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CN111067949A - 具有抑制脂肪蓄积作用的粘委陵菜总黄酮有效部位及其制备方法和应用 - Google Patents

具有抑制脂肪蓄积作用的粘委陵菜总黄酮有效部位及其制备方法和应用 Download PDF

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CN111067949A CN201911383668.8A CN201911383668A CN111067949A CN 111067949 A CN111067949 A CN 111067949A CN 201911383668 A CN201911383668 A CN 201911383668A CN 111067949 A CN111067949 A CN 111067949A
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Abstract

本发明提供一种具有抑制脂肪蓄积作用的粘委陵菜总黄酮有效部位及其制备方法和用途。本发明通过对粘委陵菜的化学成分以及其与脂肪蓄积症的关系的研究，获得具有良好的抑制脂肪蓄积作用的粘委陵菜总黄酮有效部位提取物，即粘委陵菜粗提物的乙酸乙酯提取物。同时本发明运用多种分离纯化方法分别对粘委陵菜总黄酮有效部位进行分离纯化，获得具有较好抑制脂肪蓄积作用的9种黄酮类化合物。本发明为从天然药物粘委陵菜中寻找具有能够有效地抑制脂肪蓄积及治疗脂肪蓄积相关疾病的药物提供有利的物质基础和理论依据。

Description

具有抑制脂肪蓄积作用的粘委陵菜总黄酮有效部位及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及具有抑制脂肪蓄积作用的粘委陵菜的总黄酮有效部位的制备方法以及应用，还涉及从总黄酮有效部位中分离具有抑制脂肪蓄积作用的黄酮类有效成分的分离方法。
背景技术
过多的脂肪蓄积引发了人类的诸多健康问题，如肥胖、脂肪肝疾病、高脂血症、高血压和糖尿病等等，给现代人带来了越来越严重的困扰。预防和治疗脂肪蓄积是解决这些健康问题的关键。
以肥胖症为例，半个世纪以前，世界上的肥胖者不到1亿。伴随着经济发展的脚步越来越快，人类健康面临的威胁也越来越严重，其中肥胖及其并发症正作为一个“无情的杀手”，严重危害着人类的健康。目前，在全球范围内，肥胖患者人数日益增加。
在欧美等西方国家，近几年肥胖成为全球第4大医学社会问题，排在前三位的是吸毒、酒精中毒及艾滋病。特别在美国，统计共有7800万名肥胖人士，占全球肥胖者总数的13％，有研究表明，每年有高达520亿美元的直接消费用于肥胖方面，间接使用的费用也会达到470亿美元，这些消费大约会占美国国民生产经济总值的4％，中国的肥胖人口排全球第二，而且人数在不断增加。
肥胖已经成为严重威胁人们生命安全的危险因素。随着社会的发展，人们的饮食结构产生了变化，逐渐以高脂肪、高能量、低纤维的食物为主，这使得肥胖的人数逐步增加，到2016年为止，最新调查显示，全球如今全球约70亿人中有百分之十以上的人口正在遭受着肥胖带来的各种苦恼和困扰。同时，肥胖也是引起各种慢性代谢疾病的重要原因，例如糖尿病、脂肪肝、心脑血管疾病、动脉粥样硬化、肌肉骨骼疾病和某些癌症等。众所周知，引起肥胖的关键因素是脂肪组织的蓄积。
目前，有多种治疗肥胖的方式，例如，减少食物或能量的摄入，通过脂质的代谢刺激能量产生，抑制胰脂肪酶及脂肪细胞分化，其中抑制脂肪细胞分化是最为常用的方式。脂肪组织的大量堆积主要是由脂肪细胞数目的增多和脂肪细胞体积增大引起，而脂肪细胞数目的多少在很大程度上是通过脂肪细胞分化来实现，并且脂肪细胞分化的增加会导致脂肪因子分泌过多，这些因子在肥胖及相关疾病的发展过程中，都起到至关重要的作用，因此调节脂肪细胞的分化可以为有效的控制肥胖提供帮助。
许多传统药物被用来治疗脂肪蓄积。其中药用植物粘萎陵菜，拉丁名
Potentilla longifolia Willd.ex Schlecht，为蔷薇科委陵菜属多年生草本植物，在朝药(朝鲜民族药)中称为肝炎草，是一味朝鲜族特色药材。医药典籍中记载肝炎草可以全草入药，在夏、秋之时采集，鲜用或干燥入药，用于治疗肝炎。
发明内容
本发明的目的在于提供粘委陵菜中总黄酮有效部位的制备方法和从该总黄酮有效部位中分离黄酮类化合物的分离方法，为从天然药物粘委陵菜中寻找具有能够有效地抑制脂肪蓄积及治疗脂肪蓄积相关疾病的药物提供有利的物质基础和理论依据。
本发明的第一方面，提供了一种粘委陵菜总黄酮有效部位提取物在制备防治脂肪蓄积症药物中的应用，所述粘委陵菜总黄酮有效部位提取物为粘委陵菜粗提物的乙酸乙酯提取物；
所述粘委陵菜粗提物的乙酸乙酯提取物的制备方法包括如下步骤：
a.将粘委陵菜用50％～95％乙醇或50％～95％甲醇或水加热回流提取1～3次，合并滤液，减压浓缩滤液至浸膏状，得粗提物浸膏；
b.将粗提物浸膏悬浮在蒸馏水中，按照极性由小到大的顺序，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，合并相同有机溶剂层，分别得石油醚层、乙酸乙酯层以及正丁醇层，将所述乙酸乙酯层减压浓缩后即得粘委陵菜粗提物的乙酸乙酯提取物。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤a中所述的粘委陵菜为粘委陵菜的地上部分或根。作为原料可采用新鲜采集的粘委陵菜也可以采用干燥后的粘委陵菜。优先地，粘委陵菜用75％～95％乙醇或75％～95％甲醇或水加入回流提取，更优选地，粘委陵菜用95％乙醇或95％甲醇或水加入回流提取。
进一步地，在上述技术方案中，所述的防治脂肪蓄积症药物是由所述粘委陵菜总黄酮有效部位提取物与药学上可接受的载体或辅料组成。所述粘委陵菜总黄酮有效部位提取物可以与药学上可接受的载体或辅料结合制备得到各种制剂，如散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、注射剂等。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备得到。
本发明的第二方面，提供了一种具有抑制脂肪蓄积作用的黄酮类化合物的分离方法，所述黄酮类化合物是上述的粘委陵菜总黄酮有效部位提取物中分离得到，分离方法包括以下步骤：
(1)对所述粘委陵菜总黄酮有效部位提取物采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比依次为100:1～1:1的石油醚-乙酸乙酯系统以及100％甲醇作为流动相进行梯度洗脱，每个梯度的流动相的使用量为柱体积的10-50倍，以每个梯度的流动相为一个馏分，得到6个馏分，分别为馏分E-1～E-6；
(2)对馏分E-2采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比为50:1～1:1的石油醚-乙酸乙酯系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到8个馏分E-2-1～E-2-8，对馏分E-2-8采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比为30:1～3:1的石油醚-乙酸乙酯系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到10个馏分E-2-8-1～E-2-8-10，对馏分E-2-8-7用乙酸乙酯重结晶，得到化合物9；
(3)对馏分E-4用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比为500:1～10:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到化合物3及6个馏分E-4-1～E-4-6；
(4)对馏分E-4-3用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比为150:1～40:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到6个馏分E-4-3-1～E-4-3-6，对馏分E-4-3-5采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比为80:1～15:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到8个馏分E-4-3-5-1～E-4-3-5-8，对馏分E-4-3-5-3采用反相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为2:1甲醇-水系统作为流动相进行洗脱，并根据薄层层析结果，得到化合物10；
(5)对馏分E-4-3-3采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比为12:1～1:1的石油醚-丙酮系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到7个馏分E-4-3-3-1～E-4-3-3-7，对馏分E-4-3-3-6采用反相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为3:2的甲醇-水系统作为流动相进行洗脱，并根据薄层层析结果，得到化合物11；
(6)对E-6采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为90:1～1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相为进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到8个馏分E-6-1～E-6-8，对馏分E-6-3采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为70:1～1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到12个馏分E-6-3-1～E-6-3-12，对馏分E-6-3-1采用葡聚糖凝胶柱层析进行分离，在分离过程中，用100％甲醇作为流动相进行洗脱，得到馏分E-6-3-1-2和化合物4；
(7)对馏分E-6-4采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为80:1～1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到7个馏分E-6-4-1～E-6-4-7，对馏分E-6-4-6采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为20:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行洗脱，并根据薄层层析结果，得到化合物8；
(8)对馏分E-6-4-2采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为6:1～1:1的石油醚-乙酸乙酯系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到6个馏分E-6-4-2-1～E-6-4-2-6，对馏分E-6-4-2-2采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为25:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，得到化合物5；
(9)对馏分E-6-6采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为80:1～1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到7个馏分E-6-6-1～E-6-6-7，对馏分E-6-6-2采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为80:1～10:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到11个馏分E-6-6-2-1～E-6-6-2-11，对馏分E-6-6-2-3采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为14:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行洗脱，并根据薄层层析结果，得到化合物7；
(10)对馏分E-6-6-4采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为75:1～1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到8个馏分E-6-6-4-1～E-6-6-4-8，对馏分E-6-6-4-4采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为11:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，得到化合物6；
其中，所述化合物3为3,8,4'-三甲基草质素；化合物4为3,8-二甲基草质素；化合物5为5,7,4'-三羟基-3-甲氧基-6-C-甲基黄酮；化合物6为黄芩苷；化合物7为委陵菜黄酮；化合物8为6-甲基芹黄素；化合物9为芹菜素；化合物10为杜鹃素；化合物11为8-去甲杜鹃素。
本发明的第三方面，提供了一种黄酮组合物，该黄酮组合物包括化合物3和化合物4中的一种或两种，所述化合物3和化合物4是通过上述的粘委陵菜总黄酮有效部位提取物中黄酮类化合物的分离方法来制备得到的。
进一步地，在上述技术方案中，所述黄酮组合物还包括化合物5～11中的任意一种或一种以上，其中所述化合物5～11是通过上述的粘委陵菜总黄酮有效部位提取物中黄酮类化合物的分离方法来制备得到的。
本发明的第四方面，提供了所述的黄酮组合物在制备防治脂肪蓄积症药物中的用途。所述黄酮组合物可以与药学上可接受的辅料结合制备得到各种制剂，如散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、合剂、注射剂等。
本发明对粘委陵菜的化学成分以及其与脂肪蓄积症的关系，进行了系统的、深入的研究，从而获得具有良好的抑制脂肪蓄积作用的粘委陵菜总黄酮有效部位提取物，即粘委陵菜粗提物的乙酸乙酯提取物。同时本发明运用多种分离纯化方法(有机溶剂萃取、大孔吸附树脂柱层析，正反相硅胶柱层析、MPLC、HPLC以及葡聚糖凝胶柱层析等)分别对粘委陵菜总黄酮有效部位进行分离纯化，获得具有较好抑制脂肪蓄积作用的9种黄酮类化合物。本发明为从天然药物粘委陵菜中寻找具有能够有效地抑制脂肪蓄积及治疗脂肪蓄积相关疾病的药物提供有利的物质基础和理论依据。
附图说明
图1表示粘委陵菜不同提取物对ICR脂肪肝小鼠血清指标的影响。
图2表示化合物3～11对3T3-L1小鼠前脂肪细胞生存率的影响。
图3表示处理化合物3～11后诱导分化的3T3-L1小鼠前脂肪细胞的油红O染色结果照片。
图4表示处理化合物3-11后诱导分化的3T3-L1小鼠前脂肪细胞，经油红O染色后，再经异丙醇脱色后在540nm处测定吸光度的结果。
图5表示处理化合物3-11后诱导分化的3T3-L1前脂肪细胞中甘油三酯含量的的测定结果。
图6表示化合物4对3T3-L1小鼠前脂肪细胞的脂肪蓄积的影响。
图7表示化合物4对SREBP1c等脂肪生成相关基因表达的影响。
图8表示化合物4对AMPK及ACC磷酸化以及脂肪生成相关蛋白质表达的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。
下述实施例所用材料：
粘委陵菜(Potentilla longifolia Willd.ex Schlecht)(俗称肝炎草)地上部分：将采集于吉林省延边地区的粘委陵菜的地上部分进行避阳、风干而获得。
实施例1粘委陵菜不同提取物对ICR脂肪肝小鼠血清指标的影响
ⅰ)给药样品的准备
取委陵菜地上部分，用95％乙醇加热回流提取3次，合并滤液，减压浓缩滤液至浸膏状，即为粘委陵菜醇提物；
将粘委陵菜醇提物悬浮于蒸馏水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取三次，合并相同有机层，分别得到石油醚层，乙酸乙酯层，正丁醇层，以及水层，将乙酸乙酯层减压浓缩滤液至浸膏状，得粘委陵菜醇提物的乙酸乙酯提取物；
粘委陵菜醇提物以及粘委陵菜醇提物的乙酸乙酯提取物分别溶解在10％聚乙二醇溶液中，分别获得粘委陵菜醇提物组以及粘委陵菜总黄酮组，作为小鼠灌胃给药样品。
ⅱ)脂肪肝小鼠模型建立与给药
40只4周龄雄性ICR小鼠(18～20g)，温度为20～25℃，湿度为40～60％，采用日光灯照明，昼夜各12h条件下饲养，自由饮食。适应环境一周后，随机分成四组，每组10只，分别为正常对照组(Control，CON)、模型组(High fat diet，HFD)、粘委陵菜醇提物组(800mg/kg，CTW)、粘委陵菜总黄酮组(300mg/kg，ZHT)。正常对照组用10％kcal饲料喂养，其他组用45％kcal高脂饲料喂养共12周，最后3周小鼠灌胃给药，一天一次。正常对照组和模型组小鼠灌胃10％聚乙二醇溶液，其他组小鼠灌胃相应剂量的药物，药物溶解在10％聚乙二醇溶液中。
小鼠处死前12h禁食，腹腔注射动物麻醉剂(Zoletil 50)麻醉动物，待小鼠完全麻醉后，用心脏穿刺法取了全血。取得的血浆，在4℃下3000rpm离心15min，离心两次，取离心后上清液即为血清，血清可于-80℃长期保存。取制备完成的血清，按照试剂盒的操作说明分别测定TG(Triglyceride，甘油三酯)，TC(Total cholesterol，总胆固醇)，AST(谷草转氨酶)水平。测定结果如图1所示。
图1A表明，模型组和正常对照组相比，出现极其显著性差异(###p<0.001)，说明造模成功，实验数据可信；粘委陵菜醇提物组和模型组相比，出现了极其显著性差异(***p<0.001)，说明具有较强的活性；尤其是，粘委陵菜总黄酮组不仅和模型组出现了显著性差异(***p<0.001)，而且和粘委陵菜醇提物组相比也出现了显著性差异($p<0.05)，说明粘委陵菜总黄酮组的抑制甘油三酯作用非常显著。
图1B表明，模型组和正常对照组相比，出现极其显著性差异(###p<0.001)，说明造模成功，实验数据可信；粘委陵菜醇提物组和模型组相比，出现了显著性差异(*p<0.05)；尤其是，粘委陵菜总黄酮组不仅和模型组出现了显著性差异(**p<0.01)，而且和粘委陵菜醇提物组相比也出现了非常显著性差异($$p<0.01)，说明粘委陵菜总黄酮组的抑制总胆固醇作用非常显著。
图1C表明，模型组和正常对照组相比，出现极其显著性差异(###p<0.001)，说明造模成功，实验数据可信；粘委陵菜醇提物组和模型组相比，出现了极其显著性差异(***p<0.001)，说明具有较强的活性；尤其是，粘委陵菜总黄酮组不仅和模型组出现了显著性差异(***p<0.001)，而且和粘委陵菜醇提物组相比也出现了极其显著性差异($p<0.05)，说明粘委陵菜总黄酮组的抑制AST作用非常显著。
还有，上述实验结果表明，总黄酮组是在剂量大大降低(水提物是800mg/kg，总黄酮组300mg/kg)的前提下显著提高疗效的，说明其抑制脂肪蓄积作用非常显著，具有极为重要的研究开发价值。
实施例2粘委陵菜中9个黄酮类化学成分的分离及纯化
1.1提取
称取粘委陵菜地上部分5kg，用95％乙醇浸泡1小时后加热回流提取4小时，重复提取3次，合并滤液，减压浓缩滤液至浸膏状，得到粗提物浸膏。
1.2萃取
将粗提物浸膏悬浮在5L蒸馏水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取三次，合并同一有机层，分别得到石油醚层，乙酸乙酯层，正丁醇层，以及水层。其中，将乙酸乙酯层减压浓缩滤液至浸膏状，得粘委陵菜粗提物的乙酸乙酯提取物，即粘委陵菜总黄酮有效部位提取物。
1.3分离纯化
运用多种分离纯化方法(有机溶剂萃取、大孔吸附树脂柱层析，正反相硅胶柱层析、MPLC、HPLC以及葡聚糖凝胶柱层析等)对粘委陵菜总黄酮有效部位提取物进行分离、纯化，获得具有抑制脂肪蓄积作用的黄酮类化合物，具体为：
将粘委陵菜粗提物的乙酸乙酯提取物(E)254.2g用乙酸乙酯完全溶解后加入二倍量的柱层析用正相硅胶(200～300目)轻微震荡，混匀，减压浓缩至粉末状，在用研砵研匀，备用。固定相为200-300目正相硅胶，湿法装柱，干法上样。流动相为石油醚-乙酸乙酯系统，以体积比依次为100:1、10:1、5:1、2:1、1:1以及100％MeOH的流动相来进行梯度洗脱，每个比例流动相的洗脱体积为柱体积的15倍，每个比例合为一个馏分，得到6个馏分(E-1～6)。
对馏分E-2(7.32g)，用正相硅胶柱层析法进行分离，湿法填柱，干法上样后，用体积比依次为50:1、25:1、10:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到8个馏分(E-2-1～8)；对馏分E-2-8(5.05g)采用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，用体积比依次为30:1、20:1、10:1、3:1石油醚-乙酸乙酯系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到10个馏分(E-2-8-1～10)，对馏分E-2-8-7(673mg)用乙酸乙酯重结晶三次，得到化合物9(22mg)。
将馏分E-4(39.41g)用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，用体积比依次为500:1、300:1、200:1、100:1、50:1、10:1二氯甲烷-甲醇系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到化合物3(56mg)及其它6个馏分(E-4-1～6)，对馏分E-4-3(12.97g)用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，用体积比依次为150:1、120:1、100:1、80:1、60:1、40:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到6个馏分(E-4-3-1～6)，对馏分E-4-3-5(2.54g)用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，用体积比依次为80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、15:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到8个馏分(E-4-3-5-1～8)，对馏分E-4-3-5-3(148mg)用反相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，湿法上样后，甲醇-水系统(2:1)作为流动相进行洗脱，根据薄层层析结果，得到化合物10(12mg)；对馏分E-4-3-3(5.23g)用正相硅胶柱层进行分离，湿法填柱，干法上样后，用体积比依次为12:1、10:1、8:1、4：1、2:1、1:1的石油醚-丙酮系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到7个馏分(E-4-3-3-1～7)；对馏分E-4-3-3-6(450mg)用反相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，湿法上样后，用甲醇-水系统(3:2)作为流动相进行洗脱，根据薄层层析结果，得到化合物11(16mg)。
将E-6(101.5g)用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，用体积比依次为90:1、70:1、50:1、30:1:、10:1、5:1、1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到8个馏分(E-6-1～8)，对馏分E-6-3(5.4g)正相硅胶柱层进行分离，湿法填柱，干法上样后，用体积比依次为70:1、50:1、30:1、10:1、5:1、1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到12个馏分(E-6-3-1～12)，对馏分E-6-3-1(88mg)用葡聚糖凝胶柱层进行分离，湿法填柱，湿法上样后，用100％甲醇作为流动相，进行洗脱，得到E-6-3-1-2和单体化合物4(20mg)；对馏分E-6-4(13.1g)用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，用体积比依次为80:1、60:1、40:1、20:1、10:1、5:1、1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到7个馏分(E-6-4-1～7)；对馏分E-6-4-6(0.6g)用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，用二氯甲烷-甲醇系统(20:1)作为流动相进行洗脱，根据薄层层析结果，得到化合物8(30.0mg)；对馏分E-6-4-2(4.2g)用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，用体积比依次为6:1、4:1、2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到6个馏分(E-6-4-2-1～6)；对将E-6-4-2-2(0.8g)用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，二氯甲烷-甲醇系统(25:1)作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，得到化合物5(15mg)；对馏分E-6-6(23.8g)用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，用体积比依次为80:1、40：1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到7个馏分(E-6-6-1～7)；对馏分E-6-6-2(3.2g)用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，用体积比依次为80:1、40：1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到11个馏分(E-6-6-2-1～11)；对E-6-6-2-3(0.9g)用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，用二氯甲烷-甲醇系统(14:1)为流动相进行洗脱，根据薄层层析结果，得到化合物7(16mg)；对馏分E-6-6-4(4.1g)用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，用体积比依次为5:1、50:1、30:1、10:1、3:1、1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到8个馏分(E-6-6-4-1～8)；对馏分E-6-6-4-4(0.3g)用正相硅胶柱层析进行分离，湿法填柱，干法上样后，以二氯甲烷-甲醇系统(11:1)为流动相，进行梯度洗脱，根据薄层层析结果，得到化合物6(43mg)；
实施例3化合物的化学性质及化学结构
结合不同的核磁共振图谱(1H-NMR、13C-NMR等)对得到的化合物进行化学结构鉴定。
如实施例2所述，从粘委陵菜的地上部分的乙酸乙酯萃取层中共分离得到9个化合物，结合不同的核磁共振图谱(1H-NMR、13C-NMR等)对得到的化合物进行化学结构鉴定并鉴定了9个化合物的化学结构，化合物3～11的化学结构式如下，数字3～11分别表示化合物3～11：
Figure BDA0002342934140000111
化合物3为3,8,4'-三甲基草质素(5,7-dihydroxyl-3,8,4′-trimethoxylflavone)；
化合物4为3,8-二甲基草质素(Herbacetin-3,8-dimethyl ether)；
化合物5为5,7,4'-三羟基-3-甲氧基-6-C-甲基黄酮(5,7,4′-trihydroxy-3-methoxy-6-C-methylflavone)；
化合物6为黄芩苷(4',5,7-Trihydroxyflavone 3-β-D-glucopyranoside)；
化合物7为委陵菜黄酮(transtiliroside)；
化合物8为6-甲基芹黄素(6-Methylapigenin)；
化合物9为芹菜素(apigenin)；
化合物10为杜鹃素(5,7-Dihydroxy-2-4-hydroxyphenyl)-6,8-dimethylchroman-4-one)；
化合物11为8-去甲杜鹃素(8-Demethylfarrerol)。
化合物3和化合物4的结构鉴定结果如下：
化合物3：分子式为C18H16O7，分子量为344。1H-NMR(300MHz,MeOD)δH 7.95(2H,d,J＝9.0Hz),6.83(2H,d,J＝9.0Hz)为黄酮B环上氢质子信号峰；6.15(1H,s)为黄酮A环上氢质子信号峰；3.63(3H,s),3.74(3H,s),δ3.72(3H,s)为三个甲氧基质子信号峰。13C-NMR(75MHz,MeOD)δC 178.7为C环羰基碳；98.9为A环上未被取代碳信号峰；59.8,61.2,55.1为三个甲氧基碳信号峰。以上数据与参考文献(Liu,Y.等,Acta.Pharm.Sin.2015(50),475-479)报告的一致，故鉴定为3,8,4'-三甲基草质素。
表1.化合物3的1H NMR和13C NMR数据(MeOD,J in Hz)
Figure BDA0002342934140000121
Figure BDA0002342934140000131
化合物4：分子式为C17H14O7，分子量为330。1H-NMR(300MHz,MeOD)δH 8.06(2H,d,J＝8.9Hz),6.96(2H,d,J＝8.9Hz)为黄酮B环上两组对称氢质子信号峰；6.15(1H,s)为A环氢质子信号峰；3.92(3H,s),3.80(3H,s),是两个甲氧基氢质子信号峰。13C-NMR(75MHz,MeOD)δC 179.8为C环羰基碳信号峰；139.1为C环连甲氧基碳信号峰；98.9为A环上没有被取代碳信号峰；61.8,60.4为两个甲氧基碳信号峰。以上数据与参考文献(Gedara,S.R.等,Naturforsch.C.2003(58),23-32)报告的一致，故鉴定为3,8-二甲基草质素。
表2.化合物4的1H NMR和13C NMR数据(MeOD,J in Hz)
Figure BDA0002342934140000132
实施例4化合物3～11对3T3-L1小鼠前脂肪细胞生存率的影响
用MTT法检测化合物3～11的细胞毒性：
(1)3T3-L1细胞培养
用含有10％小牛血清(FCS)、1％的青霉素-链霉素双抗混合液的DMEM培养基在含有一定湿度和5％二氧化碳的37℃培养箱中培养3T3-L1小鼠前脂肪细胞。
(2)细胞毒性实验(MTT)
本实验对单体化合物3～11(C3～C11)进行细胞毒性实验，在96孔板中加入100μL含有3T3-L1细胞的培养液，待细胞贴壁后，每孔加入100μL相应浓度的相应单体，处理细胞的单体浓度分别为0、10、20、40、80μM。每个浓度梯度设3个平行孔，将处理后的3T3-L1细胞放置后37℃和5％的二氧化碳条件下继续培养。96h后，弃去培养液，每孔加入10μL MTT溶液，在避光、37℃温度下放置4h后，再加入100μL二甲基亚砜，并用摇床震荡10min后，在540nm波长下测定吸光度A值，计算3T3-L1细胞的细胞生存率(Cell viability)，结果如图2，图2中***表示处理化合物组与0μM组相比，p<0.001，有显著差异。
图2中A～I分别为化合物3～9(C3～C11)的细胞毒性实验结果，其中，化合物9(C9)在0-80μM范围内没有毒性；化合物3、4、5、6、7、10、11(C3、C4、C5、C6、C7、C10、C11)、在0-40μM范围内没有毒性；化合物8(C8)在0-20μM范围内没有毒性。因此，在接下来的研究中化合物3、4、5、6、7、9、10、11，选用浓度为40μM，化合物8选用浓度为20μM。
实施例5化合物3～11对3T3-L1小鼠前脂肪细胞分化的影响
(1)3T3-L1细胞分化及药物处理
将3T3-L1前脂肪细胞传代接种于6孔板内，用含10％小牛血清(FCS)的培养液进行培养，待3T3-L1细胞长满时(定义为第0天)进行诱导分化，分别设正常组(CON组，加入10％FCS培养液)；单独给诱导分化液的对照组【(differentiation medium)DM组，加入诱导分化剂Ⅰ(5％FBS+DMEM+1μM地塞米松+500μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+10μg/mL胰岛素)】；吡格列酮对照组：((pioglitazone)PIO组，加入诱导分化剂Ⅰ+10μM吡格列酮)；化合物3-11(C1～C11)给药组【诱导分化剂Ⅰ+化合物3、4、5、6、7、9、10或11：40μM；或+化合物8：20μM】；培养2天后，按上述方法更换同样的诱导分化剂。培养4天后，更换培养液，CON组更换新鲜的10％FCS培养液，DM组、PIO组、各个给药组均换用诱导分化剂Ⅱ：10μg/mL胰岛素+5％FBS+DMEM。2天后，CON组更换新鲜的10％FCS培养液，其余组换用诱导分化剂Ⅲ：5％FBS+DMEM。每2日换液一次，持续培养到第8天，完成诱导过程。
(2)油红O染色
细胞诱导分化完成后，弃去6孔板内的培养基，用PBS清洗3次。在室温下用10％的多聚甲醛固定1h后，PBS清洗2次，每孔加入1mL提前配好的油红O染料试剂，常温染色2h后，再用蒸馏水洗净板中的染料，并在倒置显微镜中观察3T3-L1细胞分化情况，拍摄照片，结果如图3。染色后的6孔板在室温下隔夜晾干后，用异丙醇(IPA)脱色，并在540nm处测定吸光度，结果如图4。
油红O是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三酯结合呈小脂滴状，细胞或组织中的脂滴用其染色后呈橘红色，为了筛选能够抑制3T3-L1前脂肪细胞分化的单体，3T3-L1细胞处理相应浓度的药物的同时进行分化，分化完成后，用油红O进行染色，根据染色情况判断3T3-L1细胞的分化情况，染色后的细胞用异丙醇脱色，测定其吸光度，吸光度值的大小亦可说明3T3-L1细胞的分化情况。从油红O染色结果(图3)可以看出，与CON组相比较，DM组中的3T3-L1细胞从长梭形的细胞分化成为成熟的脂肪细胞，脂滴大量聚集，形成“戒环”样结构；DM组与PIO组相比较，细胞分化情况并无显著性差异，由此说明3T3-L1细胞分化完全。与DM组相比，化合物3、4、5、8给药组中的油滴累积均有减少，3T3-L1细胞的分化都受到了不同程度的抑制。染色的细胞用异丙醇脱色后测定吸光度，吸光度值的测定结果(图4)表明，与DM组相比，化合物3、4、5、8，给药组的吸光度值分别到61％，61％，73％，76％。
在图4中，##表示与正常对照组相比较p<0.01；**表示与模型(DM)组相比较p<0.01；++表示与化合物4处理组相比较p<0.01。
(3)TG含量测定
甘油三酯(TG)是人体中脂质的组成成分，是人体内含量最多的脂质，更是临床中脂质相关疾病的检查指标。采用如下方法检测化合物3-11对3T3-L1中TG含量的影响：
按照步骤(1)诱导分化完成的6孔板样品中，每孔加入120μl的细胞裂解液[(25mM蔗糖，20mM三氨基甲烷，1mM乙二胺四乙酸，1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸]，将细胞刮下，放入1.5mL试管中，置于冷冻离心机中，4℃，13000rpm，离心20min。离心完毕后，取上清液进行蛋白质的定量，绘制标准曲线。(做三次平行实验)，测定样品浓度。取80μg蛋白质定量至30μl；按试剂盒说明操作后，510nm条件下测定校准孔及各孔样品吸光度值。根据吸光度值计算了样品的TG含量，结果如图5。
图5结果显示，与DM组相比，化合物3、4、5给药组，3T3-L1中TG含量分别降低到72％、67％、61％、56％、67％。
在图5中，##表示与正常对照组相比较p<0.01；**表示与模型(DM)组相比较p<0.01；++表示与化合物4处理组相比较p<0.01。
综合上述的实验结果表明，在这9种单体化合物中化合物3、4、5对3T3-L1细胞的分化及脂肪的积蓄都有较强的抑制作用。从油红O染色、异丙醇脱色、TG测定等实验结果综合考虑，其中化合物4抑制脂肪蓄积效果显著。
图6为采用上述方法，对用不同浓度的化合物4处理并分化完成的3T3-L1细胞，进行油红O染色、异丙醇脱色、TG测定得到的结果。图6A为油红O染色结果，图6B为异丙醇脱色后在540nm条件下测定吸光度的结果，图6C为TG含量测定结果。图6进一步说明化合物4具有良好的抑制脂肪蓄积效果，并呈现浓度依赖性。
在图6中，###表示与正常对照组相比较p<0.001；***表示与模型(DM)组相比较p<0.001。
实施例6化合物3-11脂肪抑制作用的分子机理
以化合物4为例，进一步研究本发明化合物对脂肪抑制作用的分子机理。
(1)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
采用Trizol一步法提取各祖细胞总RNA，完成逆转录反应。逆转录反应采用M-MLV第一链cDNA合成试剂盒，用5μg在50μL反应体系中逆转录成cDNA。以合成的cDNA为模板，按照逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒进行PCR扩增。PCR条件为95℃预变性60s后进行30个循环，每个循环95℃变性30s，退火30s(各基因的退火温度分别为：50℃(FAS,ACC,C/EBPα)、56℃(SCD1)、58℃(SREBP1c,actin,GPAT)、55℃(PPARγ))，72℃延伸1min。RT-PCR用1％琼脂糖凝胶在100V下进行电泳，用0.5μg/mL溴化乙锭染色，检测各基因的表达，结果如图7。各基因引物及序列如表3所示。
表3.引物名称及序列
Figure BDA0002342934140000171
图7中，图7A为化合物4对脂肪蓄积相关基因表达的影响，图7B～7D分别为化合物4对各基因表达量影响的量化图。图7显示，化合物4可显著抑制SREBP1c、FAS、SCD1基因的表达，同时显著抑制SCD-1的下游激酶GPAT的表达，并呈现浓度依赖性，以上三种基因均与脂肪的生成有关。脂肪细胞分化由多种转录因子参与，PPARγ和C/EBPα主要存在于脂肪组织中，可协同表达调节脂肪细胞的分化，是脂肪形成和脂肪生成的关键转录因子。图7结果可见，化合物4以浓度依赖性，显着地抑制PPARγ和C/EBPα的mRNA水平。这些结果表明，化合物4抑制脂肪细胞分化和脂肪形成可能通过影响转录因子级联PPARγ和C/EBPα的上游，从而可能抑制脂肪蓄积的。
在图7中，##表示与对照组相比较p<0.01；**表示与模型(DM)组相比较p<0.01。
(2)Western-blot实验
将按照实施5的步骤(1)进行药物处理并分化完成的3T3-L1细胞，用冰冷的PBS洗涤两次，用蛋白提取试剂盒提取各组细胞中的总蛋白，以13000转/分的速度在4℃离心20分钟，上清液即为细胞总蛋白，收集上清液。
对于各组样品的上清液用BCA法进行蛋白质定量，按照Bio-rad蛋白检测试剂盒操作说明进行操作。将等量的蛋白质(40μg)样品，用预先制备好的SDS-PAGE凝胶进行电泳，进行Western Blot分析，测定化合物4对AMPK及ACC磷酸化以及脂肪生成相关蛋白质表达量的影响，其中脂肪生成相关蛋白质为SREBP1c、FAS、SCD1、PPARγ和C/EBPα，结果如图8。
图8中，图8A为化合物4对AMPK及ACC磷酸化的影响，图8B为化合物4对脂肪生成相关蛋白质表达的影响，图8C～8E分别表示为化合物4对各脂肪生成相关蛋白质表达影响的量化图。图8显示，化合物4可显著抑制SREBP1c、FAS、SCD1、PPARγ和C/EBPα等蛋白质表达，并呈现浓度依赖性，以上5种蛋白质均与脂肪的生成有关。和RT-PCR实验中抑制脂肪的生成有关基因结果相一致。同时，和DM组相比，pAMPK/AMPK和pACC/ACC表达均呈现显著增多，说明化合物4是通过增强AMPK和ACC的磷酸化抑制脂肪生成相关的SREBP1c、FAS、SCD1、PPARγ和C/EBPα等蛋白质和基因的表达，从而显著抑制脂肪蓄积。
在图8中，##表示与对照组相比较p<0.01；**表示与模型(DM)组相比较p<0.01。
上述实施例所涉及的数据统计与分析方法如下：所有的数据以“平均值±标准差”(MEAN±SE)表示，选用Sigma plot 12.5统计软件对数据进行处理，多组间比较分析采用单因素方差分析(one-way anova-student’s t-test)。当P<0.05时，组间存在差异，P<0.01时，组间差异显著，P<0.001时，组间差异极显著。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.粘委陵菜总黄酮有效部位提取物在制备防治脂肪蓄积症药物中的应用，其特征在于，所述粘委陵菜总黄酮有效部位提取物为粘委陵菜粗提物的乙酸乙酯提取物；
所述粘委陵菜粗提物的乙酸乙酯提取物的制备方法包括如下步骤：
a.将粘委陵菜用50％～95％乙醇或50％～95％甲醇或水加热回流提取1～3次，合并滤液，减压浓缩滤液至浸膏状，得粗提物浸膏；
b.将粗提物浸膏悬浮在蒸馏水中，按照极性由小到大的顺序，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，合并相同有机溶剂层，分别得石油醚层、乙酸乙酯层以及正丁醇层，将所述乙酸乙酯层减压浓缩后即得粘委陵菜粗提物的乙酸乙酯提取物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤a中，所述粘委陵菜为粘委陵菜的地上部分或根。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防治脂肪蓄积症药物是由所述粘委陵菜总黄酮有效部位提取物与药学上可接受的载体或辅料组成。
4.一种具有抑制脂肪蓄积作用的黄酮类化合物的分离方法，其特征在于，所述黄酮类化合物是从权利要求1所述粘委陵菜总黄酮有效部位提取物中分离得到，分离方法包括以下步骤：
(1)对所述粘委陵菜总黄酮有效部位提取物采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比依次为100:1～1:1的石油醚-乙酸乙酯系统以及100％甲醇作为流动相进行梯度洗脱，每个梯度的流动相的使用量为柱体积的10-50倍，以每个梯度的流动相为一个馏分，得到6个馏分，分别为馏分E-1～E-6；
(2)对馏分E-2采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比为50:1～1:1的石油醚-乙酸乙酯系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到8个馏分E-2-1～E-2-8，对馏分E-2-8采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比为30:1～3:1的石油醚-乙酸乙酯系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到10个馏分E-2-8-1～E-2-8-10，对馏分E-2-8-7用乙酸乙酯重结晶，得到化合物9；
(3)对馏分E-4用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比为500:1～10:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到化合物3及6个馏分E-4-1～E-4-6；
(4)对馏分E-4-3用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比为150:1～40:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到6个馏分E-4-3-1～E-4-3-6，对馏分E-4-3-5采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比为80:1～15:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到8个馏分E-4-3-5-1～E-4-3-5-8，对馏分E-4-3-5-3采用反相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为2:1甲醇-水系统作为流动相进行洗脱，并根据薄层层析结果，得到化合物10；
(5)对馏分E-4-3-3采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，用体积比为12:1～1:1的石油醚-丙酮系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到7个馏分E-4-3-3-1～E-4-3-3-7，对馏分E-4-3-3-6采用反相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为3:2的甲醇-水系统作为流动相进行洗脱，并根据薄层层析结果，得到化合物11；
(6)对E-6采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为90:1～1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相为进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到8个馏分E-6-1～E-6-8，对馏分E-6-3采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为70:1～1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到12个馏分E-6-3-1～E-6-3-12，对馏分E-6-3-1采用葡聚糖凝胶柱层析进行分离，在分离过程中，用100％甲醇作为流动相进行洗脱，得到馏分E-6-3-1-2和化合物4；
(7)对馏分E-6-4采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为80:1～1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到7个馏分E-6-4-1～E-6-4-7，对馏分E-6-4-6采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为20:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行洗脱，并根据薄层层析结果，得到化合物8；
(8)对馏分E-6-4-2采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为6:1～1:1的石油醚-乙酸乙酯系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到6个馏分E-6-4-2-1～E-6-4-2-6，对馏分E-6-4-2-2采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为25:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，得到化合物5；
(9)对馏分E-6-6采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为80:1～1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到7个馏分E-6-6-1～E-6-6-7，对馏分E-6-6-2采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为80:1～10:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到11个馏分E-6-6-2-1～E-6-6-2-11，对馏分E-6-6-2-3采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为14:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行洗脱，并根据薄层层析结果，得到化合物7；
(10)对馏分E-6-6-4采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为75:1～1:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，合并相同馏分，得到8个馏分E-6-6-4-1～E-6-6-4-8，对馏分E-6-6-4-4采用正相硅胶柱层析进行分离，在分离过程中，以体积比为11:1的二氯甲烷-甲醇系统作为流动相进行梯度洗脱，并根据薄层层析结果，得到化合物6；
其中，所述化合物3为3,8,4'-三甲基草质素；化合物4为3,8-二甲基草质素；化合物5为5,7,4'-三羟基-3-甲氧基-6-C-甲基黄酮；化合物6为黄芩苷；化合物7为委陵菜黄酮；化合物8为6-甲基芹黄素；化合物9为芹菜素；化合物10为杜鹃素；化合物11为8-去甲杜鹃素。
5.一种黄酮组合物，其特征在于，包括化合物3和化合物4中的一种或两种，所述化合物3和化合物4通过权利要求4所述的分离方法制备得到。
6.根据权利要求5所述的黄酮组合物，其特征在于，所述黄酮组合物还包括化合物5～11中的任意一种或一种以上，其中所述化合物5～11通过权利要求4所述的分离方法制备得到。
7.权利要求5～6中任一项所述的黄酮组合物在制备防治脂肪蓄积症药物中的应用。
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