CN111073811A - 一种用于实时荧光核酸扩增检测的微流控芯片及检测方法 - Google Patents

Abstract

一种用于实时荧光核酸扩增检测的微流控芯片及检测方法，该芯片包括层叠压合的基底层和盖板层，盖板层设置有入液口，基底层设置有废液接收部、滤纸腔室、进样口、混合流道、清洗液注入部及反应液注入部，进样口连接盖板层的入液口，滤纸腔室具有透明区域，滤纸腔室内设置有用于吸附核酸的滤纸，滤纸腔室与进样口、废液接收部和清洗液注入部相连，并通过混合流道连接反应液注入部，清洗液注入部用于向滤纸腔室注入清洗液，反应液注入部用于提供含有引物和酶的反应液，经过混合流道后流入滤纸腔室。使用本发明能够极大地简化繁琐的人为操作，缩短实时荧光核酸扩增检测时间。

Description

一种用于实时荧光核酸扩增检测的微流控芯片及检测方法

技术领域

本发明涉及核酸扩增检测技术，特别是一种用于实时荧光核酸扩增检测的微流控芯片及检测方法。

背景技术

近年来，大量的传染病如非洲猪瘟、埃博拉病毒等在全球范围内传播，但该病毒的检测需要专业的仪器进行核酸提取扩增方能检测，成品较贵且无法普及使用。而微流控是一种小型化，集成度较高的技术，其拥有成本低廉，可进行自动化操作等优点，被广泛应用于医学领域。

微流控技术起源于Manz和Widmer等人采用芯片实现了此前一直在毛细管内完成的电泳分离，之后微流控技术得到快速发展，从最初的分析化学平台逐渐应用与各个领域如生化医疗诊断，食品商品检验等。微流控体系驱动系统最常用的有主动式和被动式两种，主动式主要采用外界驱动力如机械压力、磁场、电场等，而被动式主要靠流道的设计来实现流体的流动，被动式相对于主动式结构简单，更加容易小型化，但被动式驱存在着不稳定的缺陷。

临床上，分子诊断被广泛应用于感染性疾病、肿瘤以及遗传性疾病的检测。随着生命科学、生物技术、微加工技术取得重大突破，高尖端核酸分子检测的相关产业成为全球未来竞争的新领域。

分子诊断是包括多种扩增技术的精细探测方法，其中，实时荧光核酸恒温扩增检测技术simultaneousamplificationandtesting，简称SAT，是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术。该技术具有反应快速、高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。然而，跟常规的核酸检测技术一样，该技术摆脱不了样品准备耗时长、操作繁琐等缺点，不满足快速、低成本的临床诊断需要。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种用于实时荧光核酸扩增检测的微流控芯片及检测方法，以提高检测速度，简化操作，便于控制，降低检测成本。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于实时荧光核酸扩增检测的微流控芯片，包括基底层和盖板层，所述基底层与所述盖板层层叠压合，所述盖板层设置有入液口，所述基底层设置有废液接收部、滤纸腔室、进样口、混合流道、清洗液注入部以及反应液注入部，所述进样口连接所述入液口，所述滤纸腔室具有透明区域，所述滤纸腔室内设置有用于吸附核酸以进行核酸纯化浓缩的滤纸，所述滤纸腔室与所述进样口、所述废液接收部和所述清洗液注入部相连，并通过所述混合流道连接所述反应液注入部，待测样品通过所述进样口进入所述滤纸腔室，所述清洗液注入部用于向所述滤纸腔室注入清洗液，清洗后的废液流向所述废液接收部，所述反应液注入部用于提供含有引物和酶的反应液，经过所述混合流道后流入所述滤纸腔室，所述滤纸腔室用于核酸恒温扩增及荧光检测。

进一步地：

所述清洗液注入部包括预埋清洗液腔室，所述预埋清洗液腔室通过设置有软阀的流道与所述滤纸腔室相连，所述预埋清洗液腔室在外力驱动下释放预埋的清洗液，冲破所述软阀以对所述滤纸腔室内的所述滤纸进行杂质清洗。

所述反应液注入部包括预埋酶腔室和预埋引物腔室，所述预埋酶腔室和预埋引物腔室各自具有反应液入口，所述预埋酶腔室和所述预埋引物腔室的出口均连接所述混合流道，在外力驱动下流入所述预埋酶腔室和所述预埋引物腔室的反应液分别与预埋的引物和酶混合，再通过所述混合流道进行混合之后流至所述滤纸腔室，优选地，所述预埋酶腔室和所述预埋引物腔室对称设置。

所述反应液注入部还包括预埋反应液腔室，所述预埋反应液腔室通过设置有软阀的两个流道分别连接所述预埋酶腔室和所述预埋引物腔室，所述预埋反应液腔室在外力驱动下释放预埋的反应液，冲破软阀并流入所述预埋酶腔室和所述预埋引物腔室。

所述滤纸通过胶粘或者机械卡槽的方式固定在所述滤纸腔室中，通过控制所述滤纸的直径来控制核酸吸附量。

所述基底层上设置有并列的多个所述滤纸腔室。

所述废液接收部包括废液出口或废液池，所述废液池连接所述盖板层上设置的废液通气孔。

所述基底层和所述盖板层的材料为聚氯乙烯(PVC)，聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)或ABS。

一种实时荧光核酸扩增检测方法，使用所述的微流控芯片来进行实时荧光核酸扩增检测，所述方法包括如下步骤：

(1)从所述进样口注入待测样品到所述滤纸腔室，废液流向所述废液接收部；

(2)从所述清洗液注入部注入清洗液到所述滤纸腔室，废液流向所述废液接收部；

(3)从反应液注入部注入混合有引物和酶的反应液到所述滤纸腔室，流向滤纸，由所述滤纸吸附核酸，实现核酸纯化浓缩；

(4)控制所述滤纸腔室的温度为37℃，在显微镜下观测反应物的荧光强度，并定量分析核酸浓度。

进一步地，所述滤纸腔室通过接触外部的恒温控制板来维持37℃的反应条件。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明于一个微流控芯片上实现核酸纯化浓缩与实时荧光恒温扩增检测的设计，能够极大地简化繁琐的人为操作，缩短检测时间。通过设置滤纸腔室，利用滤纸对核酸进行提取浓缩，还简化了以往使用磁珠提取核酸的成本，同时，本发明也发挥出微流控芯片技术本身的优势(低成本、高通量、自动化等)，满足临床中快速诊断的需要。在优选的方案中，本发明中使用预埋技术将酶和引物分别预埋平行的两个腔室中，有效解决反应液分别与引物、酶的充分混合问题。

利用本发明的微流控芯片，可方便快捷进行核酸的自动化纯化浓缩，可以实现自动化加样和反应，在此基础上实现操作快速简便、控制灵活的核酸恒温扩增实时荧光检测。本微流控芯片结构简单，控制方便，芯片可批量化、低成本加工。在芯片上检测核酸的过程中，可以准确控制试剂用量，降低试剂消耗，同时可以检测多项指标，保证检测结果的可靠、稳定以及可快速获得。本发明实现核酸提取纯化浓缩、扩增及检测的一体化，可广泛适用于核酸分子的快速检测，相对于现有技术更加方便快捷，成本更低。

附图说明

图1为本发明一种实施例的用于实时荧光核酸扩增检测的微流控芯片的结构示意图；

图2为图1中所示的基底层的结构示意图；

具体实施方式

以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者间接在该另一个元件上。当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至该另一个元件上。另外，连接既可以是用于固定作用也可以是用于电路/信号连通作用。

需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明实施例和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

图1为本发明一种实施例的用于实时荧光核酸扩增检测的微流控芯片的结构示意图。图2为图1中所示的基底层1的结构示意图。参阅图1和图2，本发明实施例提供一种用于实时荧光核酸扩增检测的微流控芯片，包括基底层1和盖板层2，所述基底层1与所述盖板层2层叠压合，所述盖板层2设置有入液口，所述基底层1设置有废液接收部、滤纸腔室5、进样口6、混合流道7、清洗液注入部以及反应液注入部，所述进样口6连接所述入液口，所述滤纸腔室5即恒温扩增腔室，其具有透明区域以便检测，所述滤纸腔室5内设置有用于吸附核酸以进行核酸纯化浓缩的滤纸，所述滤纸腔室5与所述进样口6、所述废液接收部和所述清洗液注入部相连，并通过所述混合流道7连接所述反应液注入部，待测样品通过所述进样口6进入所述滤纸腔室5，所述清洗液注入部用于向所述滤纸腔室5注入清洗液，清洗后的废液流向所述废液接收部，所述反应液注入部用于提供含有引物和酶的反应液，经过所述混合流道7后流入所述滤纸腔室5，在所述滤纸腔室5进行核酸恒温扩增及荧光检测。

利用本发明实施例的微流控芯片，可方便快捷进行核酸的自动化纯化浓缩，可以实现自动化加样、反应，在此基础上实现操作快速简便、控制灵活的核酸恒温扩增实时荧光检测。本微流控芯片结构简单，控制方便，芯片可批量化、低成本加工。在芯片上检测核酸的过程中，可以准确控制试剂用量，降低试剂消耗，同时可以检测多项指标，保证检测结果的可靠、稳定以及可快速获得。

参阅图1和图2，在优选的实施例中，所述清洗液注入部包括预埋清洗液腔室12，所述预埋清洗液腔室12通过设置有软阀13的流道与所述滤纸腔室5相连，所述预埋清洗液腔室12在外力驱动下释放预埋的清洗液，冲破所述软阀13以对所述滤纸腔室5内的所述滤纸进行杂质清洗，废液流入所述废液接收部，例如废液池4。

参阅图1和图2，在优选的实施例中，所述反应液注入部包括预埋酶腔室8和预埋引物腔室11，所述预埋酶腔室8和预埋引物腔室11各自具有反应液入口，所述预埋酶腔室8和所述预埋引物腔室11的出口均连接所述混合流道7，在外力驱动下流入所述预埋酶腔室8和所述预埋引物腔室11的反应液分别与预埋的引物和酶混合，再通过所述混合流道7进行混合之后流至所述滤纸腔室5。优选地，所述预埋酶腔室8和所述预埋引物腔室11对称设置。

上述实施例中，使用预埋技术将酶和引物分别预埋在的两个腔室中，有利于反应液与引物、酶的充分混合。

参阅图1和图2，在优选的实施例中，所述反应液注入部还包括预埋反应液腔室14，所述预埋反应液腔室14通过设置有软阀9、10的两个流道分别连接所述预埋酶腔室8和所述预埋引物腔室11，所述预埋反应液腔室14在外力驱动下释放预埋的反应液，冲破软阀9、10并流入所述预埋酶腔室8和所述预埋引物腔室11。

在一些实施例中，所述滤纸腔室5中的所述滤纸可以通过胶粘或者机械卡槽的方式固定在所述滤纸腔室5中，可以通过控制所述滤纸的直径来控制核酸吸附量。

在一些实施例中，所述基底层1上可设置并列的多个所述滤纸腔室5，可同时进行多种检测。

在一些实施例中，所述废液接收部可以包括废液出口或是废液池4，所述废液池4连接所述盖板层上设置的废液通气孔。废液通气孔使废液池4与大气相连，更好地驱动废液流入废液池。

在一些实施例中，所述基底层1和所述盖板层2的材料可以为聚氯乙烯(PVC)，聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)或ABS等，但不限于此。

本发明实施例还提出一种实时荧光核酸扩增检测方法，使用所述的微流控芯片来进行实时荧光核酸扩增检测，参阅图1和图2。所述检测方法基于实时荧光核酸扩增检测技术，包括如下步骤：

(1)从所述进样口6注入待测样品到所述滤纸腔室5，废液流向所述废液接收部；

(2)从所述清洗液注入部注入清洗液到所述滤纸腔室5，废液流向所述废液接收部；

(3)从反应液注入部注入混合有引物和酶的反应液到所述滤纸腔室5，流向滤纸，由所述滤纸吸附核酸，实现核酸纯化浓缩；

(4)控制所述滤纸腔室5的温度为37℃，在显微镜下观测反应物的荧光强度，并定量分析核酸浓度。

在优选的实施例中，所述滤纸腔室5通过接触外部的恒温控制板来维持37℃的反应条件。

以下结合附图进一步描述本发明的具体实施例。

具体实施例的微流控芯片利用滤纸吸附进行核酸纯化浓缩以及实时荧光核酸扩增检测。基于该微流控芯片的实时荧光核酸扩增检测方案包括核酸纯化浓缩单元、反应物混合单元和核酸恒温扩增检测单元；核酸纯化浓缩单元中利用滤纸吸附核酸，进行核酸纯化浓缩；反应物混合单元进行必要反应物的供应和混合，芯片可通过外力驱动注入反应物，并使得微流体在各个腔室中流动；核酸恒温扩增检测单元涉及恒温控制下进行核酸扩增以及荧光检测。

该微流控芯片具体包含基底层1及盖板层2，基底层1和盖板层2的材料不限于采用聚氯乙烯(PVC)，聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、ABS等常见的医用塑料，可采用模压热塑成型、注塑成型等多种塑料成型方式成型。基底层1和盖板层2采用压合工艺封装。

该微流控芯片的核酸纯化浓缩单元包含一个进样口6、一个滤纸腔室5(纯化浓缩腔室)、一个清洗液池、一个废液池4以及与反应物混合单元相连通的流道；进样口6可通过外界的驱动系统将样本注入芯片，流体流经滤纸核酸被吸附，其余废液流入废液池4。核酸纯化浓缩单元入口及废液池4通气孔分布在盖板层2，流体流道均分布在底层流道板；清洗液池预埋清洗液，释放清洗液需外界施加压力，使得清洗液冲破软阀，流至滤纸处，进行杂质清洗，废液流入废液池4。

滤纸腔室5中含有可吸附核酸的滤纸；该滤纸可通过胶粘或者机械卡槽的方式固定在腔室中，通过控制滤纸的直径来控制吸附核酸量。

反应物混合单元包含多个规则分布的、敞口的预混腔室和混合流道7，混合流道7直接与核酸恒温扩增检测单元相连通；在滤纸上缠绕有纯化后的核酸，反应液从其所在的腔室中流出，在之后流道中混入预埋的酶及引物，充分混合后流经滤纸，进行核酸扩增及检测。

反应液混合单元包括两个对称的腔室；两腔室中分别预埋引物、酶，反应液在外力的驱动下等量流入两个腔室，分别与引物、酶混合，再通过弯曲汇合通道进行混合，最终流至滤纸腔室5。

核酸恒温扩增检测单元可包含多个滤纸腔室5及若干流道，分布于基底层1；滤纸腔室5的温度通过接触外部的恒温控制板来维持37℃的反应条件。通过将芯片置于荧光检测平台中，可实时检测荧光强度的变化来反映循环扩增情况。在盖板层2开有敞口。

一个实施例的核酸检测方法包括如下具体步骤：

(1)使用注射枪从核酸纯化浓缩单元的进样口6灌注待测样品到纯化浓缩腔室，废液流向废液池4；

(2)将清洗液腔室12中的清洗液释放，废液流向废液池4；

(3)释放混有Mg+的反应液，混合引物和酶，流向滤纸，进行核酸扩增及检测；

(4)控制核酸恒温扩增检测单元的温度为37℃，在显微镜下观测反应物的荧光强度，并定量分析核酸浓度。

如图1所示为一个具体实施例提供的集成核酸纯化浓缩和实时荧光核酸恒温扩增的核酸检测芯片的结构示意图，芯片包括基底层1、盖板层2。如图2所示，基底层1包含废液池通气孔3、废液池4、滤纸腔室5、进样口6、混合流道7、预埋酶腔室8、预埋酶腔室软阀9、预埋引物腔室软阀10、预埋引物腔室11、预埋清洗液腔室12、预埋清洗液腔室软阀13及预埋反应液腔室14。

基底层、盖板层的材料采用常见的医用塑料，比如聚氯乙烯(PVC)，聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯PC、ABS，采用模压热塑成型、注塑成型等多种塑料成型方式；比如采用注塑成型的方法，预先加工出模具，然后将聚丙烯(PP)材料在恒温料筒220-280℃中融化，然后加压800-140MPa将融化后的PP材料注入模具，之后保压、冷却成型。在芯片组装前，在滤纸腔室中将滤纸粘贴至腔室5中，预埋清洗液在腔室12中，预埋反应液在腔室14中。核酸检测步骤具体包括：

(1)使用注射枪以200μL/min的速度从核酸纯化浓缩单元的进样口(6)灌注待测样品20μL到纸基腔室5；

(2)挤压腔室12，清洗液流经纸基之后，流至废液池4；

(3)挤压腔室14，反应液流经纸基之后，流至废液池4；

(4)控制所述核酸恒温扩增检测单元的温度为37℃，在显微镜下观测反应物的荧光强度，并定量分析核酸浓度。

芯片可通过外力驱动进行流体的注入，并使得流体在各个腔室中流动。

本发明可以实现核酸提取纯化浓缩、扩增及检测的一体化，可广泛适用于核酸分子的检测，方便快捷。

本发明的背景部分可以包含关于本发明的问题或环境的背景信息，而不一定是描述现有技术。因此，在背景技术部分中包含的内容并不是申请人对现有技术的承认。

以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。在本说明书的描述中，参考术语“一种实施例”、“一些实施例”、“优选实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管已经详细描述了本发明的实施例及其优点，但应当理解，在不脱离专利申请的保护范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。

Claims (10)

1.一种用于实时荧光核酸扩增检测的微流控芯片，其特征在于，包括基底层和盖板层，所述基底层与所述盖板层层叠压合，所述盖板层设置有入液口，所述基底层设置有废液接收部、滤纸腔室、进样口、混合流道、清洗液注入部以及反应液注入部，所述进样口连接所述入液口，所述滤纸腔室具有透明区域，所述滤纸腔室内设置有用于吸附核酸以进行核酸纯化浓缩的滤纸，所述滤纸腔室与所述进样口、所述废液接收部和所述清洗液注入部相连，并通过所述混合流道连接所述反应液注入部，待测样品通过所述进样口进入所述滤纸腔室，所述清洗液注入部用于向所述滤纸腔室注入清洗液，清洗后的废液流向所述废液接收部，所述反应液注入部用于提供含有引物和酶的反应液，经过所述混合流道后流入所述滤纸腔室，所述滤纸腔室用于核酸恒温扩增及荧光检测。

2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述清洗液注入部包括预埋清洗液腔室，所述预埋清洗液腔室通过设置有软阀的流道与所述滤纸腔室相连，所述预埋清洗液腔室在外力驱动下释放预埋的清洗液，冲破所述软阀以对所述滤纸腔室内的所述滤纸进行杂质清洗。

3.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述反应液注入部包括预埋酶腔室和预埋引物腔室，所述预埋酶腔室和预埋引物腔室各自具有反应液入口，所述预埋酶腔室和所述预埋引物腔室的出口均连接所述混合流道，在外力驱动下流入所述预埋酶腔室和所述预埋引物腔室的反应液分别与预埋的引物和酶混合，再通过所述混合流道进行混合之后流至所述滤纸腔室，优选地，所述预埋酶腔室和所述预埋引物腔室对称设置。

4.如权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述反应液注入部还包括预埋反应液腔室，所述预埋反应液腔室通过设置有软阀的两个流道分别连接所述预埋酶腔室和所述预埋引物腔室，所述预埋反应液腔室在外力驱动下释放预埋的反应液，冲破软阀并流入所述预埋酶腔室和所述预埋引物腔室。

5.如权利要求1至4任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述滤纸通过胶粘或者机械卡槽的方式固定在所述滤纸腔室中，通过控制所述滤纸的直径来控制核酸吸附量。

6.如权利要求1至5任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底层上设置有多个并列的所述滤纸腔室。

7.如权利要求1至6任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述废液接收部包括废液出口或废液池，所述废液池连接所述盖板层上设置的废液通气孔。

8.如权利要求1至7任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底层和所述盖板层的材料为聚氯乙烯(PVC)，聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)或ABS。

9.一种实时荧光核酸扩增检测方法，其特征在于，使用如权利要求1至7任一项所述的微流控芯片来进行实时荧光核酸扩增检测，所述方法包括如下步骤：

(1)从所述进样口注入待测样品到所述滤纸腔室，废液流向所述废液接收部；

(2)从所述清洗液注入部注入清洗液到所述滤纸腔室，废液流向所述废液接收部；

(3)从反应液注入部注入混合有引物和酶的反应液到所述滤纸腔室，流向滤纸，由所述滤纸吸附核酸，实现核酸纯化浓缩；

(4)控制所述滤纸腔室的温度为37℃，在显微镜下观测反应物的荧光强度，并定量分析核酸浓度。

10.如权利要求9所述的实时荧光核酸扩增检测方法，其特征在于，所述滤纸腔室通过接触外部的恒温控制板来维持37℃的反应条件。

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