CN111087301B

CN111087301B - 布洛芬咖啡酸酯的合成方法及其在制备免疫抑制药物中的应用

Info

Publication number: CN111087301B
Application number: CN201911336463.4A
Authority: CN
Inventors: 朱鑫; 陈坤; 武香香; 曾华辉; 闫敏; 张岚; 田启康
Original assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Current assignee: Henan University of Traditional Chinese Medicine HUTCM
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN111087301A

Abstract

本发明公开了一种布洛芬咖啡酸酯的合成方法及其在制备免疫抑制药物中的应用，将布洛芬，无水二氯甲烷及吡啶，室温搅拌下缓慢滴加SOCl₂的CH₂Cl₂溶液，油浴温度55‑65℃回流2小时，旋干，加入无水二氯甲烷得到布洛芬酰氯的CH₂Cl₂溶液；将咖啡酸，DMF和无水二氯甲烷，冰水浴冷至5℃，滴加三乙胺，搅拌下缓慢滴加布洛芬酰氯的CH₂Cl₂溶液，冰水浴搅拌反应2h，TLC跟踪检测反应，得到布洛芬咖啡酸酯。本发明提供的布洛芬咖啡酸酯（CI）通过MTT法检测其细胞毒性，结果表明CI对MCF‑7细胞增殖和HepG2细胞增殖的抑制情况非常显著；不同浓度的CI溶液对于乳腺癌细胞具有诱导凋亡、抑制增殖的作用。

Description

布洛芬咖啡酸酯的合成方法及其在制备免疫抑制药物中的应用

技术领域

本发明属于有机合成技术领域，具体涉及一种布洛芬咖啡酸酯的合成方法及其在制备免疫抑制药物中的应用。

背景技术

从人们在柳树皮中发现水杨酸的结构至今，临床应用包括阿司匹林、布洛芬等非甾体抗炎药(NSAIDs)已有多年的历史。它们的主要作用方式是抑制环加氧酶(即COX-1和COX-2)导致前列腺素(炎症过程中的信使分子)的合成减少从而实现镇痛抗炎的效用。布洛芬在临床上已使用多年，属于适用最广泛的非甾体类药物，可应用于治疗一般的解热镇痛及风湿性关节炎、神经炎。

大量报道关注了非甾体类抗炎药在肿瘤上的研究。已经有研究表明，长期服用布洛芬可降低患前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、肝癌、胰腺癌等恶性肿瘤的风险。实验发现，某些非甾体药物具有抑制卵巢癌细胞的增殖并诱导其凋亡的潜力。人们发现环氧化酶的次生类亚型体(COX-2)在肿瘤进程和发展中扮演着重要角色。然而，尚未阐明布洛芬的抗肿瘤机制。本研究旨在探讨经过结构修饰的布洛芬对肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞MCF-7的作用，为临床上进一步为布洛芬的联合应用治疗乳腺癌奠定理论基础。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种炎症是肿瘤发生进展的重要组成部分，非甾体类抗炎药(NSAIDs)在抑制早期肿瘤进展和恶性转化方面是有效的。比如，布洛芬可有效降低患病风险各种人类癌症，包括乳腺癌，肺癌和前列腺癌等。有报道称，NSAIDs抑制癌症是通过环加氧酶(COX)的机制，然而也有COX非依赖性的靶标，包括过氧化物酶体增殖物激活受体，脂氧合酶和细胞凋亡信号。常规的NSAID的毒性相关，这使得它们长期用于预防癌症有问题的。

本发明提供了一种新的常规NSAID化学修饰方法，以减少其毒性并增强其作用功效。通过联合中药酚酸类活性成分，这种改良的布洛芬咖啡酸酯(CI)是布洛芬的衍生物。本文旨在研究布洛芬衍生物体外作用于MCF-7细胞、HepG2细胞后，2种肿瘤细胞株的增殖、凋亡情况，为临床肿瘤治疗提供新的思路。本发明首先应用MTT的方法检测了不同浓度布洛芬、CI作用下2种肿瘤细胞株的增殖抑制情况。实验结果表明，CI对2种肿瘤细胞的效果较好。流式细胞术分析发现，CI作用后不同浓度的给药量增加了MCF-7细胞株的凋亡率并且影响了细胞周期进程。CI具有一定程度的抗肿瘤作用，其分子机制有待进一步探究。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种布洛芬咖啡酸酯的合成方法，包括以下步骤：

(1)向三颈瓶中依次加入布洛芬，无水二氯甲烷及吡啶，室温下边搅拌边缓慢滴加SOCl₂的CH₂Cl₂溶液，油浴温度保持在55-65℃回流2小时，之后缓慢冷却反应液，减压除去过量的SOCl₂旋干得到浅黄色固体，加入无水二氯甲烷得到布洛芬酰氯的CH₂Cl₂溶液，密闭备用；甲醇衍生酯法检查酰氯是否制备成功。取甲醇少许至洁净1.5mL EP管中，滴加微量布洛芬酰氯混匀，TLC点板确认酰氯制备成功；

(2)另取三口瓶加入咖啡酸，DMF和无水二氯甲烷，冰水浴冷至5℃，滴加三乙胺，搅拌下缓慢滴加步骤(1)得到的布洛芬酰氯的CH₂Cl₂溶液，低温持续搅拌反应2h，TLC跟踪检测反应，抽滤，滤液旋干得油状物，硅胶柱层析，得到布洛芬咖啡酸酯白色固体，反应路线如下：

进一步，所述步骤(1)中15mmol布洛芬需要无水二氯甲烷20mL，10mmol布洛芬需要吡啶1滴。

进一步，所述步骤(1)中15mmol布洛芬需要SOCl₂的CH₂Cl₂溶液5mL，其中SOCl₂为0.5mL。

进一步，所述布洛芬与咖啡酸的摩尔比为5:1。

进一步，所述步骤(2)中咖啡酸与三乙胺的摩尔比为3:5。

进一步，所述步骤(2)中DMF和无水二氯甲烷的体积比为1:10，3mmol咖啡酸需要无水二氯甲烷10mL。

进一步，所述步骤(2)中硅胶柱层析所用的淋洗剂为石油醚：乙酸乙酯(V:V)＝5:1。

所述的合成方法制得的布洛芬咖啡酸酯在制备免疫抑制药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的化合物布洛芬咖啡酸酯是通过酰氯法制备的；对于单溶剂不溶的原料咖啡酸，采用混合溶剂进行溶解；本发明方法简单，便于工业转化。本发明提供的化合物布洛芬咖啡酸酯通过MTT法检测其细胞毒性，结果表明，布洛芬咖啡酸酯(CI)对MCF-7细胞增殖和HepG2细胞增殖的抑制情况非常显著；进一步测试了CI对MCF-7细胞凋亡的作用，随着CI浓度的增加，细胞中的凋亡细胞所占比率不断增加，观察到了不同浓度的CI溶液对于乳腺癌细胞具有诱导凋亡、抑制增殖的作用，其生长抑制率具有浓度的依赖性。

附图说明

图1为不同浓度布洛芬、CI对MCF-7细胞增殖的抑制情况。

图2为不同浓度布洛芬、CI对HepG2细胞增殖的抑制情况。

图3为流式细胞仪检测CI对于MCF-7细胞凋亡影响的结果。

图4为CI的氢谱图。

图5为CI的碳谱图。

图6为CI的质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例1

本实施例的布洛芬咖啡酸酯的合成方法如下：

(1)三颈瓶中依次加入布洛芬3.09g(15mmol)，20mL无水二氯甲烷及1滴吡啶。室温下边搅拌边缓慢滴加SOCl₂(0.5mL)的CH₂Cl₂溶液5mL。油浴温度保持在60℃上下回流2小时。之后缓慢冷却反应液，减压除去过量的SOCl₂，旋干得到浅黄色固体，加入无水二氯甲烷5mL，密闭备用；

甲醇衍生酯法检查酰氯是否制备成功。取甲醇少许至洁净1.5mL EP管中，滴加微量布洛芬酰氯混匀，TLC点板确认酰氯制备成功；

(2)另取三口瓶加入咖啡酸0.54g(3mmol)，1mL DMF和10mL无水二氯甲烷，冰水浴冷至5℃左右，滴加三乙胺5mmol，搅拌下缓慢滴加上一步的布洛芬酰氯的CH₂Cl₂溶液。低温持续搅拌反应2h。TLC跟踪检测反应。抽滤，滤液旋干得油状物。硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)，得到布洛芬咖啡酸酯(CI)白色固体427mg。

CI的结构

布洛芬咖啡酸酯，白色固体，产率为79.1％，mp：121.8-122.5℃。分子式为C₂₂H₂₄O₅，M＝368。其中MS(ESI，m/z)：[M-H]+为367；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)，δ/×10^-6：0.83(s，3H，CH₃)，0.84(s，3H，CH₃)，1.78～1.82(m，1H，CH)，1.40(d，3H，CH-CH₃)，2.43(d，2H，CH-CH₂)，3.72(m,1H，CH-CH₃)，6.53(d，1H，J＝16Hz，CH＝CH)，7.52(d，1H，J＝16Hz，CH＝CH)，7.15(d，2H，J＝7.95Hz)，7.23(d，2H，J＝7.9Hz)，7.13(d，1H，J＝8.55Hz)，7.16～7.19(dd，1H，J＝2.9、7.8Hz)，7.57(d，1H)。¹³C NMR(500MHz，DMSO-d₆)，δ/×10^-6：171.64，167.25，143.14，142.22，141.96，140.17，137.00，133.20，129.29，127.23，126.71，123.76，122.86，120.43，44.18，43.79，29.52，22.10，18.64，18.38。

一、合成化合物癌细胞增殖的影响

1、细胞培养

人肝癌细胞HepG2和乳腺癌细胞MCF-7在DMEM完全培养基中(DMEM+10％胎牛血清+1％双抗)在置37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱内培养。显微镜下观察到培养皿中细胞贴壁80-85％时以1mL 0.25％胰酶消化传代。

2、MTT法检测抑制率

待细胞传3～4代后，以5000-10000个/孔细胞铺96孔板，观察后放入培养箱中培养24h。镜下观察细胞密度达85％后加入不同浓度(50、100、150、200、250、300、350、400μmol/L)的CI，并设置正常组和空白组，均设6个复孔，放入培养箱中培养24h。24h后加入每孔分别加入20μl MTT(5mg/ml)37℃继续孵育，4h后终止培养。小心吸去培养基上清液，每孔加入150μl DMSO，37℃孵育10min，用平板摇床低速震荡10min，使结晶充分溶解，以空白对照调零，于490nm波长处测定各孔的吸光度，求平均值，计算抑制率和IC 50。结果如图1和图2所示。

从图1和2结果可以看出CI对MCF-7细胞、HepG2细胞在50-400μmol/L范围有较强的抑制作用，表现出较好的活性，经过Graph Pad Prism软件计算得到24小时CI作用于MCF-7的IC 50值为273.6μmol/L，作用于HepG2的IC 50值为223.3μmol/L。

3、流式细胞术检测乳腺癌细胞凋亡率

以2×10⁵个/孔细胞铺6孔板，培养24h后弃上清，加入含CI且浓度为200μmol/L、273.7μmol/L、300μmol/L的新培养液，并设对照组。继续培养24h后，每个加药浓度下离心收集5×10⁵个细胞。用双蒸水稀释5×结合缓冲液为1×工作液，取500μL 1×结合缓冲液重悬细胞，每管加入5μL Annexin V-CITC和10μL PI。轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5分钟。在流式细胞仪上，通过CITC检测通道检测Annexin V-CITC(Ex＝488nm；Em＝530nm)和通过PE检测通道检测PI。结果如图3所示。

由图3可知，对照组中凋亡比率只占到所有细胞的0.19％，而随着CI浓度的增加，细胞中的凋亡细胞所占比率不断增加，在350μmol/L CI处理组MCF-7细胞凋亡比例高达82.17％。观察到了不同浓度的CI溶液对于乳腺癌细胞具有诱导凋亡、抑制增殖的作用，其生长抑制率具有浓度的依赖性。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种布洛芬咖啡酸酯的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）向三颈瓶中依次加入布洛芬，无水二氯甲烷及吡啶，室温下边搅拌边缓慢滴加SOCl₂的CH₂Cl₂溶液，油浴温度保持在55-65℃回流2小时，之后缓慢冷却反应液，减压除去过量的SOCl_2，旋干得到浅黄色固体，加入无水二氯甲烷得到布洛芬酰氯的CH₂Cl₂溶液，密闭备用；

（2）另取三口瓶加入咖啡酸，DMF和无水二氯甲烷，冰水浴冷至5℃，滴加三乙胺，搅拌下缓慢滴加步骤（1）得到的布洛芬酰氯的CH₂Cl₂溶液，冰水浴持续搅拌反应2h，TLC跟踪检测反应，抽滤，滤液旋干得油状物，硅胶柱层析，得到布洛芬咖啡酸酯白色固体。

2.根据权利要求1所述的布洛芬咖啡酸酯的合成方法，其特征在于：所述步骤（1）中15mmol布洛芬需要无水二氯甲烷20mL，10mmol布洛芬需要吡啶1滴。

3.根据权利要求1所述的布洛芬咖啡酸酯的合成方法，其特征在于：所述步骤（1）中15mmol布洛芬需要SOCl₂的CH₂Cl₂溶液5mL，其中SOCl₂为0.5mL。

4.根据权利要求1所述的布洛芬咖啡酸酯的合成方法，其特征在于：所述布洛芬与咖啡酸的摩尔比为5:1。

5.根据权利要求1所述的布洛芬咖啡酸酯的合成方法，其特征在于：所述步骤（2）中咖啡酸与三乙胺的摩尔比为3:5。

6.根据权利要求1所述的布洛芬咖啡酸酯的合成方法，其特征在于：所述步骤（2）中DMF和无水二氯甲烷的体积比为1:10，3mmol咖啡酸需要无水二氯甲烷10mL。

7.根据权利要求1所述的布洛芬咖啡酸酯的合成方法，其特征在于：所述步骤（2）中硅胶柱层析所用的淋洗剂为石油醚:乙酸乙酯V:V=5:1。

8.利用权利要求1-7任一项所述的合成方法制得的布洛芬咖啡酸酯在制备治疗肝癌和乳腺癌药物中的应用。