CN111077305B - 基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置 - Google Patents
基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是关于一种基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，它包括免疫侧向流道和孔径小于1.2um的微孔膜，免疫侧向流道的末端设置溶液流出口，所述溶液流出口处贴合有所述微孔膜；免疫侧向流道中设置了至少一种标记试剂，微孔膜上包被了捕获试剂。本发明还公开了一种微孔膜渗滤检测装置，免疫侧向流道和孔径基本均匀且孔径大于20nm的微孔膜，所述免疫侧向流道的末端设置溶液流出口，所述溶液流出口处贴合有所述的微孔膜，所述微孔膜为亲水性的微孔膜；免疫侧向流道中设置了包被微球、固定于微球表面的捕获试剂、以及标记试剂。捕获试剂及标记试剂中分别设置有互为直接或间接配位体关系的物质。
Description
技术领域
本发明属于生物医学诊断领域的免疫侧向流动检测技术，具体的说，是关于一种基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置。
背景技术
免疫侧向层析技术是20世纪末发展起来的结合免疫技术和色谱层析技术的一种生物分析方法，该方法具有特异性、操作简单、快速等特点，广泛应用于临床诊断、环境监测、食品安全等重要领域。传统免疫层析技术以胶体金为标记物，通过条带显色对目标物定性检测或半定量分析。荧光免疫层析技术作为一项新型免疫检测技术，既有传统胶体金试纸条的现场快速检测优点，又发展了荧光技术的高灵敏度特点。
免疫层析技术是基于抗原抗体特异反应的。该技术以亲水多孔膜固定有检测线(包被抗体或包被抗原，也记作T线)和质控线(抗抗体，也记作C线)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再被包被抗体动态捕获结合形成双抗夹心的“三明治”反应复合物。
斑点金免疫渗滤法试验是在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等被滤出膜片。其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。相比较免疫侧向层析中5-20um孔径的硝酸纤维素膜，渗滤法中的膜孔径一般是0.45um，因此穿越膜的溶液流动速度慢不少，因此亲和力较弱的免疫反应能在渗滤法实验中得到合适的结果。但斑点金免疫渗滤实验中需要多个溶液的添加操作，如果能设法改造成一步加样操作简便的方案就更好了。
免疫侧向层析在固相膜上展开长度一般超过2cm，T线宽度不超过1mm，液体前行1mm的时间仅仅3秒左右，待测蛋白在3秒内要被动态捕获蛋白捕获结合。因此包被蛋白的免疫亲和力要求很高，很多蛋白在静态捕获的酶联免疫吸附试验(ELISA)中表现不错，但在免疫侧向层析的应用中却不能采用。因此很多项目中，将标记抗体预先与样品溶液进行混合反应，或增加包被试剂与标记试剂混合层析的距离以便更充分的进行结合反应，这都能提高检测灵敏度，但却增加了额外的操作步骤。如果能在免疫层析的方法中摒弃蛋白动态捕获却采用偏向静态孵育的混合孵育方式进行免疫结合捕获，将会有更好的应用效果。
国内专利文献CN201310228708.8公开了一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置及其检测方法：将标记蛋白的包被微球放入深孔滤板，与标记试剂进行静态的混合孵育反应，随后通过离心力作用将样品溶液及洗涤溶液从滤板的滤膜流尽，标记试剂等小分子或小粒径的物质随溶液流出了深孔滤板，包被微球则在穿越底部滤膜时被部分截留，随后通过光学对膜表面进行检测得到相关检测信号的实验。这个方法的意义在于免疫反应试剂在均相环境中进行了静态孵育，更加降低了对免疫抗体抗原的亲和力要求；同时孵育反应后溶液中承载着反应复合物的包被微球被集聚到滤膜中，起到了良好的反应物质浓缩作用。但是，该专利文献中的包被微球的粒径与滤膜的孔径的关系没有明确界定，微球将渗入滤膜一定深度，这将导致部分微球会穿越滤膜，从而导致检测结果不准确。同时，也将导致滤膜不同深度的微球反射的光谱信号的差异。
专利内容
本发明的目的是提供一种基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，以实现将免疫层析试纸的免疫反应复合物通过免疫侧向流道中设置的微孔膜捕获截留或微球捕获截留，能在一步免疫层析的基础上对免疫反应复合物的信号通过微孔膜的方式捕获，从而达到更高检测灵敏度的结果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，包括免疫侧向流道和孔径小于1.2um的微孔膜，免疫侧向流道的溶液直接流入其末端设置的溶液流出口，所述溶液流出口处贴合有所述微孔膜。
根据本发明，免疫侧向流道中设置了至少一种标记试剂，微孔膜上包被了捕获试剂；捕获试剂及标记试剂中分别设置有互为直接或间接配位体关系的物质。
根据本发明，免疫侧向流道包括能定向传递水溶液的亲水多孔膜,所述亲水多孔膜选自硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、化学纤维膜及滤纸中的一种或多种；
免疫侧向流道还包括由两片亲水膜的亲水表面夹持所述亲水多孔膜所构建的空隙通道，溶液从空隙通道的一端流向另一端。
根据本发明，所述两片亲水膜的上亲水膜是透明的，它与微孔膜之间构建的空隙通道将溶液导引流入微孔膜。
根据本发明，所述标记试剂包括肉眼直接可见的颜色微粒或荧光物质；所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、其他带颜色信号的纳米颗粒等中的一种或几种；所述荧光物质选自荧光分子及其微球、量子点微粒及其微球、上转换发光微粒及其微球、时间分辨荧光分子及其微球、荧光蛋白等中的一种或几种。
根据本发明，所述的基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置还包括能对所述经过免疫侧向流动后集聚在微孔膜的反应复合物进行特定波长的光线照射被激发后接收反射出的至少一个波长光谱信号的检测设备。
作为本发明的第二个方面，一种基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，包括免疫侧向流道和孔径基本均匀且孔径范围在0.02-1.2um的微孔膜，所述免疫侧向流道的溶液流向其末端设置的溶液流出口，所述溶液流出口处贴合有所述的微孔膜，所述微孔膜为亲水性的，溶液可以穿越渗滤。
根据本发明，免疫侧向流道中设置了至少一种直径基本均匀且大于微孔膜孔径的包被微球、固定于微球表面的捕获试剂、以及直径小于微孔膜孔径的标记试剂；捕获试剂及标记试剂中分别设置有互为直接或间接配位体关系的物质。
根据本发明，免疫侧向流道包括能定向传递水溶液的亲水多孔膜,所述亲水多孔膜选自硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、化学纤维膜及滤纸中的一种或多种；
免疫侧向流道还包括由两片亲水膜的亲水表面夹持所述亲水多孔膜所构建的空隙通道，溶液从空隙通道的一端流向另一端。
根据本发明，两片亲水膜设置于所述免疫侧向流道末端，两片亲水膜的亲水表面夹持亲水多孔膜的上下表面，两片亲水膜中底部的亲水膜的下表面贴合有所述微孔膜，贴合在微孔膜上表面的亲水膜的中部设置有缺口作为溶液流出口；
或者，两片亲水膜的亲水表面夹持亲水多孔膜的左右两侧，两片亲水膜夹持形成的空隙通道底面的的中部设置有缺口作为溶液流出口。
根据本发明，所述亲水膜上设置的缺口形状中至少包括最大间隙不超过1.5mm的空隙形状或角度不超过95度的夹角。
根据本发明，微孔膜的下表面贴合有吸水材料，流入亲水膜缺口的溶液穿越微孔膜后被吸水材料吸收传递。
根据本发明，所述标记试剂包括肉眼直接可见的颜色微粒或荧光物质；所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、其他带颜色信号的纳米颗粒等中的一种或几种；所述荧光物质选自荧光分子及其微球、量子点微粒及其微球、上转换发光微粒及其微球、时间分辨荧光分子及其微球、荧光蛋白等中的一种或几种。
进一步的，基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置还包括能对所述经过免疫侧向流动后截留集聚在微孔膜的反应复合物进行特定波长的光线照射被激发后接收反射出的至少一个波长光谱信号的检测设备。
根据本发明，当包被微球及其与标记试剂的反应复合物形成的微球在微孔膜表面形成堆积时,游离的标记试剂能从堆积的微球之间的孔隙被溶液携带穿越后从微孔膜的微孔中再次穿越流出，不会形成阻截残留。
本发明的基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，其有意效果是：实现了将免疫层析试纸的微球反应复合物通过侧流流道中设置的微孔膜进行捕获或微球捕获截留集聚，能在一步免疫层析的基础上对免疫反应复合物的信号进行捕获截留，从而达到更高检测灵敏度的结果。具体如下：
1、提高了反应的灵敏度：当采用微孔膜作为包被载体时，孔径范围小于1.2um的微孔膜溶液流动速度会慢下来，因此减少了动态反应对抗体等配位体的亲和力的依赖，同时更小孔径的微孔膜如硝酸纤维素膜的蛋白结合量会提高，增加的蛋白密度也有利于微孔膜上包被蛋白的捕获能力；当采用微球作为包被载体时，它从根本上改变了免疫反应复合物的动态捕获模式，减少了免疫反应中对配位体亲和力的依赖,由包被试剂与标记试剂跟随待测样品在溶液流动中进行充分混合并自由反应，反应不再由微孔膜的包被蛋白对动态层析的配位体进行捕获，而是通过微孔膜截留集聚反应复合物，提高了反应的灵敏度；
2、被微孔膜截留的反应复合物集聚在相同位置，提供了进行单点多重免疫荧光检测的机会。
附图说明
图1为本发明的基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置的结构示意图。
图2为待测样品、固定有捕获试剂的微球与标记试剂结合的示意图。
图3为待测样品、固定有捕获试剂的微球与标记试剂结合的另一示意图。
图4为基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置的另一结构示意图。
图5为基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置的局部俯视图示意图。
图6为另一种微孔膜渗滤检测装置的两亲水膜的结构示意图。
图7为本发明的溶液流出口的结构示意图。
图8为本发明的溶液流出口的另一结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，本发明结合示意图进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，表示器件结构的剖面图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是示例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间尺寸。
同时在本发明的描述中，需要说明的是，术语中的“上、下、内和外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
如图1所示，为本发明的一种基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，它包括免疫侧向流道和孔径小于1.2um的微孔膜3，免疫侧向流道的溶液直接流入其末端设置的溶液流出口9，所述溶液流出口9处贴合有所述微孔膜3供溶液穿越渗滤,或侧向流动到达微孔膜的溶液将改变方向穿越微孔膜向下流动；免疫侧向流道中设置了至少一种标记试剂，微孔膜3上包被了捕获试剂；捕获试剂及标记试剂中分别设置有互为直接或间接配位体关系的物质。
在竞争免疫反应中，捕获试剂可以是包被在微孔膜上的竞争抗原如偶联了载体蛋白的小分子抗原，标记试剂则是标记了荧光或其他光谱信号的待测物质的抗体；当溶液中的游离抗原在溶液中与全部标记试剂反应后，则捕获试剂将不再有免疫反应复物；当溶液中的游离抗原在溶液中与部分标记试剂反应后，微孔膜上的捕获试剂将产生部分的免疫反应复合物，因此将有一部分免疫反应复合物被捕获在微孔膜上。
在免疫夹心法反应中，捕获试剂可以是包被在微孔膜上的抗体A，标记试剂则是标记了荧光或其他光谱信号的的抗体B；当溶液中的抗原在侧向流动的溶液混合流动时,它先与同时溶解在溶液中的标记试剂及抗体B反应,溶液在微孔膜上渗滤流动时,再被微孔膜上的抗体A捕获而截留在微孔膜上。免疫侧向流道包括能定向传递水溶液的亲水多孔膜1,所述亲水多孔膜选自硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、化学纤维膜及滤纸中的一种或多种。
免疫侧向流道还包括由上、下两片亲水膜4的亲水表面夹持所述亲水多孔膜1所构建的空隙通道，通过亲水膜表面的溶液表面张力作为液体流动的动力，溶液从空隙通道的一端流向另一端。
两片亲水膜4的上亲水膜是透明的，它与微孔膜3之间构建的空隙通道将溶液导引流入微孔膜3。
微孔膜3的下表面贴合有吸水材料2，如滤纸，从缺口流入亲水膜4的溶液穿越微孔膜3后被滤纸等吸水材料2吸收传递。
所述标记试剂包括肉眼直接可见的颜色微粒或荧光物质；所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、其他带颜色信号的纳米颗粒等中的一种或几种；所述荧光物质选自荧光分子及其微球、量子点微粒及其微球、上转换发光微粒及其微球、时间分辨荧光分子及其微球、荧光蛋白等中的一种或几种。
基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，还包括能对所述经过免疫侧向流动后被捕获集聚在微孔膜3表面的免疫反应复合物进行特定波长的光线照射被激发后接收反射出的至少一个波长光谱信号的检测设备。当被集聚在微孔膜3表面的免疫反应复合物受到特定波长的光线照射，反应复合物中的至少一种荧光标记物质被激发后发射出不同波长的荧光信号被荧光光谱仪接收后通过微型处理器解析出对应波峰的荧光来检测不同的微球反应复合物，计算得到不同待检测物的浓度。
如图1所示，亲水多孔膜1的首端还设置有孔径小于微孔膜3的孔径的前处理微孔膜8；样品溶液从样品吸收垫6流经前处理微孔膜8后再流向亲水多孔膜1；固定了标记试剂的亲水多孔膜设置在前处理微孔膜8的后端，由前处理微孔膜8的溶液溶解后流经亲水多孔膜。
如图4和图5所示，为本发明的另一种基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，它包括免疫侧向流道和孔径基本均匀且孔径范围在0.02-1.2um的微孔膜3所述微孔膜3为亲水性，它供溶液穿越渗滤，或侧向流动到达微孔膜的溶液将改变方向穿越微孔膜向下流动；所述免疫侧向流道的溶液流向其末端设置的溶液流出口9，所述溶液流出口9处贴合有所述的微孔膜3；免疫侧向流道中设置了至少一种直径基本均匀且大于微孔膜3孔径的包被微球、固定于微球表面的捕获试剂、以及直径小于微孔膜孔径的标记试剂；捕获试剂及标记试剂中分别设置有互为直接或间接配位体关系的物质。捕获试剂、标记试剂、待测样品在溶液侧向流动中发生结合反应，在微球表面形成反应复合物。
标记试剂可以悬浮在溶液中被加入侧向流道中；标记试剂也可以包被固化在流道中的多孔膜上或包被固化在侧向流道的某个表面，随后被溶液溶解后跟随溶液向前流动。包被微球可以悬浮在溶液中被加入侧向流道中；包被微球也可以包被固化在流道中的多孔膜上或包被固化在侧向流道的某个表面，随后被溶液溶解后跟随溶液向前流动。
在竞争免疫反应中，捕获试剂可以是包被在微球上的竞争抗原如偶联了载体蛋白的小分子抗原，标记试剂则是标记了荧光或其他光谱信号的待测物质的抗体；当溶液中的游离抗原在溶液中与全部标记试剂反应后，则捕获试剂将不再有免疫反应复物，因此被截留在微孔膜表面的将是游离的包被微球；当溶液中的游离抗原在溶液中与部分标记试剂反应后，捕获试剂将产生部分的免疫反应复合物，因此被截留在微孔膜表面的将是游离的包被微球及部分带有免疫反应复合物的微球。
将克伦特罗竞争抗原蛋白包被在直径大于800nm的PS微球上，把它固化在样品垫上；将克伦特罗单抗标记了直径小于300nm的荧光粒子，把它固化在试剂结合垫中；当将样品溶液添加在样品垫上时，样品溶液先与包被了克伦特罗竞争抗原蛋白的包被微球混合反应，然后溶液侧向流动穿越孔径均匀且为450nm的样品前处理膜，逐步将试剂结合垫上的标记了克伦特罗单抗的荧光粒子溶解并混合流向前方，经过一定长度层析膜的混合反应，溶液中的游离克伦特罗在溶液中如果与全部标记试剂反应后，则包被微球的捕获试剂将不再有免疫反应复物，因此被截留在微孔膜表面的将是游离的PS微球；当溶液中的游离克伦特罗在溶液中与部分标记试剂反应后，捕获试剂将产生部分的免疫反应复合物，因此被截留在微孔膜表面的将是游离的包被微球及部分带有克伦特罗免疫反应复合物的PS微球。
在免疫夹心法反应中，捕获试剂可以是包被在PS微球上的抗体A，标记试剂则是标记了荧光或其他光谱信号的的抗体B；当溶液中的抗原在溶液中同时被抗体A及抗体B捕获后，截留在微孔膜表面的将是游离的PS微球及带有免疫反应复合物的PS微球。将HCG单抗A包被在直径大于800nm的PS微球上，把它固化在样品垫上；将HCG单抗B标记了直径小于300nm的荧光粒子，把它固化在试剂结合垫中；当将样品溶液添加在样品垫上时，样品溶液先将包被了HCG单抗A的PS微球溶解混合，然后溶液侧向流动穿越孔径均匀且为450nm的样品前处理膜，逐步将试剂结合垫上的标记了HCG单抗B的荧光粒子溶解并混合流向前方，经过层析膜的混合反应，当溶液中的HCG蛋白在溶液中同时被抗体A及抗体B捕获形成免疫反应复合物后，截留在微孔膜表面的将是游离的包被微球及带有免疫反应复合物的微球。
如图1、图4和图5所示，免疫侧向流道包括能定向传递水溶液的亲水多孔膜1,所述亲水多孔膜1选自硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、化学纤维膜及滤纸中的一种或多种；免疫侧向流道还包括由上下两片亲水膜4的亲水表面夹持所述亲水多孔膜所构建的空隙通道，通过亲水膜4亲水表面产生的溶液表面张力作为液体流动的动力，溶液从空隙通道的一端流向另一端。样品吸收垫玻璃纤维膜可以作为(待测)样品吸收垫和(标记物、标准品、连接了捕获试剂的微球等的)试剂结合垫，化学纤维膜作为亲水膜起导引水道的作用，滤纸可作为吸水材料。
所述免疫侧向流道中贴合在微孔膜3上的亲水膜4的下表面涂布有胶水或不干胶，溶液中的微球不会从亲水膜与微孔膜的贴合间隙中流走，只能从作为溶液流出口9的亲水膜缺口处贴合的的微孔膜3流出。如图7所示，这个缺口可以是多边形、圆形或长方形，所述缺口中至少有一个最大间隙不超过1.5mm的空隙形状91(如图7和图8所示)或角度不超过95度的夹角，这样更有利于流动到缺口边缘的溶液沿侧边流入缺口，接触到贴合在亲水膜侧边底部的具有良好亲水性的微孔膜；当缺口成为长方形时，其宽度可设置为0.2-2.5mm，它两个侧边上表面的溶液由于表面张力缘故，将拉动溶液从侧边向前跨越空隙，此时在重力的作用下，跨越了侧边的溶液将下沉接触到底部的亲水多孔膜，随后在亲水多孔膜的亲水拉动力作用下，液体将进入缺口穿越微孔膜3。
使用时，亲水膜4的亲水表面能传递溶液达缺口边缘，但亲水膜4的缺口侧边很难处理达到同样的表面亲水性，因此溶液不容易沿侧边流入缺口，接触到的贴合在亲水膜侧边底部的具有良好亲水性的微孔膜。当缺口的空隙或角度造成的临界条件达到后，即设置最大间隙不超过1.5mm的空隙形状或角度不超过95度的夹角，其靠近的两个侧边上表面的溶液由于表面张力缘故，将拉动溶液从侧边向前跨越空隙，此时在重力的作用下，跨越了侧边的溶液将下沉接触到底部的亲水微孔膜，随后在微孔膜的亲水拉动力作用下，液体将进入缺口穿越微孔膜3。当由两层亲水膜夹持形成侧向流道时，至少在设置了缺口的亲水膜对面的亲水膜是透明的，能对其对面亲水膜缺口处的微孔膜表面进行荧光或其他光谱检测。
如图1或4所示，免疫侧向流道末端设置有两片亲水膜，两片亲水膜的亲水表面夹持亲水多孔膜的上下表面，两片亲水膜中底部的亲水膜的下表面贴合有所述微孔膜，贴合在微孔膜上表面的亲水膜的中部设置有缺口作为溶液流出口9。如图6所示，两片亲水膜的亲水表面还可夹持亲水多孔膜的左右两侧，两片亲水膜夹持形成的空隙通道底面的中部设置有缺口作为溶液流出口9。为了构建空隙通道，两片亲水膜可以夹持亲水多孔膜1，形成一个空隙通道，在通道末端可以贴合一个双面胶或设置其他封堵材质，将两片亲水膜间隙高度固定并封堵，使空隙通道的溶液不再外流。
微孔膜3的下表面贴合有吸水材料2，如滤纸等，从缺口流入亲水膜4的溶液穿越微孔膜3后被滤纸等吸水材料2吸收传递。市场还有直接在滤纸表面成型的微孔膜，就可以直接采用该商品化产品，将表面带胶水的亲水膜贴合在微孔膜表面，更加能保证吸水效果。
如图4所示，亲水多孔膜1的的首端还设置有孔径小于微孔膜的孔径的前处理微孔膜8；样品溶液从样品吸收垫6流经前处理微孔膜8后再流向亲水多孔膜；固定了捕获试剂的包被微球设置在前处理微孔膜8的后端，由前处理微孔膜8的溶液溶解后流经亲水多孔膜。
所述标记试剂包括肉眼直接可见的颜色微粒或荧光物质；所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、其他带颜色信号的纳米颗粒中的一种或几种；所述荧光物质选自荧光分子及其微球、量子点微粒及其微球、上转换发光微粒及其微球、时间分辨荧光分子及其微球、荧光蛋白中的一种或几种。
基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，还包括能对所述经过免疫侧向流动后截留集聚在微孔膜的反应复合物进行特定波长的光线照射被激发后接收反射出的至少一个波长光谱信号的检测设备。当集聚在微孔膜表面的反应复合物受到特定波长的光线照射，反应复合物中的至少两种荧光标记物质被激发后发射出不同波长的荧光信号被荧光光谱仪接收后通过微型处理器解析出对应波峰的荧光来检测不同的微球反应复合物，计算得到不同待检测物的浓度。
当包被微球及其与标记试剂的反应复合物形成的微球在微孔膜表面形成堆积时,游离的标记试剂能从堆积的微球之间的孔隙被溶液携带穿越后从滤膜的微孔中再次穿越流出，不会形成阻截残留。
如图4所示，为本发明的一种基于免疫侧向流动的微孔膜截留微球检测装置。在涂布有不干胶的PVC底板上粘贴硝酸纤维素膜(即多孔亲水膜1)，依次在其前端下缘粘贴试剂结合垫7、前处理微孔膜8和样品吸收垫6，其中样品吸收垫16mm，与前处理微孔膜8交叠部分2mm，长度12mm的前处理微孔膜8与试剂结合垫7交叠部分2mm，完全遮挡样品吸收垫6和试剂结合垫7相交叠的部分；长度8mm试剂结合垫7与长度20mm的硝酸纤维素膜交叠部分1mm，硝酸纤维素膜被上下两片亲水膜4夹持1-10mm，形成的亲水膜空隙通道长度5-30mm，亲水膜4底部缺口位置如图4所示(缺口9设于下方亲水膜上)，缺口的宽度0.2-1.5mm，截留微孔滤膜紧贴在亲水膜缺口处，微孔滤膜宽度2-8mm，两者组装时如图4所示，此时样品溶液从免疫侧向流道流向微孔膜3，全部溶液只能从亲水膜4的缺口穿越微孔膜3流动。
本实施例的捕获试剂、标记试剂、待测样品在溶液中发生结合反应的方式有三种：
(1)待测样品与标记试剂竞争结合溶液反应区内的固定有捕获试剂的微球，在微球表面形成反应复合物，待溶液充分反应后，当反应液流经微孔膜，固定有捕获试剂的微球及反应复合物截留在微孔膜表面；
(2)如图2所示，待测样品15与固定有捕获试剂12的微球11竞争结合标记试剂14，在微球11表面形成反应复合物13，待溶液充分反应后，当反应液流经微孔膜，固定有捕获试剂12的微球11及反应复合物13截留在微孔膜表面；
(3)如图3所示，待测样品15、固定有捕获试剂12的微球11、标记试剂14结合形成反应复合物13，待溶液充分反应后，当反应液流经微孔膜，固定有捕获试剂12的微球11及反应复合物13截留在微孔膜表面。
实施例1：基于免疫侧向流动的微孔膜检测装置用于检测尿液中HCG蛋白
一种基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，它包括免疫侧向流道和孔径0.45um的微孔膜两部分，免疫侧向流道主要由样品吸收垫、试剂结合垫、亲水多孔膜、微孔膜组成，所述样品吸收垫、试剂结合垫、亲水多孔膜、微孔膜从前向后依次设置，亲水多孔膜由两层亲水膜的亲水面相向夹持而成，并保持0.15mm的空隙向前延伸约5mm，亲水多孔膜的溶液被上下夹持亲水多孔膜的亲水膜引流出来，溶液直接流入底部亲水膜末端设置的溶液流出口9，所述溶液流出口9处贴合有0.45um微孔膜3。
免疫侧向流道的试剂结合垫上添加了一种HCG单抗A标记的胶体金颗粒，微孔膜上包被了HCG单抗B；当溶液中含有HCG蛋白时在免疫侧向流道中流动时，HCG蛋白将被HCG单抗A反应结合，随后在穿越微孔膜3时，反应复合物再次被HCG单抗B捕获，在微孔膜的膜面上形成两个单抗夹心HCG蛋白的反应复合物。这些反应复合物通过使用者的肉眼或配套的胶体金定量分析仪器，能对溶液中HCG的浓度情况进行判断分析。
实施例2基于免疫侧向流动的微孔膜微球检测装置用于检测尿液中HCG蛋白
一种基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤截留微球检测装置，它包括免疫侧向流道和孔径0.22um的微孔膜两部分，免疫侧向流道主要由样品吸收垫、试剂结合垫、亲水多孔膜、微孔膜组成，所述样品吸收垫、试剂结合垫、亲水多孔膜、微孔膜从前向后依次设置，亲水多孔膜由两层亲水膜的亲水面相向夹持而成，并保持0.15mm的空隙向前延伸约5mm，亲水多孔膜的溶液被上下夹持亲水多孔膜的亲水膜引流出来，溶液直接流入底部亲水膜末端设置的溶液流出口，所述溶液流出口处贴合有0.22um微孔膜。
免疫侧向流道中的样品吸收垫上固化有一种HCG单抗A标记的粒径约40nm的胶体金颗粒，试剂结合垫上固化有一种直径1.5um且表面固定包被了HCG单抗A的包被微球，当尿液样品溶液中含有HCG蛋白时在免疫侧向流道中流动时，HCG蛋白将在溶液层析过程中与HCG单抗A及单抗B相对应的微球及纳米金粒混合反应结合，形成两个单抗夹心HCG蛋白的反应复合物，随后在穿越0.22um微孔膜时，游离的HCG单抗A标记的粒径约40nm的胶体金颗粒将穿越微孔膜流走，反应复合物的包被微球及游离包被微球将被截留在微孔膜表面，这些反应复合物通过使用者的肉眼或配套的胶体金定量分析仪器，能对溶液中HCG的浓度情况进行判断分析。
实施例3基于免疫侧向流动的微孔膜微球检测装置用于检测粪便类样品中FOB蛋白
一种基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤截留微球检测装置，它包括免疫侧向流道和孔径0.22um的微孔膜两部分，免疫侧向流道主要由样品吸收垫、标记试剂结合垫、0.22um的微孔膜、包被试剂结合垫、亲水多孔膜组成，所述样品吸收垫、标记试剂结合垫、包被试剂结合垫、亲水多孔膜、微孔膜从前向后依次设置，亲水多孔膜由两层亲水膜的亲水面相向夹持而成，并保持0.15mm的空隙向前延伸约5mm，亲水多孔膜的溶液被上下夹持层析膜的亲水膜引流出来，溶液直接流入底部亲水膜末端设置的溶液流出口，所述溶液流出口处贴合有0.22um微孔膜。
免疫侧向流道中的标记试剂结合垫上固化有一种FOB单抗A标记的粒径约40nm的胶体金颗粒，包被试剂结合垫上固化有一种直径1.5um且表面固定包被了FOB单抗A的包被微球。当粪便类样品溶液滴加在检测装置中时，FOB蛋白在免疫侧向流道中流动，溶液将先FOB单抗A标记的胶体金粒子混合反应结合，随后溶液将穿越0.22um的过滤微孔膜，所有粒径大于该孔径的杂志颗粒将被截留，已经初步反应的胶体金粒子复合物与FOB单抗B相对应的包被微球进一步混合反应结合，形成两个单抗夹心HCG蛋白的反应复合物，随后在穿越0.22um微孔膜时，游离的HCG单抗A标记的粒径约40nm的胶体金颗粒将穿越微孔膜流走，反应复合物的包被微球及游离包被微球将被截留在微孔膜表面，这些反应复合物通过使用者的肉眼或配套的胶体金定量分析仪器，能对溶液中HCG的浓度情况进行判断分析。
综上所述，本发明在免疫测向层析检测基础上增加一个新的功能结构——微孔膜，一方面采取斑点免疫胶体金渗滤膜法通过微孔膜捕获免疫反应复合物，另一方面通过微孔膜对在侧向流动过程中实现了充分的混合孵育反应后的微球反应复合物进行截留捕获免疫反应复合物。通过微孔膜对在侧向流动过程中实现了充分的混合孵育反应后的反应复合物进行捕获或物理截留，如果是物理截留则反应复合物的出现不再依赖配位体的亲和力了。
在免疫侧向流动及斑点金免疫渗滤法中，微孔膜的孔径一般是0.45um，因此穿越膜的溶液流动速度慢不少，因此亲和力较弱的免疫反应能在渗滤法实验中得到合适的结果。在免疫侧向流动及微球微孔膜方法中，侧向流动过程中免疫反应复合物的捕获截留出现不再依赖配位体的亲和力了，在本发明中包被试剂可设置悬浮于水溶液中的微球上，微球设置在溶液流道上，当待测样品溶液进入侧向溶液流道，分别将捕获试剂、标记试剂混合溶解，样品溶液中的待测物质、捕获试剂和标记试剂在溶液的侧向流动中发生混合孵育及免疫结合反应，在微球表面形成免疫或配位体反应复合物，经过一定距离的免疫测向流动，溶液中各组分依次到达微孔膜，粒径小于微孔膜孔径的组分穿越微孔膜流向吸水材料如滤纸；包被微球直径大于微孔膜孔径，游离的包被微球及形成反应复合物的包被微球被溶液出口处的微孔膜截留。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，其特征在于，包括免疫侧向流道和孔径小于1.2um的微孔膜，免疫侧向流道的溶液直接流入其末端设置的溶液流出口，所述溶液流出口处贴合有所述微孔膜，以供溶液穿越渗滤；
免疫侧向流道包括能定向传递水溶液的亲水多孔膜，所述亲水多孔膜选自硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、化学纤维膜及滤纸中的一种或多种；免疫侧向流道还包括由上下两片亲水膜的亲水表面夹持所述亲水多孔膜所构建的空隙通道，通过亲水膜亲水表面产生的溶液表面张力作为液体流动的动力，溶液从空隙通道的一端流向另一端；样品吸收垫玻璃纤维膜作为样品吸收垫和试剂结合垫，化学纤维膜作为亲水膜起导引水道的作用，滤纸作为吸水材料；
所述免疫侧向流道中贴合在微孔膜上的亲水膜的下表面涂布有胶水或不干胶，溶液中的微球不会从亲水膜与微孔膜的贴合间隙中流走，只能从作为溶液流出口的亲水膜缺口处贴合的微孔膜流出；
免疫侧向流道中设置了至少一种标记试剂，微孔膜上包被了捕获试剂；捕获试剂及标记试剂中分别设置有互为直接或间接配位体关系的物质；
所述标记试剂包括肉眼直接可见的颜色微粒或荧光物质；所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、其他带颜色信号的纳米颗粒中的一种或几种；所述荧光物质选自荧光分子及其微球、量子点微粒及其微球、上转换发光微粒及其微球、时间分辨荧光分子及其微球、荧光蛋白中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，其特征在于，还包括能对经过免疫侧向流动后集聚在微孔膜的反应复合物进行特定波长的光线照射被激发后接收反射出的至少一个波长光谱信号的检测设备。
3.一种基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，其特征在于，包括免疫侧向流道和孔径均匀且孔径范围在0.02-1.2um的微孔膜，所述免疫侧向流道的溶液流向其末端设置的溶液流出口，所述溶液流出口处贴合有所述的微孔膜，供溶液穿越渗滤，所述微孔膜为亲水性的；
免疫侧向流道包括能定向传递水溶液的亲水多孔膜，所述亲水多孔膜选自硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜、化学纤维膜及滤纸中的一种或多种；免疫侧向流道还包括由上下两片亲水膜的亲水表面夹持所述亲水多孔膜所构建的空隙通道，通过亲水膜亲水表面产生的溶液表面张力作为液体流动的动力，溶液从空隙通道的一端流向另一端；样品吸收垫玻璃纤维膜作为样品吸收垫和试剂结合垫，化学纤维膜作为亲水膜起导引水道的作用，滤纸作为吸水材料；
所述免疫侧向流道中贴合在微孔膜上的亲水膜的下表面涂布有胶水或不干胶，溶液中的微球不会从亲水膜与微孔膜的贴合间隙中流走，只能从作为溶液流出口的亲水膜缺口处贴合的微孔膜流出；
免疫侧向流道中设置了至少一种直径均匀且大于微孔膜孔径的包被微球、固定于微球表面的捕获试剂以及直径小于微孔膜孔径的标记试剂；捕获试剂及标记试剂中分别设置有互为直接或间接配位体关系的物质。
4.如权利要求3所述的基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，其特征在于，两片亲水膜设置于所述免疫侧向流道末端，两片亲水膜的亲水表面夹持亲水多孔膜的上下表面，两片亲水膜中底部的亲水膜的下表面贴合有所述微孔膜，贴合在微孔膜上表面的亲水膜的中部设置有缺口作为溶液流出口；或者，两片亲水膜的亲水表面夹持亲水多孔膜的左右两侧，两片亲水膜夹持形成的空隙通道底面的中部设置有缺口作为溶液流出口。
5.如权利要求4所述的基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，其特征在于，所述亲水膜上设置的缺口形状中至少包括最大间隙不超过1.5mm的空隙形状或角度不超过95度的夹角。
6.如权利要求3所述的基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，其特征在于，微孔膜的下表面贴合有吸水材料，流入亲水膜缺口的溶液穿越微孔膜后被吸水材料吸收传递。
7.如权利要求3所述的基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，其特征在于，所述标记试剂包括肉眼直接可见的颜色微粒或荧光物质；所述颜色微粒选自纳米胶体金、乳胶微球、炭黑微粒、其他带颜色信号的纳米颗粒中的一种或几种；所述荧光物质选自荧光分子及其微球、量子点微粒及其微球、上转换发光微粒及其微球、时间分辨荧光分子及其微球、荧光蛋白中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，其特征在于，还包括能对经过免疫侧向流动后截留集聚在微孔膜表面的反应复合物进行特定波长的光线照射被激发后接收反射出的至少一个波长光谱信号的检测设备。
9.如权利要求1所述的基于免疫侧向流动的微孔膜渗滤检测装置，其特征在于，当包被微球及其与标记试剂的反应复合物形成的微球在微孔膜表面形成堆积时，游离的标记试剂能从堆积的微球之间的孔隙被溶液携带穿越后从微孔膜的微孔中再次穿越流出，不会形成阻截残留。
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