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CN111051339A - 活性mmp-9-结合肽 - Google Patents

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CN111051339A
CN111051339A CN201880047818.5A CN201880047818A CN111051339A CN 111051339 A CN111051339 A CN 111051339A CN 201880047818 A CN201880047818 A CN 201880047818A CN 111051339 A CN111051339 A CN 111051339A
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CN
China
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peptide
mmp
active
amino acid
acid sequence
Prior art date
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Application number
CN201880047818.5A
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矢野秀法
西宫大祐
桥本隆二
新津阳一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daiichi Sankyo Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明提供了新型肽。这种肽具有SEQ ID NO:18代表的氨基酸序列，并且结合活性蛋白酶，但不结合前体蛋白酶。

Description

活性MMP-9-结合肽
技术领域
本发明涉及肽、多核苷酸、载体、细胞、用于产生肽的方法、通过此类方法获得的肽、含有该肽的组合物、含有该肽的药物组合物、用于治疗或预防各种疾病的含有该肽的药物组合物、该肽用于治疗或预防各种疾病的用途、包括施用该肽的步骤的用于治疗各种疾病的方法、用于诊断或测试各种疾病的含有该肽的组合物等。
背景技术
基质金属蛋白酶9(MMP-9)是一种金属蛋白酶(宗族MA，家族M10)，并且由N-末端前肽、与锌离子配位的酶活性结构域、参与结合底物的II型纤连蛋白结构域和C-末端HPX结构域构成(非专利文献1)。MMP-9作为MMP-9的无活性、前体形式(前-MMP-9)分泌，且然后前-MMP-9通过用蛋白酶诸如MMP-3或纤溶酶切割前肽而转化为MMP-9的活化形式(活性MMP-9)(非专利文献2和3)。活性MMP-9切割许多作为底物的细胞外基质蛋白(诸如IV型胶原蛋白和弹性蛋白)或细胞因子(诸如IL-1β和IL-8)，并且参与许多生理功能，诸如细胞增殖、分化、迁移和凋亡(非专利文献4)。
据信，由于组织结构的破坏和细胞功能的失调，MMP-9的过度增强导致各种疾病的发展或恶化。具体而言，已经表明，MMP-9的过度增强深度参与此类疾病的病理生理学，例如，在许多炎性疾病诸如结肠炎中，参与上皮结构和屏障功能的破坏以及炎性反应的连续扩增，同时，在血管疾病诸如脑血管病症和主动脉疾病中，参与血-脑屏障或基底膜的失败以及弹性纤维的破坏。预期抑制过度增强的MMP-9活性的MMP-9抑制剂是作为治疗MMP-9相关疾病的药剂的候选物，并且迄今为止已鉴定出许多MMP-9抑制剂。螯合与MMP-9的酶活性中心配位的锌离子的低分子量化合物具有有效的MMP-9抑制活性。然而，由于MMP家族分子的活性中心的氨基酸序列具有非常高的同源性，因此这些化合物也强烈抑制其他MMP的活性(非专利文献5)。在其中施用此类非选择性MMP-9抑制剂的临床试验中，在肌肉骨骼系统中观察到严重的副作用，因此已经停止此类抑制剂的开发(非专利文献6和7)。当靶向酶活性中心时，使用低分子量抑制剂难以获得MMP-9特异性抑制剂。
根据抗体药物产生技术的进步，已经进行尝试以使用抗体分子来获取抑制MMP的抗体。此外，已经报道了一些抑制MMP-9的抗体。然而，结合酶活性中心、同时表现出有效的MMP-9抑制活性的抗体，也表现出MMP-2和MMP-14抑制活性，因此它们不能特异性抑制MMP-9(专利文献1、2和3以及非专利文献8)。此外，结合MMP家族分子之间的低氨基酸序列同源性的区域、同时具有有效的MMP-9特异性抑制活性的抗体，不仅结合活性MMP-9，而且结合非活性的前-MMP-9，因此它们不能特异性结合活性MMP-9(专利文献4、5和6，以及非专利文献9和10)。还报道了不结合前-MMP-9、但确实特异性结合活性MMP-9且特异性抑制MMP-9活性的抗体(专利文献7和8，以及非专利文献11)。然而，除了抗体或其片段以外，不结合前-MMP-9、但确实特异性结合活性MMP-9并抑制MMP- 9活性的低分子量蛋白(例如，不含免疫球蛋白可变区的蛋白或肽)是未知的。
SPINK2(丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal-2型)是具有三个二硫键的Kazal-样结构域，并且作为胰蛋白酶/顶体蛋白抑制剂发挥功能(非专利文献12)。SPINK2和活性MMP-9-结合活性之间的关系尚未阐明。
引文列表
专利文献
专利文献1：WO2004/087042
专利文献2：WO2008/102359
专利文献3：WO2011/092700
专利文献4：WO2012/027721
专利文献5：WO2013/130078
专利文献6：WO2013/130905
专利文献7：WO2016/023972
专利文献8：WO2016/023979
非专利文献
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发明概述
技术问题
本发明的一个目的是提供新型的活性基质金属蛋白酶9(MMP-9)结合肽。
问题的解决方案
本发明主要涉及以下内容。
(1) SPINK2突变型肽，其包含由SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列，并且结合活性人MMP-9，但不结合前人MMP-9。
(2)根据(1)所述的SPINK2突变型肽，其中所述肽结合活性人MMP-9的酶活性结构域。
(3)根据(1)或(2)所述的肽，其中所述肽抑制人MMP-9的蛋白酶活性。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的肽，其中所述抑制对MMP-9是特异性的。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的肽，其中X1是Asp或Gly。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的肽，其中X7是Pro，X9是Gln，且X10是Met。
(7)根据(6)所述的肽，其中X2是Arg、Gln、Gly、Trp或Tyr；X3是Arg、Asp、Gln、Glu、Lys、Met、Ser、Thr或Val；X4是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Gly、Leu、Lys或Val；X5是Ala、Arg、Asn、Gly、Ile、Leu或Lys；X6是Ala、Glu、Gly、Met或Ser；X8是Ala、Leu或Ser；X11是Ala、Gly或Ser；X12是Leu、Phe、Ser或Tyr；且X13是Asn、Asp、Gln、Leu或Lys。
(8)根据(7)所述的肽，其中X2是Arg或Gln；X3是Arg、Gln、Lys、Thr或Val；X4是Arg、Gly或Val；X5是Arg、Gly、Ile或Lys；X6是Glu或Gly；X8是Ala或Ser；X11是Ala、Gly或Ser；X12是Phe或Tyr；且X13是Asn、Gln或Lys。
(9)根据(8)所述的肽，其中所述肽包含由SEQ ID NO:2至6和8(图16至20和22)中的任一个代表的氨基酸序列。
(10)根据(1)至(5)中任一项所述的肽，其中X6是Tyr，X8是Gln，且X9是Ser。
(11)根据(10)所述的肽，其中X2是Arg、Lys、Met或Val；X3是Arg、Gln、Lys或Met；X4是Phe或Tyr；X5是Gln、Glu或Lys；X7是Ala或Gly；X10是Asn或His；X11是Leu、Lys、Met或Val；X12是Phe、Ser或Tyr；且X13是Ala、Asn、Gln或Lys、Gln或Lys。
(12)根据(11)所述的肽，其中X2是Met或Val；X3是Met；X4是Tyr；X5是Lys；X7是Ala；X10是His；X11是Lys；X12是Ser或Tyr；且X13是Gln或Lys。
(13)根据(12)所述的肽，其中所述肽包含由SEQ ID NO:7(图21)或SEQ ID NO:9(图23)代表的氨基酸序列。
(14)根据(1)至(13)中任一项所述的肽，其中所述肽包含具有以下的氨基酸序列：
SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列；和
1至3个氨基酸残基或SEQ ID NO:19(图33)或SEQ ID NO:20(图34)代表的氨基酸序列，其添加至SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列的氨基末端侧。
(15)根据(1)至(14)中任一项所述的肽，其中所述肽包含具有以下的氨基酸序列：
SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列；和
由添加至SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列的羧基末端侧的1至6个氨基酸组成的氨基酸序列。
(16)根据(1)至(15)中任一项所述的肽，其中所述肽包含由SEQ ID NO:2至17(图16至31)中的任一个代表的氨基酸序列。
(17)根据(1)至(16)中任一项所述的肽，其中所述肽具有特征在于具有三个二硫键且包括环结构、α-螺旋和β-片层的构象。
(18)多核苷酸，其包含编码根据(1)至(17)中任一项所述的肽中含有的氨基酸序列的核苷酸序列。
(19)载体，其包含根据(18)所述的多核苷酸。
(20)细胞，其包含根据(18)所述的多核苷酸或根据(19)所述的载体，或产生根据(1)至(17)中任一项所述的肽。
(21)用于产生SPINK2突变型肽的方法，其包括以下步骤(i)和(ii)：
(i)培养根据(20)所述的细胞；和
(ii)从培养物回收SPINK2突变型肽。
(22)用于产生根据(1)至(17)中任一项所述的肽的方法，其包括通过化学合成或体外翻译制备所述肽的步骤。
(23)通过根据(21)或(22)所述的方法获得的SPINK2突变型肽。
(24)缀合物，其包含根据(1)至(17)和(23)中任一项所述的肽以及与其结合的另一部分。
(25)根据(24)所述的缀合物，其中所述缀合物是肽。
(26)根据(24)或(25)所述的缀合物，其中所述缀合物包含免疫球蛋白Fc区或其功能片段。
(27)用于产生根据(24)至(26)中任一项所述的SPINK2突变型肽缀合物的方法，其包括以下步骤(i)和(ii)：
(i)培养细胞，所述细胞含有具有编码所述缀合物中含有的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸或已经向其中插入所述多核苷酸的载体；和
(ii)从所述培养物回收所述SPINK2突变型肽缀合物或所述缀合物中含有的肽。
(28)用于产生根据(24)至(26)中任一项所述的SPINK2突变型肽缀合物的方法，其包括通过化学合成或体外翻译制备所述缀合物或所述缀合物中含有的肽的步骤。
(29)通过根据(27)或(28)所述的方法产生的缀合物。
(30)抗体或其功能片段，其结合根据(1)至(17)和(23)中任一项所述的肽。
(31)组合物，其包含根据(1)至(17)和(23)中任一项所述的肽，根据(18)所述的多核苷酸，根据(19)所述的载体，根据(20)所述的细胞，根据(24)至(26)和(29)中任一项所述的缀合物，和/或根据(30)所述的抗体或其功能片段。
(32)用于测试或诊断的组合物，其包含根据(1)至(17)和(23)中任一项所述的肽和/或根据(24)至(26)和(29)中任一项所述的缀合物。
(33)用于检测活性MMP-9的方法，其包括以下步骤(i)和(ii)：
(i)使根据(1)至(17)和(23)中任一项所述的肽和/或根据(24)至(26)和(29)中任一项所述的缀合物与测试样品接触；和
(ii)测量与所述测试样品中的组分结合的SPINK2突变型肽和/或缀合物。
(34)根据(33)所述的方法，其中步骤(ii)是回收与所述测试样品接触的SPINK2突变型肽和/或缀合物和测量与所述SPINK2突变型肽和/或缀合物结合的活性MMP-9的量或活性的步骤。
(35)药物组合物，其包含根据(1)至(17)和(23)中任一项所述的肽，根据(18)所述的多核苷酸，根据(19)所述的载体，根据(20)所述的细胞，和/或根据(24)至(26)和(29)中任一项所述的缀合物。
(36)根据(35)所述的药物组合物，其用于治疗或预防MMP-9相关疾病。
(37)根据(36)所述的药物组合物，其中所述MMP-9相关疾病是炎性/自身免疫疾病、神经退行性疾病、精神疾病、血管疾病或恶性肿瘤。
(38)根据(37)所述的药物组合物，其中所述炎性/自身免疫疾病是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、支气管哮喘、间质性肺炎、慢性阻塞性肺疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肝炎、湿疹(或皮炎)、银屑病、扁平苔藓、红斑/红皮病、荨麻疹、秃头症、天疱疮、寻常痤疮、压力性溃疡/伤口、结膜炎、角膜炎、鼻炎、口腔炎、舌炎、白塞氏病、多发性硬化症、脑炎、头痛、周围神经炎、糖尿病性并发症(糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病)、动脉粥样硬化、胰腺炎、慢性心力衰竭或肾炎。
(39)根据(37)所述的药物组合物，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、额颞叶痴呆、脑损伤、脊髓损伤、缺氧、惊厥或创伤性脑病。
(40)根据(37)所述的药物组合物，其中所述精神疾病是重度抑郁症、双相情感障碍、焦虑症、创伤后应激障碍(PTSD)、进食障碍、睡眠障碍、精神分裂症、成瘾、自闭症、脆性X综合征、注意缺陷多动障碍或唐氏综合症。
(41)根据(37)所述的药物组合物，其中所述血管疾病是脑血管病症、脑动脉瘤、脑淀粉样血管病、外周血管病症、主动脉瘤、主动脉夹层、动静脉瘘、动脉硬化、高安动脉炎、川崎病、静脉曲张或血管钙化。
(42)根据(37)所述的药物组合物，其中所述恶性肿瘤是肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌或神经胶质瘤。
(43)用于测试或诊断的组合物，其包含根据(30)所述的抗体或其功能片段。
(44)根据(21)、(22)、(27)或(28)所述的方法，其包括使用根据(30)所述的抗体或其功能片段的亲和纯化步骤。
(45)用于鉴定人MMP-9抑制性SPINK2突变型肽的方法，其包括以下步骤(i)至(iii)：
(i)在待测试的SPINK2突变型肽存在和不存在的情况下孵育人MMP-9蛋白酶和底物；
(ii)在待测试的SPINK2突变型肽存在和不存在的情况下测量人MMP-9蛋白酶活性；和
(iii)比较在SPINK2突变型肽存在的情况下的人MMP-9蛋白酶活性与在SPINK2突变型肽不存在的情况下的人MMP-9蛋白酶活性，和当在SPINK2突变型肽存在的情况下的人MMP-9蛋白酶活性小于在SPINK2突变型肽不存在的情况下的人MMP-9蛋白酶活性时，确定所述SPINK2突变型肽是阳性的。
(46)用于鉴定人MMP-9特异性抑制化合物的方法，其包括以下步骤(i)至(iii)：
(i)在具有SEQ ID NO:2至17(图16至31)中的任一个代表的氨基酸序列的肽存在的情况下，使测试化合物结合人活性MMP-9；
(ii)确定所述化合物是否与所述肽竞争结合人活性MMP-9；和
(iii)确定所述化合物是否具有人MMP-9特异性结合活性。
(47)根据(46)所述的方法，其中所述化合物是SPINK2突变型肽。
(48)根据(46)所述的方法，其中所述化合物是抗体或抗原结合蛋白。
(49)根据(45)、(47)或(48)所述的方法，其进一步包括通过化学合成、体外翻译或重组制备肽、抗体或抗原结合蛋白的步骤。
本发明的有利效果
本发明提供的肽或包含该肽的药物组合物具有活性MMP-9-结合活性，且因此可用于治疗或预防MMP-9相关疾病、检测活性MMP-9等。
附图简述
[图1(A)] 图1(A)是显示人/猴/大鼠/小鼠MMP-9的序列相似性的比较的图表。虚线表示前肽(人MMP-9：Ala20至Arg106)。实线表示含有纤连蛋白II型结构域(人MMP-9：Ala225至Ser273，Ala283至Thr331，Ser342至Asp390)的酶活性结构域(人MMP-9：Phe107至Pro449)。
[图1(B)] 图1(B)是显示人/猴/大鼠/小鼠MMP-9的序列相似性的比较的图表(续)。
[图1(C)] 图1(C)是显示人/猴/大鼠/小鼠MMP-9的序列相似性的比较的图表(续)。
[图2(A)] 图2(A)是显示使用添加至活性MMP-9-结合肽的氨基末端的标签的检测强度作为指标的每种结合肽或野生型SPINK2的活性人MMP-9-结合活性的评估的图(n＝2)。
[图2(B)] 图2(B)是显示使用添加至活性MMP-9-结合肽的氨基末端的标签的检测强度作为指标的每种结合肽或野生型SPINK2的前人MMP-9-结合活性的评估的图(n＝2)。
[图3] 图3是显示活性MMP-9-结合肽的活性人MMP-9-结合活性EC50的表格(n＝2)。
[图4(A)] 图4(A)是显示使用底物肽的降解率作为指标评估活性MMP-9-结合肽的人MMP-9抑制活性的图(n＝3，平均值±SD)。
[图4(B)] 图4(B)是显示使用底物肽的降解率作为指标评估活性MMP-9-结合肽的人MMP-9抑制活性的图(n＝3，平均值±SD)(续)。
[图5] 图5是显示当使用底物肽时活性MMP-9-结合肽的人MMP-9抑制常数Ki的表格(n＝3，平均值±SD)。
[图6] 图6是显示使用底物明胶的降解率作为指标评估活性MMP-9-结合肽的人MMP-9抑制活性的图(n＝3，平均值±SD)。
[图7] 图7是显示当使用底物明胶时活性MMP-9-结合肽的人MMP-9抑制活性IC50的表格(n＝3，平均值±SD)。
[图8] 图8是显示使用底物肽的降解率作为指标评估活性MMP-9-结合肽的小鼠MMP-9抑制活性的图(n＝3，平均值±SD)。
[图9] 图9是显示当使用底物肽时活性MMP-9-结合肽的小鼠MMP-9抑制活性IC50的表格(n＝3，平均值±SD)。
[图10] 图10是显示使用底物肽的降解率作为指标的活性MMP-9-结合肽对于每种MMP或对于ADAM17的抑制活性IC50的表格(n＝3，平均值±SD)。
[图11(A)] 图11(A)是显示使用底物肽的降解率作为指标评估活性MMP-9-结合肽M91002及其C-末端衍生物M91002_G3、M91002_G2和M91002_G0的人MMP-9抑制活性的图(n＝3，平均值±SD)。
[图11(B)] 图11(B)是显示当使用底物肽时活性MMP-9-结合肽M91002及其C-末端衍生物M91002_G3、M91002_G2和M91002_G0的人MMP-9抑制活性IC50的表格(n＝3，平均值±SD)。
[图12(A)] 图12(A)是显示使用底物肽的降解率作为指标评估活性MMP-9-结合肽M91005及其C-末端缀合物M91005-Fc-01的人MMP-9抑制活性的图(n = 1)。
[图12(B)] 图12(B)是显示当使用底物肽时活性MMP-9-结合肽M91005及其C-末端缀合物M91005-Fc-01的人MMP-9抑制活性IC50的表格(n = 1)。
[图13(A)] 图13(A)是显示使用底物肽的降解率作为指标评估活性MMP-9-结合肽C-末端缀合物M91005-Fc-01及其N-末端衍生物M91005_D1G-Fc-01的人MMP-9抑制活性的图(n = 1)。
[图13(B)] 图13(B)是显示当使用底物肽时活性MMP-9-结合肽C-末端缀合物M91005-Fc-01及其N-末端衍生物M91005_D1G-Fc-01的人MMP-9抑制活性IC50的表格(n =1)。
[图14(A)] 图14(A)是显示通过免疫沉淀方法评估活性MMP-9-结合肽是否不结合前人MMP-9、但确实结合活性人MMP-9的数据的图。添加的人MMP-9酶活性结构域被表示为输入(Inp)，不结合珠粒的上清液级分被表示为流通物(FT)，且结合珠粒的沉淀物级分被表示为洗脱物(Elu)。当添加前人MMP-9酶活性结构域时，在Inp和FT泳道中检测到约50 kDa的条带，且在Elu泳道中未检测到条带。当添加活性人MMP-9酶活性结构域时，在Inp和Elu泳道中检测到约40 kDa的条带，且在FT泳道中未检测到条带。当不添加活性MMP-9-结合肽C-末端缀合物M91005-Fc-01的情况下发生免疫沉淀时，在Elu泳道中未检测到条带。
[图14(B)] 图14(B)是显示通过免疫沉淀方法评估活性MMP-9-结合肽是否不结合前小鼠MMP-9、但确实结合活性小鼠MMP-9的数据的图。添加的小鼠MMP-9酶活性结构域被表示为输入(Inp)，不结合珠粒的上清液级分被表示为流通物(FT)，且结合珠粒的沉淀物级分被表示为洗脱物(Elu)。当添加前小鼠MMP-9酶活性结构域时，在Inp和FT泳道中检测到约60kDa的条带，且在Elu泳道中未检测到条带。当添加活性小鼠MMP-9酶活性结构域时，在Inp和Elu泳道中检测到约40 kDa的条带，且在FT泳道中未检测到条带。当不添加活性MMP-9-结合肽的C-末端缀合物M91005-Fc-01的情况下发生免疫沉淀时，在Elu泳道中未检测到条带。
[图15] 图15显示人SPINK2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
[图16] 图16显示肽M91001的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
[图17] 图17显示肽M91002的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
[图18] 图18显示肽M91004的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
[图19] 图19显示肽M91005的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
[图20] 图20显示肽M91010的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
[图21] 图21显示肽M91011的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。
[图22] 图22显示肽M91012的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。
[图23] 图23显示肽M91014的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。
[图24] 图24显示肽衍生物M91001_D1G的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)。
[图25] 图25显示肽衍生物M91002_D1G的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。
[图26] 图26显示肽衍生物M91004_D1G的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)。
[图27] 图27显示肽衍生物M91005_D1G的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。
[图28] 图28显示肽衍生物M91010_D1G的氨基酸序列(SEQ ID NO:14)。
[图29] 图29显示肽衍生物M91011_D1G的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)。
[图30] 图30显示肽衍生物M91012_D1G的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)。
[图31] 图31显示肽衍生物M91014_D1G的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。
[图32] 图32显示活性MMP-9-结合肽的通式(SEQ ID NO:18)，其中X1至X13表示任一氨基酸。
[图33] 图33显示由Stag + 接头1组成的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)。
[图34] 图34显示由Stag + 接头2组成的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)。
[图35] 图35显示C-末端6-聚体的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)。
[图36] 图36显示C-末端3-聚体Gly-Gly-Gly的氨基酸序列。
[图37] 图37显示C-末端2-聚体Gly-Gly的氨基酸序列。
[图38] 图38显示G4S接头的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)。
[图39] 图39显示人免疫球蛋白G1 Fc区的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)。
[图40] 图40显示引物1的核苷酸序列(SEQ ID NO:24)。
[图41] 图41显示引物2的核苷酸序列(SEQ ID NO:25)。
[图42] 图42显示引物3的核苷酸序列(SEQ ID NO:26)。
[图43] 图43显示引物4的核苷酸序列(SEQ ID NO:27)。
[图44] 图44显示人MMP-9的氨基酸序列(SEQ ID NO:28)。
[图45] 图45显示小鼠MMP-9的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)。
[图46] 图46显示MOCAc-KPLGL-A2pr (Dnp)-AR-NH2的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)。分别地，N-末端的“MOCAc-K”意指(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基-L-赖氨酸，“A2pr(Dnp)-A”意指[Nβ-(2,4-二硝基苯基)-L-2,3-二氨基丙酰基]-L-丙氨酸，且C-末端的“R-NH2”意指L-精氨酸酰胺。
[图47] 图47显示MOCAc-PLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)。分别地，N-末端的“MOCAc-P”意指(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基-L-脯氨酸，“A2pr(Dnp)-A”意指[Nβ-(2,4-二硝基苯基)-L-2,3-二氨基丙酰基]-L-丙氨酸，且C-末端“R-NH2”意指L-精氨酸酰胺。
[图48] 图48显示DNP-PLGMWSR的氨基酸序列(SEQ ID NO:32)。N-末端的“DNP-P”意指N-(2,4-二硝基苯基)-L-脯氨酸。
[图49] 图49显示MOCAc-RPKPVE-Nva-WR-Lys(Dnp)-NH2的氨基酸序列(SEQ IDNO:33)。分别地，N-末端的“MOCAc-R”意指(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基-L-精氨酸，“Nva”意指L-正缬氨酸，且“Lys(Dnp)-NH2”意指[Nε-(2,4-二硝基苯基)]-L-赖氨酸酰胺。
[图50] 图50显示FLAG标签的氨基酸序列(SEQ ID NO:34)。
[图51] 图51显示Avi标签的氨基酸序列(SEQ ID NO:35)。
[图52] 图52是显示使用底物肽的降解率作为指标的活性MMP-9-结合肽的丝氨酸蛋白酶抑制活性IC50的表格(n = 1)。
[图53(A)] 图53(A)是显示通过大小排阻色谱评估活性MMP-9-结合肽是否结合活性人MMP-9的图。在抑制剂不存在的情况下，在7.0分钟的保留时间(虚线)检测到活性人MMP-9酶活性结构域的峰。在TIMP-1或活性MMP-9-结合肽M91005和M91011存在的情况下，活性人MMP-9酶活性结构域的峰的保留时间偏移至高分子量侧。
[图53(B)] 图53(B)是显示通过大小排阻色谱评估活性MMP-9-结合肽是否不结合人MMP-9 E402Q突变体的图。在抑制剂不存在的情况下，在7.1分钟的保留时间(虚线)检测到人MMP-9酶活性结构域E402Q突变体的峰。在TIMP-1存在的情况下，人MMP-9酶活性结构域E402Q突变体的峰的保留时间偏移至高分子量侧。相反，在活性MMP-9-结合肽M91005或M91011存在的情况下，人MMP-9酶活性结构域E402Q突变体的峰的保留时间没有改变。
[图53(C)] 图53(C)是显示通过大小排阻色谱评估TIMP-1和活性MMP-9-结合肽M91005和M91011的图。
[图54(A)] 图54(A)是显示当使用底物肽时的活性MMP-9-结合肽的人MMP-9突变体抑制活性IC50 (n = 3，平均值±SD)和当野生型人MMP-9 IC50被取为1时IC50的相对值的表格。
[图54(B)] 图54(B)是显示当使用底物肽时的活性MMP-9-结合肽的人MMP-9突变体抑制活性IC50 (n = 3，平均值±SD)和当野生型人MMP-9 IC50被取为1时IC50的相对值的表格(续)。
[图55] 图55显示Boc-FSR-MCA的氨基酸序列。N-末端的“Boc”意指叔丁氧基羰基，且C-末端的“MCA”意指4-甲基香豆基-7-酰胺。
[图56] 图56显示Suc-LLVY-MCA的氨基酸序列(SEQ ID NO:36)。N-末端的“Suc”意指琥珀酰基，且C-末端的“MCA”意指4-甲基香豆基-7-酰胺。
[图57] 图57显示Suc-AAPF-MCA的氨基酸序列(SEQ ID NO:37)。N-末端的“Suc”意指琥珀酰基，且C-末端的“MCA”意指4-甲基香豆基-7-酰胺。
[图58] 图58显示Boc-VLK-MCA的氨基酸序列。N-末端的“Boc”意指叔丁氧基羰基，且C-末端的“MCA”意指4-甲基香豆基-7-酰胺。
[图59] 图59显示Boc-VPR-AMC的氨基酸序列。N-末端的“Boc”意指叔丁氧基羰基，且C-末端的“AMC”意指7-氨基-4-甲基香豆素。
[图60] 图60显示Suc(OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MCA的氨基酸序列(SEQ ID NO:38)。N-末端的“Suc(OMe)”意指N-甲氧基琥珀酰基，且C-末端的“MCA”意指4-甲基香豆基-7-酰胺。
[图61] 图61显示Boc-QAR-AMC的氨基酸序列。N-末端的“Boc”意指叔丁氧基羰基，且C-末端的“AMC”意指7-氨基-4-甲基香豆素。
[图62] 图62显示Boc-LSTR-MCA的氨基酸序列(SEQ ID NO:39)。N-末端的“Boc”意指叔丁氧基羰基，且C-末端的“MCA”意指4-甲基香豆基-7-酰胺。
[图63] 图63显示Pyr-GR-MCA的氨基酸序列。N-末端的“Pyr”意指L-焦谷氨酰基，且C-末端的“MCA”意指4-甲基香豆基-7-酰胺。
[图64] 图64显示Z-FR-MCA的氨基酸序列。N-末端的“Z”意指苄氧基羰基，且C-末端的“MCA”意指4-甲基香豆基-7-酰胺。
[图65] 图65显示肠激酶识别序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)。
在本发明中，当用SEQ ID NO:X连同图Y描述序列(诸如“SEQ ID NO:X(图Y)”或“图Y(SEQ ID NO:X)”)时，其意味着该序列由SEQ ID NO:X或图Y代表。
另外，当氨基酸(X)、数字(一个至几个数字)和另一氨基酸(Y)被表示为诸如XnY、XnnY、XnnnY等时，其意味着在第n位、第nn位或第nnn位(分别在一位数字、两位数字或三位数字的位置)处的氨基酸X被另一氨基酸Y替换。例如，Arg344Lys意味着第344个氨基酸从Arg替换为Lys。
实施方案的描述
1. 定义
在本发明中，术语“基因”意指含有编码蛋白中含有的氨基酸序列的核苷酸序列或其互补链的核酸分子。所述核酸分子由一条链、两条链或三条或更多条链组成，并且“基因”包括DNA链和RNA链的复合物，存在于一条链上的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物，以及由各自含有这条链的两条或三条或更多条链构成的核酸分子。
在本发明中，术语“基因”、“多核苷酸”和“核酸分子”具有相同的含义，并且它们的组成单元(其为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸、核苷等)的数目没有限制。例如，在“基因”、“多核苷酸”和“核酸分子”的范围内包括DNA、RNA、mRNA、cDNA、cRNA、探针、寡核苷酸、引物等。“核酸分子”有时被缩写为“核酸”。
在本发明中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”具有相同的含义。
在本发明中，识别或结合靶分子X的肽(以下，将这种识别或结合作用统称为“X结合活性”)可以被称为“X结合肽”。此外，识别或结合靶分子X并抑制或遏制靶分子X的一种或两种或更多种活性或功能的肽(在下文中，抑制或遏制的作用被统称为“X抑制活性”)可以被称为“X抑制肽”。
在本发明中，术语“SPINK2”意指丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal-2型，并且是由具有三个二硫键的Kazal-样结构域构成的7 kDa蛋白。优选的是，SPINK2衍生自人。在本发明中，除非另有指定，否则人SPINK2被简称为“SPINK2”。
在本发明中，术语“MMP-9”意指基质金属蛋白酶-9。MMP-9是一种属于MMP家族的蛋白，并且由分泌信号肽、前肽、与锌离子配位的酶活性结构域、参与结合底物的II型纤连蛋白结构域和C-末端HPX结构域构成。优选的是，MMP-9衍生自人。在本发明中，除非另有指定，否则有时将人MMP-9简称为“MMP-9”。
在本发明中，术语“前-MMP-9”意指前-基质金属蛋白酶-9。前-MMP-9由前肽、与锌离子配位的酶活性结构域、参与结合底物的II型纤连蛋白结构域和C-末端HPX结构域构成。优选的是，前-MMP-9衍生自人。在本发明中，除非另有指定，否则人前体MMP-9被简称为“前-MMP-9”，但有时也称为“全长成熟MMP-9”或“hMMP-9(完全)”。
在本发明中，术语“活性MMP-9”意指活性基质金属蛋白酶-9。活性MMP-9由与锌离子配位的酶活性结构域、参与结合底物的II型纤连蛋白结构域和C-末端HPX结构域构成。优选的是，活性MMP-9衍生自人。在本发明中，除非另有指定，否则人活性MMP-9被简称为“活性MMP-9”，但有时也称为“活性MMP-9(完全)”。
在本发明中，术语“前-MMP-9酶活性结构域”意指前-基质金属蛋白酶-9催化结构域。前-MMP-9酶活性结构域含有前肽和与锌离子配位的酶活性结构域作为必需组分，并且任选地含有参与结合底物的II型纤连蛋白结构域。优选的是，前-MMP-9酶活性结构域衍生自人。在本发明中，除非另有说明，否则前人MMP-9酶活性结构域被简称为“前-MMP-9酶活性结构域”，但有时也称为“前-MMP-9(cat)”。
在本发明中，术语“活性MMP-9酶活性结构域”意指活性基质金属蛋白酶-9催化结构域。活性MMP-9酶活性结构域包括与锌离子配位的酶活性结构域作为必需组分，并且任选地含有参与结合底物的II型纤连蛋白结构域。优选的是，活性MMP-9酶活性结构域衍生自人。在本发明中，除非另有说明，否则活性人MMP-9酶活性结构域被缩写为“活性MMP-9酶活性结构域”，但有时也称为“前-MMP-9(cat)”。
在本发明中，术语“MMP-9-结合肽”意指识别或结合MMP-9的部分肽或部分高阶结构的肽。当肽的片段、另一部分与肽的加合物或肽的缀合物维持MMP-9-结合活性时，它们被包括在术语“MMP-9-结合肽”的范围内。即，维持MMP-9-结合活性的肽的片段、加合物和修饰化合物也被包括在术语“MMP-9-结合肽”内。
在本发明中，术语“活性MMP-9-结合肽”意指识别或结合活性MMP-9的部分肽或部分高阶结构的肽。当肽的片段、另一部分与肽的加合物或肽的缀合物维持活性MMP-9-结合活性时，它们被包括在术语“活性MMP-9-结合肽”的范围内。即，维持活性MMP-9-结合活性的肽的片段、加合物和修饰化合物也被包括在术语“活性MMP-9-结合肽”内。
在本发明中，术语“MMP-9抑制肽”意指抑制或遏制MMP-9的一种或两种或更多种活性或功能的肽。当肽的片段、另一部分与肽的加合物或肽的缀合物维持MMP-9抑制活性时，它们被包括在术语“MMP-9抑制肽”的范围内。即，维持MMP-9抑制活性的肽的片段、加合物和修饰化合物也被包括在术语“MMP-9抑制肽”内。
在本发明中，术语“细胞”包括衍生自单个动物的各种细胞、传代培养的细胞、原代培养的细胞、细胞系、重组细胞、酵母、微生物等。
在本发明中，肽结合的“位点”，即被该肽识别的“位点”，意指该肽结合或识别的靶分子上的连续或间歇的部分氨基酸序列或部分高阶结构。在本发明中，这种位点可以被称为靶分子上的表位或结合位点。
在本发明中，术语“SPINK2突变体”意指含有氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列在野生型SPINK2的氨基酸序列中具有一个或两个或更多个氨基酸被不同于野生型的氨基酸取代，一个或两个或更多个氨基酸从野生型缺失，一个或两个或更多个非野生型氨基酸插入，和/或非野生型氨基酸添加至氨基末端(N-末端)和/或羧基末端(C-末端)(在下文中，这些改变被统称为“突变”)。当“SPINK2突变体”具有活性的MMP-9-结合活性时，它被术语“活性MMP-9-结合肽”所涵盖。应当注意，在本发明中，术语“插入”可以被包括在术语“添加”的范围内。
在本发明中，术语“一至几个”中的术语“几个”是指3至10。
在本发明中，术语“在严格条件下杂交”意指在如下条件下杂交：其中在65℃下在含有5 × SSC的溶液中进行杂交，且然后分别在含有2 × SSC-0.1%SDS的水溶液中在65℃下进行洗涤20分钟，在含有0.5 × SSC-0.1%SDS的水溶液中在65℃下进行洗涤20分钟，且在含有0.2 × SSC-0.1%SDS的水溶液中在65℃下进行洗涤20分钟，或在与之等同的条件下进行。SSC代表150 mM NaCl-15 mM柠檬酸钠的水溶液，且n x SSC意指n倍浓度的SSC。
2. 肽
2-1. 氨基酸
术语“氨基酸”是含有氨基和羧基的有机化合物，且其优选意指作为构成单元包括在蛋白中、更优选天然存在的蛋白中的α-氨基酸。在本发明中，更优选的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。除非另有指定，否则术语“氨基酸”意指这些总共20种氨基酸。总共20种氨基酸可以被称为“天然存在的氨基酸”。本发明的活性MMP-9-结合肽优选含有天然存在的氨基酸。
在本发明中，术语“氨基酸残基”有时缩写为“氨基酸”。
在本发明中，氨基酸是L-氨基酸、D-氨基酸或其混合物(DL-氨基酸)，但除非另有指定，否则其意指L-氨基酸。
基于共同侧链的性质，天然存在的氨基酸可以被分为例如以下组。
(1)疏水氨基酸组：Met、Ala、Val、Leu、Ile
(2)中性亲水氨基酸组：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
(3)酸性氨基酸组：Asp、Glu
(4)碱性氨基酸组：His、Lys、Arg
(5)影响骨架的取向的氨基酸组：Gly、Pro
(6)芳香族氨基酸组：Trp、Tyr、Phe
然而，天然存在的氨基酸的分类不限于这些。
在本发明中，天然存在的氨基酸可以经历保守的氨基酸取代。
术语“保守氨基酸取代”意指被功能上等同或相似的氨基酸取代。肽中的保守氨基酸取代导致肽的氨基酸序列的静态变化。例如，具有相似极性的一个或两个或更多个氨基酸在功能上等同地起作用，因此用此类氨基酸的保守氨基酸取代导致肽的氨基酸序列中的静态变化。通常，被相同组中的氨基酸取代可以被认为对于结构和功能是保守的。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，特定氨基酸残基所起的作用可以在含有氨基酸的分子的三维结构中确定。例如，半胱氨酸残基可以采取氧化(二硫化物)形式，与还原(硫醇)形式相比，其具有较低的极性。精氨酸侧链的长脂族部分可以构成结构和功能上重要的特征。含有芳香族环的侧链(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)也可以促成离子-芳香族相互作用或阳离子-π相互作用。在这种情况下，即使具有这种侧链的氨基酸被属于酸性或非极性组的氨基酸取代，该取代也可以在结构和功能上是保守的。残基，诸如脯氨酸、甘氨酸和半胱氨酸(二硫键形式)，具有直接影响骨架构象的可能性，因此，在没有结构扭曲的情况下，它们通常无法被取代。
保守氨基酸取代包括如下所示基于侧链相似性的特定取代(L. Lehninger,Biochemistry, 第2版, pp.73-75, Worth Publisher, New York (1975))和典型取代。
(1)非极性氨基酸组：丙氨酸(下文中被称为“Ala”或简称“A”)，缬氨酸(下文中被称为“Val”或简称“V”)，亮氨酸(下文中被称为“Leu”或简称“L”)，异亮氨酸(下文中被称为“Ile”或简称“I”)，脯氨酸(下文中被称为“Pro”或简称“P”)，苯丙氨酸(下文中被称为“Phe”或简称“F”)，色氨酸(下文中被称为“Trp”或简称“W”)和甲硫氨酸(下文中被称为“Met”或简称“M”)；
(2)不带电荷的极性氨基酸组：甘氨酸(下文中被称为“Gly”或简称“G”)，丝氨酸(下文中被称为“Ser”或简称“S”)，苏氨酸(下文中被称为“Thr”)或简称“T”)，半胱氨酸(下文中被称为“Cys”或简称“C”)，酪氨酸(下文中被称为“Tyr”或简称“Y”)，天冬酰胺(下文中被称为“Asn”或简称“N”)和谷氨酰胺(下文中被称为“Gln”或简称“Q”)；
(3)酸性氨基酸组：天冬氨酸(下文中被称为“Asp”或简称“D”)和谷氨酸(下文中被称为“Glu”或简称“E”)；
(4)碱性氨基酸组：赖氨酸(下文中被称为“Lys”或简称“K”)，精氨酸(下文中被称为“Arg”或简称“R”)和组氨酸(下文中被称为“His”或简称“H”)。
在本发明中，所述氨基酸可以是除了天然存在的氨基酸以外的氨基酸。此类氨基酸的实例包括，例如，硒代半胱氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、吡咯烷、焦谷氨酸、胱氨酸、羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、甲状腺素、O-磷酸丝氨酸、锁链素、β-丙氨酸、肌氨酸、鸟氨酸、肌酸、γ-氨基丁酸、opain、茶氨酸、tricolominic acid、红藻氨酸、软骨藻酸和achromeic acid，其在天然存在的肽和蛋白中找到。此类氨基酸的另外的实例包括正亮氨酸，N-末端保护的氨基酸，诸如Ac-氨基酸，Boc-氨基酸，Fmoc-氨基酸，Trt-氨基酸和Z-氨基酸；C-末端受保护的氨基酸，诸如氨基酸的叔丁酯、苄酯、环己酯和芴酯；以及自然界中未发现的其他氨基酸，包括二胺、ω-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸，氨基酸的Tic衍生物和氨基膦酸。然而，在本发明中，为了方便起见，不限于这些实例，将除了上述20种“天然存在的氨基酸”以外的氨基酸统称为“非天然存在的氨基酸”。
2-2. 活性MMP-9-结合肽
本发明的活性MMP-9-结合肽是SPINK2突变体，其中SPINK2的骨架被至少部分维持(以下简称为“SPINK2突变体”)。其识别或结合活性MMP-9或其部分肽或部分高阶结构(下文中，这种识别或结合作用被统称为“活性MMP-9-结合活性”)。优选的是，本发明的活性MMP-9-结合肽不结合前-MMP-9。换言之，优选的是，本发明的活性MMP-9-结合肽优选特异性结合活性MMP-9。
可以使用本领域技术人员已知的方法，诸如ELISA方法，表面等离振子共振(下文中被称为“SPR”)分析方法，生物层干涉法(下文中被称为“BLI”)方法，等温滴定热量法(下文中被称为“ITC”)，流式细胞术，免疫沉淀方法等，测量或测定根据本发明的SPINK2突变体与MMP-9的结合。
ELISA方法包括检测识别和结合固定在板上的活性MMP-9的活性MMP-9-结合肽的方法。为了将活性MMP-9固定在板上，除了生物素-链霉抗生物素蛋白以外，还可以使用识别活性MMP-9或与活性MMP-9融合的标签的固相的抗体等。为了检测活性MMP-9-结合肽，除了标记的链霉抗生物素蛋白以外，还可以使用识别活性MMP-9-结合肽或与活性MMP-9-结合肽融合的标签的标记的检测抗体等。为了标记，可以使用生物素以及可用于生物化学分析的任何其他手段，诸如HRP、碱性磷酸酶或FITC。为了使用酶标记物进行检测，可以使用发色底物，诸如TMB (3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯)，ρ-NPP (ρ-硝基苯基磷酸酯)，OPD(邻苯二胺)，ABTS (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和SuperSignal ELISAPico化学发光底物(Thermo Fisher Scientific)；荧光底物，诸如QuantaBlu(TM)荧光过氧化物酶底物(Thermo Fisher Scientific)；和化学发光底物。为了测量检测信号，可以使用吸收板读取器、荧光板读取器、发光板读取器、RI液体闪烁计数器等。
用于SPR分析的装置的实例包括BIAcore(TM) (GE Healthcare)，ProteOn(TM)(Bio-Rad Laboratories, Inc.)，SPR-Navi(TM) (BioNavis Oy), Spreeta(TM) (TexasInstruments Incorporate)，SPRi-PlexII(TM) (HORIBA Scientific)和Autolab SPR(TM)(Metrohm AG)。用于BLI方法的装置的实例包括Octet(TM) (Pall Corporation)。
免疫沉淀方法包括用于检测被固定在珠粒上的活性MMP-9-结合肽识别和结合的活性MMP-9的方法。作为珠粒，可以使用磁性珠粒或琼脂糖珠粒。为了将活性MMP-9-结合肽固定在板上，可以使用生物素-链霉抗生物素蛋白以及识别活性MMP-9-结合肽或与活性MMP-9-结合肽融合的标签的抗体、蛋白A、蛋白G等。通过磁体、离心等分离珠粒，并用SDS-PAGE或Western印迹方法检测与珠粒一起沉淀的活性MMP-9。为了检测活性MMP-9，可以使用标记的链霉抗生物素蛋白以及识别活性MMP-9或与活性MMP-9融合的标签的标记的检测抗体。为了标记，可以使用生物素以及可用于生物化学分析的任何其他手段，诸如HRP、碱性磷酸酶或FITC。为了使用酶标记物进行检测，可以使用与ELISA方法中相同的底物。为了测量检测信号，可以使用ChemiDoc(TM) (Bio-Rad Laboratories, Inc.)、Luminograph (ATTOCorporation)等。
在本发明中，“特异性识别”或“特异性结合”意指不是非特异性吸附的结合。结合是否特异性的确定标准的实例包括ELISA方法中的结合活性EC50。EC50是当将过量的活性MMP-9-结合肽添加至固定在板上的活性MMP-9并将检测到的信号的最大值取为100%时，给出50%信号的肽浓度。对于活性MMP-9，本发明的优选的活性MMP-9-结合肽的EC50值是1 ×10-6 M或更小，5 × 10-7 M或更小，2 × 10-7 M或更小，或1 × 10-7 M或更小，更优选5 ×10-8 M或更小，2 × 10-8 M或更小，或1 × 10-8 M或更小，且甚至更优选5 × 10-9 M或更小，2 × 10-9 M或更小，或1 × 10-9 M或更小。本发明中的优选的活性MMP-9-结合肽是不识别前-MMP-9、即不结合前-MMP-9的活性MMP-9特异性结合肽。此类活性MMP-9特异性结合肽对前-MMP-9的EC50值是1 x 10-6 M或更大，优选1 × 10-5 M或更大。或者，在以1 × 10-6M的浓度添加肽的条件和不添加肽的条件之间，信号强度没有差异。另一测定标准的实例包括解离常数(下文中被称为“KD”)。对于活性MMP-9，本发明的优选的活性MMP-9-结合肽的KD值是1 x 10-5 M或更小，5 × 10-6 M或更小，2 × 10-6 M或更小，或1 × 10-6 M或更小，更优选5 × 10-7 M或更小，2 × 10-7 M或更小，或1 × 10-7 M或更小，甚至更优选5 × 10-8M或更小，2 × 10-8 M或更小，或1 × 10-8 M或更小，且仍更优选5 × 10-9 M或更小，2 ×10-9 M或更小，或1 × 10-9 M或更小。本发明的优选的活性MMP-9-结合肽(其为不结合前-MMP-9的活性MMP-9特异性结合肽)对前-MMP-9的KD值是1 x 10-6 M或更大，优选1 × 10-5 M或更大。另一测定标准的另外的实例包括通过免疫沉淀方法的分析结果。在免疫沉淀方法中，当将本发明中的优选的活性MMP-9-结合肽固定在珠粒上；添加活性MMP-9；然后分离珠粒；且检测与珠粒一起沉淀的活性MMP-9时，检测到活性MMP-9的信号。当将本发明的优选的活性MMP-9-结合肽(即不结合前-MMP-9的活性MMP-9特异性结合肽)固定在珠粒上；添加前-MMP-9；然后分离珠粒；且检测与珠粒一起沉淀的前-MMP-9时，未检测到前-MMP-9信号。换言之，在当将MMP-9-结合肽固定在珠粒上；添加前-MMP-9；然后分离珠粒；且检测与珠粒一起沉淀的前-MMP-9时同样检测到前-MMP-9的信号的情况下，可以确定MMP-9-结合肽不具有活性MMP-9特异性结合活性。
此外，本发明的一个实施方案中的活性MMP-9-结合肽优选具有MMP-9抑制活性。
本发明的活性MMP-9-结合肽的靶标MMP-9，优选衍生自脊椎动物，更优选衍生自哺乳动物，甚至更优选衍生自灵长类动物，且最优选衍生自人。前人MMP-9(即全长成熟人MMP-9 (下文中被称为“hMMP-9(完全)”))的氨基酸序列由SEQ ID NO:28(图44)代表的氨基酸序列的第20个至第707个氨基酸组成，并且没有其中第1个至第19个氨基酸的信号序列。前人MMP-9酶活性结构域(下文中被称为“前-hMMP-9(cat)”)的氨基酸序列的实例包括由SEQ IDNO:28(图44)代表的氨基酸序列的Ala20至Pro449组成的氨基酸序列或含有SEQ ID NO:28(图44)代表的氨基酸序列的Ala20至Gly215和Gln391至Tyr443(从其中缺失参与与底物的结合的II型纤连蛋白结构域)的氨基酸序列。活性人MMP-9酶活性结构域(下文中被称为“活性hMMP-9(cat)”)的氨基酸序列没有特别限制，只要该氨基酸序列保留蛋白酶活性即可，且其实例包括由SEQ ID NO:28(图44)代表的氨基酸序列的Phe107至Pro449组成的氨基酸序列或含有SEQ ID NO:28(图44)代表的氨基酸序列的Phe107至Gly215和Gln391至Tyr443(从其中缺失参与与底物的结合的II型纤连蛋白结构域)的氨基酸序列。MMP-9及其功能片段(其也被表示为MMP-9蛋白酶)，可以纯化自组织或细胞，或通过本领域技术人员已知的用于制备蛋白的方法(诸如基因重组、体外翻译或肽合成)制备。此外，信号序列、免疫球蛋白Fc区、标签、标记物等可以与MMP-9或其功能片段连接。
可以使用MMP-9的蛋白酶活性作为指标来评估MMP-9抑制活性。例如，在MMP-9或其功能片段、底物和本发明的活性MMP-9-结合肽或其候选物共存的情况下，当MMP-9的蛋白酶活性与其中对照存在或抑制剂或其候选物不存在的情况相比是70%或更小、50%或更小、30%或更小、20%或更小、10%或更小、5%或更小、1%或更小或0%时，MMP-9被抑制，并且抑制活性分别是30%或更大、50%或更大、70%或更大、80%或更大、90%或更大、95%或更大或99%或更大或100%。MMP-9抑制活性可以根据反应条件、底物的类型和浓度等而变化。反应条件的实例包括以下实施例中描述的那些，但不限于此。可以通过将底物肽或底物蛋白添加至特定浓度的MMP-9，使混合物反应特定时间段，然后检测底物肽的荧光或通过SDS-PAGE、Western印迹方法、液相色谱法等检测底物蛋白，评估酶活性。缓冲溶液的实例包括磷酸盐缓冲盐水(下文中被称为“PBS”)和Tris缓冲液(50mM Tris，pH 7至8.5，例如pH 7.5)。此外，可以将盐诸如NaCl (0至200 mM，例如200 mM)，CaCl2 (0至10 mM，例如2 mM)，ZnCl2和Brij-35添加至缓冲溶液中。然而，缓冲溶液不限于这些。
MMP-9蛋白酶的底物没有特别限制，并且它们的实例包括内源底物、外源底物和合成底物。作为人内源底物，可以例举胶原蛋白。通过胶原蛋白的热变性获得的明胶也可以用作底物。合成底物的实例包括，但不限于，MOCAc-KPLGL-A2pr (Dnp)-AR-NH2 (SEQ ID NO:30，图46)，MOCAc-PLGL-A2pr (Dnp)-AR-NH2 (SEQ ID NO:31，图47)，DNP-PLGMWSR (SEQ IDNO:32，图48)，和MOCAc-RPKPVE-Nva-WR-Lys(Dnp)-NH2 (SEQ ID NO:33，图49)。本发明的活性MMP-9-结合肽的MMP-9抑制活性(IC50或Ki)是1 μM或更小，优选100 nM或更小，更优选10nM或更小，甚至更优选1 nM或更小。
此外，还优选的是，本发明的活性MMP-9-结合肽不抑制或遏制除了MMP-9的蛋白酶活性以外的蛋白酶活性，或抑制或遏制除了MMP-9的蛋白酶活性以外的蛋白酶活性的程度相对弱。换言之，本发明的活性MMP-9-结合肽的蛋白酶抑制活性优选具有高MMP-9特异性。本发明的优选的活性MMP-9-结合肽不抑制或遏制MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、ADAM17等的蛋白酶活性，或其抑制或遏制的程度相对弱。本发明的更优选的活性MMP-9-结合肽是不抑制或遏制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、类胰蛋白酶、糜蛋白酶、纤溶酶、凝血酶、弹性蛋白酶、matriptase、蛋白C、tPA、uPA、血浆激肽释放酶等，或者其抑制或遏制的程度相对弱的那些。本发明的此类优选的肽没有由其他蛋白酶活性的抑制或遏制引起的副作用，并且可以合适地用作与MMP-9相关的疾病的治疗或预防剂(后面描述)。
对MMP-9具有低特异性并抑制其他MMP以及MMP-9的蛋白酶活性的抑制剂，即非选择性MMP-9抑制剂，当施用于人时引起严重的副作用。螯合锌离子的小分子抑制剂是非选择性MMP-9抑制剂，并且在施用这些抑制剂的临床试验中，观察到严重的肌肉骨骼副作用，诸如骨骼和关节疼痛和挛缩(非专利文献6和7)。相反，非常可能的是，对MMP-9具有高特异性的抑制剂，即MMP-9特异性抑制剂，可以避免如上所述的副作用。在用大鼠的安全性研究中报告，当将非选择性MMP-9抑制剂Marimastat施用于一组时，观察到肌肉骨骼综合症的症状，而在施用MMP-9特异性抑制抗体的组中未观察到此类症状(专利文献6)。因此，特异性抑制MMP-9的蛋白酶活性的本发明的活性MMP-9-结合肽可以适合地用于治疗或预防与MMP-9相关的疾病。
本发明的活性MMP-9-结合肽可以与蛋白酶底物竞争对MMP-9的结合。
如上所示，本发明的肽的靶标MMP-9，衍生自脊椎动物，优选哺乳动物，更优选灵长类动物，且甚至更优选人，但其也可以衍生自非人动物，例如，啮齿动物(诸如大鼠和小鼠)和灵长类动物(诸如食蟹猴、普通狨猴和猕猴)。对衍生自非人类动物的MMP-9具有活性MMP-9-特异性结合活性的肽可以用于对这种非人类动物的活性MMP-9特异性的检测和测量。此外，靶向衍生自非人动物的MMP-9的本发明的肽可以是抑制衍生自这种非人动物的MMP-9的蛋白酶活性的肽。对衍生自非人动物的MMP-9具有活性形式的特异性结合活性和/或蛋白酶抑制活性的这种肽可用于诊断、测试、治疗或预防这种非人类动物中的与MMP-9相关的疾病。此外，当对衍生自非人动物的MMP-9具有蛋白酶抑制活性的这种肽也抑制人MMP-9的蛋白酶活性时，可以在非临床研究和开发该肽作为与人类MMP-9相关的疾病的治疗或预防剂期间，在使用这种非人动物作为动物病理模型的药理学和药代动力学测试中，以及在使用这种非人动物作为健康动物的安全性测试和毒性测试中使用该肽。
与本领域中用作药物或诊断剂的其他生物大分子、诸如抗体相比，本发明的活性MMP-9-结合肽具有较小的分子量，并且该肽的生产(后面描述)相对容易。在物理特性诸如储存稳定性和热稳定性的方面，本发明的肽也是优异的。此外，该肽具有的优点在于，当用于药物组合物(后面描述)中时，其对于施用途径、施用方法、制剂等具有很多选择。当通过用已知方法(诸如添加生物大分子或聚合物)增加本发明的肽的分子量来将该肽用作药物组合物时，还可以将所述肽的血液半衰期调节为更长。本发明的这种活性MMP-9-结合肽的分子量小于10,000，优选小于8,000，更优选约7,000至7,200。在由SEQ ID NO:18(图32)的Cys 15至Cys 31组成的可变环部分和由SEQ ID NO:18(图32)的Cys 15至Cys 63组成的部分(下文中被称为“含6个Cys的部分”)中，具有活性MMP-9-结合活性的部分也被包括在本发明的活性MMP-9-结合肽中。可变环部分的分子量为小于2,500，优选约1,800至2,000，并且含有6个Cys的部分的分子量为小于6,000，优选约5,300至5,500。
作为本发明的活性MMP-9-结合肽的SPINK2突变体可以具有如上所述的特异性结合活性、蛋白酶抑制活性以及其他特性、功能、特征等，而活性MMP-9-结合肽的全长氨基酸序列与人野生型SPINK2的氨基酸序列具有高度序列同一性。本发明的SPINK2突变体的氨基酸序列与人SPINK2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1，图15)具有60%或更高、70%或更高、75%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高、98%或更高或99%或更高的序列同一性。
术语“同一性”意指指示两个序列之间的相似性或关系的程度的特性。通过将相同氨基酸或氨基酸残基的数目除以氨基酸或氨基酸残基的总数并将获得的数值乘以100来计算氨基酸序列同一性(%)。
术语“空位”意指由两个或更多个序列中的至少一个的缺失和/或加入导致的两个或更多个序列间的比对中的空位。
具有完全相同的氨基酸序列的两个氨基酸序列之间的同一性为100%，而如果一个氨基酸序列中的一个或两个或更多个氨基酸或氨基酸残基与另一序列相比存在取代、缺失或添加，则两者的同一性小于100%。用于在考虑空位的同时测定两个序列之间的同一性的算法和程序的实例包括本领域普通技术人员已知的算法和程序，诸如BLAST (Altschul,等人 Nucleic Acids Res., Vol.25, pp.3389-3402, 1997)，BLAST2 (Altschul, 等人J. Mol. Biol., Vol.215, pp.403-410, 1990)，和Smith-Waterman (Smith, 等人 J.Mol. Biol., Vol.147, pp.195-197, 1981)等，其中使用标准参数。
在本发明中，术语“突变的”意味着与天然存在的核酸分子或肽相比，已经在核苷酸序列或氨基酸序列中进行一个或两个或更多个核苷酸或核苷酸残基或氨基酸或氨基酸残基的取代、缺失或插入。与人SPINK2的氨基酸序列相比，本发明的SPINK2突变体的氨基酸序列具有一个或两个或更多个突变的氨基酸或氨基酸残基。
在本发明的一个实施方案中，SPINK2突变体的氨基酸序列在人SPINK2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1，图15)中具有：
Ser16至Gly22的1、2、3、4、5、6或7个氨基酸被另一个氨基酸或氨基酸残基取代；和
Pro24至Asn28的1、2、3、4或5个氨基酸被另一氨基酸或氨基酸残基取代。
优选的是，Cys15、Cys23、Cys31、Cys42、Cys45和Cys63是如野生型中的Cys，以便维持天然存在的二硫键。然而，它们中的1个、2个、3个、4个、5个或6个可以被另一氨基酸取代，以便消除天然存在的二硫键或生成非天然存在的二硫键。在本发明的SPINK2突变体的一些优选的活性MMP-9-结合肽中，Cys在与天然存在的肽中的那些相同的6个位置处得到维持，因此二硫键得到维持。在此类活性MMP-9-结合肽的一些更优选的实施方案中，Cys15-Cys45、Cys23-Cys42和Cys31-Cys63各自形成二硫键。
当活性MMP-9-结合肽中含有SPINK2突变体的这种氨基酸序列时，优选的是，野生型SPINK2的氨基酸序列中含有的如下结构得到维持达到可以展现活性MMP-9-结合活性的程度，所述结构包括由Ser16至Val30组成的环结构，由(1)由Cys31和Gly32组成的β链和(2)由Ile57至Arg59组成的β链构成的β片层，和由Glu41至Gly51组成的α螺旋，或与其相似或与其(或与其位置)至少部分对应的环结构、β片层和α螺旋。
在本发明的SPINK2突变体中，下面描述一些活性MMP-9-结合肽的氨基酸序列。如上所述，在本发明中，术语“氨基酸残基”有时简单表示为“氨基酸”。
在SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列中，X1至X13的每一个不特别限制，只要它们是任何氨基酸并且达到活性MMP-9-结合肽结合MMP-9并抑制MMP-9活性的程度。在下文中，描述了X1至X13的优选氨基酸，但它们可以包括天然存在的氨基酸，即，与野生型人SPINK2的氨基酸序列中相同的氨基酸。
第一个X1优选为Asp或Gly，更优选Gly。
当第21个X7是Pro，第24个X9是Gln且第25个X10是Met时，
第16个X2优选为Arg、Gln、Gly、Trp或Tyr，更优选Arg或Gln；
第17个X3优选为Arg、Asp、Gln、Glu、Lys、Met、Ser、Thr或Val，更优选Arg、Gln、Lys、Thr或Val；
第18个X4优选为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Gly、Leu、Lys或Val，更优选Arg、Gly或Val；
第19个X5优选为Ala、Arg、Asn、Gly、Ile、Leu或Lys，更优选Arg、Gly、Ile或Lys；
第20个X6优选为Ala、Glu、Gly、Met或Ser，更优选Glu或Gly；
第22个X8优选为Ala、Leu或Ser，更优选Ala或Ser；
第26个X11优选为Ala、Gly或Ser；
第27个X12优选为Leu、Phe、Ser或Tyr，更优选Phe或Tyr；且
第28个X13优选为Asn、Asp、Gln、Leu或Lys，更优选Asn、Gln或Lys。
当第20个X6是Tyr，第22个X8是Gln且第24个X9是Ser时，
第16个X2优选为Arg、Lys、Met或Val，更优选Met或Val；
第17个X3优选为Arg、Gln、Lys或Met，更优选Met；
第18个X4优选为Phe或Tyr，更优选Tyr；
第19个X5优选为Gln、Glu或Lys，更优选Lys；
第21个X7优选为Ala或Gly，更优选Ala；
第25个X10优选为Asn或His，更优选His；
第26个X11优选为Leu、Lys、Met或Val，更优选Lys；
第27个X12优选为Phe、Ser或Tyr，更优选Ser或Tyr；且
第28个X13优选为Ala、Asn、Gln或Lys，更优选Gln或Lys。
野生型X1至X13分别是Asp、Ser、Gln、Tyr、Arg、Leu、Pro、Gly、Pro、Arg、His、Phe和Asn。
在本发明中，可以将一个或几个或更多个氨基酸进一步添加至第一氨基酸的N-末端侧。待添加的此类氨基酸的实例包括由Stag +接头组成的氨基酸序列(SEQ ID NO:19和20，图33和34)。
此外，可以将一个至几个氨基酸添加至位于C-末端的Cys63。例如，可以将Gly-Gly添加至C-末端，并且可以获得在C-末端具有Gly65的氨基酸序列。待添加的此类氨基酸的实例包括C-末端6-聚体(SEQ ID NO:21，图35)，Gly-Gly-Gly(图36)和Gly-Gly(图37)。
在本发明中，通过在SPINK2突变型肽或SPINK2突变型肽(下文中被称为“亲本肽”)的N-末端和/或C-末端加合物中取代、添加和/或缺失一个或两个或更多个氨基酸而获得的肽有时被称为“亲本肽的衍生物”或“亲本肽衍生物”。这种“衍生物”也包括在本发明的“肽”的范围内。
在本发明的活性MMP-9-结合肽的范围中包括的SPINK2突变体的氨基酸序列中，除了X1至X13以外的部分，即野生型人SPINK2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1，图15)中的Pro2至Cys15、Cys23和Pro29至Cys63的位置可以包括天然存在的氨基酸或突变的氨基酸或氨基酸序列。例如，可以将SPINK2突变体在任何一个或两个或更多个位置处突变，只要该突变没有完全阻碍或干扰活性MMP-9-结合活性或折叠即可。可以通过使用本领域技术人员已知的标准方法来进行这种突变。氨基酸序列中的典型突变可以包括一个、两个或更多个氨基酸的取代、缺失或添加。取代的实例包括保守取代。通过保守取代，特定氨基酸残基被另一氨基酸残基取代，所述另一氨基酸残基不仅在堆积高度的方面、而且在极性的方面具有相似的特征。保守取代的实例在本说明书的别处描述。然而，在除了X1至X13以外的部分中，可以允许一个或两个或更多个氨基酸的非保守取代，只要该取代没有完全阻碍或干扰活性MMP-9-结合活性或折叠即可。
关于作为本发明的活性MMP-9-结合肽的SPINK2突变体的氨基酸序列，X1至X13优选为SEQ ID NO:2至17(图16至图13)中任一个中的X1至X13的各个氨基酸，并且除了X1至X13以外的部分可以具有没有完全阻碍或干扰活性MMP-9-结合活性或折叠的任何氨基酸或氨基酸序列。
作为本发明的活性MMP-9-结合肽的SPINK2突变体的氨基酸序列的实例包括以下(a)至(d)中任一项中所述的氨基酸序列：
(a) SEQ ID NO:2至17(图16至31)中的任一个代表的氨基酸序列；
(b)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列在严格条件下与编码(a)中描述的氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，并编码具有活性MMP-9-结合活性的肽中含有的氨基酸序列；
(c)在(a)中描述且在具有活性MMP-9-结合活性的肽中含有的氨基酸序列中具有1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2或1个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；和
(d)与(a)中描述且在具有活性MMP-9-结合活性的肽中含有的氨基酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更高同一性的氨基酸序列。
由以上(a)至(d)中任一项中描述的氨基酸序列组成或含有其的肽优选不结合前-MMP-9，且更优选抑制MMP-9的蛋白酶活性，且甚至更优选地，特异性抑制MMP-9的蛋白酶活性(此类肽被称为“MMP-9特异性抑制肽”或“MMP-9特异性抑制SPINK2突变型肽”)。
可以将突变引入本发明的活性MMP-9-结合肽中，以改善折叠稳定性、热稳定性、储存稳定性、血液半衰期、水溶性、生物活性、药理活性、次级效应等。例如，可以通过突变引入新的反应基团诸如Cys，以缀合至其他物质，诸如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、生物素、肽或蛋白。
在本发明中，可以将活性MMP-9-结合肽与另一部分缀合，并且这种缀合物被统称为“活性MMP-9-结合肽的缀合物”。“缀合物”或“缀合”包括这样的形式，其中通过化学物质诸如交联剂或通过适合于连接至氨基酸的侧链的试剂将特定部分连接至本发明的肽，或通过基因工程改造技术将特定部分连接至本发明的肽的N-末端和/或C-末端。用于改善血液半衰期的这种“部分”的实例包括聚亚烷基二醇分子，诸如聚乙二醇(PEG)；羟乙基淀粉；脂肪酸分子，诸如棕榈酸等；免疫球蛋白的Fc区；免疫球蛋白的CH3结构域；免疫球蛋白的CH4结构域；白蛋白或其片段；白蛋白结合肽；白蛋白结合蛋白，诸如链球菌蛋白G；和转铁蛋白。“部分”的其他实例包括可以经由接头、诸如肽接头连接至本发明的肽的“部分”。
此外，药物可以与本发明的活性MMP-9-结合肽缀合，以发挥或增强药理活性。通过用本发明的肽替代抗体，本领域技术人员已知为抗体领域中的抗体-药物缀合物(ADC)的技术和实施方案可以成为本发明的实施方案。
本发明的活性MMP-9-结合肽可以进一步含有一个或两个或更多个对除了MMP-9以外的靶分子表现出结合亲和力、抑制活性、拮抗活性、激动活性等的部分，或者可以与此类部分缀合。这种“部分”的实例包括抗体或其片段，以及具有除了抗体以外的骨架的蛋白，诸如SPINK2突变体或其片段。通过用本发明的肽取代那些中含有的两种或更多种“抗体”中的至少一种，本领域技术人员已知为抗体领域中的多特异性抗体和双特异性抗体的技术和实施方案可以成为本发明的缀合物的实施方案。
本发明的活性MMP-9-结合肽或其前体可以含有信号序列。在多肽或其前体的N-末端存在或向其添加的信号序列可用于将多肽递送至细胞的特定区室，例如在大肠杆菌的情况下为周质，或在真核细胞的情况下为内质网。许多信号序列是本领域技术人员已知的，并且可以根据宿主细胞进行选择。用于在大肠杆菌的周质中分泌期望的肽的信号序列的实例包括OmpA。具有含有这种信号序列的形式的缀合物也可以包括在本发明的缀合物中作为其实施方案。
此外，通过预先将标签添加至本发明的活性MMP-9-结合肽，可以通过亲和色谱纯化该肽。例如，本发明的肽可以在C-末端具有生物素、Strep标签(TM)、Strep标签II(TM)、寡组氨酸诸如His6、聚组氨酸、免疫球蛋白结构域、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、钙调蛋白-结合肽(CBP)、半抗原诸如洋地黄毒苷或二硝基苯酚、表位标签诸如FLAG(TM)、myc标签、HA标签等(下文中统称为“亲和标签”)。其中添加标签的肽也可以包括在本发明的缀合物中作为其实施方案。
本发明的活性MMP-9-结合肽可以包含用于标记的部分。具体地，标记部分诸如酶标记物、放射性标记物、颜色标记物、荧光标记物、生色标记物、发光标记物、半抗原、洋地黄毒苷、生物素、金属络合物、金属、胶体金等可以与肽缀合。含有用于标记的部分的肽也可以包括在本发明的缀合物中作为其实施方案。
本发明的活性MMP-9-结合肽可以在肽部分中含有天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸，并且天然存在的氨基酸可以含有L-氨基酸和D-氨基酸。
本发明的活性MMP-9-结合肽的氨基酸序列可以含有天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸两者，并且天然存在的氨基酸可以含有L-氨基酸和D-氨基酸两者。
本发明的活性MMP-9-结合肽可以作为单体、二聚体、三聚体或更高寡聚体或多聚体存在。二聚体、三聚体或更高寡聚体和多聚体可以是由单一单体构成的均聚体，或由两个或更多个不同单体构成的杂聚体。单体可以例如迅速扩散并且优异渗透至组织中。二聚体、寡聚体和多聚体可以在一些方面具有优势，例如，它们可以在局部组织中对靶分子具有高亲和力或结合活性，可以具有较慢的解离速率，或可以表现出高活性MMP-9-结合活性。除了自发二聚化、寡聚化和多聚化以外，还可以通过将jun-fos结构域、亮氨酸拉链等引入本发明的活性MMP-9-结合肽中来实现预期的二聚化、寡聚化和多聚化。
本发明的活性MMP-9-结合肽可以结合一个或两个或更多个靶分子，或抑制作为单体、二聚体、三聚体或更高寡聚体或多聚体的靶分子的活性。
本发明的活性MMP-9-结合肽可以是分离的形式(冻干的制备物、溶液等)，如上所述的缀合物形式或与另一分子结合的形式(固定在板上的形式，与不同分子缔合的形式，与靶分子结合的形式等)，但不限于这些，并且可以采取适合于表达、纯化、使用、储存等的任何形式。
在某些实施方案中，被MMP-9抑制肽、尤其是MMP-9特异性抑制肽(其为本发明的优选的活性MMP-9-结合肽)识别的活性人MMP-9分子上的结合位点可以是以下(i)或(ii)：
(i)在活性MMP-9 (SEQ ID NO:28)的氨基酸序列中，(ia)Glu402，和(ib)一个或两个或更多个选自Phe110、Tyr179、Leu187、Phe192、Gln199、Tyr393、Leu397、Val398、Tyr420、Met422和Tyr423的氨基酸；或
(ii)在活性MMP-9 (SEQ ID NO:28)的氨基酸序列中，(iia) Glu402，和(ib)一个或两个或更多个选自Tyr179、Asp185、Phe192、Phe193、Tyr393、Leu397、Val398、Met422、Tyr423和Arg424的氨基酸。
在此，“2个或更多个”优选为3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、或6个或更多个，更优选7个或更多个、8个或更多个、或9个或更多个，且最佳为10个，或10个或11个。
可以通过使用活性MMP-9的野生型和突变体测量肽的抑制活性来鉴定活性MMP-9-结合肽识别的活性MMP-9分子上的结合位点。例如，当测试化合物对其中第n个氨基酸X被取代的活性MMP-9突变体的底物肽降解活性的抑制浓度(IC50)与以野生型活性MMP-9的底物肽降解活性为100%测量的测试化合物的50% IC50相比增加(例如2倍或更大，优选3倍或更大，更优选4倍或更大，且甚至更优选5倍或更大)(尽管标准没有特别限制)时，确定测试化合物识别第nnn个氨基酸X并结合活性MMP-9。
3. 活性MMP-9-结合肽的鉴定
可以通过本领域技术人员众所周知的方法，使用SPINK2的氨基酸序列或本发明的活性MMP-9-结合肽的氨基酸序列(例如，选自SEQ ID NO:2至17或图16至31的氨基酸序列)、编码该氨基酸序列的核苷酸序列、含有该核苷酸序列的核酸分子等作为起始材料，来鉴定活性MMP-9-结合肽。作为一个优选的实例，可以使用人MMP-9-结合活性作为指标从人SPINK2突变体文库鉴定活性人MMP-9-结合肽。也可以将前-MMP-9-结合活性或MMP-9抑制活性组合为指标。
在一个实例中，可以使用重组DNA技术将作为起始材料的核酸分子进行突变诱导，并引入合适的细菌或真核宿主中。SPINK2突变体文库已知为用于鉴定靶分子的结合剂或抑制剂的技术。例如，WO2012/105616中公开的SPINK2突变体文库以其整体通过引用并入本文。在适当的宿主中表达进行突变诱导的核苷酸序列后，可以富集和/或筛选其遗传性状与具有期望特性、活性、功能等的SPINK2突变体相关联的克隆，并从文库鉴定。为了富集和/或筛选克隆，可以使用本领域技术人员已知的方法，诸如细菌展示方法(Francisco, J.A.,等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol.90, pp.10444-10448)，酵母展示方法(Boder, E.T.,等人 (1997) Nat. Biotechnol., Vol.15, pp.553-557)，哺乳动物细胞展示方法(Ho M,等人 (2009) Methods Mol Biol., Vol.525: pp.337-52)，噬菌体展示方法(Smith, G.P. (1985) Science., Vol. 228, pp.1315-1317)，核糖体展示方法(Mattheakis LC,等人 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol.91, No.19,pp.9022-9029)，核酸展示方法，诸如mRNA展示方法(Nemoto N,等人 (1997) FEBS Lett.,Vol.414, No.2, pp.405-408)，菌落筛选方法(Pini, A.等人 (2002) Comb. Chem. HighThroughput Screen. Vol.5, pp.503-510)等。通过对选择和鉴定的克隆中含有的SPINK2突变体的核苷酸序列进行测序，可以将该核苷酸序列编码的氨基酸序列确定为该克隆中含有的SPINK2突变体(即活性MMP-9-结合肽)的氨基酸序列。
本发明的SPINK2突变体可以例如通过在天然存在的SPINK2中诱导突变来获得。术语“诱导突变”是指引起在氨基酸序列的各个位置处存在的一个或两个或更多个氨基酸被另一氨基酸取代或被缺失，或引起氨基酸序列中不存在的氨基酸的添加或插入。这种缺失、添加或插入可以改变序列长度。在本发明的SPINK2突变体中，突变的诱导可以优选发生在SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列中的X1至X13的一个或两个或更多个位置处。
然而，在诱导这种合适的突变后在X1至X13的1个或2个或更多个位置中的特定位置处维持与天然存在的氨基酸序列中存在的氨基酸相同的氨基酸的天然存在的氨基酸的突变体也包括在突变体的范围内，只要它们以其整体具有至少一个突变的氨基酸即可。同样，在本发明的一个实施方案中，在除了X1至X13以外的部分中的一个或多个位置中诱导突变后在特定位置处维持与天然存在的氨基酸序列中存在的氨基酸相同的氨基酸的天然存在的氨基酸的突变体也包括在突变体的范围内，只要它们以其整体具有至少一个突变的氨基酸即可。
术语“诱导随机突变”意味着对于序列中的特定位置的突变的诱导引起在特定位置处以特定概率引入一个或两个或更多个不同氨基酸，其中引入至少两个不同氨基酸的每种概率不必全部相同。此外，在本发明中，所述至少两种不同的氨基酸可以包括一种与天然存在(野生型)的氨基酸相同的残基，并且这种情况也包括在术语“诱导随机突变”的范围内。
作为用于在特定位置处诱导随机突变的方法，可以使用本领域技术人员已知的标准方法。例如，可以通过PCR(聚合酶链式反应)使用含有简并核苷酸组成的合成寡核苷酸的混合物在序列中的特定位置处诱导突变。例如，使用密码子NNK或NNS (N =腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶；K =鸟嘌呤或胸腺嘧啶；S =腺嘌呤或胞嘧啶)诱导突变，其中引入所有20种天然存在的氨基酸以及终止密码子。然而，密码子VVS (V =腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶)的使用不可能引起Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr和Val的引入，并且诱导引起剩余12种天然存在的氨基酸的引入的突变。此外，例如，密码子NMS(M =腺嘌呤或胞嘧啶)的使用不可能引起Arg、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Trp和Val的引入，并且诱导引起剩余11种天然存在的氨基酸的引入的突变。特殊的密码子、人工密码子等可以用于诱导引起非天然存在的氨基酸的引入的突变。
也可以使用具有更高阶结构的靶标和/或针对该靶标的肽或该肽由其衍生的野生型肽的结构信息来进行突变的位点特异性诱导。在本发明中，可以使用结构信息引入位点特异性突变，所述结构信息包括：(a) 作为靶标MMP-9和/或(b) 针对靶标的SPINK2突变体或野生型SPINK2，或(c) (a)和(b)二者的复合物的更高阶结构信息。例如，可以发现通过如下获得的结构信息与活性MMP-9-结合活性具有相关性：鉴定具有活性MMP-9-结合活性的SPINK2突变体；获得MMP-9和SPINK2突变体的复合物的晶体后进行X-射线晶体结构分析；和基于分析结果鉴定SPINK2突变体与其结合的MMP-9分子上的表位和对应于该表位的SPINK2突变体上的互补位。基于这种结构-活性关系，可以设计在特定位置处被特定氨基酸的取代，在特定位置处的氨基酸的插入或缺失等，并且实际上证实活性MMP-9-结合活性。另外，例如，可以用具有改变的碱基对特异性的核苷酸构成单元诸如肌苷来进行突变的诱导。
此外，例如，通过使用DNA聚合酶的易错PCR、通过化学诱变等，在随机位置处诱导突变是可能的，所述DNA聚合酶缺乏校正功能且具有高错误率。
可以通过使用细菌展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示、噬菌体展示、核糖体展示、核酸展示、菌落筛选等从本领域技术人员已知的文库(诸如适用于每种筛选方法的噬菌体文库或菌落文库)富集和/或筛选活性MMP-9-结合肽。这些文库可以用本领域技术人员已知的适用于每种文库(诸如用于噬菌体文库的噬菌粒和用于菌落筛选的粘粒)的载体和方法来构建。此类载体可以是感染原核或真核细胞的病毒或病毒载体。这些重组载体可以通过本领域技术人员已知的方法(诸如基因工程改造)来制备。
细菌展示是通过将期望的蛋白融合至大肠杆菌的外膜脂蛋白(Lpp)和外膜蛋白OmpA的一部分而在例如大肠杆菌的表面上呈递期望的蛋白的技术。通过在编码特定蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列中诱导随机突变、将通过诱导随机突变而获得的DNA组引入适用于细菌展示的载体和用该载体转化细菌细胞，可以获得在转化的细菌细胞的表面上呈递一组随机突变的蛋白的文库(Francisco, J. A., 等人(1993), Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. Vol.90, pp.10444-10448)。
酵母展示是通过将期望的蛋白融合至存在于酵母的细胞表面的外壳上的蛋白诸如α-凝集素而在酵母表面上呈递期望的蛋白的技术。α-凝集素包括推测为糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定附着信号、信号序列、活性结构域、细胞壁结构域等的C-末端疏水区域。通过操纵这些元件，可能在酵母的细胞表面上展示期望的蛋白。通过在编码特定蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列中诱导随机突变、将通过诱导随机突变而获得的DNA组引入适用于酵母展示的载体和用该载体转化酵母细胞，可以获得在转化的酵母细胞的表面上呈递一组随机突变的蛋白的文库(Ueda, M.& Tanaka, A., Biotechnol. Adv., Vol.18, p.121 (2000):Ueda, M.& Tanaka, A., J. Biosci. Bioeng., Vol.90, p.125 (2000)，和其他文献)。
动物细胞展示是通过例如将期望的蛋白融合至膜蛋白诸如血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的跨膜区域而在哺乳动物细胞诸如HEK293或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的表面上呈递期望的蛋白的技术。通过在编码特定蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列中诱导随机突变、将通过诱导随机突变而获得的DNA组引入适用于动物细胞展示的载体和用该载体转化动物细胞，可以获得在转化的动物细胞的表面上呈递一组随机突变的蛋白的文库(Ho M,等人 (2009) Methods Mol Biol. Vol.525: pp.337-52)。
可以将细胞诸如酵母、细菌和动物细胞上呈递的期望的文库在靶分子存在的情况下孵育或与靶分子接触。例如，将用生物素等修饰的MMP-9和含有该文库的细胞孵育特定时间段，然后添加载体诸如磁珠，并将细胞与载体分离，且随后洗涤载体以除去非特异性的吸附或结合物质，因此可以回收与载体结合的呈递肽、肽组装体或浓缩的肽组装体的细胞组(或与载体结合的MMP-9)。类似地，可以通过在添加磁珠后进行磁性细胞分离(MACS)或通过在使用抗MMP-9抗体细胞染色后进行FACS来回收与载体结合的呈递肽、肽组装体或浓缩的肽组装体的细胞组(或与载体结合的MMP-9)。可以对非特异性吸附位点和/或结合位点进行例如封闭处理，并且可以并入通过适当方法的封闭步骤。通过回收表达因此获得的肽、肽组装体或浓缩的肽组装体的载体且然后对插入载体中的多核苷酸的核苷酸序列进行测序，可以测定由核苷酸序列编码的氨基酸序列。另外，通过将载体再次引入宿主细胞并且将上述程序在循环中重复一次或几次，可以高度浓缩结合靶分子的肽组装体。
在噬菌体展示中，噬菌粒是细菌质粒，例如，除了质粒复制起点之外，其还含有衍生自单链噬菌体的第二复制起点。含有噬菌粒的细胞可以在M13或类似辅助噬菌体的超感染中通过单链复制模式复制噬菌粒。即，单链噬菌粒DNA包装在以噬菌体外壳蛋白为衣壳的感染性颗粒中。以这种方式，分别地，噬菌粒DNA可以在感染的细菌中形成为克隆双链DNA质粒，或者噬菌粒可以从超感染的细胞的培养上清液形成为噬菌体样颗粒。通过将噬菌体样颗粒注入细菌中以用这种DNA感染F-纤维化细菌，颗粒本身可以再次形成为质粒。
通过将含有具有编码测试肽的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸和噬菌体外壳蛋白基因的融合基因插入这种噬菌粒中，并用噬菌粒感染细菌，且然后培养细胞，可能引起这种肽将在细菌或噬菌体样颗粒上表达或呈递(换句话说，展示)，或在噬菌体颗粒中或细菌的培养上清液中产生，作为与外壳蛋白的融合蛋白。
例如，通过将含有该多核苷酸和噬菌体外壳蛋白基因gpIII的融合基因插入噬菌粒，且然后用噬菌粒与M13或类似的辅助噬菌体一起超感染大肠杆菌，可能引起在大肠杆菌的培养上清液中产生这种肽，作为包含该肽和外壳蛋白的融合蛋白。
当使用各种环状或非环状载体诸如病毒载体代替噬菌粒时，可能根据本领域技术人员已知的方法引起具有由插入这种载体中的多核苷酸的核苷酸序列编码的氨基酸序列的肽在其中已引入载体的细胞或病毒样颗粒上表达或呈递，或在细胞的培养上清液中产生。
表达因此获得的肽的文库可以在靶分子存在的情况下孵育或与靶分子接触。例如，将板上的其上固定有MMP-9的载体与含有文库的流动相孵育特定时间段，然后将流动相与载体分离，且然后洗涤载体以除去非特异性的吸附或结合物质，因此可以通过洗脱回收与载体结合的肽、肽组装体或浓缩的肽组装体(或与载体结合的MMP-9)。洗脱可以在相对高的离子强度、低pH、中等变性条件、离液盐存在等下非选择性进行，或通过添加可溶性靶分子(诸如MMP-9)、与靶分子结合的抗体、天然存在的配体、底物等以与固定在板上的靶分子竞争来选择性洗脱。可以对非特异性吸附位点和/或结合位点进行例如封闭处理，并且可以并入通过适当方法的封闭步骤。
通过回收表达因此获得的肽、肽组装体或浓缩的肽组装体的载体、然后对插入载体中的多核苷酸的核苷酸序列进行测序，可以测定由核苷酸序列编码的氨基酸序列。另外，通过将载体再次引入宿主细胞并且将上述程序作为循环重复一次或几次，可以高度浓缩结合靶分子的肽组装体。
核糖体展示是用于在试管中合成分子的技术，其中例如通过使用没有终止密码子的编码期望的蛋白的mRNA以及无细胞蛋白合成系统，使期望的蛋白、与之对应的mRNA和核糖体相结合。可以通过使用通过在编码特定蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列中诱导随机突变而获得的mRNA组以及无细胞蛋白合成系统来获得在核糖体上呈递随机突变的蛋白组的文库(Mattheakis LC, 等人 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Vol.91, No.19,pp.9022-9029)。
核酸展示也被称为mRNA展示，并且是用于合成例如分子的技术，其中通过使用接头诸如具有类似于酪氨酰t-RNA的3'末端的结构的嘌呤霉素，使期望的蛋白、编码其的mRNA和核糖体相结合。由于该技术使用无细胞蛋白合成系统，而不是活细胞，因此可能在体外进行合成。可以通过使用通过在编码特定蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列中诱导随机突变而获得的mRNA组、接头诸如嘌呤霉素以及无细胞蛋白合成系统来获得在核糖体上呈递随机突变的蛋白组的文库(Nemoto N, 等人 (1997) FEBS Lett. Vol.414, No.2, pp.405-408)。
经由无细胞合成系统诸如核糖体展示或核酸展示获得的表达肽的文库可以在靶分子存在的情况下孵育或与靶分子接触。例如，将板上的其上固定有MMP-9的载体与含有文库的流动相孵育特定时间段，然后将流动相与载体分离，且然后洗涤载体以除去非特异性的吸附或结合物质，因此可以通过洗脱回收与载体结合的肽、肽组装体或浓缩的肽组装体(或与载体结合的MMP-9)。洗脱可以在相对高的离子强度、低pH、中等变性条件、离液盐存在等下非选择性进行，或通过添加可溶性靶分子(诸如MMP-9)、与靶分子结合的抗体、天然存在的配体、底物等以与固定在板上的靶分子竞争来选择性洗脱。可以对非特异性吸附位点和/或结合位点进行例如封闭处理，并且可以并入通过适当方法的封闭步骤。
回收表达因此获得的肽、肽组装体或浓缩的肽组装体的核酸，并且在mRNA的情况下逆转录反应为cDNA后，对核苷酸序列进行测序，然后可以测定由核苷酸序列编码的氨基酸序列。另外，通过从回收的核酸转录mRNA并且将上述程序作为循环重复一次至几次，可以高度浓缩结合靶分子的肽组装体。
当亲和标签初步与肽、肽组装体或浓缩肽组装体缀合时，可以有效地纯化肽或肽组装体。例如，当蛋白酶底物初步与作为标签的肽组装物缀合时，可以通过用蛋白酶活性切割来洗脱肽。
通过基于获得的序列信息和肽的功能在获得的克隆或文库中诱导进一步突变，还可能从其中已引入突变的文库获得具有改善的功能(诸如活性MMP-9-结合活性)、物理特性(热稳定性、储存稳定性等)、药代动力学(分布、血液半衰期)等的肽。
可以通过确定获得的肽是否具有活性MMP-9-结合活性来鉴定活性MMP-9-结合肽。
在可以实现活性MMP-9-结合活性的程度上，活性MMP-9-结合肽可以优选维持野生型SPINK2的氨基酸序列中含有的这样的构象，所述构象包括由Ser16至Val30组成的环结构，由(1)由Cys31和Gly32组成的β链和(2)由Ile57至Arg59组成的β链构成的β片层，和由Glu41至Gly51组成的α螺旋，或与其相似或与其(或与其位置)至少部分对应的环结构、β片层和α螺旋。也可能使用构象(整个结构或部分结构)作为指标的一部分来鉴定更优选的活性MMP-9-结合肽。
4.4. 编码活性MMP-9-结合肽的核酸分子、含有其的载体、含有其的细胞以及用于产生重组活性MMP-9-结合肽的方法
本发明还提供了含有编码活性MMP-9-结合肽中含有的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(下文中被称为“编码活性MMP-9-结合肽的核酸分子”)，其中已插入基因的重组载体，其中已引入基因或载体的细胞(下文中被称为“含有编码活性MMP-9-结合肽的核酸分子的细胞”)，或产生活性MMP-9-结合肽的细胞(下文中被称为“产生活性MMP-9-结合肽的细胞”)。
编码本发明的活性MMP-9-结合肽的核酸分子的一部分的优选实例包括具有以下(a)至(d)中任一项中描述的核苷酸序列的核酸分子(下文中被称为“活性MMP-9-结合肽的核苷酸序列”)，具有含有编码活性MMP-9-结合肽的核苷酸序列的核苷酸序列的核酸分子，和具有编码活性MMP-9-结合肽的核苷酸序列的核酸分子：
(a)编码SEQ ID NO:2至17(图16至31)中的任一个代表的氨基酸序列的核苷酸序列；
(b)在严格条件下与(a)中描述的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交并编码具有活性MMP-9-结合活性的肽中含有的氨基酸序列的核苷酸序列；
(c)在(a)中描述且编码具有活性MMP-9-结合活性的肽中含有的氨基酸序列的核苷酸序列中具有1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2或1个核苷酸或核苷酸残基取代、缺失、添加和/或插入的核苷酸序列；和
(d)与(a)中描述且编码具有活性MMP-9-结合活性的肽中含有的氨基酸序列的核苷酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%或更高同一性的核苷酸序列。
由以上(a)至(d)中任一项中描述的核苷酸序列编码的氨基酸序列组成或含有其的肽优选不结合前-MMP-9，且更优选抑制MMP-9的蛋白酶活性，且甚至更优选地，特异性抑制MMP-9的蛋白酶活性。
然而，编码活性MMP-9-结合肽的核酸分子不限于(a)至(d)，并且含有编码具有活性MMP-9-结合活性的SPINK2突变体中含有的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，优选SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列，通常涵盖于编码活性MMP-9-结合肽的核酸分子的范围内。
为了设计编码氨基酸序列的核苷酸序列，可以使用对应于每个氨基酸的一个或两个或更多个密码子。因此，编码特定肽中含有的单一氨基酸序列的核苷酸序列可以具有多个变异。在选择此类密码子时，可以根据其中可以引入具有核苷酸序列的多核苷酸或含有其的载体的用于表达的宿主细胞的密码子使用适当地选择密码子，并且可以适当地调整使用多个密码子的频率或比率。例如，当使用大肠杆菌作为宿主细胞时，可以使用在大肠杆菌中频繁使用的密码子来设计核苷酸序列。
编码活性MMP-9-结合肽的核酸分子可以可操作连接至一个或两个或更多个调节序列。术语“可操作连接”意味着其可以表达连接的核酸分子或允许表达该分子中含有的核苷酸序列。调节序列包括序列元件，其包括关于转录和/或翻译调节的信息。调节序列因物种而异，但通常包括启动子和参与转录和翻译起始的5'非编码序列，例如原核生物中的-35/-10盒和Shine Dalgarno序列，以及真核生物中的TATA盒、CAAT序列和5'加帽序列。此类序列可以包括增强子元件和/或阻遏子元件，以及信号序列、前导序列等，其可以被翻译以将天然或成熟的肽递送至宿主细胞内部或外部的特定区室。此外，调节序列可以含有3'非编码序列，并且这种序列可以包括参与转录终止、聚腺苷酸化等的元件。在此，如果用于转录终止的序列在特定宿主细胞中不能充分发挥功能，则其可以用适用于该细胞的序列替换。
启动子序列的实例包括原核生物中的tet启动子、lacUV5启动子、T7启动子等，以及真核细胞中的SV40启动子、CMV启动子等。
编码活性MMP-9-结合肽的核酸分子可以是但不限于是分离的形式或载体或其他克隆媒介物(下文中，简称为“载体”：诸如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒或粘粒)中含有的形式或染色体中的形式。除了活性MMP-9-结合肽的核苷酸序列和上述调节序列以外，载体还可以包括适合于用于表达的宿主细胞的复制序列和控制序列，以及为其中已通过转化等引入核酸分子的细胞提供可选择表型的选择标记。
可以通过本领域技术人员已知的方法诸如转化将编码活性MMP-9-结合肽的核酸分子和含有活性MMP-9-结合肽的核苷酸序列的载体引入能够表达该肽或核苷酸序列的宿主细胞中。可以在适用于表达该肽或核苷酸序列的条件下培养其中已引入核酸分子或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。原核细胞的实例包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。真核细胞的实例包括酵母诸如啤酒酵母和巴斯德毕赤酵母，昆虫细胞诸如SF9和High5，以及动物细胞诸如HeLa细胞、CHO细胞、COS细胞和NS0。通过使用真核细胞等作为宿主细胞，可以对本发明表达的肽进行期望的翻译后修饰。翻译后修饰的实例包括添加官能团诸如糖链，添加肽或蛋白以及转化氨基酸化学特性。也可能将期望的修饰人工应用于本发明的肽。此类修饰的肽也涵盖于本发明的“肽”的范围内。
本发明还包括产生活性MMP-9-结合肽的方法。该方法包括步骤1：培养其中引入编码活性MMP-9-结合肽的核酸分子或含有活性MMP-9-结合肽的核苷酸序列的载体的宿主细胞或表达活性MMP-9-结合肽的细胞；和/或步骤2：从步骤1中获得的培养物回收活性MMP-9-结合肽。对于步骤2，可以应用本领域技术人员已知的方法，诸如分级分离、色谱、纯化等。例如，可以应用通过后面描述的使用本发明的抗体的亲和色谱进行的纯化。
在本发明的一些实施方案中，活性MMP-9-结合肽具有分子内二硫键。有时优选通过使用信号序列等将具有分子内二硫键的肽递送至具有氧化性氧化还原环境的细胞部分。氧化环境可以由革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌的周质、革兰氏阳性细菌的细胞外环境、真核细胞的内质网腔等提供。在此类情况下，可以促进结构二硫键形成。也可能产生在宿主细胞诸如大肠杆菌的胞质中具有分子内二硫键的肽。在该情况下，该肽可以直接以可溶性折叠状态获得，或者可以在包涵体中回收，且然后在体外重构。此外，还可能选择具有氧化性细胞内环境的宿主细胞，并在宿主细胞的胞质中产生具有分子内二硫键的肽。当活性MMP-9-结合肽不具有分子内二硫键时，可以在具有还原性氧化还原环境的细胞部分中，例如在革兰氏阴性细菌的胞质中，产生该肽。
本发明的活性MMP-9-结合肽还可以通过本领域技术人员已知的其他方法来制备，所述其他方法诸如固相肽合成法，包括Merryfield或其他方法；化学合成方法，包括使用叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)等的有机合成化学肽合成方法；和体外翻译。
作为其一些实施方案，本发明提供了结合具有活性MMP-9-结合活性的SPINK2突变型肽的抗体及其功能片段。所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并且单克隆抗体没有特别限制，只要其为免疫球蛋白或其衍生物。抗体的功能片段不限于其具有抗原结合活性、即对SPINK2突变型肽的结合活性的程度。其实例包括重链和轻链中的一者或两者，其片段，缺乏恒定区和/或Fc区的片段，以及与另一种蛋白或标记物质的缀合物。此类抗体及其功能片段可以通过本领域技术人员已知的方法来制备，并且它们可用于通过亲和色谱、与含有该肽的药物组合物或其用途相关的临床测试、在诊断等中检测肽、免疫测定等来纯化SPINK2突变型肽。本发明的抗体可以通过使用该抗体结合的本发明的肽的亲和色谱来纯化。
5. 药物组合物
本发明还提供了包含活性MMP-9-结合肽或其缀合物的药物组合物。优选地，所述活性MMP-9-结合肽或其缀合物是具有MMP-9抑制活性的MMP-9抑制肽或其缀合物。
本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防由MMP-9诱发或恶化的各种疾病，且其中MMP-9的表达或功能的抑制或遏制可以抑制诱发或恶化，带来治愈，维持或改善症状，避免继发性疾病等(下文中，该疾病被称为“与MMP-9相关的疾病”或“MMP-9相关疾病”)。
与MMP-9相关的疾病的实例包括是炎性/自身免疫疾病、神经退行性疾病、精神疾病、血管疾病或恶性肿瘤。
所述炎性/自身免疫疾病的实例包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、支气管哮喘、间质性肺炎、慢性阻塞性肺疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肝炎、湿疹(或皮炎)、银屑病、扁平苔藓、红斑/红皮病、荨麻疹、秃头症、天疱疮、寻常痤疮、压力性溃疡/伤口、结膜炎、角膜炎、鼻炎、口腔炎、舌炎、白塞氏病、多发性硬化症、脑炎、头痛、周围神经炎、糖尿病性并发症(糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病)、动脉粥样硬化、胰腺炎、慢性心力衰竭和肾炎。
所述神经退行性疾病的实例包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、额颞叶痴呆、脑损伤、脊髓损伤、缺氧、惊厥和创伤性脑病。
所述精神疾病的实例包括重度抑郁症、双相情感障碍、焦虑症、创伤后应激障碍(PTSD)、进食障碍、睡眠障碍、精神分裂症、成瘾、自闭症、脆性X综合征、注意缺陷多动障碍和唐氏综合症。
所述血管疾病的实例包括脑血管病症、脑动脉瘤、脑淀粉样血管病、外周血管病症、主动脉瘤、主动脉夹层、动静脉瘘、动脉硬化、高安动脉炎、川崎病、静脉曲张和血管钙化。
所述恶性肿瘤的实例包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌和神经胶质瘤。
然而，与MMP-9相关的疾病不限于本文例举的疾病。
本发明的药物组合物可以含有治疗或预防有效量的活性MMP-9-结合肽，以及药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或助剂。
术语“治疗或预防有效量”意指发挥治疗或预防对特定疾病、施用形式或施用途径的作用的量。“治疗或预防有效量”具有与“药理有效量”相同的含义。
本发明的药物组合物可以含有用于改变、维持或保持pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等张性、无菌性、组合物或其中含有的肽或缀合物的稳定性、溶解度、持续释放、吸收性、渗透特性、剂型、强度、特性、形状等的物质(下文中被称为“用于制剂的物质”)。用于制剂的物质没有特别限制，只要其为药理学上可接受的即可。例如，无毒或低毒是用于制剂的物质优选具有的物质的特性。
用于制剂的物质的实例包括但不限于氨基酸，诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；抗细菌剂；抗氧化剂，诸如抗坏血酸、硫酸钠或亚硫酸氢钠；缓冲液，诸如磷酸、柠檬酸、硼酸缓冲液、碳酸氢钠和Tris-HCl溶液；填充剂，诸如甘露醇和甘氨酸；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；络合剂，诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精；填充剂，诸如葡萄糖、甘露糖或糊精；单糖、二糖和其他碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖和糊精；着色剂；矫味剂；稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；低分子量多肽；成盐抗衡离子；苯扎氯铵；防腐剂，诸如苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢；溶剂，诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇；糖醇，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；混悬剂；PEG；脱水山梨糖醇酯；聚山梨醇酯，诸如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；表面活性剂，诸如triton、氨丁三醇、卵磷脂或胆固醇；稳定增强剂，诸如蔗糖或山梨糖醇；氯化钠；氯化钾；弹性增强剂，诸如甘露糖醇或山梨糖醇；转运剂；稀释剂；赋形剂；和/或药物助剂。
这些用于制剂的物质的添加量是活性MMP-9-结合肽的重量的0.001至1000倍，优选0.01至100倍，更优选0.1至10倍。
在脂质体中含有活性MMP-9-结合肽的药物组合物或含有与脂质体连接的活性MMP-9-结合肽的修饰产物的药物组合物也包括在本发明的药物组合物中。
赋形剂和载体通常是液体或固体，并且没有特别限制，只要它们是用于口服或肠胃外施用的物质、诸如注射用水、生理盐水、人工脑脊髓液等即可。生理盐水的实例包括中性的生理盐水和含有血清白蛋白的生理盐水。
缓冲液的实例包括制备为使得药物组合物的最终pH被设置为7.0至8.5的Tris缓冲液，类似地制备为4.0至5.5的乙酸盐缓冲液，类似地制备为5.0至8.0的柠檬酸盐缓冲液，和类似地制备为5.0至8.0的组氨酸缓冲液。
本发明的药物组合物是固体、液体、悬浮液等。本发明的药物组合物的其他实例包括冻干制剂。赋形剂诸如蔗糖可用于形成冻干制剂。
本发明的药物组合物的施用途径可以是滴眼、肠内施用、局部施用和肠胃外施用中的任一种，并且其具体实例包括结膜上滴眼、玻璃体内施用、静脉内施用、动脉内施用、肌内施用、皮内施用、皮下施用、腹膜内施用、经皮施用、骨内施用和关节内施用。
这种药物组合物的组成可以根据施用方法、活性MMP-9-结合肽的活性MMP-9-结合亲和力或MMP-9抑制活性等来确定。本发明的活性MMP-9-结合肽对活性MMP-9蛋白的亲和力越高(KD值、IC50值或Ki值越低)，发挥其药物作用的剂量越低。
本发明的活性MMP-9-结合肽的剂量没有限制，只要其为药理学有效量即可，并且其可以根据因素诸如个体的物种、疾病的种类、症状、性别、年龄、慢性疾病、该肽的MMP-9蛋白结合亲和力或生物活性等适当地确定。然而，通常，0.01至1000 mg/kg，优选地0.1至100mg/kg的活性MMP-9-结合肽可以每天一次，两次或三次或更多次，施用1至180天。
药物组合物的形式的实例包括注射剂(包括冻干的制剂和滴剂)、栓剂、经鼻吸收制剂、经皮吸收制剂、舌下剂、胶囊、片剂、软膏、颗粒剂、气溶胶、丸剂、粉剂、混悬剂、乳剂、滴眼剂和生物嵌入制剂。
含有活性MMP-9-结合肽作为活性成分的药物组合物可以与额外的药物同时施用或分开施用。例如，在施用额外的药物之后或在施用额外的药物之前，施用含有活性MMP-9-结合肽作为活性成分的药物组合物，或者可以在施用这种药物之后同时施用药物组合物和额外的药物。当同时施用时，所述活性MMP-9-结合肽和额外的药物可以包含在单一制备物或分开的制备物(多种制备物)中。
可以施用或接受一种或两种或三种或更多种额外的药物。这些被统称为本发明的药物组合物的“与额外的药物组合使用”或“与额外的药物组合”。除了本发明的肽或其缀合物以外还含有额外的药物或与额外的药物组合使用的本发明的药物组合物，也作为“与额外的药物组合使用”或“与额外的药物组合”的一个实施方案包括在本发明中。
本发明提供了治疗或预防与MMP-9相关的疾病的方法，其包括施用活性MMP-9-结合肽的步骤；本发明的活性MMP-9-结合肽用于制备用于治疗或预防该疾病的药物组合物中的用途；和活性MMP-9-结合肽用于治疗或预防疾病的用途。含有本发明的活性MMP-9-结合肽的用于治疗或预防的试剂盒也包括在本发明中。
此外，本发明提供了含有编码本发明的活性MMP-9-结合肽或其缀合物中含有的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；含有该多核苷酸的载体；包含含有该多核苷酸或载体或表达本发明的活性MMP-9-结合肽或其缀合物的细胞的药物组合物。例如，分别地，使用已知技术，这种多核苷酸和载体可以应用于与MMP-9相关的疾病的基因疗法，并且这种细胞可以应用于与MMP-9相关的疾病的细胞疗法。此外，可能例如通过将这种多核苷酸或载体引入自体细胞或同种异体细胞(相同物种的细胞)中来制备用于细胞疗法的细胞。这种多核苷酸和载体作为用于制备细胞治疗剂的组合物也包括在本发明中。然而，含有本发明的多核苷酸、载体或细胞的药物组合物的实施方案不限于上述。
6. 诊断组合物
本发明还提供了用于测试或诊断的组合物(下文中，统称为“诊断组合物”)，其含有本发明的活性MMP-9-结合肽或其缀合物。
本发明的诊断组合物可用于测试或诊断与MMP-9相关的疾病，诸如炎性疾病或血管疾病，以及MMP-9表达。本发明中的测试或诊断的实例包括，但不限于，发病风险的确定或测量，发病的存在或不存在的确定，进展或恶化的程度的测量，用药物组合物(诸如MMP-9抑制剂)的药物治疗的效果的测量或确定，除了药物治疗以外的治疗的效果的测量或确定，复发风险的测量以及是否已经发生复发的确定。
本发明的诊断组合物可用于鉴定将向其施用本发明的肽或其缀合物、包含它们的组合物或包含它们的药物组合物的个体。
这种诊断组合物可以含有pH缓冲液、渗透调节剂、盐、稳定剂、防腐剂、着色剂、敏化剂、抗聚集剂等。
本发明还提供了用于测试或诊断与MMP-9相关的疾病、诸如炎性疾病或血管疾病的方法，本发明的肽用于制备用于该疾病的诊断组合物的用途，本发明的肽用于测试或诊断疾病的用途。含有本发明的肽的用于测试或诊断的试剂盒也包括在本发明中。
使用本发明的肽的测试或诊断方法优选用夹心ELISA进行，但也可以用通常ELISA方法、RIA方法、酶联免疫斑点(ELISPOT)方法、斑点印迹方法、octalony方法、抗免疫电泳(CIE)方法、化学发光免疫测定(CLIA)、流式细胞术(FCM)和类似其他检测方法。为了检测，可以使用抗体或通过标记本发明的肽或其缀合物获得的抗体。作为标记手段，可以使用生物素以及可以用于生物化学分析的其他标记手段，诸如HRP、碱性磷酸酶、FITC和其他荧光团、放射性同位素的标记物等。为了使用酶标记物进行检测，可以使用发色底物，诸如TMB (3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，BCIP (5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯)，ρ-NPP (ρ-硝基苯基磷酸酯)，OPD(邻苯二胺)，ABTS (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和SuperSignal ELISA Pico化学发光底物(Thermo Fisher Scientific)；荧光底物，诸如QuantaBlu(TM)荧光过氧化物酶底物(Thermo Fisher Scientific)；以及化学发光底物。可以对衍生自人或非人动物的样品以及人工加工的样品(诸如重组蛋白)进行测量。衍生自人或非人动物的生物学测试样品的实例包括，但不限于，血液、关节液、腹水、淋巴液、脑脊髓液、肺泡灌洗液、唾液、痰液、组织匀浆上清液和组织切片。
含有本发明的肽的用于测试或诊断的夹心ELISA试剂盒可以含有活性MMP-9蛋白的标准溶液、着色剂、稀释缓冲液、用于固相的蛋白、用于检测的蛋白和洗涤溶液。作为用于测量与抗原结合的蛋白的量的方法，可以合适地使用吸光方法、荧光方法、发光方法、放射性同位素(RI)方法等。为了测量，可以合适地使用吸收板读取器、荧光板读取器、发光板读取器、RI液体闪烁计数器等。
也可以用使用免疫沉淀方法的方法进行所述测试或诊断。
本发明还提供了用于检测或测量测试样品中的活性MMP-9的方法。在用于检测或测量的方法中，可以使用本发明的诊断组合物。样品中的活性MMP-9可以通过如下检测：步骤1：使活性MMP-9-结合肽或其结合物与测试样品接触，和随后步骤2：测量与活性MMP-9-结合肽结合的MMP-9的量或检测与活性MMP-9-结合肽结合的MMP-9。步骤1可以包括，例如，经由蛋白G将与免疫球蛋白的Fc区缀合的活性MMP-9-结合肽固定至磁珠，并向其中添加测试样品。步骤2可以包括，例如，分离磁珠，通过SDS-PAGE或Western印迹方法分析与珠粒一起沉淀的可溶性蛋白，和检测活性MMP-9。可以对来自人或非人动物的样品以及人工加工的样品(诸如重组蛋白)进行测量。衍生自人或非人动物的生物学测试样品的实例包括，但不限于，血液、关节液、腹水、淋巴液、脑脊髓液、肺泡灌洗液、唾液、痰液、组织匀浆上清液和组织切片。
活性MMP-9检测不仅可以在体外进行，而且可以在体内进行。当使用图像诊断时，可以使用用药学上可接受的放射性核素或发光体标记的活性MMP-9-结合肽或其缀合物。步骤1可以包括，例如，向受试者施用具有标记物的肽或其缀合物。此外，步骤2可以包括，例如，使用图像诊断技术诸如PET/CT来拍摄图像，和确定或检查活性MMP-9的存在。
本发明的诊断组合物中含有的肽或其缀合物结合活性MMP-9，并且优选具有活性MMP-9-特异性结合活性，换言之，不结合前-MMP-9。
本发明还涵盖鉴定可以向其施用本发明的药物组合物的个体的方法。在鉴定方法中，测量衍生自个体的样品中的活性MMP-9，并且当在样品中检测到活性MMP-9或样品中检测到的活性MMP-9的量大于衍生自健康个体的样品中的量时，可以确定该个体为阳性。本发明的诊断组合物可以用于鉴定方法中。
在鉴定方法的一个优选实施方案中，所述个体患有MMP-9相关疾病或处于MMP-9相关疾病的风险中。
此外，在其一个实施方案中，本发明的药物组合物可以施用于在鉴定方法中已被确定为阳性的个体。
7. 用于分离活性MMP-9的方法
本发明的活性MMP-9-结合肽具有活性MMP-9-特异性结合活性，并且优选不具有前-MMP-9-结合活性。因此，用本发明的优选的活性MMP-9-结合肽或其缀合物，可能从其中前-MMP-9和活性MMP-9共存的样品中特异性分离活性MMP-9。活性MMP-9从肽的释放可以在条件诸如相对高离子强度、低pH、适度变性、离液盐存在等下非选择性实施，但优选的是，释放在活性MMP-9的蛋白酶活性不减弱的条件下实施。
8. 用于鉴定MMP-9相关疾病的治疗或预防剂的方法
在一个实施方案中，本发明提供了使用MMP-9抑制活性作为指标来鉴定MMP-9抑制化合物、MMP-9相关疾病的治疗或预防剂或其候选物的方法。所述方法可以包括步骤(i)：在测试化合物存在或不存在的情况下(或在媒介物存在的情况下)孵育MMP-9蛋白酶和底物，步骤(ii)：在测试化合物存在和不存在的情况下测定MMP-9蛋白酶活性，和步骤(iii)：当在测试化合物存在的情况下的MMP-9蛋白酶活性小于在测试化合物不存在的情况下的MMP-9蛋白酶活性时，确定所述测试化合物为阳性。在另一个实施方案中，用于鉴定本发明的MMP-9特异性抑制化合物的方法可以包括步骤(i)：在本发明的MMP-9特异性抑制性SPINK2突变型肽、优选具有SEQ ID NO:2至17(图16至31)代表的氨基酸序列中的任一个的肽存在的情况下，使测试化合物结合人活性MMP-9，步骤(ii)：确定测试化合物是否与所述肽竞争结合人活性MMP-9，和任选步骤(iii)：确定所述化合物是否具有人MMP-9特异性结合活性。鉴定方法中的测试化合物可以是肽的或非肽的。肽化合物不限于SPINK2突变体，并且肽化合物的实例包括抗体、该抗体的抗原结合片段、抗原-结合蛋白、具有非免疫球蛋白的蛋白骨架的除了SPINK2突变体以外的肽，以及MMP-9底物类似物。然而，优选的肽化合物是SPINK2突变型肽。非肽化合物的实例包括，但不限于，合成的小分子化合物和核酸。这种方法中使用的MMP-9优选是人MMP-9。
实施例
在以下实施例中，进一步详细描述本发明的一些实施方案，但本发明不限于此。
应当注意，在以下实施例中，除非另有说明，否则根据"Molecular Cloning"((Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T.，在1982年或1989年由Cold SpringHarbor Laboratory Press出版)中描述的方法和本领域技术人员使用的其他实验方案教科书中描述的方法进行与基因操作相关的各程序，或者当使用市售试剂或试剂盒时，根据市售产品的说明书进行程序。
实施例1. 活性MMP-9-结合肽的制备
(1-1)活性MMP-9-结合肽表达载体pET 32a(修饰的)_活性MMP-9-结合肽的构建
首先，构建具有SPINK2支架的骨架的活性MMP-9-结合肽的表达载体。使用编码各结合肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:2至9)的核苷酸序列和编码SPINK2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列作为模板，通过PCR方法((94℃，15秒；60℃，30秒；68℃，30秒) × 30个循环)使用以下引物和KOD-plus-(Toyobo Co., Ltd.)扩增结合肽的片段。
引物1：5'-AAAAGAATTCTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
引物2：5'-AAAACTCGAGTTATGCGGCCGCAGACGCGCCGCACGGACC-3'
将扩增的片段进行琼脂糖凝胶电泳，然后切下期望的DNA片段，并通过QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)制备DNA。将制备的DNA片段和pET 32a(修饰的)用限制性酶EcoRI (NewEngland Biolabs, Inc.)和XhoI (New England Biolabs, Inc.)在37℃下处理1小时或更长时间。琼脂糖凝胶电泳后，切下期望的DNA片段，并通过QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)进行纯化。使纯化的片段与T4 DNA连接酶(New England Biolabs, Inc.)在16℃下反应过夜，以实施连接反应。将连接溶液添加至大肠杆菌JM109 (Toyobo Co., Ltd.)，并使其在冰上静置30分钟。然后将所得溶液进行42℃的热处理45秒，并使其在冰上静置5分钟，然后接种在含有0.1 mg/ml氨苄青霉素的2YT板上，且然后在37℃下进行静态培养过夜以转化大肠杆菌。第二天，将转化的大肠杆菌接种至含有0.1mg/ml氨苄青霉素的Terrific液体培养基(Thermo Fisher Scientific)中，并在37℃下培养过夜。然后，使用QIAprep 96Turbo Miniprep试剂盒(QIAGEN)回收质粒DNA(下文中被称为“小量制备处理”)，并进行序列分析以构建“pET 32a(修饰的)_活性MMP-9-结合肽”。
(1-2)活性MMP-9-结合肽的表达和纯化
将(1-1)中构建的载体pET 32a(修饰的)_活性MMP-9-结合肽转化至大肠杆菌OrigamiB (DE3) (Merck & Co., Inc.)中，并将转化的大肠杆菌在37℃下使用含有0.1 mg/ml氨苄青霉素的2YT培养基培养。然后添加IPTG (1 mM的最终浓度)，并将混合物在16℃下培养过夜。第二天，通过离心(3,000 g，20分钟，4℃)回收细胞，然后使用BugBuster Master Mix(Merck & Co., Inc.)制备裂解液，并使用TALON金属亲和树脂(Clontech Laboratories,Inc.)纯化与His标签融合的靶蛋白。接下来，使用凝血酶切割捕获试剂盒(Merck & Co.,Inc.)从硫氧还蛋白标签切割靶蛋白，然后用TALON进行纯化。此外，将纯化的产物进行凝胶过滤色谱(Superdex 75 10/300 GL)或反相色谱(YMC-Pack ODS-AM)以制备活性MMP-9-结合肽。在获得的肽中，分别地，在N-末端缀合由Stag +接头1(SEQ ID NO:19，图33)构成的部分，且在C-末端缀合C-末端6-聚体(SEQ ID NO:21，图35)。
实施例2. 制备MMP-9用于评估活性MMP-9-结合肽
图1显示人/猴/大鼠/小鼠MMP-9的序列相似性。
(2-1)人MMP-9酶活性结构域hMMP-9(cat)的制备
(2-1-1) pCMA-前-hMMP-9(cat)_His6的构建
使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)将通过用限制性酶XbaI (New England Biolabs, Inc.)和PmeI (New England Biolabs, Inc.)消化质粒pcDNA 3.3-TOPO/LacZ (Thermo Fisher Scientific)获得的约5.4 kb的片段与含有编码SEQ ID NO:28(图44)代表的人MMP-9 (P14780)的核苷酸序列的DNA片段连接以产生pcDNA3.3-hMMP-9。使用作为模板的pcDNA3.3-hMMP-9和下述引物进行PCR，然后将获得的约5.5kb的片段磷酸化，且然后自连接以构建在CMV启动子的下游具有编码SEQ ID NO:28(图44)代表的人MMP-9的核苷酸序列的pCMA-hMMP-9。
引物3：5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3'
引物4：5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3'
使用pCMA-hMMP-9作为模板进行PCR，并且构建pCMA-前-hMMP-9(cat)_His6，其在CMV启动子的下游具有编码人MMP-9(SEQ ID NO:28(图44))的分泌信号(Met1-Ala19)、前肽(Ala20-Arg106)、酶活性结构域(Phe107-Pro449)和His标签的核苷酸序列。
(2-1-2) pCMA-前-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi的构建
使用pCMA-hMMP-9作为模板进行PCR，并且构建pCMA-前-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi，其在CMV启动子的下游具有编码人MMP-9(SEQ ID NO:28(图44))的分泌信号(Met1-Ala19)、His标签、前肽(Ala20-Arg106)、酶活性结构域(Phe107-Pro449)、FLAG标签(DYKDDDDK：图50：SEQ ID NO:34))和Avi标签(GGGLNDIFEAQKIEWHE：图51，SEQ ID NO:35)的核苷酸序列。
(2-1-3) 前-hMMP-9(cat)_His6的制备
使用聚乙烯亚胺Max (Polysciences, Inc.)将(2-1-1)中构建的pCMA-前-hMMP-9(cat)_His6转染至FreeStyle 293F (Thermo Fisher Scientific)中，并且六天后，回收培养上清液。通过HisTrap excel (GE Healthcare)回收His标签融合蛋白，并用PBS替换缓冲溶液以纯化前-hMMP-9(cat)_His6。
(2-1-4)活性hMMP-9(cat)_His6的制备
将(2-1-3)中获得的前-hMMP-9(cat)_His6和用APMA活化的hMMP-3混合，并在37℃下反应4小时。在低温下用PBS替换反应溶液，以纯化活性hMMP-9(cat)_His6。
(2-1-5)前-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi的制备
以与(2-1-3)中相同的方式，使用(2-1-2)中构建的pCMA-前-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi，并纯化前-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi。
(2-1-6)生物素-标记的前-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi的制备
将(2-1-5)中获得的前-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi用10 mM Tris-HCl, pH 8.0替换，且然后根据生物素连接酶BirA (Avidity, LLC)的程序在30℃下用生物素标记1小时。在低温下用PBS替换反应溶液，并且纯化生物素标记的前-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi。
(2-1-7)生物素标记的活性hMMP-9(cat)_FLAG_Avi的制备
以与(2-1-4)中相同的方式，活化(2-1-6)中获得的生物素-标记的前-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi，并且纯化生物素-标记的活性hMMP-9(cat)_FLAG_Avi。
(2-2)小鼠MMP-9酶活性结构域mMMP-9(cat)的制备
(2-2-1) pCMA-前-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi的构建
使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)将通过用限制性酶XbaI和PmeI消化质粒pcDNA 3.3-TOPO/LacZ (Thermo Fisher Scientific)获得的约5.4kb的片段与含有编码SEQ ID NO:29(图45)代表的小鼠MMP-9 (P41245)的核苷酸序列的DNA片段连接以产生pcDNA3.3-mMMP-9。使用以下引物和作为模板的pcDNA3.3-mMMP-9进行PCR。将获得的近似5.6 kb的片段磷酸化，然后自连接以构建pCMA-mMMP-9，其在CMV启动子的下游具有编码SEQ ID NO:29(图45)代表的小鼠MMP-9的核苷酸序列。
引物3：5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3'
引物4：5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3'
使用pCMA-mMMP-9作为模板进行PCR，并且构建pCMA-前-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi，其在CMV启动子的下游具有编码小鼠MMP-9(SEQ ID NO:29(图45))的分泌信号(Met1-Ala19)、His标签、前肽(Ala20-Arg107)、酶活性结构域(Phe108-Pro449)、FLAG标签(图50，SEQ ID NO:34))和Avi标签(图51，SEQ ID NO:35)的核苷酸序列。
(2-2-2)前-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi的制备
以与(2-1-3)中相同的方式，使用(2-2-1)中构建的pCMA-前-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi，并纯化前-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi。
(2-2-3)活性mMMP-9(cat)_FLAG_Avi的制备
以与(2-1-4)中相同的方式，活化(2-2-2)中获得的前-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi，并纯化活性mMMP-9(cat)_FLAG_Avi。
实施例3. 活性MMP-9-结合肽的MMP-9-结合活性的评估
将(2-1-6)中获得的生物素-标记的前-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi或(2-1-7)中获得的生物素-标记的活性hMMP-9(cat)_FLAG_Avi固定在链霉抗生物素蛋白包被的96-孔板(Thermo Fisher Scientific)上。用3% BSA封闭后，添加1至1,000 nM的结合肽，并在室温下反应1.5小时。洗涤后，添加HRP缀合的山羊抗-S-Tag (Bethyl Laboratories, Inc.)，并在室温下反应1小时。洗涤后，添加ELISA POD底物A.B.T.S试剂盒(Nacalai Tesque Inc.)的底物，并在室温下反应。添加反应终止溶液后，用Enspire (PerkinElmer, Inc.)测量405nm处的吸光度，并评估活性MMP-9-结合肽的MMP-9-结合活性。通过使用GraphPad Prism(5.0版；GraphPad软件)计算50%有效浓度(EC50)，揭示所述活性MMP-9-结合肽中每一种都以低浓度结合活性人MMP-9酶活性结构域，但甚至在1 μM下也不结合前人MMP-9酶活性结构域(图2和3)。相反，野生型SPINK2 (WT)既不结合活性人MMP-9酶活性结构域，也不结合前人MMP-9酶活性结构域(图2)。
实施例4. 活性MMP-9-结合肽的MMP-9抑制活性的评估
(4-1)使用底物肽评估活性MMP-9-结合肽的人MMP-9抑制活性
将底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr (Dnp)-AR-NH2 (SEQ ID NO:30 (图46)) (PEPTIDEINSTITUTE, INC.; 3226-v)溶解于水中至1 mM，并用测定缓冲液(50 mM Tris-HCl, 200mM NaCl, 2 mMCaCl2, pH 7.5)稀释以便以2.5至10 μM的最终浓度使用。将50 μl用测定缓冲液稀释的活性hMMP-9(cat)_His6中的每种和活性MMP-9-结合肽混合，并在37℃下反应1小时。然后，添加100 μl用测定缓冲液稀释的底物，并用Enspire (PerkinElmer, Inc.)测量荧光信号(激发328 nm/发射393 nm)。活性hMMP-9(cat)_His6的最终浓度为0.4 nM，且活性MMP-9-结合肽的最终浓度为0.5至25 nM。对于反应和测量，使用ProteoSave(TM) SS96F黑板(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)。
计算在活性MMP-9-结合肽的每种浓度下的底物肽降解率，并且通过以0 nM的抑制剂浓度下的降解率为100%，评估每种结合肽的人MMP-9抑制活性(图4)。使用GraphPadPrism (5.0版；GraphPad软件)根据Morrison氏公式计算抑制常数Ki，且作为结果，揭示活性MMP-9-结合肽中的每一种都在低浓度下强烈抑制人MMP-9酶活性(图5)。
(4-2)使用底物明胶评估活性MMP-9-结合肽的人MMP-9抑制活性
将来自猪皮的底物明胶DQ Gelatin，荧光素缀合物(Thermo Fisher Scientific)溶解于水中至1 mg/ml，并用测定缓冲液(50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH7.5)稀释以便以10 μg/ml的最终浓度使用。将50 μl用测定缓冲液稀释的活性hMMP-9(cat)_His6中的每种和活性MMP-9-结合肽混合，并在37℃下反应1小时。然后，添加100 μl用测定缓冲液稀释的底物，并用Enspire (PerkinElmer, Inc.)测量荧光信号(激发495nm/发射515 nm)。活性hMMP-9(cat)_His6的最终浓度为0.6 nM，且活性MMP-9-结合肽的最终浓度为0.002至100 nM。对于反应和测量，使用ProteoSave(TM) SS96F黑板(SumitomoBakelite Co., Ltd.)。
计算在活性MMP-9-结合肽的每种浓度下的底物明胶降解率，并且通过以0 nM的抑制剂浓度下的降解率为100%，评估每种结合肽的人MMP-9抑制活性(图6)。使用GraphPadPrism (5.0版；GraphPad软件)计算50%抑制浓度(IC50)，且作为结果，揭示活性MMP-9-结合肽中的每一种都在低浓度下强烈抑制人MMP-9酶活性(图7)，如(4-1)中一样，甚至当使用明胶作为底物时。
实施例5. 使用底物肽评估活性MMP-9-结合肽的小鼠MMP-9抑制活性
将底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr (Dnp)-AR-NH2 (SEQ ID NO:30 (图46)) (PEPTIDEINSTITUTE, INC.; 3226-v)溶解于水中至1 mM，并用测定缓冲液(50 mM Tris-HCl, 200mM NaCl, 2 mMCaCl2, pH 7.5)稀释以便以10 μM的最终浓度使用。将50 μl用测定缓冲液稀释的活性mMMP-9(cat)_FLAG_Avi中的每种和活性MMP-9-结合肽混合，并在37℃下反应1小时。然后，添加100 μl用测定缓冲液稀释的底物，并用Enspire (PerkinElmer, Inc.)测量荧光信号(激发328 nm/发射393 nm)。活性mMMP-9(cat)_FLAG_Avi的最终浓度为0.4 nM，且活性MMP-9-结合肽的最终浓度为0.002至100 nM。对于反应和测量，使用ProteoSave(TM)SS96F黑板(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)。
计算在活性MMP-9-结合肽的每种浓度下的底物肽降解率，并且通过以0 nM的抑制剂浓度下的降解率为100%，评估每种结合肽的小鼠MMP-9抑制活性(图8)。使用GraphPadPrism (5.0版；GraphPad软件)计算50%抑制浓度(IC50)，且作为结果，揭示活性MMP-9-结合肽中的每一种都在低浓度下强烈抑制小鼠MMP-9酶活性(图9)。
实施例6. 活性MMP-9-结合肽的特异性评估
使用底物肽的切割作为指标评估其他MMP或ADAM17蛋白酶的特异性。以与(3-1)中所述的方法相同的方式，将50 μl用测定缓冲液稀释的蛋白酶中的每一种和样品(1 μM的最终浓度)混合，并对于MMP-13和MMP-17，将混合物在37℃下反应10分钟，对于其他蛋白酶，将混合物在37℃下反应60分钟。然后，添加100 μl用测定缓冲液稀释的底物，并用Enspire(PerkinElmer, Inc.)测量荧光信号(激发328 nm/发射393 nm)。应当注意，使用50 mMTris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 7.5的缓冲液作为测定缓冲液用于评估MMP-17活性，并且使用50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7.5的缓冲液作为测定缓冲液用于评估除了MMP-17以外的蛋白酶的活性。对于反应和测量，使用ProteoSave(TM) SS96F黑板(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)。用于特异性评估的蛋白酶和底物的组合如下。
人MMP-1抑制活性评估；最终浓度为5 nM的APMA-活化的人MMP-1酶活性结构域(内部制备)，和最终浓度为10 µM的底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (SEQ ID NO:30，图46) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3226-v)
人MMP-2抑制活性评估；最终浓度为1.4 nM的MMP-2，活性，人，重组，CHO细胞(Merck &Co., Inc.; PF023)，和最终浓度为50 µM的底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (SEQID NO:30，图46) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3226-v)
人MMP-3抑制活性评估；最终浓度为25 nM的由APMA活化的人MMP-3(内部制备)，和最终浓度为10 µM的底物肽MOCAc-RPKPVE-Nva-WR-Lys(Dnp)-NH2 (SEQ ID NO:33，图49)(PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3168-v)
人MMP-7抑制活性评估；最终浓度为1 nM的MMP-7(催化结构域)(人)，(重组)(EnzoLife Sciences, Inc.; BML-SE 181)，和最终浓度为10 µM的底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (SEQ ID NO:30，图46) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3226-v)
人MMP-8抑制活性评估；最终浓度为0.6 nM的APMA-活化的人MMP-8酶活性结构域(内部制备)，和最终浓度为10 µM的底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (SEQ ID NO:30，图46) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3226-v)
人MMP-10抑制活性评估；最终浓度为4 nM的MMP-10(催化结构域)(人)，(重组)(EnzoLife Sciences, Inc.; BML-SE 329)，和最终浓度为10 µM的底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (SEQ ID NO:30，图46) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3226-v)
人MMP-12抑制活性评估；最终浓度为4 nM的MMP-12(催化结构域)(人)，(重组)(EnzoLife Sciences, Inc.; BML-SE 138)，和最终浓度为10 µM的底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (SEQ ID NO:30，图46) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3226-v)
人MMP-13抑制活性评估；最终浓度为2 nM的APMA-活化的人MMP-13酶活性结构域(内部制备)，和最终浓度为10 µM的底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (SEQ ID NO:30，图46) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3226-v)
人MMP-14抑制活性评估；最终浓度为1 nM的MMP14重组蛋白(Thermo FisherScientific; RP-77531)，和最终浓度为10 µM的底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2(SEQ ID NO:30，图46) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3226-v)
人MMP-15抑制活性评估；最终浓度为1 nM的MT2-MMP，催化结构域，人，重组，大肠杆菌(Merck & Co., Inc.; 475938)，和最终浓度为10 µM的底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (SEQ ID NO:30，图46) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3226-v)
人MMP-16抑制活性评估；最终浓度为3 nM的重组人MMP-16/MT3-MMP蛋白，CF (R&DSystems, Inc.; 1785-MP)，和最终浓度为10 µM的底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2(SEQ ID NO:30，图46) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3226-v)
人MMP-17抑制活性评估；最终浓度为3 nM的重组人MMP-17蛋白，CF (R&D Systems,Inc.; 7796-MP)，和最终浓度为10 µM的底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (SEQ IDNO:30，图46) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3226-v)
人ADAM17抑制活性评估；最终浓度为3 nM的ADAM17(催化结构域)(人)，(重组)(His-标签) (Enzo Life Sciences, Inc.; BML-SE268)，和最终浓度为10 µM的底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (SEQ ID NO:30，图46) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3226-v)。
以与(4-1)中相同的方式，使用底物肽的降解作为指标评估对其他MMP或ADAM17蛋白酶的特异性。在1 µM的抑制剂最终浓度下，每种结合肽均不抑制任何蛋白酶的蛋白酶活性，表明活性MMP-9-结合肽具有MMP-9特异性抑制作用(图10)。相反，非选择性抑制剂sc-311438 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)在1 μM的最终浓度下抑制所有蛋白酶(图10)。
实施例7. 活性MMP-9-结合肽衍生物的制备
(7-1)活性MMP-9-结合肽衍生物的表达载体的构建
(7-1-1)活性MMP-9-结合肽衍生物(C-末端衍生物)表达载体的构建
使用通过将活性MMP-9-结合肽M91002插入(1-1)中构建的载体pET 32a(修饰的)_活性MMP-9-结合肽中而获得的载体pET 32a(修饰的)_M91002作为模板进行PCR，并且构建pET32a(修饰的)_M91002_G0，其在T7启动子的下游具有编码Trx标签、His标签、Stag +接头2(SEQ ID NO:20，图34)和M91002 (SEQ ID NO:3，图17)的核苷酸序列。接下来，使用构建的pET 32a(修饰的)_M91002_G0作为模板进行PCR，并且构建pET 32a(修饰的)_M91002_G2，其在T7启动子的下游具有编码Trx标签、His标签、Stag +接头2 (SEQ ID NO:20，图34)、M91002 (SEQ ID NO:3，图17)和C-末端2-聚体(Gly-Gly：图37)的核苷酸序列。然后，使用构建的pET 32a(修饰的)_M91002_G0作为模板进行PCR，并且构建pET 32a(修饰的)_M91002_G3，其在T7启动子的下游具有编码Trx标签、His标签、Stag +接头2 (SEQ ID NO:20，图34)、M91002 (SEQ ID NO:3，图17)和C-末端3-聚体(Gly-Gly-Gly：图36)的核苷酸序列。
(7-1-2)活性MMP-9-结合肽衍生物(Fc缀合物)表达载体的构建
使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将通过用限制性酶XbaI (New England Biolabs, Inc.)和PmeI (New England Biolabs, Inc.)消化(2-1-1)中构建的载体pCMA-hMMP-9以除去编码人MMP-9的核苷酸序列获得的DNA片段，以及含有编码人IgG1重链信号序列、Stag +接头1 (SEQ ID NO:19，图33)、M91005 (SEQ ID NO:5，图19)、C-末端6-聚体(SEQ ID NO:21，图35)、G4S接头(SEQ ID NO:22，图38)和人IgG1 Fc(SEQID NO:23，图39)的核苷酸序列的DNA片段连接以产生pCMA-M91005-Fc-01。
(7-1-3)活性MMP-9-结合肽衍生物(N-末端衍生物)表达载体的构建
使用(7-1-2)中构建的载体pCMA-M91005-Fc-01作为模板进行PCR，并且构建pCMA-M91005_D1G-Fc-01，其在CMV启动子的下游具有编码人IgG1重链信号序列、Stag +接头1(SEQ ID NO:19，图33)、M91005_D1G (SEQ ID NO:13，图27)、C-末端6-聚体(SEQ ID NO:21，图35)、G4S接头(SEQ ID NO:22，图38)和人IgG1 Fc(SEQ ID NO:23，图39)的核苷酸序列。
(7-2)活性MMP-9-结合肽衍生物的表达和纯化
以与(1-2)中相同的方式，使用(7-1-1)中构建的载体pET 32a(修饰的)_M91002_G0、pET 32a(修饰的)_M91002_G2或pET 32a(修饰的)_M91002_G3，并且制备活性MMP-9-结合肽衍生物(C-末端衍生物)。在获得的肽衍生物中，分别地，在N-末端缀合由Stag +接头2 (SEQID NO:20，图34)组成的部分，而在M91002_G2的C-末端缀合C-末端2-聚体(Gly-Gly：图37)且在M91002_G3的C-末端缀合C-末端3-聚体(Gly-Gly-Gly：图36)。
使用聚乙烯亚胺Max (Polysciences, Inc.)将(7-1-2)中构建的pCMA-M91005-Fc-01或(7-1-3)中构建的pCMA-M91005_D1G-Fc-01转染至FreeStyle 293F (ThermoFisher Scientific)中，并且六天后，回收培养上清液。通过MabSelect SuRe (GEHealthcare)回收Fc缀合物蛋白，然后进行凝胶过滤色谱(Superdex 200增加10/300 GL)以制备活性MMP-9-结合肽衍生物(Fc缀合物)或活性MMP-9-结合肽衍生物(N-末端衍生物)。在获得的肽衍生物中，在N-末端缀合由Stag +接头1(SEQ ID NO:19，图33)组成的部分，而在C-末端缀合C-末端6-聚体(SEQ ID NO:21，图35)、G4S接头(SEQ ID NO:22，图38)和人IgG1Fc(SEQ ID NO:23，图39)。
实施例8. 活性MMP-9-结合肽衍生物的MMP-9抑制活性的评估
根据(4-1)中描述的方法，用最终浓度为0.6 nM的活性hMMP-9(cat)_His6和最终浓度为0.0015至100nM的每种活性MMP-9-结合肽，评估每种结合肽的人MMP-9抑制活性(图11(A)、12(A)和13(A))。使用GraphPad Prism (5.0版；GraphPad软件)计算50%抑制浓度(IC50)，并且作为结果，揭示M91002_G3、M91002_G2和M91002_G0的抑制活性等同于M91002的抑制活性(图11(B))，并且向结合肽的C-末端添加1至6个氨基酸不影响MMP-9抑制活性。还显示M91005-Fc-01和M91005的抑制活性是等同的(图12(B))，并且Fc缀合不影响MMP-9抑制活性。此外，显示M91005-Fc-01和M91005_D1G-Fc-01的抑制活性是等同的(图13(B))，并且用Gly取代结合肽中的Asp 1不影响MMP-9抑制活性。
实施例9. 使用活性MMP-9-结合肽衍生物(Fc缀合物)检测活性MMP-9
用(7-2)中制备的M91005-Fc-01和(2-1)中制备的前-hMMP-9(cat)_His6和活性hMMP-9(cat)_His6，通过免疫沉淀方法评估结合活性。将3 μg活性MMP-9-结合肽衍生物和1.5 mg用于免疫沉淀的Dynabeads(TM)蛋白G (Thermo Fisher Scientific)混合，并在室温下反应30分钟。洗涤后，添加0.39 μg前人MMP-9酶活性结构域或0.63 μg活性人MMP-9酶活性结构域，并使混合物在4℃下反应1小时。用磁体分离珠粒后，回收上清液级分(FT)。洗涤珠粒后，添加用于SDS-PAGE的样品缓冲液(还原)，并在99℃下反应5分钟，且回收与珠粒结合的样品作为沉淀级分(Elu)。添加的人MMP-9酶活性结构域(Inp)、FT和Elu进行SDS-PAGE，并通过用生物素化人MMP-9抗体(R&D Systems; BAF911)和链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物(GEHealthcare; RPN2280)检测来评价结合活性。作为用于反应的缓冲液，使用50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 2 mMCaCl2, pH 7.5的缓冲液。
当使用与M91005-Fc-01连接的珠粒时，在Elu泳道中未检测到前-hMMP-9(cat)_His6，而在Elu泳道中检测到活性hMMP-9(cat)_His6。相反，当使用未与M91005-Fc-01连接的珠粒时，在Elu泳道中未检测到前-hMMP-9(cat)_His6和活性hMMP-9(cat)_His6(图14(A))。因此，显示活性MMP-9-结合肽衍生物(Fc缀合物)不结合前人MMP-9，但特异性结合活性人MMP-9。
以相同的方式，使用(7-2)中制备的M91005-Fc-01和(2-2)中制备的前-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi和活性mMMP-9(cat)_FLAG_Avi，通过免疫沉淀方法评估结合活性。用于评估的样品进行SDS-PAGE，并且通过使用小鼠MMP-9抗体(R&D Systems; AF909)和过氧化物酶AffiniPure F(ab')2片段驴抗山羊IgG(H+L) (Jackson ImmunoResearch Inc.;705-036-147)检测来评估结合活性。
当使用M91005-Fc-01-结合的珠粒时，在Elu泳道中未检测到前-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi，而在Elu泳道中检测到活性mMMP-9(cat)_FLAG_Avi。相反，当使用未与M91005-Fc-01连接的珠粒时，在Elu泳道中未检测到前-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi和活性mMMP-9(cat)_FLAG_Avi (图14(B))。因此，显示活性MMP-9-结合肽衍生物(Fc缀合物)不结合前小鼠MMP-9，但特异性结合活性小鼠MMP-9。
实施例10. 活性MMP-9-结合肽的特异性评估(丝氨酸蛋白酶)
使用底物肽切割作为指标，评估对12种丝氨酸蛋白酶的特异性。将用测定缓冲液(50mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0)稀释的，25μl蛋白酶和25μl样品(1 μM的最终浓度)混合，并使混合物在37℃下反应20分钟。然后，添加50 μl用测定缓冲液稀释的底物，并用Enspire (PerkinElmer, Inc.)测量荧光信号(激发380 nm/发射460 nm)。对于反应和测量，使用ProteoSave(TM) SS96F黑板(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)。用于特异性评估的蛋白酶和底物的组合如下。
人胰蛋白酶抑制活性评估；最终浓度为1 nM的来自人胰腺的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich Co.; T6264)，和最终浓度为10 μM的底物肽Boc-FSR-MCA (图55) (PEPTIDEINSTITUTE, INC.; 3107-v)
人胰凝乳蛋白酶抑制活性评估；最终浓度为10 nM的来自人胰腺的α-胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich Co.; C8946)，和最终浓度为10 µM的底物肽Suc-LLVY-MCA (SEQ ID NO:36，图56) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3120-v)
人类胰蛋白酶抑制活性评估；最终浓度为1 nM的来自人肺的类胰蛋白酶(Sigma-Aldrich Co.; T7063)，和最终浓度为100 μM的底物肽Boc-FSR-MCA (图55) (PEPTIDEINSTITUTE, INC.; 3107-v)
人糜蛋白酶抑制活性评估；最终浓度为100 nM的巴斯德毕赤酵母中表达的糜蛋白酶人重组体(Sigma-Aldrich Co.; C8118)，和最终浓度为100 µM的底物肽Suc-AAPF-MCA (SEQID NO:37，图57) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3114-v)
人纤溶酶抑制活性评估；最终浓度为50 nM的来自人血浆的纤溶酶(Sigma-AldrichCo.; P1867)，和最终浓度为100 μM的底物肽Boc-VLK-MCA (图58) (PEPTIDE INSTITUTE,INC.; 3104-v)
人凝血酶抑制活性评估；最终浓度为1 nM的来自人血浆的凝血酶(Sigma-AldrichCo.; T1063)，和最终浓度为100 μM的底物肽Boc-VPR-AMC (图59) (R&D Systems, Inc.;ES011)
人弹性蛋白酶抑制活性评估；最终浓度为0.01 U/ml的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(人)(Enzo Life Sciences, Inc.; BML-SE284)，和最终浓度为100 µM的底物肽Suc(OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (SEQ ID NO:38, Figure 60) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3153-v)
人Matriptase抑制活性评估：最终浓度为1 nM的重组人Matriptase/ST14催化结构域(R&D Systems, Inc.; 3946-SE)，和最终浓度为100 μM的底物肽Boc-QAR-AMC (图61) (R&D Systems, Inc.; ES014)
人蛋白C抑制活性评估；最终浓度为100 nM的来自人血浆的蛋白酶C (Sigma-AldrichCo.; P2562)，和最终浓度为100 µM的底物肽Boc-LSTR-MCA (SEQ ID NO:39，图62)(PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3112-v)
人tPA抑制活性评估；最终浓度为10 nM的人组织纤溶酶原激活物(Sigma-AldrichCo.; T0831)，和最终浓度为100 μM的底物肽Pyr-GR-MCA (图63) (PEPTIDE INSTITUTE,INC.; 3145-v)
人uPA抑制活性评估；最终浓度为2 nM的来自人尿液的尿激酶(Sigma-Aldrich Co.;U0633)，和最终浓度为100 μM的底物肽Pyr-GR-MCA (图63) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.;3145-v)
人血浆激肽释放酶抑制活性评估；最终浓度为0.125 μg/ml的重组人血浆激肽释放酶/KLKB1蛋白(R&D Systems, Inc.; 2497-SE)，和最终浓度为100 μM的底物肽Z-FR-MCA (图64) (PEPTIDE INSTITUTE, INC.; 3095-v)。
以与(4-1)中相同的方式，使用底物肽的降解作为指标评估对丝氨酸蛋白酶的特异性。在1 µM抑制剂的最终浓度下，每种结合肽均不抑制任何蛋白酶的蛋白酶活性，表明活性MMP-9-结合肽具有MMP-9特异性抑制作用(图52)。相反，非选择性抑制剂，即蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich Co.; 11836170001)在1 μM的最终浓度下抑制所有蛋白酶(图52)。
实施例11. 人MMP-9酶活性结构域E402Q突变体的制备
(11-1-2) pCMA-前-hMMP-9(cat)_E402Q_His6的构建
使用(2-1-1)中构建的pCMA-前-hMMP-9(cat)_His6作为模板进行PCR，并且构建pCMA-前-hMMP-9(cat)_E402Q_His6，其在CMV启动子的下游具有编码人MMP-9(SEQ ID NO:28(图44))的分泌信号(Met1-Ala19)、前肽(Ala20-Arg106)、酶活性结构域E402Q突变体(Phe107-Pro449, E402Q)和His标签的核苷酸序列。
(11-2) 前-hMMP-9(cat)_E402Q_His6的制备
使用聚乙烯亚胺Max (Polysciences, Inc.)将(11-1)中构建的pCMA-前-hMMP-9(cat)_E402Q_His6转染至FreeStyle 293F (Thermo Fisher Scientific)中，并且六天后，回收培养上清液。通过HisTrap excel (GE Healthcare)回收His标签融合蛋白，并用PBS替换缓冲溶液以纯化前-hMMP-9(cat)_E402Q_His6。
(11-3) hMMP-9(cat)_E402Q_His6的制备
将(11-2)中获得的前-hMMP-9(cat)_E402Q_His6和用APMA活化的hMMP-3混合，并在37℃下反应4小时。在低温下用PBS替换反应溶液，以纯化hMMP-9(cat)_E402Q_His6。
实施例12. 活性MMP-9-结合肽和人MMP-9活性中心Glu402残基之间的相互作用分析
用(1-2)中制备的M91005和M91011、(2-1-4)中制备的活性hMMP-9(cat)_His6和(11-3)中制备的hMMP-9(cat)_E402Q_His6，通过大小排阻色谱评估结合活性。将25 μM活性hMMP-9(cat)_His6或hMMP-9(cat)_E402Q_His6和75 μM活性MMP-9-结合肽或hTIMP-1(内部制备)混合，并在4℃下反应1小时。反应后，通过大小排阻色谱法分析10 μl反应溶液。色谱条件如下。
柱：ACQUITY UPLC BEH200柱(Waters; 186005225)
流动相：PBS
检测：吸光度(280 nm)。
当仅分析活性hMMP-9(cat)_His6时，在7.0分钟的保留时间检测到活性hMMP-9(cat)_His6的峰(图53(A))。当分析活性hMMP-9(cat)_His6和hTIMP-1或活性MMP-9-结合肽M91005或M91011的混合反应溶液时，活性hMMP-9(cat)_His6的峰的保留时间迁移至高分子量侧(图53(A))。因此，显示hTIMP-1和活性MMP-9-结合肽M91005和M91011结合活性人MMP-9酶活性结构域。当仅分析人MMP-9(cat)_E402Q_His6时，在7.1分钟的保留时间检测到hMMP-9(cat)_E402Q_His6的峰(图53(B))。当分析人MMP-9(cat)_E402Q_His6和hTIMP-1的混合反应溶液时，hMMP-9(cat)_E402Q_His6的峰的保留时间迁移至高分子量侧(图53(B))。因此，显示hTIMP-1结合人MMP-9酶活性结构域E402Q突变体。相反，当分析hMMP-9(cat)_E402Q_His6和活性MMP-9-结合肽M91005或M91011的混合反应溶液时，hMMP-9(cat)_E402Q_His6的峰的保留时间没有改变(图53(B))。应当注意，当仅分析hTIMP-1或活性MMP-9-结合肽M91005、M91011时，在7.3分钟的保留时间检测到hTIMP-1的峰，在8.2分钟的保留时间检测到活性MMP-9-结合肽M91005的峰，并且在8.1分钟的保留时间检测到活性MMP-9-结合肽M91011的峰(图53(C))。
因此，显示活性MMP-9-结合肽M91005和M91011不结合人MMP-9酶活性结构域E402Q突变体。因此，显示活性MMP-9-结合肽M91005和M91011识别并结合作为人MMP-9的活性中心的Glu402残基。
实施例13. 活性人MMP-9酶活性结构域突变体的制备
(13-1) pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)的构建
使用(2-1-1)中构建的pCMA-前-hMMP-9(cat)_His6作为模板进行PCR，并且构建pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)，其在CMV启动子的下游具有编码人MMP-9(SEQ ID NO:28(图44))的分泌信号(Met1-Ala19)、His标签、前肽(Ala20-Arg106)、肠激酶识别序列(图65：SEQ IDNO:40)和酶活性结构域(Phe107-Pro449)的核苷酸序列。
(13-2) pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_XnnnY的构建
使用(13-1)中构建的pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)作为模板进行PCR，并且构建pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_Q108N、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_T109F、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_F110A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_E111P、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_G112R、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_D113K、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_L114P、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y179A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_P180A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_D185A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_G186A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_L187A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_F192A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_P193A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_P196T、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_I198V、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_Q199G、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y393A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_L397A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_V398A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_D410E、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_S413Q、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_L418A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y420A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_P421A、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_M422I、pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y423A和pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_R424T，其在CMV启动子的下游具有编码人MMP-9(SEQ ID NO:28(图44))的分泌信号(Met1-Ala19)、His标签、前肽(Ala20-Arg106)、肠激酶识别序列(图65：SEQ ID NO:40)和酶活性结构域(Phe107-前449)的突变体(Q108N、T109F、F110A、E111P、G112R、D113K、L114P、Y179A、P180A、D185A、G186A、L187A、F192A、P193A、P196T、I198V、Q199G、Y393A、L397A、V398A、D410E、S413Q、L418A、Y420A、P421A、M422I、Y423A或R424T)的核苷酸序列。
(13-3)前-His6_EK-hMMP-9(cat)的制备
使用聚乙烯亚胺Max (Polysciences, Inc.)将(13-1)中构建的pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)转染至FreeStyle 293F (Thermo Fisher Scientific)中，并且六天后，回收培养上清液。通过HisTrap excel (GE Healthcare)和明胶-琼脂糖树脂(GE Healthcare)回收His标签融合蛋白，并用PBS替换缓冲溶液以纯化前-His6_EK-hMMP-9(cat)。
(13-4)活性hMMP-9(cat)的制备
将(13-1-3)中获得的前-His6_EK-hMMP-9(cat)和EKMax肠激酶(Thermo FisherScientific)混合，并在4℃下反应2小时。用EKapture琼脂糖(EMD Millipore)从反应溶液除去肠激酶后，在低温下用PBS替换缓冲溶液以纯化活性hMMP-9(cat)。
(13-5)前-His6_EK-hMMP-9(cat)_XnnnY的制备
使用聚乙烯亚胺Max (Polysciences, Inc.)将(13-2)中构建的pCMA-前-His6_EK-hMMP-9(cat)_XnnnY转染至FreeStyle 293F (Thermo Fisher Scientific)中，并且六天后，回收培养上清液。通过HisTrap excel (GE Healthcare)和明胶-琼脂糖树脂(GEHealthcare)回收His标签融合蛋白，并用PBS替换缓冲溶液以纯化前-His6_EK-hMMP-9(cat)_Q108N、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_T109F、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_F110A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_E111P、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_G112R、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_D113K、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_L114P、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y179A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_P180A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_D185A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_G186A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_L187A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_F192A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_P193A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_P196T、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_I198V、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_Q199G、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y393A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_L397A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_V398A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_D410E、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_S413Q、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_L418A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y420A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_P421A、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_M422I、前-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y423A和前-His6_EK-hMMP-9(cat)_R424T。
(13-6)活性hMMP-9(cat)_XnnnY的制备
将(13-5)中获得的前-His6_EK-hMMP-9(cat)_XnnnY和EKMax肠激酶(Thermo FisherScientific)混合，并在4℃下反应2小时。通过EKapture琼脂糖(EMD Millipore)从反应溶液除去肠激酶后，在低温下用PBS替换缓冲溶液以纯化活性hMMP-9(cat)_Q108N、活性hMMP-9(cat)_T109F、活性hMMP-9(cat)_F110A、活性hMMP-9(cat)_E111P、活性hMMP-9(cat)_G112R、活性hMMP-9(cat)_D113K、活性hMMP-9(cat)_L114P、活性hMMP-9(cat)_Y179A、活性hMMP-9(cat)_P180A、活性hMMP-9(cat)_D185A、活性hMMP-9(cat)_G186A、活性hMMP-9(cat)_L187A、活性hMMP-9(cat)_F192A、活性hMMP-9(cat)_P193A、活性hMMP-9(cat)_P196T、活性hMMP-9(cat)_I198V、活性hMMP-9(cat)_Q199G、活性hMMP-9(cat)_Y393A、活性hMMP-9(cat)_L397A、活性hMMP-9(cat)_V398A、活性hMMP-9(cat)_D410E、活性hMMP-9(cat)_S413Q、活性hMMP-9(cat)_L418A、活性hMMP-9(cat)_Y420A、活性hMMP-9(cat)_P421A、活性hMMP-9(cat)_M422I、活性hMMP-9(cat)_Y423A和活性hMMP-9(cat)_R424T。
实施例14. 活性MMP-9-结合肽和活性人MMP-9酶活性结构域突变体之间的相互作用分析
用(1-2)中制备的M91005和M91011、(13-4)中制备的活性hMMP-9(cat)和(13-6)中制备的活性hMMP-9(cat)_XnnnY，评估人MMP-9抑制活性。
将底物肽MOCAc-KPLGL-A2pr (Dnp)-AR-NH2 (SEQ ID NO:30 (图46)) (PEPTIDEINSTITUTE, INC.; 3226-v)溶解于水中至1 mM，然后用测定缓冲液(50 mM Tris-HCl, 200mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH7.5)稀释并且以10 μM的最终浓度使用。将50 μl用测定缓冲液稀释的活性hMMP-9(cat)_His6或活性hMMP-9(cat)_XnnnY的每一种和活性MMP-9-结合肽或sc-311438 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)混合，并在37℃下反应1小时。然后，添加100 μl用测定缓冲液稀释的底物，并用Enspire (PerkinElmer, Inc.)测量荧光信号(激发328 nm/发射393 nm)。活性hMMP-9(cat)和活性hMMP-9(cat)_XnnnY的最终浓度为1 nM，且活性MMP-9-结合肽和sc-311438的最终浓度为0.5至330 nM。对于反应和测量，使用ProteoSave(TM) SS96F黑板(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)。
使用GraphPad Prism (5.0版；GraphPad软件)，通过计算每种浓度下的活性MMP-9-结合肽的底物肽降解率，并以0 nM的抑制剂浓度下的降解率作为100%，计算每种结合肽的50%抑制浓度(IC50)(图54(A)和54(B))。当使用野生型活性hMMP-9(cat)时，非选择性抑制剂sc-311438的IC50为28 ± 7 nM，活性MMP-9-结合肽M91005的IC50为17 ± 7 nM，且活性MMP-9-结合肽M91011的IC50为17 ± 5 nM。当使用活性hMMP-9(cat)_XnnnY时，非选择性抑制剂sc-311438的IC50小于野生型的IC50的两倍，并且未观察到显著差异。由于非选择性抑制剂sc-311438识别并结合在活性中心的锌离子，因此据信除了活性中心的残基以外的那些的取代几乎没有作用。相反，当使用活性hMMP-9(cat)_F110A、活性hMMP-9(cat)_Y179A、活性hMMP-9(cat)_L187A、活性hMMP-9(cat)_F192A、活性hMMP-9(cat)_Q199G、活性hMMP-9(cat)_Y393A、活性hMMP-9(cat)_L397A、活性hMMP-9(cat)_V398A、活性hMMP-9(cat)_Y420A、活性hMMP-9(cat)_M422I和活性hMMP-9(cat)_Y423A时，活性MMP-9-结合肽M91005的IC50与当使用野生型时相比分别增加4.0倍、3.2倍、6.7倍、>57.8倍、2.3倍、2.7倍、2.2倍、2.2倍、3.1倍、2.6倍和13.2倍。因此，已经表明活性MMP-9-结合肽M91005识别人MMP-9的Phe110、Tyr179、Leu187、Phe192、Gln199、Tyr393、Leu397、Val398、Tyr420、Met422和Tyr423，并结合活性人MMP-9。类似地，当使用活性hMMP-9(cat)_Y179A、活性hMMP-9(cat)_D185A、活性hMMP-9(cat)_F192A、活性hMMP-9(cat)_P193A、活性hMMP-9(cat)_Y393A、活性hMMP-9(cat)_L397A、活性hMMP-9(cat)_V398A、活性hMMP-9(cat)_M422I、活性hMMP-9(cat)_Y423A和活性hMMP-9(cat)_R424T时，活性MMP-9-结合肽M91011的IC50与当使用野生型时相比分别增加4.9倍、19.0倍、5.0倍、6.5倍、>57.6倍、3.5倍、4.8倍、2.6倍、>20.0倍和2.7倍。因此，已经表明活性MMP-9-结合肽M91005识别人MMP-9的Tyr179、Asp185、Phe192、Phe193、Tyr393、Leu397、Val398、Met422、Tyr423和Arg424，并结合活性人MMP- 9。
产业适用性
本发明提供的肽以及含有该肽的药物和诊断组合物可用于与MMP-9相关的疾病的治疗、预防、测试、诊断等。
序列表的自由文本
SEQ ID NO:1: 人SPINK2的氨基酸序列(图15)
SEQ ID NO:2: 活性MMP-9-结合肽M91001的氨基酸序列(图16)
SEQ ID NO:3: 活性MMP-9-结合肽M91002的氨基酸序列(图17)
SEQ ID NO:4: 活性MMP-9-结合肽M91004的氨基酸序列(图18)
SEQ ID NO:5: 活性MMP-9-结合肽M91005的氨基酸序列(图19)
SEQ ID NO:6: 活性MMP-9-结合肽M91010的氨基酸序列(图20)
SEQ ID NO:7: 活性MMP-9-结合肽M91011的氨基酸序列(图21)
SEQ ID NO:8: 活性MMP-9-结合肽M91012的氨基酸序列(图22)
SEQ ID NO:9: 活性MMP-9-结合肽M91014的氨基酸序列(图23)
SEQ ID NO:10: 活性MMP-9-结合肽M91001_D1G的氨基酸序列(图24)
SEQ ID NO:11: 活性MMP-9-结合肽M91002_D1G的氨基酸序列(图25)
SEQ ID NO:12: 活性MMP-9-结合肽M91004_D1G的氨基酸序列(图26)
SEQ ID NO:13: 活性MMP-9-结合肽M91005_D1G的氨基酸序列(图27)
SEQ ID NO:14: 活性MMP-9-结合肽M91010_D1G的氨基酸序列(图28)
SEQ ID NO:15: 活性MMP-9-结合肽M91011_D1G的氨基酸序列(图29)
SEQ ID NO:16: 活性MMP-9-结合肽M91012_D1G的氨基酸序列(图30)
SEQ ID NO:17: 活性MMP-9-结合肽M91014_D1G的氨基酸序列(图31)
SEQ ID NO:18: 活性MMP-9-结合肽的通式(图32)
SEQ ID NO:19: Stag + 接头1的氨基酸序列(图33)
SEQ ID NO:20: Stag + 接头2的氨基酸序列(图34)
SEQ ID NO:21: C-末端6-聚体的氨基酸序列(图35)
SEQ ID NO:22: G4S接头的氨基酸序列(图38)
SEQ ID NO:23: 人IgG1 Fc的氨基酸序列(图39)
SEQ ID NO:24: 引物1的核苷酸序列(图40)
SEQ ID NO:25: 引物2的核苷酸序列(图41)
SEQ ID NO:26: 引物3的核苷酸序列(图42)
SEQ ID NO:27: 引物4的核苷酸序列(图43)
SEQ ID NO:28: 人MMP-9的氨基酸序列(图44)
SEQ ID NO:29: 小鼠MMP-9的氨基酸序列(图45)
SEQ ID NO:30: MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2的氨基酸序列(图46)
SEQ ID NO:31: MOCAc-PLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2的氨基酸序列(图47)
SEQ ID NO:32: DNP-PLGMWSR的氨基酸序列(图48)
SEQ ID NO:33: MOCAc-RPKPVE-Nva-WR-Lys (Dnp)-NH2的氨基酸序列(图49)
SEQ ID NO:34: FLAG标签的氨基酸序列(图50)
SEQ ID NO:35: Avi标签的氨基酸序列(图51)
SEQ ID NO:36: Suc-LLVY-MCA的氨基酸序列(图56)
SEQ ID NO:37: Suc-AAPF-MCA的氨基酸序列(图57)
SEQ ID NO:38: Suc(OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MCA的氨基酸序列(图60)
SEQ ID NO:39: Boc-LSTR-MCA的氨基酸序列(图62)
SEQ ID NO:40: 肠激酶识别序列的氨基酸序列(图65)。
Figure IDA0002371668250000011
Figure IDA0002371668250000021
Figure IDA0002371668250000031
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Claims (49)

1.SPINK2突变型肽，其包含由SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列，并且结合活性人MMP-9，但不结合前人MMP-9。
2.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽结合活性人MMP-9的酶活性结构域。
3.根据权利要求1或2所述的肽，其中所述肽抑制人MMP-9的蛋白酶活性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽，其中所述抑制对MMP-9是特异性的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽，其中X1是Asp或Gly。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，其中X7是Pro，X9是Gln，且X10是Met。
7.根据权利要求6所述的肽，其中X2是Arg、Gln、Gly、Trp或Tyr；X3是Arg、Asp、Gln、Glu、Lys、Met、Ser、Thr或Val；X4是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Gly、Leu、Lys或Val；X5是Ala、Arg、Asn、Gly、Ile、Leu或Lys；X6是Ala、Glu、Gly、Met或Ser；X8是Ala、Leu或Ser；X11是Ala、Gly或Ser；X12是Leu、Phe、Ser或Tyr；且X13是Asn、Asp、Gln、Leu或Lys。
8.根据权利要求7所述的肽，其中X2是Arg或Gln；X3是Arg、Gln、Lys、Thr或Val；X4是Arg、Gly或Val；X5是Arg、Gly、Ile或Lys；X6是Glu或Gly；X8是Ala或Ser；X11是Ala、Gly或Ser；X12是Phe或Tyr；且X13是Asn、Gln或Lys。
9.根据权利要求8所述的肽，其中所述肽包含由SEQ ID NO:2至6和8(图16至20和22)中的任一个代表的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，其中X6是Tyr，X8是Gln，且X9是Ser。
11.根据权利要求10所述的肽，其中X2是Arg、Lys、Met或Val；X3是Arg、Gln、Lys或Met；X4是Phe或Tyr；X5是Gln、Glu或Lys；X7是Ala或Gly；X10是Asn或His；X11是Leu、Lys、Met或Val；X12是Phe、Ser或Tyr；且X13是Ala、Asn、Gln或Lys、Gln或Lys。
12.根据权利要求11所述的肽，其中X2是Met或Val；X3是Met；X4是Tyr；X5是Lys；X7是Ala；X10是His；X11是Lys；X12是Ser或Tyr；且X13是Gln或Lys。
13.根据权利要求12所述的肽，其中所述肽包含由SEQ ID NO:7(图21)或SEQ ID NO:9(图23)代表的氨基酸序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的肽，其中所述肽包含具有以下的氨基酸序列：
SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列；和
1至3个氨基酸残基或SEQ ID NO:19(图33)或SEQ ID NO:20(图34)代表的氨基酸序列，其添加至SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列的氨基末端侧。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的肽，其中所述肽包含具有以下的氨基酸序列：
SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列；和
由添加至SEQ ID NO:18(图32)代表的氨基酸序列的羧基末端侧的1至6个氨基酸组成的氨基酸序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的肽，其中所述肽包含由SEQ ID NO:2至17(图16至31)中的任一个代表的氨基酸序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的肽，其中所述肽具有特征在于具有三个二硫键且包括环结构、α-螺旋和β-片层的构象。
18.多核苷酸，其包含编码根据权利要求1至17中任一项所述的肽中含有的氨基酸序列的核苷酸序列。
19.载体，其包含根据权利要求18所述的多核苷酸。
20.细胞，其包含根据权利要求18所述的多核苷酸或根据权利要求19所述的载体，或产生根据权利要求1至17中任一项所述的肽。
21.用于产生SPINK2突变型肽的方法，其包括以下步骤(i)和(ii)：
(i)培养根据权利要求20所述的细胞；和
(ii)从培养物回收SPINK2突变型肽。
22.用于产生根据权利要求1至17中任一项所述的肽的方法，其包括通过化学合成或体外翻译制备所述肽的步骤。
23.通过根据权利要求21或22所述的方法获得的SPINK2突变型肽。
24.缀合物，其包含根据权利要求1至17和23中任一项所述的肽以及与其结合的另一部分。
25.根据权利要求24所述的缀合物，其中所述缀合物是肽。
26.根据权利要求24或25所述的缀合物，其中所述缀合物包含免疫球蛋白Fc区或其功能片段。
27.用于产生根据权利要求24至26中任一项所述的SPINK2突变型肽缀合物的方法，其包括以下步骤(i)和(ii)：
(i)培养细胞，所述细胞含有具有编码所述缀合物中含有的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸或已经向其中插入所述多核苷酸的载体；和
(ii)从所述培养物回收所述SPINK2突变型肽缀合物或所述缀合物中含有的肽。
28.用于产生根据权利要求24至26中任一项所述的SPINK2突变型肽缀合物的方法，其包括通过化学合成或体外翻译制备所述缀合物或所述缀合物中含有的肽的步骤。
29.通过根据权利要求27或28所述的方法产生的缀合物。
30.抗体或其功能片段，其结合根据权利要求1至17和23中任一项所述的肽。
31.组合物，其包含根据权利要求1至17和23中任一项所述的肽，根据权利要求18所述的多核苷酸，根据权利要求19所述的载体，根据权利要求20所述的细胞，根据权利要求24至26和29中任一项所述的缀合物，和/或根据权利要求30所述的抗体或其功能片段。
32.用于测试或诊断的组合物，其包含根据权利要求1至17和23中任一项所述的肽和/或根据权利要求24至26和29中任一项所述的缀合物。
33.用于检测活性MMP-9的方法，其包括以下步骤(i)和(ii)：
(i)使根据权利要求1至17和23中任一项所述的肽和/或根据权利要求24至26和29中任一项所述的缀合物与测试样品接触；和
(ii)测量与所述测试样品中的组分结合的SPINK2突变型肽和/或缀合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中步骤(ii)是回收与所述测试样品接触的SPINK2突变型肽和/或缀合物和测量与所述SPINK2突变型肽和/或缀合物结合的活性MMP-9的量或活性的步骤。
35.药物组合物，其包含根据权利要求1至17和23中任一项所述的肽，根据权利要求18所述的多核苷酸，根据权利要求19所述的载体，根据权利要求20所述的细胞，和/或根据权利要求24至26和29中任一项所述的缀合物。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其用于治疗或预防MMP-9相关疾病。
37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述MMP-9相关疾病是炎性/自身免疫疾病、神经退行性疾病、精神疾病、血管疾病或恶性肿瘤。
38.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述炎性/自身免疫疾病是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、支气管哮喘、间质性肺炎、慢性阻塞性肺疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、肝炎、湿疹(或皮炎)、银屑病、扁平苔藓、红斑/红皮病、荨麻疹、秃头症、天疱疮、寻常痤疮、压力性溃疡/伤口、结膜炎、角膜炎、鼻炎、口腔炎、舌炎、白塞氏病、多发性硬化症、脑炎、头痛、周围神经炎、糖尿病性并发症(糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经病)、动脉粥样硬化、胰腺炎、慢性心力衰竭或肾炎。
39.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、额颞叶痴呆、脑损伤、脊髓损伤、缺氧、惊厥或创伤性脑病。
40.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述精神疾病是重度抑郁症、双相情感障碍、焦虑症、创伤后应激障碍(PTSD)、进食障碍、睡眠障碍、精神分裂症、成瘾、自闭症、脆性X综合征、注意缺陷多动障碍或唐氏综合症。
41.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述血管疾病是脑血管病症、脑动脉瘤、脑淀粉样血管病、外周血管病症、主动脉瘤、主动脉夹层、动静脉瘘、动脉硬化、高安动脉炎、川崎病、静脉曲张或血管钙化。
42.根据权利要求37所述的药物组合物，其中所述恶性肿瘤是肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌或神经胶质瘤。
43.用于测试或诊断的组合物，其包含根据权利要求30所述的抗体或其功能片段。
44.根据权利要求21、22、27或28所述的方法，其包括使用根据权利要求30所述的抗体或其功能片段的亲和纯化步骤。
45.用于鉴定人MMP-9抑制性SPINK2突变型肽的方法，其包括以下步骤(i)至(iii)：
(i)在待测试的SPINK2突变型肽存在和不存在的情况下孵育人MMP-9蛋白酶和底物；
(ii)在待测试的SPINK2突变型肽存在和不存在的情况下测量人MMP-9蛋白酶活性；和
(iii)比较在SPINK2突变型肽存在的情况下的人MMP-9蛋白酶活性与在SPINK2突变型肽不存在的情况下的人MMP-9蛋白酶活性，和当在SPINK2突变型肽存在的情况下的人MMP-9蛋白酶活性小于在SPINK2突变型肽不存在的情况下的人MMP-9蛋白酶活性时，确定所述SPINK2突变型肽是阳性的。
46.用于鉴定人MMP-9特异性抑制化合物的方法，其包括以下步骤(i)至(iii)：
(i)在具有SEQ ID NO:2至17(图16至31)中的任一个代表的氨基酸序列的肽存在的情况下，使测试化合物结合人活性MMP-9；
(ii)确定所述化合物是否与所述肽竞争结合人活性MMP-9；和
(iii)确定所述化合物是否具有人MMP-9特异性结合活性。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述化合物是SPINK2突变型肽。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述化合物是抗体或抗原结合蛋白。
49.根据权利要求45、47或48所述的方法，其进一步包括通过化学合成、体外翻译或重组制备肽、抗体或抗原结合蛋白的步骤。
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