而得到改善，而在不存在时，诱导细胞裂解以促进通过细胞壁破碎回收产物。因此，本发明优选使用Mg²⁺调控系统，优选Mg²⁺调控系统是Mg²⁺可阻遏系统。

对于诱导型裂解系统，可以使用Mg²⁺调控的启动子。Mg²⁺调控的启动子优选受外源游离Mg²⁺浓度调控。优选在Mg²⁺耗尽的条件下是有活性的。Mg²⁺耗尽的条件是其中生长培养基包含500μM或更少、100μM或更少、50μM或更少、10μM或更少、1μM或更少或0μM的游离Mg²⁺的条件。优选地，Mg²⁺耗尽的条件为10μM或更少的游离Mg²⁺。Mg²⁺调控的启动子优选是来自鼠伤寒沙门氏菌的mgtB基因(例如GI：1250998)的PmgtB启动子，来自鼠伤寒沙门氏菌(S.tyhphimurium)的pagC基因(例如1248241)的PpagC启动子，或来自大肠杆菌的mgtA基因(例如GI：948778)的PmgtA启动子。

来自鼠伤寒沙门氏菌mgtB基因的PmgtB启动子如Zhang等，2009(同上)所述，并且可通过例如以鼠伤寒沙门氏菌的基因组作为模板，并使用引物5'-GTATACTCCGGAGCAAACGCCTGAACTCCC-3'(SEQ ID NO：1)和5'-TCTAGAGGAAGAATAAGTACGTGCTATATTTAG-3'(SEQ ID NO：2)的聚合酶链式反应(PCR)获得。来自大肠杆菌的PmgtA启动子如Tamekou Lacmata等，2017(同上)所述，并且可通过例如以大肠杆菌的基因组为模板，并使用引物5'-CGAGCTCCTTTCGTTATTCAGCACCCG-3'(SEQ ID NO：3)和5'-CGAGCTCGCGATATAATACCTGCTGGC-3'(SEQ ID NO：4)的聚合酶链式反应(PCR)获得。

Mg²⁺调控的启动子可以与另外的Mg²⁺调控的元件组合，例如大肠杆菌的mgtA基因的5'UTR。来自大肠杆菌的mgtA基因的5'UTR如Tamekou Lacmata等，2017(同上)所述，并且PmgtA启动子与mgtA 5'UTR均例如可通过以大肠杆菌基因组为模板，并使用引物5'-CGAGCTCCTTTCGTTATTCAGCACCCG-3'(SEQ ID NO：3)和5'-CGAGCTCAAGGAGTCCCTCCGCACTGT-3'(SEQ ID NO：5)的聚合酶链式反应(PCR)获得。

包含诱导型裂解系统的微生物可以进一步包含一种或多种裂解基因。裂解基因没有特别限制，只要当它在其中表达时可以裂解细胞即可。例如，裂解基因可以来自噬菌体，例如来自λ噬菌体、MS2噬菌体、ΦX174噬菌体或RLT噬菌体。裂解基因的实例包括如Masuda等，2016(同上)所述的来自大肠杆菌的ydfD，来自停乳链球菌的亚种似马停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiase subsp.equisimilis)的sicG，来自大肠杆菌的vanX，来自沙门氏菌噬菌体P22的SRRz，来自肠道沙门氏菌甲型副伤寒血清型变种(S.entericaserovar Paratyphi A)的yncE，来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)噬菌体P68的裂解基因。

裂解基因的优选实例是来自λ噬菌体的SRRz基因(例如见GenBank登录号NC_001416的序列)或其Sam7突变体(在S基因的第161位携带G至A的突变)、编码E蛋白的MS2噬菌体裂解基因或编码L蛋白的ΦX174噬菌体裂解基因。SRRz基因如Zhang等，2009(同上)中所述，并且可通过例如以λ噬菌体基因组作为模板和引物5'-CCGCATATGCCAGAAAAACATGACCTG-3'(SEQ ID NO：6)和5'-TTAGTCGACGCAACTCTATCTGCACTGCTC-3'(SEQ ID NO：7)的PCR获得。MS2噬菌体或ΦX174噬菌体裂解基因如Juhas等，2016(同上)中所述。

微生物还可以包含两种或更多种相同类型或不同类型的裂解基因。任选地，可以使用两种或更多种不同裂解基因的组合，因为不同的作用机制可以导致更有效的裂解。例如，微生物可以包含来自λ噬菌体和MS2噬菌体、λ噬菌体和ΦX174噬菌体、MS2噬菌体和ΦX174噬菌体或λ噬菌体、MS2噬菌体和ΦX174噬菌体的裂解基因。然而，本发明不限于这些组合，并且所述的其它裂解基因可以单独或组合使用。优选地，两个或更多种裂解基因串联连接，并且以多顺反子方式由相同的启动子和相同的任选的另外的调控元件控制。

所述一种或多种裂解基因可以在Mg²⁺耗尽的条件下诱导表达，并且优选受具有或不具有另外调控元件的Mg²⁺调控的启动子控制。如果mgtA基因的5'UTR用作附加的调控元件，裂解基因的表达盒优选包括Mg²⁺调控的启动子，其后是mgtA基因的5'UTR，再其后是裂解基因的ORF(或ORFs)。

可用于如上所述的诱导型裂解的表达盒可以作为游离型载体，例如表达载体，例如质粒，存在于微生物中或整合到宿主染色体中。

此外，由于HMO的前体是乳糖，因此希望HMO的细胞内产物能获得高的乳糖细胞内水平。因此，本发明的微生物可以不能将乳糖切割成葡萄糖和半乳糖。这可以通过失活编码负责乳糖切割的β-半乳糖苷酶LacZ的lacZ基因，或失活编码LacZ以及乳糖阻遏物LacI、转乙酰酶LacA和乳糖通透酶LacY的整个lac操纵子来实现。失活可以通过表达抑制剂、通过引入失活突变或通过缺失来实现。包含基因lacI、lacZ、lacY和lacA的整个lac操纵子的失活可以通过防止i)乳糖降解为葡萄糖和半乳糖和ii)防止形成异乳糖或乙酰乳糖来增加细胞内乳糖的利用度。后者通过消除两个污染的糖分子而进一步简化了纯化过程。

乳糖通透酶负责将乳糖摄入细胞。许多细菌具有通过使用转运蛋白将乳糖从培养基转运到细胞中的固有能力，所述转运蛋白是大肠杆菌乳糖通透酶的任一种同系物(例如，如在地衣芽孢杆菌中发现的)，或PTS糖转运家族的成员(例如，如在干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中发现的)。因此，引入外源乳糖通透酶基因，如大肠杆菌LacY可以增加细胞内乳糖水平。在细菌不具有将胞外乳糖转运到细胞内的固有能力的情况下(包括具有失活的整个lac操纵子的那些细菌)，这种能力可以通过引入外源乳糖通透酶基因(如大肠杆菌lacY)来赋予或恢复。因此，本发明的微生物可以包含编码乳糖通透酶的外源基因。优选乳糖通透酶是大肠杆菌LacY(例如GI：949083)。特别优选大肠杆菌LacY具有A198V和/或S209I突变(Wilson等，Biochim Biophys Acta.1990；1029(1)：113-6)。预测这两种突变都会抑制LacY与其抑制剂蛋白酶-lla^Glc之间的相互作用(Hogema等，Mol Microbiol.1999；31(6)：1825-33)。结果，在细胞内乳糖浓度高时，自动调控机制可能受到抑制。因此，HMO的产量可以通过增加乳糖摄取而得到提高。此外，由于乳糖是T7启动子表达系统的天然诱导物(见下文)，例如2-FL合成所需的酶的表达可以通过增加细胞内乳糖的利用度而进一步提高。

优选地，本发明的微生物用于制备2-FL和/或3-FL。

用于在大肠杆菌中高产2-FL的示例性遗传修饰如表2所示。

表2在大肠杆菌中高产2'-岩藻糖基乳糖的遗传修饰

通过将活化的糖GDP-L-岩藻糖与乳糖偶联，可以产生2-FL或3-FL。如上所述，大肠杆菌能够通过乳糖通透酶LacY(乳糖/H⁺同向转运体)将前体分子乳糖输入细胞。此外，大肠杆菌能够通过磷酸转移酶系统将葡萄糖输入细胞。葡萄糖可以作为能量来源促进生长，并作为前体通过从头途径产生GDP-L-岩藻糖，GDP-L-岩藻糖是荚膜异多糖酸生物合成的天然中间体(见图1)。活化糖GDP-L-岩藻糖生物合成的从头途径与糖酵解中间体果糖-6-磷酸不同，并是以大肠杆菌衍生的酶ManA和ManB，GTP依赖的ManC，NADPH依赖的Gmd和WcaG为基础的。或者，GDP-L-岩藻糖也可通过补救途径由导入细胞的岩藻糖产生。

GDP-L-岩藻糖的岩藻糖部分可以通过岩藻糖基转移酶(EC2.4.1.x)转移到细胞中的受体乳糖，从而产生2-FL或3-FL(见图1)。产生2-FL的关键酶是α-1,2-岩藻糖基转移酶，例如来自幽门螺杆菌的FutC。为了产生3-FL，可以使用α-1,3-岩藻糖基转移酶，例如来自幽门螺杆菌的FutA。因此，本发明的微生物还包含编码岩藻糖基转移酶，优选α-1,2-岩藻糖基转移酶和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶的外源基因。编码岩藻糖基转移酶的基因优选是异源基因和/或由异源启动子驱动。

已经在细菌如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、普通拟杆菌(B.vulgatus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、大肠杆菌、胆汁螺杆菌(Helicobacter bilis)、肝螺杆菌(H.hepaticus)、鼬鼠螺杆菌(H.mustelae)、幽门螺杆菌和嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)中鉴定了几种岩藻糖基转移酶。因为许多生物体具有不同的密码子使用，具有有限的同源tRNA反密码子可用性的密码子的存在可由于核糖体的延宕(ribosome stalling)而降低异源基因表达。为了保证在本发明的微生物中高蛋白质表达，可以针对本发明的微生物优化α-1,2-和α-1,3-岩藻糖基转移酶编码基因(例如futC和futA)的密码子使用。因此，编码岩藻糖基转移酶的基因可以是密码子优化的，以便在微生物中表达。密码子优化可致使细胞内岩藻糖基转移酶蛋白水平增加，这可提高2-FL和/或3-FL的产量。

用于本发明的α-1,2-岩藻糖基转移酶的优选实例是来自幽门螺杆菌的FutC(例如NCBI登录号KY499613)、来自鼬鼠螺杆菌的FutL(例如NCBI登录号WP_013023529.1)，来自胆汁螺杆菌的FutF(例如NCBI登录号WP_020995676.1)，来自脆弱芽孢杆菌NCTC9343的WcfB(例如NCBI登录号WP_005817145.1)，来自大肠杆菌O128的WbsJ(例如NCBI登录号AAO37698.1)，来自大肠杆菌O86的WbwK(例如NCBI登录号AAO37719.1)，来自大肠杆菌O126的Wbgl(例如NCBI登录号ADN43847.1)，来自大肠杆菌O127的WbiQ(例如NCBI登录号CAS09719.1)，来自空肠弯曲杆菌的FutG(例如NCBI登录号WP_002861859.1)，来自普通拟杆菌ATCC8482的FutN(例如NCBI登录号ALK85429.1)，来自脆弱拟杆菌NCTC9343的WcfB和WcfW(例如NCBI登录号WP_005817145.1和WP_005813010.1)。

用于本发明的α-1,3-岩藻糖基转移酶的优选实例是来自幽门螺杆菌的FutA(例如NCBI登录号AAD07447.1)、来自幽门螺杆菌26695的FutB(例如NCBI登录号AAD07710.1)，来自长螺杆菌(H.trogontum)的FutD(例如NCBI登录号WP_052089242.1)，来自胆汁螺杆菌的FutE(例如NCBI登录号WP_034580283.1)，来自盲肠螺杆菌(H.typhlonius)的FutH(例如NCBI登录号WP_052082154.1)，来自肝螺杆菌的FutJ(Hh0072)和FutK(Hh1776)(例如NCBI登录号WP_011114915.1和AAP78373.1)，来自脆弱拟杆菌的FutM(例如NCBI登录号CAH09151.1.1)。

在优选的实施方式中，岩藻糖基转移酶的活性由于Mg²⁺的存在而增强。

岩藻糖基转移酶可以形成不溶性细胞内包涵体，这可以降低细胞中活性岩藻糖基转移酶的可用性。外源引入的分子伴侣的存在可以有利地影响岩藻糖基转移酶的溶解度，从而促进2-FL和/或3-FL的产生。因此，本发明的微生物可以进一步包含编码分子伴侣的外源基因。在优选的实施方式中，所述分子伴侣是人Hsp70(例如GenBank登录号：BC112963)。除了分子伴侣功能，人Hsp70还可用于建立自诱导表达系统(Briand等，Sci Rep.2016；6:33037)，其可用于避免在培养基中加入表达诱导物IPTG。由于IPTG也是乳糖通透酶的底物，省略IPTG可以增加乳糖摄取，从而进一步促进HMO，特别是2-FL和/或3-FL的产生。

除了上述修饰，可将许多其它基因导入细胞或在细胞中失活，以进一步优化HMO，特别是2-FL和/或3-FL的产生。RcsA是大肠杆菌中荚膜异多糖酸生物合成的正转录调节因子，其使用GDP-L-岩藻糖作为中间体。rcsA的过表达(例如GenBank登录号M58003)增加了参与GDP-L-岩藻糖中间体生物合成的基因的转录(见图1)，这可以通过增强GDP-L-岩藻糖途径来改善2-FL和/或3-FL合成(Huang等，2017，同上)。因此，本发明的微生物也可过表达rcsA基因，其优选来自大肠杆菌。

然而，RcsA受Lon蛋白酶和ClpYQ蛋白酶的控制。因此，为了防止所需GDP-L-岩藻糖生物合成基因的下调，可以使相应的lon和clpYQ基因失活。rcsA的过表达与lon/clpYQ失活组合可以显着改善GDP-L-岩藻糖，并因此促进2-FL产生。因此，在本发明的微生物中，Lon蛋白酶家族基因，优选大肠杆菌Lon蛋白酶(例如GenBank登录号L20572)和/或clpYQ基因(NC_000913.3)可以是失活的。

此外，wcaJ基因(例如GenBank登录号(氨基酸)BAA15900)编码预计启动荚膜异多糖酸生物合成的UDP-葡萄糖脂载体转移酶。wcaJ基因的失活可以用于i)防止竞争性荚膜异多糖酸途径消耗GDP-L-岩藻糖，ii)防止由于胞外多糖荚膜异多糖酸的输出而导致培养基的粘度升高，和iii)通过消除另一种污染的糖分子(荚膜异多糖酸)简化2-FL纯化过程。因此，在本发明的微生物中，wcaJ基因，优选大肠杆菌wcaJ基因可以是失活的。

辅因子NADPH和GTP也在GDP-L-岩藻糖生物合成中起重要作用，其可用性可以限制活化糖(GDP-L-岩藻糖)的合成，并因此也限制HMO如2-FL和/或3-FL的总产量。为了增加GDP-L-岩藻糖合成辅助因子的可用性，可在本发明的微生物中过表达四种基因。Zwf是戊糖磷酸途径的一部分，而PntA和PntB属于转氢酶系统。zwf和pntAB的过表达可显着有助于NADPH-再生，从而为参与GDP-L-岩藻糖合成的NADPH依赖性WcaG酶提供所需的辅因子(图1)。因此，本发明的微生物可以共过表达zwf基因和两个pntAB基因(KEGG登记号，大肠杆菌K-12MG1655：b1852，b1603和b1602)，它们优选地来源于大肠杆菌。

第二种辅因子GTP是通过两种可选择的途径合成的，即通过磷酸核糖焦磷酸的形成的GTP从头生物合成途径或从外源递送的鸟苷的补救途径。在这两种情况下，GMP的充足供应可增加GTP水平，从而提高GDP-L-岩藻糖制备的效率。本发明微生物中参与两种代谢途径的gsk基因(鸟苷肌苷激酶，例如GI：946584)的过表达可增加ManC所需的GTP-利用度(图1)。结果，GDP-L-岩藻糖合成和由此HMO的产生可以得到显着改善(Lee等，Appl MicrobiolBiotechnol.2012；93(6)：2327-34)。因此，本发明的微生物可以过表达gsk基因，其优选地来自大肠杆菌。

用于克隆上述示例性基因的引物可见于例如Huang等人,2017(同上)的表S2中。

另外的优化可涉及硫氧还蛋白活性的操控。trxA基因(KEGG登记号大肠杆菌K-12MG1655：b3781)编码大肠杆菌中的主要生理电子供体。已知硫氧还蛋白(TrxA)的过表达通过促进难溶性蛋白质中二硫键的形成来改善异源蛋白质表达。然而，还有两种其它功能与TrxA有关，潜在的分子伴侣功能，以及T7-DNA聚合酶的持续合成因子功能(Weickert等，Curr Opin Biotechnol.1996；7(5)：494-9)。因此，可以进行trxA的过表达以i)增加HMO合成所需的酶的溶解度和ii)积极影响各自基因的表达。因此，本发明的微生物可以过表达硫氧还蛋白trxA基因，其优选来自大肠杆菌。

此外，trxB基因(KEGG登记号，大肠杆菌BL21(DE3)：ECD_00892)编码NADPH依赖性硫氧还蛋白还原酶(TrxB)，其从其氧化形式再生TrxA。trxB的失活限制了细胞质中的还原潜力，并促进二硫键的形成(Weickert等，1996，同上)。可进行trxB的灭活以i)提高蛋白质溶解度和酶活性，和ii)防止NADPH的耗尽，NADPH是WcaG所需的辅因子(图1)。因此，在本发明的微生物中，trxB基因可以是失活的。

制备HMO的方法

本发明还提供了使用本发明的经遗传修饰的微生物制备HMO的方法。

通过在培养基中培养本发明的微生物，可以产生HMO。

培养基没有特别限制，只要它支持微生物的生长即可。用于培养本发明微生物的培养基的实例是LB培养基(10g/L胰蛋白胨；5g/L酵母提取物；10g/L NaCl，pH7.5)，含有葡萄糖(或甘油)作为碳源的改良M9基本培养基(36g/L葡萄糖；12.8g/L Na₂HPO₄·7H₂O，3g/LKH₂PO₄，2g/L NH₄Cl，0.5g/L NaCl，0.25g/L MgSO₄·7H₂O，14.7mg/L CaCl₂·2H₂O，10mg/L硫胺素，2g/L酵母提取物，0.1％(v/v)Triton-X 100，和1mL/L储备微量金属溶液；储备微量金属溶液：25g/L FeCl₃·6H₂O，2g/L CaCl₂·2H₂O，2g/L ZnCl₂,2g/L Na₂MoO₄·2H₂O,1.9g/LCuSO₄·5H₂O和0.5g/L H₃BO₃,pH 7.2)(参见Huang等，2017，同上)，含有2.68g/L(NH₄)₂SO₄,1g/L(NH₄)₂-H-柠檬酸盐,26.42g/L甘油,14.6g/L K₂HPO₄,0.241g/L MgSO₄,2g/L Na₂SO₄,4g/L NaH₂PO₄·H₂O,0.5g/L NH₄Cl,10mg/L硫胺素和3ml/L微量元素溶液(0.5g/L CaCl₂·2H₂O,16,7g/L FeCl₃·6H₂O,20.1g/L Na₂-EDTA,0.18g/L ZnSO₄·7H₂O,0.1g/L MnSO₄·H₂O,0.16g/L CuSO₄·5H₂O和0.18g/L CoCl₂·6H₂O)的基本培养基(

等,MicrobCell Fact.2013；12:40),或者含有20g/L甘油,13.5g/L KH₂PO₄,4.0g/L(NH₄)₂HPO₄,1.7g/L柠檬酸,1.4g/L MgSO₄·7H₂O,10ml/L微量元素溶液(10g/L Fe(III)柠檬酸盐,2.25g/L ZnSO₄·7H₂O,1.0g/L CuSO₄·5H₂O,0.35g/L MnSO₄·H₂O,0.23g/L Na₂B₄O₇·10H₂O,0.11g/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄,2.0g/L CaCl₂·2H₂O的基本培养基(Chin等,JBiotechnol.2016.pii:S0168-1656(16)31632-7)。

本发明的微生物可以在任何适于生长的温度下培养，例如在16℃至37℃的温度下，如16℃至30℃，优选16℃至25℃。

在优选的实施方式中，培养基包含乳糖。培养开始前培养基中的乳糖浓度可以是20g/L或更高、12g/L或更高、10g/L或更高、8g/L或更高、8-20g/L、10-20g/L或12-20g/L。优选地，培养开始前培养基中的乳糖浓度为10-20g/L。

在另一个优选的实施方式中，培养基包含游离Mg²⁺。

培养开始前培养基中的游离Mg²⁺浓度(即，游离Mg²⁺的浓度)可以是80mM或更高、70mM或更高、60mM或更高、50mM或更高、40mM或更高、30mM或更高、20mM或更高、10mM或更高、5mM或更高、1mM或更高、1-50mM之间、5-50mM之间、10-50mM之间、20-50mM之间、1-10mM之间、5-10mM之间、1-5mM之间或约50-60μM。优选地，培养开始前培养基中的游离Mg²⁺浓度为5-20mM。

培养结束时的游离Mg²⁺浓度可以为500μM以下、100μM以下、50μM以下、10μM以下、1μM以下或0μM。优选地，培养结束时游离Mg²⁺浓度为10μM以下。

优选地，Mg²⁺以MgSO₄的形式加入到培养基中。

在培养结束时，可以任选地加入螯合剂，例如EDTA或EGTA，优选以足够螯合残余的游离Mg²⁺离子并引发裂解的量加入。

本发明的HMO的制备方法优选以分批培养或补料分批培养的方式进行。分批培养是一种封闭系统培养，其中，细胞在特定环境条件下在固定体积的营养培养基中生长，而不添加另外的营养物。在补料分批培养中，在培养期间向生物反应器供应营养物。在两种情况下，细胞和产物都留在生物反应器中直到培养结束。

本发明的HMO的制备方法中的培养体积优选为10L以上、100L以上、1000L以上、10000L以上、50000L以上、10L-100L、100L-1000L、1000L-10000L或10000L-50000L、或50000L以上。优选地，培养体积为100L-1000L。

培养结束时培养基中HMO的浓度优选为至少15g/L，更优选为至少20g/L，甚至更优选为至少30g/L，最优选为至少50g/L。

在本发明中，优选通过单一的遗传修饰的微生物，可以产生单一的HMO，或者可以同时产生两种或更多种的HMO。例如，α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶在相同细胞中的表达可以导致2-FL，3-FL和/或二岩藻糖基化结构如乳二岩藻糖基四糖(lactodifuconteose)或乳-N-二岩藻糖基六糖(lacto-N-difucohexaose)的产生。

本发明中制备的HMO优选为2-FL和/或3-FL，且特别优选为2-FL。

HMO可从培养基和/或从微生物本身回收。为了从微生物中回收HMO，必须破坏微生物。通过细胞裂解进行的细胞破碎可以通过本领域公知的化学或物理方法进行，或者裂解可以通过本文所述的诱导型裂解系统进行诱导。

本发明的HMO的制备方法可以进一步包括从培养基中纯化HMO的步骤。在本文中，纯化是指HMO在纯化后以纯的形式或基本上纯的形式存在。纯化后，HMO，例如2-FL和/或3FL，优选占纯化产物的至少90％、95％、98％、99％或100％(w/w)，相对于干重而言。

纯化可以通过本领域技术人员公知的技术进行。例如，HMO可以通过本领域技术人员公知的方法从培养基中纯化，例如通过使用活性炭步骤的柱层析和用35-50％乙醇洗脱、通过乙醇梯度或通过尺寸排阻。

纯度可通过任何已知的方法来评估，例如薄层色谱法或本领域通常已知的其它电泳或色谱技术。

优选地，在通过诱导型裂解系统诱导裂解之后从培养基中纯化HMO。在细胞裂解时，细胞内HMO释放到培养基中，导致培养基中HMO浓度增加。这可以致使HMO的产量增加，以及由于产量增加和更少的处理步骤而节省时间和成本。因此，当培养基中游离Mg²⁺的浓度为10μM或更低时和/或当裂解可直接可视化时，优选从培养基中纯化HMO。例如通过培养物看得见的变澄清(visual clearing of the culture)和/或通过测量培养物在600nm(光密度)的OD₆₀₀吸光度值，可以直接使裂解可视化。培养物的OD₆₀₀值可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如使用分光光度计。OD₆₀₀值的下降表明细胞发生了裂解。因此，在本发明中，通过培养物OD₆₀₀值的下降可以直接使裂解可视化。

本发明还提供了一种可通过本发明的制备HMO的方法获得的培养基。由于通过培养本发明的微生物产生HMO，所述培养基含有HMO。培养结束时培养基中HMO的浓度优选为至少15g/L，更优选为至少20g/L，甚至更优选为至少30g/L，最优选为至少50g/L。本发明的培养基可以进一步被脱水，例如通过冷冻干燥。

本发明还提供了可通过本发明的HMO制备方法获得的纯化的HMO。

本发明的培养基和纯化的HMO可以用于制备供人消费的产品，例如婴儿营养品和/或动物营养品。本发明的培养基和纯化的HMO可以用于制备动物饲料。动物饲料可以用于伴侣动物(狗、猫)、家畜(牛、马、绵羊、山羊或猪类动物，以及家禽)和/或鱼。优选的动物饲料是牛饲料。优选地，动物饲料是用于小牛的乳替代产品。

本发明将通过以下非限制性的实施例进行说明。

实施例

材料和方法

所用的菌株、质粒和引物列于表3和4中。大肠杆菌BL21(DE3)用作HMO制备的宿主菌株，大肠杆菌TOP10用于质粒构建和维持。大肠杆菌在添加了氨苄青霉素(100μg ml^-1)、链霉素(50μg ml^-1)或卡那霉素(50μg ml^-1)的LB培养基(10gL^-1胰蛋白胨，5gL^-1酵母提取物，10gL^-1NaCl)中培养。对于基因缺失，可使用来自Jensen等2015的λRed重组酶/翻转酶系统(Sci Rep 2015；5:17874)。将载体pSIJ8转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中。λRed基因在15mM L-阿拉伯糖存在下进行诱导。卡那霉素抗性表达盒(kanR)从侧翼连接有50bp长的同源靶序列和FRT位点的载体pKD13(Datsenko和Wanner，2000)处扩增，并转化到L-阿拉伯糖诱导的感受态细胞中。缺失后，通过在50mM L-鼠李糖存在下诱导翻转酶-重组酶来实现抗生素表达盒的去除。为了固化温度敏感性辅助质粒(pSIJ8)，将细胞在42℃下生长。对于基因表达，可以使用载体pETDuet-1、pCDFDuet-1和pCOLADuet-1(表3，图2、4和7)。将质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中。对于分批发酵，大肠杆菌在100ml含有36g/L葡萄糖的LB中生长。当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入0.1mM的IPTG或0.2％乳糖进行诱导。在16-25℃生长2小时和10小时后，加入5g/L乳糖用于HMO-制备。

表3菌株和质粒

表4用于基因过表达或缺失的引物

下划线：限制性位点(过表达)、载体结合位点(敲除)

表达载体的构建：

pET-manCB-gmd-wcaG

使用表4中列出的引物，从大肠杆菌K-12MG1655基因组DNA扩增基因manC-manB和gmd-wcaG。首先，gmd-wcaG PCR产物用NdeI/KpnI消化，并插入同样切割的载体pETDuet-1中(图2)，产生pET-gmd-wcaG。接着，用NcoI/HindII消化manC-manB PCR片段，并将其插入到类似的切割载体pET-gmd-wcaG中，以产生载体pET-manCB-gmd-wcaG(图3)。使所选克隆在含有氨苄青霉素(100μg ml^-1)的LB中生长，并通过限制性内切图谱和DNA测序来进行验证。

pCDF-futC-lacY*-hHSP70-trxA-SRRz

合成具有针对大肠杆菌而优化的密码子的人HSP70基因并提供到pUC57载体(GeneScript)中。hHSP70基因通过NdeI/BglII限制性内切酶从该载体中分离，并插入到同样切割的载体pCDFDuet-1(图4)中，产生pCDF-hHSP70。使用表4中列出的引物，从大肠杆菌K12-MG1655的基因组DNA扩增lacY基因。对于亚克隆，通过BamHI/HindIII限制性内切酶将PCR产物插入载体pUC19(图5)。进行定点诱变以引入导致氨基酸取代S209I(LacY*)的突变。然后通过BamHI/HindIII从载体pUC19-lacY*酶切lacY*基因，并插入同样切割的载体pCDF-hHSP70中，以得到pCDF-lacY*-hHSP70。来自幽门螺杆菌的futC基因连接有/未连接有N-末端三联Asp-标签，并且用大肠杆菌的密码子进行优化，提供到pUC57载体(GeneScript)中。futC片段通过NcoI/BamHI限制性内切酶从pUC57分离，并插入到pCDF-lacY*-hHSP70/NcoI/BamHI，产生pCDF-futC-lacY*-hHSP70。从大肠杆菌K12-MG1655扩增trxA基因，经BglII/KpnI消化插入pCDF-futC-lacY*-hHSP70，以得到质粒pCDF-futC-lacY*-hHSP70-trxA。最后，从大肠杆菌BL21(DE3)扩增来自λ噬菌体的SRRz基因，在3'末端引入来自费氏弧菌的双向LuxICDABEG-终止子，用SacI/PstI消化并插入到类似切割的载体pUC19中。用来自大肠杆菌BL21(DE3)的5'-UTR区扩增mgtA的启动子，用SacI消化并插入pUC19-SRRz-luxTerm/SacI中，以产生pUC-PmgtA-UTR-SRRz-luxTerm。最后扩增出PmgttA-UTR-SRRz-luxTerm基因表达盒，经Bsu36i消化后，插入pCDF-futC-lacY*-hHSP70-trxA/Bsu36i，以产生pCDF-futC-lacY*-hHSP70-trxA-SRRz(图6)。选择的克隆在含有链霉素(50μg ml^-1)的LB中生长，并通过限制性内切图谱和DNA测序来进行验证。

pCOLA-pntAB-rcsA-zwf-gsk

从大肠杆菌K12-MG1655中扩增rcsA基因，用NdeI/BglII进行消化，插入同样切割的载体pCOLADuet-1(图7)中，以产生pCOL-rcsA。然后，从大肠杆菌K12-MG1655扩增zwf基因，插入pCOLA-rcsA/BglII/KpnI，以得到pCOLA-rcsA-zwf。随后，从大肠杆菌K12-ATCC10798扩增gsk基因，用KpnI/XhoI消化并插入pCOLA-rcsA-zwf/KpnI/XhoI，得到pCOLA-rcsA-zwf-gsk。最后从大肠杆菌K12-MG1655扩增pntAB基因，用NcoI/BamHI消化，并插入pCOLA-rcsA-zwf-gsk/NcoI/BamHI，得到载体pCOLA-pntAB-rcsA-zwf-gsk(图8)。选择的克隆在含卡那霉素的LB(50μg ml^-1)中生长，并通过限制性内切图谱和DNA测序进行验证。

工业适用性

本发明提供了用于改进人乳低聚糖(HMO)制备的方法。本发明的微生物和制备方法制备的HMO可广泛地在工业上应用，例如作为婴儿营养品、医疗营养品、功能食品和动物饲料中的功能性成分。

序列表

<110> 奥利构赛恩思生物技术公司

<120> 用于制备人乳低聚糖的微生物

<130> P61374HOF

<160> 42

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FWD primer Pmgt

<400> 1

gtatactccg gagcaaacgc ctgaactccc 30

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> REV primer Pmgt

<400> 2

tctagaggaa gaataagtac gtgctatatt tag 33

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FWD primer PmgtA

<400> 3

cgagctcctt tcgttattca gcacccg 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> REV primer PmgtA

<400> 4

cgagctcgcg atataatacc tgctggc 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FWD primer mgtA 5'UTR

<400> 5

cgagctcctt tcgttattca gcacccg 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> REV primer mgtA 5'UTR

<400> 6

cgagctcaag gagtccctcc gcactgt 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FWD primer SRRZ gene

<400> 7

ccgcatatgc cagaaaaaca tgacctg 27

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> REV primer SRRZ gene

<400> 8

ttagtcgacg caactctatc tgcactgctc 30

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SRRz-SacI-fw

<400> 9

cgagctcaag gagatataat gccagaaaaa catgacct 38

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SRRz-luxTerm-PstI

<400> 10

cggctgcaga atctggcttt ttatattctc taagcgcgtg tgtattgctc 50

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SacI-PmgtA-UTR-fw

<400> 11

ctcgagctcc tttcgttatt cagcacccg 29

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SacI-PmgtA-UTR-rv

<400> 12

cgagctcaag gagtccctcc gcactgt 27

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Bsu36i-PmgtA-UTR-fw

<400> 13

cgcctcaggc tttcgttatt cagcacccg 29

<210> 14

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SRRz-luxTerm-Bsu36i

<400> 14

cagcctgagg aaataataaa aaagccggat taataatctg gctttttata ttc 53

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> zwf-BglII-fw

<400> 15

gagagatcta tggcggtaac gcaaacagc 29

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> zwf-KpnI-rv

<400> 16

gcgggtacct tactcaaact cattccagga ac 32

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gsk-KpnI-fw

<400> 17

gtaaaaggta ccatgaaatt tcccggtaaa cgt 33

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gsk_XhoI-rv

<400> 18

cgacctcgag ttaacgatcc cagtaagact c 31

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> rcsA-NdeI-fw

<400> 19

gtatcatatg tcaacgatta ttatgg 26

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> rcsA-BglII-rv

<400> 20

ccaagatcta tgtgttagcg catgttgac 29

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lacY-BamHI-fw

<400> 21

gaaaggatcc atgtactatt taaaaaacac aaac 34

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lacY-HindIII-rv

<400> 22

cattaagctt ttaagcgact tcattcac 28

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lacY-S209I-fw

<400> 23

attcggcatt tattcttaag ctggcactgg aactg 35

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lacY-S209I-rv

<400> 24

cttaagaata aatgccgaat ggttggcacc 30

<210> 25

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> trxA-BglII-fw

<400> 25

gagagatcta tgagcgataa aattattcac ctgac 35

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> trxA-KpnI-rv

<400> 26

cgaaggtacc attcccttac gccaggttag 30

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> manCB-NcoI-fw

<400> 27

cataccatgg cgcagtcgaa actctatcca g 31

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> manCB-HindIII-rv

<400> 28

cccaagcttt ggggtaaggg aagatccgac 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gmd-NdeI-fw

<400> 29

cgccatatgt caaaagtcgc tctcatcacc 30

<210> 30

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gmd-KpnI-rv

<400> 30

ggcggtacct tcctgacgta aaaacatcat t 31

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pntAB-NcoI-fw

<400> 31

gggccatgga tgcgaattgg cataccaag 29

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pntAB-BamHI-rv

<400> 32

ccgggatcct tacagagctt tcaggattg 29

<210> 33

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lacIZYA-koF13

<400> 33

gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 34

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lacIZYA-koR13

<400> 34

ttaaactgac gattcaactt tataatcttt gaaataatag tgcttatccc gatccgtcga 60

cctgcagttc 70

<210> 35

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> wcaJ-koF13

<400> 35

atgacaaatc taaaaaagcg cgagcgagcg aaaaccaatg catcgttaat cgtgtaggct 60

ggagctgctt c 71

<210> 36

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> wcaJ-koR13

<400> 36

tcaatatgcc gctttgttaa cgaagccctt gaataccgtc aggaaaacga gatccgtcga 60

cctgcagttc 70

<210> 37

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lon-koF13

<400> 37

cagtcgtgtc atctgattac ctggcggaaa ttaaactaag agagagctct gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 38

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lon-koR13

<400> 38

cgaattagcc tgccagccct gtttttatta gtgcattttg cgcgaggtca gatccgtcga 60

cctgcagttc 70

<210> 39

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> clpYQ-koF13

<400> 39

tacttttgta cggggtttgt actctgtatt cgtaaccaag gggtcagctc gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 40

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> clpYQ-koR13

<400> 40

gcctttcagc cccatcaaac aatgatgaaa atgattgaac gcgattatag gatccgtcga 60

cctgcagttc 70

<210> 41

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> trxB-koF13

<400> 41

atctcatggg cacgaccaaa cacagtaaac tgcttatcct gggttcaggc gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 42

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> trxB-koR13

<400> 42

gcatggtgtc gccttcttta cttttgttac tgatttgtaa aattattttg gatccgtcga 60

cctgcagttc 70

Claims

1.一种用于制备人乳低聚糖的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物任选地是细菌，并且优选是大肠杆菌(Escherichia coli)。

2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物包含诱导型裂解系统，其中，所述诱导型裂解系统任选地是自动诱导型裂解系统。

3.根据权利要求2所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述诱导型裂解系统是Mg²⁺调控的，和/或其中，所述诱导型裂解系统任选地受所述外源游离Mg²⁺浓度的调控，和/或其中，所述微生物任选地包含Mg²⁺调控的启动子，和/或其中，所述微生物还任选地包含另外的Mg²⁺调控的元件，优选大肠杆菌的mgtA基因的5'UTR。

4.根据权利要求2或3所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物包含裂解基因，其中，所述裂解基因任选地为来自噬菌体的裂解基因。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物包含Mg²⁺调控的启动子和裂解基因，其中，所述裂解基因的表达受所述Mg²⁺调控的启动子控制，并且任选地受另外的Mg²⁺调控的元件控制。

6.根据权利要求1-7中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物不能将乳糖切割成葡萄糖和半乳糖，和/或其中，任选地，lac操纵子是失活的，优选通过缺失而失活。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物包含编码乳糖通透酶的外源基因，其中，所述乳糖通透酶优选是大肠杆菌LacY蛋白，其中，所述乳糖通透酶任选地具有A198V和/或S209I突变。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述人乳低聚糖为2'-岩藻糖基乳糖和/或3'-岩藻糖基乳糖。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物包含编码岩藻糖基转移酶的外源基因，其中，所述岩藻糖基转移酶优选是α-1,2-岩藻糖基转移酶和/或α-1,3-岩藻糖基转移酶，其中，编码岩藻糖基转移酶的基因任选是异源基因和/或其中编码岩藻糖基转移酶的基因任选由异源启动子驱动，其中，任选地，编码岩藻糖基转移酶的基因是针对在所述微生物中的表达进行密码子优化的。

10.根据权利要求1-9中任一项的经遗传修饰的微生物，其中，所述微生物包含编码分子伴侣的异源基因，其中所述分子伴侣优选为人Hsp70。

11.根据权利要求1-8中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，任选地，rcsA基因，优选来自大肠杆菌，是过表达的；和/或任选地，编码Lon蛋白酶家族蛋白的基因，优选编码大肠杆菌Lon蛋白酶的基因，是失活的，优选通过缺失失活；和/或任选地，wcaJ基因是失活的，优选通过缺失失活；和/或任选地，zwf基因和两个pntAB基因，优选来自大肠杆菌，是过表达的；和/或任选地，gsk基因，优选来自大肠杆菌，是过表达的；和/或任选地，trxA基因，优选来自大肠杆菌，是过表达的；和/或任选地，trxB基因是失活的，优选通过缺失失活。

12.一种制备人乳低聚糖的方法，该方法包括：

(a)在培养基中培养根据权利要求1-11中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中，所述培养基还任选地包含乳糖和/或游离Mg²⁺，其中，任选地，在培养结束时所述培养基中人乳低聚糖的浓度为至少30g/L，优选至少50g/L，其中，优选地，所述人乳低聚糖为2'-岩藻糖基乳糖和/或3'-岩藻糖基乳糖。

13.根据权利要求12所述的制备人乳低聚糖的方法，其进一步包括：

(b)从所述培养基和/或从微生物本身纯化人乳低聚糖，其中，任选地，通过诱导型裂解系统诱导裂解之后，从所述培养基纯化所述人乳低聚糖，和/或其中，任选地，当所述培养基中的游离Mg²⁺浓度为10μM或更低时和/或当所述裂解能够被直接可视化时，从所述培养基纯化所述人乳低聚糖。

14.能通过根据权利要求12所述的方法获得的培养基或能通过根据权利要求13所述的方法获得的人乳低聚糖。

15.根据权利要求14所述的培养基或人乳低聚糖在制备动物饲料中的用途。