CN111057749A - 一种可视化恒温扩增产物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及恒温扩增检测方法，具体涉及一种可视化恒温扩增产物的检测方法。其包括以下步骤：将待测核酸样品扩增反应后，加入混合指示剂显色反应；所述的混合指示剂包括金属离子指示剂和酸碱指示剂。将待测核酸样品与反应扩增液构成反应体系在反应容器内扩增反应，所述混合指示剂置于反应容器内的反应体系上侧，反应结束摇动反应容器使混合指示剂混入反应体系进行显色反应。本发明增加阴性和阳性显色的差异，从而提高检测结果肉眼分辨的准确性，能应用于可视化恒温扩增产物检测，不需要特殊的仪器。
Description
技术领域
本发明涉及恒温扩增检测方法，具体涉及一种可视化恒温扩增产物的检测方法。
背景技术
核酸扩增实验(Nucleic acid amplification tests,NAATs)是一种高度灵敏的分子诊断技术，在食品安全检测领域具有十分重要的地位。核酸扩增是基于核酸扩增技术检测方法的核心步骤。PCR技术是最早的核酸扩增技术，也是目前应用最广泛的核酸扩增技术。PCR需要经历“变性(高温)-退火(低温)-延伸(中温)”这个三个温度循环，因此反应依赖于精密的温控设备，这在很大程度上限制了PCR在资源有限的环境和即时(POC)分析中的应用。
近年来又产生了一系列新型的核酸恒温扩增技术(Isothermal nucleic acidamplification technology)。核酸恒温扩增技术是指在恒定温度下使核酸目标片段延伸或拷贝数增加的现代分子生物学技术。恒温扩增最大的优点在于扩增反应能在恒温条件下实现，因此对仪器的要求大大简化，通常利用水浴锅、热块即可进行扩增。同时由于不需要经历温度变化循环，扩增的反应时间也大大缩短。与PCR相比，核酸恒温扩增技术更能满足现代分子检测“快速简便”的要求，因而具有更大的发展潜力和实际应用价值。目前常用于食源性过敏原检测的等温扩增技术包括重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymeraseamplification.RPA)、环介导扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、依赖核酸序列的扩增技术(nuclear acid sequence-based amplification,NASBA)、链置换扩增技术(strand displacement amplification, SDA)、缺口依赖酶链置换扩增技术(nickase-dependent amplification,NDA)、网状分支扩增技术(ramificationamplification method,RAM)以及依赖解旋酶扩增技术(helicase-dependent isothermalamplification,HDA)等。
环介导等温扩增(LAMP)是一种新型核酸扩增方法，是一种使用能够识别靶序列上六个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下进行快速、高效、高特异地扩增的技术。通过LAMP方法的核酸扩增优于PCR，有以下原因：(1)操作简便，LAMP不需要昂贵的热循环仪，因为所有反应都可以在60℃至65℃的恒定温度下进行；(2)特异性强，因为LAMP反应需要一组识别靶DNA上六个不同区域的四个寡核苷酸引物；(3)LAMP的检出限等于或高于PCR，(4)检测时间较短，因为通过使用两个特别设计的环引物可以加速LAMP反应；(5)产物易检，不需要凝胶电泳检测，因为LAMP反应导致溶液由于焦磷酸镁副产物的形成而变浑浊。溶液的浊度与合成的DNA量具有高度相关性，并且已有学者开发了用于LAMP反应的实时浊度计用于定量初始模板DNA。
在一些研究报告中，LAMP用于检测各种病原体。然而，许多研究中使用昂贵的实时浊度计或实时PCR系统进行产物检测。使用昂贵的设备降低了LAMP的多功能性，并极大地限制了该技术的广泛使用，特别是在发展中国家。通过肉眼检测浊度是判断LAMP反应阳性或阴性的最简单且最具成本效益的方法。
LAMP反应产生大量焦磷酸根离子副产物。焦磷酸根离子与Mg2+反应形成不溶性产物焦磷酸镁。由于随着LAMP反应的进行，Mg2+离子浓度降低，因此可以根据反应溶液中的Mg2 +离子浓度变化来定量LAMP反应。在这种现象的基础上，通过向反应溶液中加入一种金属离子指示剂，如羟基萘酚蓝(HNB)等即可检测LAMP反应。然而，在使用HNB进行扩增产物检测时，由于受到pH、温度、dNTP及其他可能存在的核酸分子的影响，都会改变反应终点显示的颜色，造成结果肉眼难以分辨、重复性差等问题，最终影响结果判定，导致检测效果差。不同环境的色彩饱和度往往存在较大差异，因此当前方法使用单一HNB，通过由紫到蓝的颜色变化判定阴性与阳性的扩增结果存在较大问题。综上，LAMP扩增反应，存在单独使用羟基萘酚蓝指示剂显色，使阴性与阳性结果间颜色分辨难、显色不稳定、重复性差的问题。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种通过两种指示剂组合提高可视化恒温扩增反应检测结果的可视化恒温扩增产物的检测方法。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
一种可视化恒温扩增产物的检测方法，其包括以下步骤：将待测核酸样品扩增反应后，加入混合指示剂显色反应；的混合指示剂包括金属离子指示剂和酸碱指示剂。
进一步的，将待测核酸样品与反应扩增液构成反应体系在反应容器内扩增反应，混合指示剂置于反应容器内的反应体系上侧，反应结束摇动反应容器使混合指示剂混入反应体系进行显色反应。
进一步的，混合指示剂置于反应容器的器盖上。
进一步的，反应容器为反应管，反应结束之后，离心使混合指示剂混入反应体系。
进一步的，金属离子指示剂为羟基萘酚蓝、铬黑T、孔雀石绿、钙黄绿素中的一种或两种以上的组合。
进一步的，酸碱指示剂为甲基橙、甲基红、酚红和中性红中的一种或两种以上的组合。
进一步的，混合指示剂与反应体系的体积比为0.2～1.5∶10，混合指示剂中金属离子指示剂的浓度为1～3mM，酸碱指示剂的浓度为2～ 5mM。
进一步的，反应体系中还包括有pH缓冲液和镁离子，恒温扩增为 60～65℃下水浴或金属浴反应10～60min。
进一步的，可视化恒温扩增为可视化环介导等温扩增。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
1.本发明通过一种双染料的核酸扩增和检测的方法，检测核酸扩增反应过程中焦磷酸根产生导致的镁离子浓度的变化，间接可视化检测核酸恒温扩增。由于扩增过程中，同时有氢离子产生，因此该方法同样可以通过调节反应体系组成，降低pH缓冲容量，放大扩增过程所产生的氢离子对反应液pH的变化，在金属离子指示剂发生变化的同时，叠加酸碱指示剂的颜色变化，从而产生对比度更明显的颜色变化。
2.本发明对于阴性样本，金属离子指示剂与镁离子结合产生一种颜色，在相应的pH值下，酸碱指示剂产生另外一种颜色，两种颜色的叠加产生新的颜色。对于阳性样本，产生大量的焦磷酸根消耗掉镁离子形成不溶的焦磷酸镁沉淀，金属离子指示剂呈现较淡的颜色，且阳性样本扩增过程同时产生大量的氢离子，酸碱指示剂对此会响应为肉眼可见的颜色变化，与同时存在的金属离子指示剂叠加形成肉眼识别强的新的颜色；由此扩大增加阴性和阳性显色的差异，从而提高检测结果肉眼分辨的准确性，能应用于可视化恒温扩增产物检测，不需要特殊的仪器。
3.本发明将混合指示剂设置在反应容器内的反应体系上侧，反应结束摇动反应容器使混合指示剂混入反应体系进行显色反应，无需另外开盖操作，不会造成交叉污染。
4.本发明的两种指示剂设置无需额外增加操作步骤，且不减弱核酸扩增产物生成的效率。
5.本发明是通过同时检测核酸扩增过程中镁离子浓度的减少和氢离子的生成得到的叠加的颜色变化，以判断核酸扩增反应的进行，具有较低的背景干扰，有利于对结果的准确判定。
附图说明
图1为不同镁离子条件下HNB颜色变化；
图2为不同镁离子和HNB条件下OD620差值对比；
图3为LAMP恒温扩增体系不同混合指示剂的可视化检测结果。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
一种可视化恒温扩增产物的检测方法，其包括以下步骤：将待测核酸样品扩增反应后，加入混合指示剂显色反应；混合指示剂包括金属离子指示剂和酸碱指示剂。
本发明通过金属离子指示剂和酸碱指示剂，分别对扩增产物中不同的产物进行显色，使得在阴性结果和阳性结果下分别产生的肉眼可识别的清晰的颜色相差较大，易于判断阴性和阳性结果。
对于阴性样本，金属离子指示剂与镁离子结合产生一种颜色，在相应的pH值下，酸碱指示剂产生另外一种颜色，两种颜色的叠加产生新的颜色。对于阳性样本，产生大量的焦磷酸根消耗掉镁离子形成不溶的焦磷酸镁沉淀，金属离子指示剂呈现较淡的颜色，阳性样本扩增过程同时产生大量的氢离子，酸碱指示剂对此会响应为肉眼可见的颜色变化，与同时存在的金属离子指示剂叠加形成肉眼识别强的新的颜色；由此扩大增加阴性和阳性显色的差异，从而提高检测结果肉眼分辨的准确性，能应用于可视化恒温扩增产物检测，不需要特殊的仪器。
具体的，以金属离子指示剂为HNB(羟基萘酚蓝)，酸碱指示剂为甲基橙为例。对于阴性样本，整个扩增过程中不产生焦磷酸根，不会引起反应液中镁离子的大量减少，扩增结束后，HNB与镁离子结合所形成的紫色与该pH条件下显黄色的甲基橙叠加形成橙色；而对于阳性样本，随着扩增反应的进行，焦磷酸根作为副产物不断产生，与镁离子形成不溶的焦磷酸镁沉淀，溶液中镁离子浓度显著变小，使得HNB与较低浓度的镁离子显为天蓝色，并与甲基橙叠加形成肉眼可变的青色。橙色与青色两种颜色肉燕清晰可辨别，从而准确的判断阴性或者阳性结果。
进一步的，将待测核酸样品与反应扩增液构成反应体系在反应容器内扩增反应，混合指示剂置于反应容器内的反应体系上侧，反应结束摇动反应容器使混合指示剂混入反应体系进行显色反应。
本发明将混合指示剂设置在反应容器内的反应体系上侧，可以是反应容器在反应体系上侧的内壁面或者器盖上，使扩增反应中，混合指示剂不会混入反应体系影响扩增反应的进行，核酸扩增的检测不存在开盖操作，不会造成交叉污染。混合指示剂可以是液体或固体粉末的形式，若是液体，沾取适合体积份的粘附混合指示剂在反应容器在反应体系上侧的内壁面或者器盖上，由于扩增反应过程为静置，使其不掉落。若为固体粉末，可利用如琼脂糖、结冷胶等具有冷致凝胶特性的材料将粉末封存于形成的凝胶当中，固定在反应容器盖上，反应结束，通过对盖子局部加热，快速混匀，分散至扩增反应溶液当中。
进一步的，混合指示剂置于反应容器的器盖上。
进一步的，反应容器为反应管，反应结束之后，离心使混合指示剂混入反应体系。
离心优选为瞬离，即快速的离心，使反应体系中的液体将混合指示剂溶进反应体系进行
进一步的，金属离子指示剂为羟基萘酚蓝、铬黑T、孔雀石绿、钙黄绿素中的一种或两种以上的组合。金属离子指示剂可选用两种以上的组合调配，相比于其中的一种，肉眼可看到的颜色更为突出。
进一步的，酸碱指示剂为甲基橙、甲基红、酚红和中性红中的一种或两种以上的组合。酸碱指示剂可选用两种以上的组合调配，相比于其中的一种，肉眼可看到的颜色更为突出。
进一步的，混合指示剂与反应体系的体积比为0.2～1.5∶10，混合指示剂中金属离子指示剂的浓度为1～3mM，酸碱指示剂的浓度为2～ 5mM。
在上述体积配比范围内，混合指示剂体积小，在不剧烈晃动的情况下，都不会掉下来，经实验表明，0.5～2ul的混合指示剂置于反应容器在反应体系上侧的内壁面或者器盖上，在静置的扩增反应过程中，不会掉落。
进一步的，反应体系恒温扩增为60～65℃下水浴或金属浴反应 10～60min。
进一步的，可视化恒温扩增为可视化环介导等温扩增。
本发明具体为一种双染料封闭的核酸扩增和检测的方法，可以实现在不打开容器的条件下，检测核酸扩增反应过程中焦磷酸根产生导致的镁离子浓度的变化，间接可视化检测核酸恒温扩增。
具体实施例
实施例1
可视化环介导等温扩增检测沙门氏菌invA基因的方法，其包括以下步骤：
S1反应体系配制：在反应管中加入10μL反应扩增液，反应扩增液中包括可视化环介导等温扩增所必须的组分，具体的包括：浓度为1.4mM 的dNTP、2mM的Mg2+、6mM的硫酸镁溶液、3.2μBstDNA的聚合酶；还包括引物2.4μL、待测核酸样本6.0μL和其余体积的无菌蒸馏水，混匀瞬离，得到反应体系；
S2添加混合指示剂：在反应管的管盖中添加1μL混合指示剂，混合指示剂中包括2.4mM的羟基萘酚蓝，和为3mM的甲基，将反应管合上管盖；
S3核酸恒温扩增反应进行：将反应管置于63℃下水浴加热1h。
S4混合指示剂混合：在步骤S3反应完成后，离心混匀，静置5min 后判断结果，若反应管内液体为绿色，则判断为阳性，即待测核酸样本为沙门氏菌invA基因；若反应管内液体为橙色，则判断为阳性，即待测核酸样本中不包含沙门氏菌invA基因。
实施例2
可视化环介导等温扩增检测沙门氏菌phoP基因的方法，其步骤与实施例1的不同点在于，在步骤S2中，混合指示剂的体积为1.5μL，混合指示剂中金属离子指示剂的浓度为2mM，酸碱指示剂的浓度为2mM，在步骤S3中，将反应管置于60℃金属浴加热30min，其它同实例1。
实施例3
可视化环介导等温扩增(LAMP)检测副溶血弧菌toxR基因的方法，其步骤与实施例1的不同点在于，在步骤S2中，混合指示剂的体积为 0.9μL，混合指示剂中金属离子指示剂的浓度为1mM，酸碱指示剂的浓度为5mM，在步骤S3中，将反应管置于65℃金属浴加热10min，其它同实例1。
实施例4
可视化环介导等温扩增检测金黄色葡萄球菌的方法，其步骤与实施例1的不同点在于，在步骤S2中，混合指示剂的体积为1.2μL，混合指示剂中金属离子指示剂的浓度为2mM，酸碱指示剂的浓度为3mM，在步骤S3中，将反应管置于64℃金属浴加热40min。其它同实例1。
实施例5
可视化环介导等温扩增检测金黄色葡萄球菌的方法，其步骤与实施例1的不同点在于，在步骤S2中，混合指示剂的体积为0.2μL，混合指示剂中金属离子指示剂的浓度为3mM，酸碱指示剂的浓度为3mM，在步骤S3中，将反应管置于64℃金属浴加热40min。其它同实例1。
实施例6
可视化环介导等温扩增检测金黄色葡萄球菌的方法，其步骤与实施例1的不同点在于，在步骤S2中，混合指示剂的体积为1.5μL，混合指示剂中金属离子指示剂的浓度为3mM，酸碱指示剂的浓度为5mM，在步骤S3中，将反应管置于64℃金属浴加热40min。其它同实例1。
实验证明：
实验1
不同浓度的HNB在不同镁离子浓度下颜色的变化值，如图1所示。相应的OD620差值对比，如图2所示。当HNB在160μM，Mg2+在8mM时，阴性阳性的OD620差值最大，对比最明显。
图中，N代表阴性结果，P代表阳性结果。
实验2
其它同实施例1，不同点在于，混合指示剂的不同。不同混合指示剂下，判断为阳性和阴性的Lab值(色值)以及阴性和阳性之间的色差值如表1所示，相应的颜色变化结果如图3所示。
表1阳性与阴性样品的Lab值与色差值
表1中，N代表阴性结果，P代表阳性结果。
L，a，b是代表物体颜色的色度值，也就是该颜色的色空间坐标，任何颜色都有唯一的坐标值；L，a，b由Photoshop对样品图片取色得到。
其中L:代表明暗度(黑白)，a:代表红绿色，b代表黄蓝色；dE2000 (平均色差值)是根据色差公式CIE2000计算得到；其中L：如果是正值，说明样品偏亮；如果是负值，说明偏暗；a:如果是正值，说明样板偏红，如果负值，说明偏绿；b：如果是正值，说明样板偏黄，如果负值，说明偏蓝。
从表1的平均色差值得结果可知，当混合指示剂为160μM HNB和 100μM甲基橙组合时，其色差值最大，效果最好。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种可视化恒温扩增产物的检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：将待测核酸样品扩增反应后，加入混合指示剂显色反应；所述的混合指示剂包括金属离子指示剂和酸碱指示剂。
2.如权利要求1所述的可视化恒温扩增产物的检测方法，其特征在于：将待测核酸样品与反应扩增液构成反应体系在反应容器内扩增反应，所述混合指示剂置于反应容器内的反应体系上侧，反应结束摇动反应容器使混合指示剂混入反应体系进行显色反应。
3.如权利要求2所述的可视化恒温扩增产物的检测方法，其特征在于：混合指示剂置于反应容器的器盖上。
4.如权利要求3所述的可视化恒温扩增产物的检测方法，其特征在于：所述反应容器为反应管，反应结束之后，离心使混合指示剂混入反应体系。
5.如权利要求1-4任一项所述的可视化恒温扩增产物的检测方法，其特征在于：所述金属离子指示剂为羟基萘酚蓝、铬黑T、孔雀石绿、钙黄绿素中的一种或两种以上的组合。
6.如权利要求1-4任一项所述的可视化恒温扩增产物的检测方法，其特征在于：酸碱指示剂为甲基橙、甲基红、酚红和中性红中的一种或两种以上的组合。
7.如权利要求2所述的可视化恒温扩增产物的检测方法，其特征在于：混合指示剂与反应体系的体积比为0.2～1.5∶10，混合指示剂中金属离子指示剂的浓度为1～3mM，酸碱指示剂的浓度为2～5mM。
8.如权利要求2所述的可视化恒温扩增产物的检测方法，其特征在于：反应体系中还包括有pH缓冲液和镁离子，恒温扩增为60～65℃下水浴或金属浴反应10～60min。
9.如权利要求8所述的可视化恒温扩增产物的检测方法，其特征在于，可视化恒温扩增为可视化环介导等温扩增。
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