CN111073886A

CN111073886A - 一种基于超顺磁性纳米颗粒的dna提取吸附液、试剂盒以及dna提取方法

Info

Publication number: CN111073886A
Application number: CN202010046781.3A
Authority: CN
Inventors: 张玉波; 李秋佳
Original assignee: Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Current assignee: Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111073886B

Abstract

本发明提供了一种基于超顺磁性纳米颗粒DNA提取吸附液、试剂盒以及DNA提取方法，属于DNA提取技术领域，所述吸附液包括聚乙二醇、氯化钠和氯化镁；所述聚乙二醇的浓度为100～250mg/ml；所述氯化钠的浓度为1.25～2.75mol/L；所述氯化镁的浓度为10～20mmol/L。所述提取方法包括以下步骤：1)将超顺磁性纳米颗粒与吸附液混合；2)将待提取的DNA样品与工作液混合、吸附提取后进行磁分离，收集吸附有DNA的超顺磁性纳米颗粒；3)洗脱所述吸附有DNA的超顺磁性纳米颗粒，磁分离，收集液相组分即为提取获得的DNA。本发明所述吸附液成分简单、吸附效率高；所述提取方法提取速度快、成本低。

Description

一种基于超顺磁性纳米颗粒的DNA提取吸附液、试剂盒以及 DNA提取方法

技术领域

本发明属于DNA提取技术领域，尤其涉及一种基于超顺磁性纳米颗粒DNA提取吸附液、试剂盒以及DNA提取方法。

背景技术

DNA样品和基于DNA的实验在生命科学领域中是最常见也最基础的。高浓度、高纯度的DNA提取成为分子生物学实验中的关键步骤，同时，这也是许多下游实验的基础性第一步。传统的提取DNA的方法主要依赖于酚氯仿或者柱纯化。然而，有毒化学试剂的使用和提取效率的低下使得这两种方法已经不能满足现代科研工作的需求。

过去几十年中，磁粒被广泛应用到核酸提取中。磁粒提取试剂主要由磁粒和吸附液两部分组成。吸附液主要由聚乙二醇(PEG)和盐离子所组成。PEG和盐离子可以使DNA分子发生相变，从而吸附到磁粒上。值得注意的是，PEG的分子量大小、浓度及所使用的盐离子的种类、浓度不同都会影响吸附液的效果。故而，在不同的提取条件下，都需要根据所提取的目的DNA片段大小及所使用的磁粒的性质，来对吸附液的成分和配比进行具体调整。

磁粒通常由不同的修饰集团包裹四氧化三铁所形成，不同磁粒的大小、形状、表面集团和磁响应时间都不同。基于不同磁粒的核酸提取所得到的浓度和纯度也存在较大差异。在各类磁粒中，超顺磁性纳米颗粒(super paramagnetic iron oxide nanoparticles，SPION)的磁响应时间最快，它的颗粒平均直径更小，外在磁场撤离后不会有磁性滞留的现象，磁性质更为稳定，这使得SPION在核酸提取中具有更大的应用前景。然而，如何最大限度的发挥SPION的优势还有待探索，特异性针对SPION的DNA提取方法还很缺乏。探究SPION的最佳使用方法成为加快推广该技术的应用和进一步提高DNA提取效果的有效途径。

随着芯片技术和第二代测序技术的诞生和迅猛发展，国内外提出了多个基因组测序计划，文库构建和测序正逐渐成为科学研究中不可缺少的环节。巨大的测序应用需求对测序成本和文库构建成本都提出了更高的要求。随着技术平台的发展，测序成本逐渐下降，然而高昂的试剂盒使得文库构建的成本居高不下，有些样品的文库构建成本甚至高于其测序成本。值得注意的是，现有的测序平台终端都是在对DNA序列进行读取，这使得DNA的提取纯化等操作成为整个分子生物学实验和文库构建中最基础而又不可避免的环节，研发精准高效且价格低廉的DNA提取方法是降低整个文库构建成本的关键性措施。这一极大的需求推动了多种商用磁粒提取试剂盒的产生。然而，现有的提取试剂盒所采用的磁粒、吸附液各不相同，提取效果存在很大差异，同时其价格也都非常昂贵。目前使用最为广泛的进口Beckman AMPure XP试剂盒，价格高达216.67元/ml；其他的国产磁性颗粒提取试剂盒的提取效率较低，满足不了高效精准的科研需求，而其价格也都在100元/ml左右。高昂的DNA提取试剂盒是非常不合理的，这一现状也在一定程度上限制了我国基础生物学的发展和测序技术的推广。

因此，亟待研发一种基于基于超顺磁性纳米颗粒的高效，价格低廉的DNA提取方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于超顺磁性纳米颗粒DNA提取吸附液、试剂盒以及DNA提取方法；所述吸附液成分简单、吸附效率高；所述提取方法提取获得的DNA浓度高，纯度佳；提取速度快、成本低。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种基于超顺磁性纳米颗粒的DNA提取吸附液，包括聚乙二醇、氯化钠和氯化镁；所述吸附液中聚乙二醇的浓度为100～250mg/ml；氯化钠的浓度为1.25～2.75mol/L；氯化镁的浓度为10～20mmol/L。

优选的，所述吸附液中聚乙二醇的浓度为180～220mg/ml；氯化钠的浓度为2.4～2.6mol/L；氯化镁的浓度为15～18mmol/L。

本发明提供了一种DNA提取试剂盒，包括所述的DNA提取吸附液和超顺磁性纳米颗粒；所述超顺磁性纳米颗粒的粒径为100nm～1μm；所述超顺磁性纳米颗粒的浓度为0.625～10mg/ml。

本发明提供了一种基于超顺磁性纳米颗粒的DNA提取方法，包括以下步骤：

1)将超顺磁性纳米颗粒与吸附液混合获得工作液；

2)将待提取的DNA样品与步骤1)中所述工作液混合、吸附提取后进行磁分离，收集吸附有DNA的超顺磁性纳米颗粒；

3)洗脱所述吸附有DNA的超顺磁性纳米颗粒，磁分离，收集液相组分即为提取获得的DNA。

优选的，所述超顺磁性纳米颗粒与吸附液的体积比为1:(1～16)。

优选的，待提取的DNA样品与所述工作液的体积比为1:(0.5～2)。

优选的，步骤3)中所述洗脱使用的洗脱液为超纯水或TE溶液。

优选的，步骤2)和步骤3)中所述的磁分离的时间独立为30s～2min。

优选的，步骤2)中收集所述吸附有DNA的超顺磁性纳米颗粒后，还包括清洗步骤。

优选的，所述清洗的次数为1～3次，所述清洗采用体积浓度70％～80％的乙醇进行。

本发明的有益效果：本发明提供的基于超顺磁性纳米颗粒的DNA提取吸附液，包括聚乙二醇、氯化钠和氯化镁；成分简单、吸附效率高；对100bp以上的DNA片段的吸附效率达到95％以上；所述吸附液所需要的磁性纳米颗粒浓度低；所述提取方法提取用时短，仅为12min，同时本发明提供的方法提取成本低至4.38元/ml；本发明所述提取方法提取的DNA浓度高、纯度高，可直接用于后续酶切、连接、PCR及测序等反应。

附图说明

图1为本发明提取DNA的方法示意图；

图2为本方法实施例1中在

预制琼脂糖凝胶电泳系统对所提取的DNA分子标记M1的分析结果；

图3为本发明实施例1中在

预制琼脂糖凝胶电泳系统对所提取的DNA分子标记M2的分析结果。

图4为本发明实施例2中在

具体实施方式

在本发明中，所述吸附液中聚乙二醇的浓度优选为180～220mg/ml，更优选为200mg/ml；所述氯化钠的浓度优选为2.4～2.6mol/L，更优选为2.5mol/L；所述氯化镁的浓度优选为15～18mmol/L，更优选为16.3mmol/L。

在本发明中，所述聚乙二醇、氯化钠和氯化镁均采用市售产品即可。在本发明中，所述吸附液的溶剂优选为水；本发明对所述吸附液的配置方法没有特殊限定，只要能够实现三种成分在上述浓度范围内即可。在本发明中，所述吸附液的配制方法优选的包括以下步骤：S1)将超纯水与氯化钠混合溶解后，过滤膜获得氯化钠储液；S2)将超纯水与氯化镁混合溶解后，过滤膜获得氯化镁储液；S3)将所述氯化钠储液、氯化镁储液和聚乙二醇混合溶解后，过滤膜获得吸附液。在本发明中，所述混合溶解优选的采用室温旋转仪中翻转溶解；所述滤膜的孔径优选为0.22μm。在本发明中，所述吸附液优选的在3～5℃保存，更优选的在4℃保存。

本发明提供了一种DNA提取试剂盒，包括所述DNA提取吸附液和超顺磁性纳米颗粒；所述超顺磁性纳米颗粒的粒径为100nm～1μm，更优选200～500nm，最优选为300nm；所述超顺磁性纳米颗粒的浓度为0.625～10mg/ml，优选为1.0～3.0mg/ml，更优选为1.25mg/ml。本发明对所述超顺磁性纳米颗粒的来源没有特殊限定，采用本领域常规的市售产品即可。

本发明提供了一种基于超顺磁性纳米颗粒的DNA提取方法，包括以下步骤：1)将超顺磁性纳米颗粒与吸附液混合获得工作液；2)将待提取的DNA样品与步骤1)中所述工作液混合、吸附提取后进行磁分离，收集吸附有DNA的超顺磁性纳米颗粒；3)洗脱所述吸附有DNA的超顺磁性纳米颗粒，磁分离，收集液相组分即为提取获得的DNA。

在本发明中，将超顺磁性纳米颗粒与吸附液混合获得工作液。在本发明中，所述超顺磁性纳米颗粒与吸附液的体积比优选为1:(1～16)，更优选为1:(6～10)，更优选为1:8。在本发明中，所述混合通过涡旋震荡实现。在本发明中，所述超顺磁性纳米颗粒在与吸附液混合前，优选的还包括超顺磁性纳米颗粒的分离与清洗过程。在本发明中，市售的超顺磁性纳米颗粒优选的通过磁分离将其中的超顺磁性纳米颗粒与贮存液分离；然后对分离获得的超顺磁性纳米颗粒进行清洗；所述清洗优选的采用TE或超纯水进行，所述清洗的次数优选为2次，所述TE或超纯水的加入的体积优选为超顺磁性纳米颗粒体积的1～2倍。本发明在所述清洗结束后，弃掉超纯水，使残留液体充分挥发。在本发明中，所述工作液可在短期内多次分批使用，所述工作液的有效使用时间为配置完成后的30天内，优选为7天内。

本发明在获得工作液后，将待提取的DNA样品与所述工作液混合、吸附提取后进行磁分离，收集吸附有DNA的超顺磁性纳米颗粒。在本发明中，所述待提取的DNA样品与所述工作液的体积比优选为1:(0.5～2)，更优选为1:1.2。在本发明中，所述吸附提取优选为静置孵育，所述吸附提取的时间优选为2min；所述吸附提取的温度优选为25℃。在本发明中，对所述待提取的DNA样品没有特殊限定，所有含有DNA的液体样品均可。在本发明中，所述混合优选的通过涡旋振荡实现。在本发明中，所述磁分离的时间优选为30s～2min。在本发明中，收集所述吸附有DNA的超顺磁性纳米颗粒后，还包括清洗步骤；所述清洗的次数优选为1～3次，更优选为2次，所述清洗优选的采用体积浓度70％～80％的乙醇进行，更优选的采用75％的乙醇进行。在本发明中，所述乙醇的加入的体积优选为吸附有DNA的超顺磁性纳米颗粒体积的1～2倍。本发明在所述清洗结束后，弃掉乙醇，使残留液体充分挥发。在本发明中，工作混合液与待提取的DNA样品混合后，在PEG的作用下，DNA分子发生从螺旋状到球状的相变过程，压缩后的球状DNA分子通过Na⁺的作用，与磁性颗粒上的羧基集团发生连接，从而实现DNA与磁性颗粒的吸附。

在本发明中，洗脱所述吸附有DNA的超顺磁性纳米颗粒，磁分离，收集液相组分即为提取获得的DNA。在本发明中，所述洗脱使用的洗脱液优选为超纯水或TE溶液。在本发明中，所述磁分离的时间优选为30s～2min。在本发明中，所述提取获得的DNA优选的置于3～5℃保存，更优选的置于4℃保存。在本发明中，洗脱利用洗脱液的溶液性质不同，DNA分子发生从球状到螺旋状的相变恢复，与磁性粒间连接断开，从而实现DNA的洗脱；

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例中的DNA提取简要原理和步骤如图1所示；具体步骤如下：

吸附液的配制

本实例中的吸附液由PEG、NaCl、MgCl₂三种成分所组成。储存液的具体配置方法如下：

储存液A：称取14.61g的NaCl，加入40ml超纯水，置于室温旋转仪中翻转溶解，待大部分白色颗粒溶解后，室温静置1～6h，使管内气泡充分消散，管壁液滴充分聚合，方便准确定容，后定容至50ml，而后，再次翻转溶解。全部溶解后，采用0.22μm微孔滤膜过滤器完成过滤，4℃储存备用。

储存液B：称取4.066g的MgCl₂·6H₂O加入4ml超纯水，置于室温旋转仪中翻转溶解，待颗粒溶解后，室温静置长于1～6h后定容至10ml，而后，再次翻转溶解。全部溶解后，采用0.22μm微孔滤膜过滤器完成过滤，4℃储存备用。

储存液配置完成后即可配置吸附液。吸附液配置的具体方法为：取储存液A 4ml、取储存液B 81.5μl，混匀后加入2g的PEG8000。置于室温旋转仪中翻转溶解。待大部分PEG的白色片剂溶解后，室温静置长于1h后定容至10ml，而后，再次翻转溶解。全部溶解后，采用0.22μm微孔滤膜过滤器完成过滤，4℃储存备用。

磁粒工作液的配制

磁粒工作液由超顺磁性纳米颗粒和吸附液所组成，本实例所采用的羧基修饰包被的磁性颗粒可直接从生化试剂商店购买，其储存液为20％的乙醇溶液。配置磁粒工作混合液的具体步骤如下：

(1)提前孵育磁粒储存液。为保证所取体积的准确性，需要提前将磁粒储存液由4℃拿出，静置室温长于30min。(需要提醒的是，温度并不会影响到超顺磁性纳米颗粒的性能，故而此步骤不是必须的。

(2)取100μl混匀后的磁粒置于EP管中，磁性分离。在外在磁场如磁力架的作用下，使液相和磁粒分离，时间2min。

(3)弃掉液相，清洗两次。磁性分离后，用移液枪弃掉液相，并用200μl超纯水清洗两次，清洗完毕后，用移液枪吸净残留液体。

(4)加入800μl的吸附液。盖紧管盖，涡旋混匀30s。

提取DNA

本发明中以不同片段大小的DNA分子为研究对象，在本实施例共采用两种不同的DNA分子，分别为片段为50bp～2500bpDNA分子标记M1、片段为100bp～10kbDNA分子标记M2；后续实验的开展均依托于此。不同DNA的提取过程一致，本实例中以分子标记M1为例做具体介绍，具体提取过程如下：

(1)提前孵育磁粒工作混合液。为保证所取体积的准确性，需要提前将磁粒工作混合液由4℃拿出，静置于室温长于30min。各取50μl的M1溶液置于2个不同的EP管中，分别标记为s1,s2。

(2)s1,s2中加入60μl的磁粒工作液。分别吹打混匀后，静置于室温5min。

(3)置于磁力架上磁性分离。磁性分离时间为2min。

(4)弃掉上清液，80％(v/v)的乙醇清洗两次

(5)待所有乙醇残留挥发完全后，加入20μl超纯水，吹打混匀洗脱DNA。

(6)再次磁性分离后，转移液相至新的EP管中。

(7)所获得的DNA溶液采用

仪器检测浓度，并用

预制琼脂糖凝胶电泳系统检测DNA条带范围。

另外，本实例还将Beckman AMPure XP作为对比研究，AMPure XP的提取实验按照其说明书进行，提取样品分别标记为x1，x2。

结果分析

所获得的DNA分子标记M1结果，其DNA条带范围采用

预制琼脂糖凝胶电泳系统检测，结果见图2；其浓度采用

仪器检测，结果如表1。

表1 DNA分子标记M1的提取结果

所获得的DNA分子标记M2结果，其DNA条带范围采用

预制琼脂糖凝胶电泳系统检测，结果见图3；其浓度采用

仪器检测，结果如表2。

表2 DNA分子标记M2的提取结果

由此可以看出，表1和表2中两种方法所得到的提取效率几乎一致，本发明甚至有更稳定的效果。而从

预制琼脂糖凝胶电泳系统检测结果图2和图3来看，两种方法所得到的DNA条带范围也几乎一致，本发明对150bp～10kp的DNA片段都具有接近100％的回收效率。故而，本发明从提取效果上完全可以替代现有的AmPure XP试剂盒，甚至更优。同时本发明的提取成本低至4.38元/ml，成本仅为AMPure XP试剂盒的1/50，国产试剂盒的1/25。

实施例2

吸附液的配制

本实例中的吸附液由PEG、NaCl、MgCl2三种成分所组成，具体配置方法如实施例1。

磁粒工作液的配制

提前孵育磁粒储存液。为保证所取体积的准确性，需要提前将磁粒储存液由4℃拿出，静置室温长于30min。(需要提醒的是，温度并不会影响到超顺磁性纳米颗粒的性能，故而此步骤不是必须的。

取100μl混匀后的磁粒置于EP管中，磁性分离。在外在磁场如磁力架的作用下，使液相和磁粒分离，时间2min。

弃掉液相，清洗两次。磁性分离后，用移液枪弃掉液相，并用200μl超纯水清洗两次，清洗完毕后，用移液枪吸净残留液体。

分别加入100μl，400μl，800μl，1600μl的吸附液，使磁性颗粒的终浓度分别为10mg/ml，2.5mg/ml，1.25mg/ml，0.625mg/ml，并分别记为磁粒工作液Mwb10(Mag workingbuffer 10)，Mwb2.5，Mwb1.25，Mwb0.625。盖紧管盖，涡旋混匀30s。

提取DNA

本发明中以不同片段大小的DNA分子为研究对象，在本实施例采用片段为50bp～2500bpDNA分子标记M1。具体提取过程如下：

提前孵育磁粒工作混合液。为保证所取体积的准确性，需要提前将磁粒工作混合液由4℃拿出，静置于室温长于30min。各取50μl的M1溶液置于8个不同的EP管中，分别标记为10A，10B，2.5A，2.5B，1.25A，1.25B，0.625A，0.625B；依次对应加入60μl的磁粒工作液Mwb10，Mwb2.5，Mwb1.25，Mwb0.625。分别吹打混匀后，静置于室温5min。

置于磁力架上磁性分离。磁性分离时间为2min。

弃掉上清液，80％(v/v)的乙醇清洗两次

待所有乙醇残留挥发完全后，加入20μl超纯水，吹打混匀洗脱DNA。

再次磁性分离后，转移液相至新的EP管中。

所获得的DNA溶液采用

仪器检测浓度，并用

预制琼脂糖凝胶电泳系统检测DNA条带范围。

另外，本实例还将Beckman AMPure XP作为对比研究，AMPure XP的提取实验按照其说明书进行，提取样品分别标记为xA，xB。

结果分析

所获得的DNA分子标记M1结果，其DNA条带范围采用

预制琼脂糖凝胶电泳系统检测，结果见图4；其浓度采用

仪器检测，结果如表3。

表3 DNA分子标记M1的提取结果

由此可以看出，不同超顺磁性颗粒的终浓度均可以高效的提取DNA，超顺磁性颗粒的终浓度在0.625～10mg/ml之间时，DNA提取效率从85％到97％，而从

预制琼脂糖凝胶电泳系统检测结果图4来看，不同方法所得到的DNA条带范围也几乎一致。故而，本发明从提取效果上完全可以替代现有的AmPure XP试剂盒，甚至更优。同时本发明所述方法在具体实验时，针对不同需求可以使用不同的磁性颗粒浓度，优选的1.25mg/ml磁性颗粒终浓度方法的提取成本低至4.38元/ml，成本仅为AMPure XP试剂盒的1/50，国产试剂盒的1/25；如DNA样本多，也可以采用0.625mg/ml的终浓度，在保证85％以上的提取效率的同时进一步降低成本。

由上述实施例可知，本发明特异性针对超顺磁性纳米颗粒，采用最简单的最优化的吸附液，提取DNA的过程简单，快速，效果等同甚至更优，成本却远远低于现有试剂盒；这些都使得本发明相较于现有的DNA提取方法具有无法替代的优势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种基于超顺磁性纳米颗粒的DNA提取吸附液，其特征在于，包括聚乙二醇、氯化钠和氯化镁；所述吸附液中聚乙二醇的浓度为100～250mg/ml；氯化钠的浓度为1.25～2.75mol/L；氯化镁的浓度为10～20mmol/L。

2.根据权利要求1所述的DNA提取吸附液，其特征在于，所述吸附液中聚乙二醇的浓度为180～220mg/ml；氯化钠的浓度为2.4～2.6mol/L；氯化镁的浓度为15～18mmol/L。

3.一种的DNA提取试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的DNA提取吸附液和超顺磁性纳米颗粒；所述超顺磁性纳米颗粒的粒径为100nm～1μm；所述超顺磁性纳米颗粒的浓度为0.625～10mg/ml。

4.一种基于超顺磁性纳米颗粒的DNA提取方法，包括以下步骤：

1)将超顺磁性纳米颗粒与权利要求1或2所述吸附液混合获得工作液；

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述步骤1)超顺磁性纳米颗粒与吸附液的体积比为1:(1～16)。

6.根据权利要求4或5所述的提取方法，其特征在于，所述步骤2)待提取的DNA样品与所述工作液的体积比为1:(0.5～2)。

7.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，步骤3)中所述洗脱使用的洗脱液为超纯水或TE溶液。

8.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，步骤2)和步骤3)中所述的磁分离的时间独立的为30s～2min。

9.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，步骤2)中收集所述吸附有DNA的超顺磁性纳米颗粒后，还包括清洗步骤。

10.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述清洗的次数为1～3次，所述清洗采用体积浓度70％～80％的乙醇进行。