CN111053900A - 一种靶向肿瘤、提高放疗敏感性的血小板载药体系及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种靶向肿瘤、提高放疗敏感性的血小板载药体系，血小板载药体系指大鼠血小板载药体系，是mPEG‑PCL修饰阿托伐醌、PEG修饰纳米金与大鼠血小板的混合物即Ato‑Au@Plt；所述靶向肿瘤，提高放疗敏感性所述的血小板载药体系采用血小板为载体，实现体内长循环及肿瘤微环境靶向释放药物，提高肿瘤的放疗敏感性。本发明通过肿瘤微环境激活血小板载体，发生变形、聚集、靶向肿瘤释放药物；释放的药物能够抑制肿瘤细胞氧化磷酸化，解决乏氧，同时与纳米金协同作用，提高肿瘤对放疗的敏感性，继而提高放疗治疗效果。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种靶向肿瘤、提高放疗敏感性，继而提高放疗治疗效果的 载药体系。
背景技术
尽管目前已有多种抗肿瘤药物上市，但是由于肿瘤靶向性不佳，肿瘤内蓄积 能力较差，使得抗肿瘤效果不尽如人意。如何高效地将抗肿瘤药物递送入肿瘤， 提高药物在肿瘤部位的浓度，降低其在正常组织中的浓度，成为制药领域研究的 热点。
放疗几乎适用于所有的肿瘤，但治疗效果不尽相同，其中肿瘤细胞的含氧量 直接影响了放疗的敏感性。放疗增敏是提高放疗效果、减少副作用的有效做法。 放疗增敏剂及解决肿瘤乏氧能够起到提高放疗敏感性的良好效果。
发明内容
本发明的目的是，为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种能够实现肿瘤 靶向释药、提高放疗敏感性的新药物及制备方法。为了达到上述目的，本发明提 供了一种实现肿瘤靶向释药、提高放疗敏感性药物(Ato-Au@PLT)。本发明还提 供了上述血小板载药体系的制备方法。本发明还提供了上述血小板载药体系在放 疗抗肿瘤方面的应用。
本发明的技术方案：一种靶向肿瘤、提高放疗敏感性的血小板载药体系，血 小板载药体系指大鼠血小板载药体系，是mPEG-PCL修饰阿托伐醌、PEG修饰纳 米金与大鼠血小板(也可以是其它血小板)的混合物；所述靶向肿瘤，提高放疗 敏感性的所述血小板载药体系指采用大鼠血小板为载体，实现体内长循环及肿瘤 微环境靶向释放药物，提高肿瘤的放疗敏感性。
所述靶向肿瘤、提高放疗敏感性的所述血小板载药体系的粒径为1664±27nm。
所述大鼠血小板载药体系即Ato-Au@Plt的粒径激活后从1664nm逐步变小， 最终粒径为46.47nm。
所述靶向肿瘤、提高放疗敏感性的血小板载药体系的制备方法，包括以下步 骤：
(1)血小板的提取：经过收集、分离、抑制活化等步骤，获得血细胞载体；
(2)阿托伐醌的预处理：对阿托伐醌进行疏水改性；
(3)血小板包载阿托伐醌及纳米金：将步骤(1)制备的大鼠血小板包裹纳 米金及步骤(2)得到的阿托伐醌，得到大鼠血小板载药体系Ato-Au@PLT。
所述步骤(1)中血小板的收集、分离、抑制活化等步骤制备血小板载体具体 步骤如下：
(1)SPF级SD大鼠，10％水合氯醛溶液，按0.3mL/kg体质量行腹腔注射麻醉， 三线定位确定穿刺位点，使用采血针采血，利用采血管负压收集血液。
(2)为了分离血小板，将血液和血浆样品在室温下以100g离心20分钟以分离 红细胞和白细胞。
(3)将得到的血小板以100g离心20分钟以除去剩余的血细胞。将含有1mM EDTA和2mM前列腺素E1(PGE1，Sigma Aldrich)的PBS缓冲液加入到纯化的 血细胞中以防止血小板活化。
(4)通过在室温下以800g离心20分钟沉淀血小板，之后弃去上清液并将血小 板重悬于含有1mM EDTA的PBS中并与蛋白酶抑制剂(Pierce)混合。
所述的制备方法步骤(2)中：取mPEG-PCL与阿托伐醌，质量比2：1，将阿 托伐醌溶解于DMSO，再分散在纯水中，加入mPEG-PCL，搅拌0.5h。
所述的制备方法步骤(3)：将PEG溶解于纯水中，并按体积比1：1与纳米金 溶液混合，旋转搅拌0.5h。对阿托伐醌进行疏水改性及纳米金提高稳定性后 与血小板混合，超声80W 15分钟。
所述靶向肿瘤、提高放疗敏感性的血小板载药体系在制备治疗肿瘤方面的应用。
本发明提供抑制肿瘤细胞线粒体呼吸药物及肿瘤增敏剂纳米金采用血小板包载；肿瘤微环境激活血小板载体，发生变形、聚集、靶向肿瘤释放药物；释放的 药物能够抑制肿瘤细胞氧化磷酸化，解决乏氧，同时与纳米金协同作用，提高肿 瘤对放疗的敏感性，继而提高放疗治疗效果。采用本发明实现体内长循环，药物 释放实现肿瘤微环境响应释放，靶向肿瘤，抑制肿瘤细胞氧化磷酸化，解决乏氧， 提高纳米金的放疗增敏效果，继而提高放疗治疗效果。
本发明相比现有技术具有以下效果：提高药物的肿瘤靶向性：药物经过血小 板包载后，能够正常在血液中循环，不会被血液清楚；当到达肿瘤部位，载药血 小板会被激活，从而聚集、释放内容药物，达到体内长循环及靶向释放药物的目 的。
提高放疗敏感性：放疗是氧依赖性的治疗方法，乏氧会大大降低放疗的效果。 本研究中采用抑制肿瘤细胞的氧化磷酸化，减少对氧气的消耗，更加有效地降低 肿瘤的氧消耗，从而解决肿瘤乏氧；同时增加了纳米金，提高放疗增敏作用，达 到了良好的效果。
减少放疗副作用：放疗效果低下，往往采用提高放疗剂量的方法，但这样副 作用比较大。本研究中解决了放疗效果低下的根本原因，使得放疗效果大大提高， 从而能够在低剂量下达到杀伤肿瘤细胞的放疗效果，也减少了放疗对正常组织的 损伤。
为低剂量放疗提高数据积累：本研究中提出的靶向肿瘤、提高放疗敏感性的 治疗策略，有望能够为现有的临床试验提供理论依据和实验室数据。也为提高肿 瘤治疗效果提供一个新思路。
附图说明
图1为本发明Ato-Au@Plt血小板靶向肿瘤、解决乏氧提高肿瘤放射治疗效果 示意图。图中，(A)血小板靶向肿瘤纳米粒子Ato-Au@Plt的制备过程；(B) Ato-Au@Plt靶向肿瘤过程：Ato-Au@Plt在血管内循环，在肿瘤微环境中，血小板 被激活、集聚；(C)Ato-Au@Plt在肿瘤微环境中聚集、释放内容物；(D)Ato 干扰线粒体电子传递，解决乏氧；
图2为本发明Ato-Au@Plt的激活过程。图中，(A-C)SEM表征图，依次 是激活开始、激活中、激活后；(D)Ato-Au@Plt的激活前后的DLS粒径分布 图；(E、F)Ato-Au@Plt激活过程中，上清中内容物释放百分比；
图3为本发明Ato-Au@Plt的体内靶向结果。图中，(A)Ato-Au@Plt主要是 集聚在肿瘤部位。Ato-Au NPs直接静脉注射后，很快就集聚在肝脏部位被清除。 (B)Ato-Au@Plt组在肝脏和肿瘤组织中出现富集；而Ato-Au NPs组仅在肝脏中 出现富集；
图4为本发明Ato-Au@Plt抑制细胞呼吸作用结果。图中，(A)溶液溶解 氧监测示意图；(B)给药24h后，溶解氧剩余百分比；(C)溶解氧—时间变 化曲线；(D)给药6h激活Ato-Au@Plt溶解氧变化曲线图；(E)激活与非 激活Ato-Au@Plt给药后细胞数量柱状图。
图5为本发明Ato-Au@Plt给药后荷瘤小鼠瘤体积变化及生存情况。图中，(A) 给药方案；(B)体积变化曲线；(C)肿瘤重量变化曲线；(D)生存率变化曲 线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
本发明靶向肿瘤、提高放疗敏感性的血小板载药体系的具体制备过程如下：
1.血小板的制备
(1)SPF级SD大鼠，10％水合氯醛溶液，按0.3mL/kg体质量行腹腔注射麻醉， 三线定位确定穿刺位点，使用采血针采血，利用采血管负压收集血液。
(2)为了分离血小板，将血液和血浆样品在室温下以100g离心20分钟以分离 红细胞和白细胞。
(3)将得到的血小板以100g离心20分钟以除去剩余的血细胞。将含有1mM EDTA和2mM前列腺素E1(PGE1，Sigma Aldrich)的PBS缓冲液加入到纯化的 血细胞中以防止血小板活化。
(4)通过在室温下以800g离心20分钟沉淀血小板，之后弃去上清液并将血小 板重悬于含有1mM EDTA的PBS中并与蛋白酶抑制剂(Pierce)混合。
2.纳米金的制备：
(1)合成过程中所有需使用的玻璃仪器都经重铬酸钾溶液中浸泡过夜，然后 用去离子水冲洗干净，烘干备用。
(2)氯金酸、柠檬酸三钠及所使用的Milli-pore纯水均用0.22μm膜过滤。将 100mL过滤水和1mL 10mg/mL氯金酸先后加入到三颈烧瓶中，用控温电热套加热 至沸腾。
(3)在快速搅拌下，用移液管吸取1mL 10mg/mL柠檬酸三钠迅速注入三颈 烧瓶中，反应10min，观察到溶液颜色由无色→蓝紫色→酒红色。
(4)10min后，将三颈烧瓶移至恒温磁力搅拌器，调整转速，不加热，反应 10min，调整金胶溶液的体积，制得100ppm的纳米金。
3.Ato-Au@Plt的制备
(1)对阿托伐醌进行疏水改性：取mPEG-PCL(甲氧基聚乙二醇-聚ε-己内酯， 是一种嵌段共聚物,一端是亲水链段-甲氧基聚乙二醇,一端是亲油链段-聚ε-己内酯) 与阿托伐醌，质量比2：1，将阿托伐醌溶解于DMSO(二甲基亚砜)，再分散在纯 水中，加入mPEG-PCL，搅拌0.5h。
(2)纳米金提高稳定性：将PEG溶解于纯水中，并按体积比1：1与纳米金 溶液混合，旋转搅拌0.5h。
(3)将mPEG-PCL修饰的阿托伐醌、PEG修饰纳米金与血小板混合，超声 80W 15分钟。
4.结果：
4.1实验设计示意图
如图1所示为Ato-Au@PT的制备过程及肿瘤靶向释放、提高放疗敏感性机制。 本发明制备的血小板载药体系具有对肿瘤具有靶向响应，并释放阿托伐醌和纳米 金。阿托伐醌能够解决肿瘤乏氧，进而提高纳米金的放疗增敏效果，达到提高放 疗治疗效果的目的。
4.2肿瘤响应释放结果
如图2所示为Ato-Au@Plt的激活过程。(图A-C)SEM表征图，依次是激活 开始、激活中、激活后；可以看出Ato-Au@Plt激活后，开始出现“触角”，随着 时间的延长，“触角”变长，并且相互集聚、融合。当到4h以后，Ato-Au@Plt的 血小板膜全部破裂，并包裹在内容物的表面，从而形成小颗粒。(图D)Ato-Au@Plt 的激活前后的DLS粒径分布图；Ato-Au@Plt的粒径从1664nm逐步变小，激活后 平均粒径为46.47nm。(图E、F)Ato-Au@Plt激活过程中，上清中内容物释放百 分比；在正常状态下，血小板不激活，不会释放内容物。而在低pH条件下，血小 板会被激活，逐步释放内容物。上清中的纳米金和阿托伐醌的含量逐步增加。
如图3Ato-Au@Plt活体成像结果。(A)Ato-Au@Plt主要是集聚在肿瘤部位。 Ato-AuNPs直接静脉注射后，很快就集聚在肝脏部位被清除。(B)Ato-Au@Plt 组在肝脏和肿瘤组织中出现富集；而Ato-Au NPs组仅在肝脏中出现富集；说明本 发明构建的Ato-Au@Plt能够起到靶向肿瘤，释放内容物的作用。
4.3解决乏氧效果
如图4Ato-Au@Plt解决乏氧效果。(A)溶液溶解氧监测示意图；(B)给药24h后，溶解氧剩余百分比；(C)溶解氧—时间变化曲线；(D)激活与非激活 Ato-Au@Plt给药后细胞生长曲线；(E)膜电位变化荧光图。
给药后24小时，DMEM中无细胞，氧气未被消耗，以该组为100％，如图4B。 HeLa细胞组及HeLa细胞被纳米金、血小板膜处理后，溶液中的氧含量降为为原 来的20％-30％。而经过阿托伐醌(Atovaquone)和Ato-Au@Plt处理后，溶解氧抑 制率为67％。这主要是阿托伐醌能够抑制细胞线粒体的电子传递，从而抑制线粒 体的呼吸作用，进而使得细胞不能消耗氧气。
随后，为证明我们的猜想，对Ato-Au@Plt处理组的溶解氧进行实时监测，结 果如图4C，Ato-Au@Plt处理12h后后，氧的消耗量下降。而HeLa细胞组继续 消耗氧，直到溶液中的溶解氧下降到4ppm左右。细胞增殖方面，在6h时，HeLa 细胞未处理组、Ato-Au@Plt激活和未激活组的细胞数量没有统计学差异。但在18 h时，Ato-Au@Plt激活组的细胞数量要少于其他2组(P≤0.01)。说明细胞的呼吸 作用被抑制后，细胞的生长速度明显减缓。并且从E图中可以看出，采用 Ato-Au@Plt处理后24h，Ato-Au@Plt被激活，所以线粒体的膜电位出现异常， 此时线粒体发出绿色的荧光。
4.4提高肿瘤治疗效果
图5为本发明Ato-Au@Plt给药后荷瘤小鼠瘤体积变化及生存情况。(A)给 药方案；(B)体积变化曲线；(C)肿瘤重量变化曲线；(D)生存率变化曲线；
可以看出，与对照组(PBS)相比，Ato治疗组的荷瘤小鼠在开始时(7天内) 表现出肿瘤生长缓慢，之后很快就以生长速度高于PBS+RT 2Gy治疗组。与之形 成鲜明对比的是Ato-Au@Plt+RT 2Gy治疗组在X-射线的协同作用下，肿瘤体积 随时间推移，逐步减小。为更加准确的得到肿瘤生长速度的数据，我们对肿瘤进 行剥离，并称重，结果如图C。我们同样发现Ato-Au@Plt+RT 2Gy治疗组的肿 瘤明显小于其他组，P≤0.01。
通过对荷瘤小鼠的生存率计算得出：Ato-Au@Plt+RT 2Gy组中的所有给药的 小鼠在3周后仍然存活，而单独给药Ato-Au@Plt或PBS的荷瘤小鼠的存活率分别 仅为70或60％。
Claims (8)
1.一种靶向肿瘤、提高放疗敏感性的血小板载药体系，其特征在于：血小板载药体系指大鼠血小板载药体系，是mPEG-PCL修饰阿托伐醌、PEG修饰纳米金与大鼠血小板的混合物即Ato-Au@Plt；所述靶向肿瘤，提高放疗敏感性所述的血小板载药体系采用血小板为载体，实现体内长循环及肿瘤微环境靶向释放药物，提高肿瘤的放疗敏感性。
2.根据权利要求1所述的靶向肿瘤、提高放疗敏感性的血小板载药体系，其特征在于：所述靶向肿瘤、提高放疗敏感性的血小板载药体系粒径为1664±27nm。
3.根据权利要求2所述的靶向肿瘤、提高放疗敏感性的血小板载药体系，其特征在于：所述血小板载药体系Ato-Au@Plt的粒径激活后从1664nm逐步变小，最终粒径为46.47nm。
4.权利要求1至3任一所述靶向肿瘤、提高放疗敏感性的血小板载药体系的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)血小板的提取：经过收集、分离、抑制活化等步骤，获得血细胞载体；
(2)阿托伐醌的预处理：对阿托伐醌进行疏水改性；
(3)血小板包载阿托伐醌及纳米金：将步骤(1)制备的血小板包裹纳米金及步骤(2)得到的阿托伐醌，得到血小板载药体系Ato-Au@PLT。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中收集、分离、抑制活化等步骤制备血小板载体具体步骤如下：
(1)SPF级SD大鼠，10％水合氯醛溶液，按0.3mL/kg体质量行腹腔注射麻醉，三线定位确定穿刺位点，使用采血针采血，利用采血管负压收集血液。
(2)为了分离血小板，将血液和血浆样品在室温下以100g离心20分钟以分离红细胞和白细胞。
(3)将得到的血小板以100g离心20分钟以除去剩余的血细胞。将含有1mM EDTA和2mM前列腺素E1(PGE1，Sigma Aldrich)的PBS缓冲液加入到纯化的血细胞中以防止血小板活化。
(4)通过在室温下以800g离心20分钟沉淀血小板，之后弃去上清液并将血小板重悬于含有1mM EDTA的PBS中并与蛋白酶抑制剂(Pierce)混合。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中：取mPEG-PCL与阿托伐醌，质量比2：1，将阿托伐醌溶解于DMSO，再分散在纯水中，加入mPEG-PCL，搅拌0.5h。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中其特征在于：将PEG溶解于纯水中，并按体积比1：1与纳米金溶液混合，旋转搅拌0.5h。对阿托伐醌进行疏水改性及纳米金提高稳定性后与血小板混合，超声80W 15分钟。
8.权利要求1至3任一所述靶向肿瘤、提高放疗敏感性的血小板载药体系在制备治疗肿瘤方面的应用。
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